CN115474510B - 一种黄色毛柄金钱菌及其栽培方法和分子鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种黄色毛柄金钱菌及其栽培方法和分子鉴定方法，本发明选育出具有菌柄较长、生长迅速、生长周期短，并且产量高等多方面优良性状的黄色毛柄金钱菌。克服了黄色品种生长周期长、产量低的缺点，显著降低了黄色毛柄金钱菌的生产成本，利于规模化生产，具有非常好的市场前景。本发明特异性微卫星标记引物组合能够从105种现有主要栽培品种中特异性的鉴定出本发明的毛柄金钱菌菌种。
Description
技术领域
本发明属于毛柄金钱菌菌种选育及检测技术领域，具体涉及一种黄色毛柄金钱菌及其栽培方法和分子鉴定方法。
背景技术
毛柄金钱菌属真菌门、担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、口蘑科、金钱菌属，在自然界广为分布，亚洲、欧洲、北美洲、澳洲等地均有种植，在我国分布广泛，栽培历史十分悠久，毛柄金钱菌是秋冬与早春栽培的食用菌，以其菌盖滑嫩、柄脆、营养丰富、味美适口而著称于世，其营养丰富、氨基酸的含量较高，味道鲜美，深受大众的喜爱。
毛柄金钱菌主要分为黄色和白色品种，目前市售毛柄金钱菌以白色菌种为主，相比于白色品种，黄色品种具有特殊的甜味香气，口感更为脆滑，不会“塞牙”，营养更为丰富，然而，黄色品种具有栽培周期长、产量低的缺点，显著提高了生产成本，不利于规模化生产，很大程度上限制了黄色品种的应用。
因此，如何选育出生产周期短，产量较高的黄色毛柄金钱菌是有待解决的技术问题。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。
本发明以毛柄金钱菌菌种0747(美国ATCC菌种库，编号20167)、和上研1号菌种(GDMCC No：61490)为亲本，经过孢子单核体分离、杂交、挑选杂交后代，最终选育出出菇快、产量高、子实体为浅黄色的毛柄金钱菌菌种：Flammulina filiformis上研1820，Flammulina filiformis上研1820，于2021年2月8日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，保藏编号为GDMCC No：61532。
作为本发明其中一个方面，本发明提供所述的黄色毛柄金钱菌的栽培方法：栽培瓶灭菌接种后移入培菌培养室，黑暗培养；搔菌，移入出菇培养室，搔菌后控制温度和湿度，采收。
优选地，所述黑暗培养，培养温度为14-19℃。
优选地，所述黑暗培养，湿度保持在85％以上。
优选地，所述搔菌，为黑暗培养22d后搔菌。
优选地，所述搔菌后控制温度和湿度，为在菌丝恢复阶段控制温度为14-15℃，湿度保持在90％以上。
优选地，所述搔菌后控制温度和湿度，为在搔菌9d后控制温度控制在3-4℃之间，湿度保持在90％以上，搔菌15d后温度控制在5-8℃，湿度为80-85％。
优选地，所述采收，为搔菌25d后开始采收。
作为本发明的另一个方面，本发明提供所述的黄色毛柄金钱菌的分子鉴定方法，所述分子鉴定，包括以下引物组合：
引物1：上游引物：cctaatggcgttcagccaa，下游引物：ctctgaatcggatgccttc；
引物2：上游引物：gtctttcgcgcaggtt，下游引物：tgaggggacgggtatgaga；
引物3：上游引物：ggtgcacgctcctaaaccta，下游引物：cttgtcgaggaagatccatg；
引物4：上游引物：atttcttcggatgctttgga，下游引物：ttctctttgcacacgtcgaa；
引物5：上游引物：agtcgtcgttcaaggtgtcg，下游引物：cggttgtttgttccactttt；
引物6：上游引物：agacccaacaccggacatat，下游引物：ggttagggatgtgacgcggt。
本发明还提供所述的黄色毛柄金钱菌的分子鉴定方法，其特征在于：将所述黄色毛柄金钱菌菌种接种到马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基，20～25℃下培养7-10天后，提取菌丝体DNA，并用所述引物组合对提取出的菌丝体DNA进行PCR扩增，进行数据分析，引物1-6依次得到的基因片段分子量为：
基因片段1：430-430.99bp和438-438.99bp；
基因片段2：105-105.99bp和109-109.99bp；
基因片段3：266.00-266.99bp和287-287.99bp；
基因片段4：229.00-229.99bp；
基因片段5：264-264.99bp和246-246.99bp；
基因片段6：292-292.99bp和294-294.99bp。
本发明的有益效果：本发明选育出具有菌柄较长、生长迅速、生长周期短，并且产量高等多方面优良性状的黄色毛柄金钱菌。克服了黄色品种生长周期长、产量低的缺点，显著降低了黄色毛柄金钱菌的生产成本，利于规模化生产，具有非常好的市场前景。同时，本发明栽培方法能够提高产量。此外，本发明开发的特异性微卫星标记引物组合能够从105种现有主要栽培品种中特异性的鉴定出本发明的毛柄金钱菌菌种。
附图说明
图1为毛柄金钱菌菌种上研1820与亲本0747的菌种形态对比图。
图2为本发明毛柄金钱菌菌与亲本菌种及目前市售白色主要栽培品种在同样栽培条件下的生长情况对照图。
图3为相对分子量图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
实施例1：
菌种的选育：
供试材料：
供试菌株：以毛柄金钱菌菌种0747(美国ATCC菌种库，编号20167)和上研1号菌种(GDMCC No：61490)为亲本。
供试培养基：PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，无菌水定容至1000mL。pH自然，121℃、1×105Pa灭菌20min。
液体培养基：豆粉1.5g，白砂糖12g，硫酸镁0.4g，磷酸氢二钾0.4g，无菌水定容至600mL，121℃、1×105Pa灭菌20min。
栽培配方:培养基干物质构成包括玉米芯38.5％，米糠29.5％，麸皮9.6％，棉籽壳5.4％，大豆皮3.2％，啤酒糟4.8％，甜菜渣3.2％，豆渣3.5％，贝化石1.6％，轻质碳酸钙0.7％，含水量65％左右，pH自然。
杂交群体构建：将浓度为1×106的金针菇‘上研1号’与‘0747’的孢子分别涂布于PDA平板上，于20℃条件下恒温培养3-5d，挑选单菌落后镜检，根据无锁状联合鉴定为孢子单核体。分别用打孔器取直径为5mm的‘上研1号’与‘0747’的孢子单核体菌种块分别接于同一平板PDA培养基上，两个菌块相距约1.0cm左右，于20℃条件下恒温培养。待菌块的菌丝相互接触交融后，挑取交界处的菌丝进行镜检，根据有锁状联合鉴定为杂交菌株，构建了‘上研1号’与‘0747’的杂交群体。用打孔器取直径为5mm的杂交菌株菌种块转接于PDA平板，于20℃条件下恒温培养7d，保存备用。
杂交菌株菌丝生长速度测定：将杂交菌株分别转接于PDA平板上，于20℃条件下恒温培养，从菌块中心点开始测量培养第5d和第7d的菌丝生长距离，计算杂交菌株菌丝在平板PDA培养基上的日平均生长速度，每个杂交菌株设3个重复。
杂交菌株摇瓶培养：用打孔器取8块5mm的菌种块接种于装有600mL培养基的1000mL三角瓶中，置于20℃、150r/min的摇床中避光培养8d，观察杂交菌株的菌球形态及测量菌丝生物量，每个杂交菌株设3个重复。
上研1820的栽培方法：
栽培瓶灭菌接种后移入培菌培养室，黑暗培养，培养温度为14-19℃，湿度保持在85％以上。培养22d后搔菌，移入出菇培养室。菌丝恢复阶段温度为14-15℃，湿度保持在90％以上。搔菌后第4d开始现原基，原基发生期每天给予充分光刺激。搔菌后第9d进入抑制期，抑制期的温度控制在3-4℃之间，湿度保持在90％以上，间断给予光刺激。搔菌后第15d套筒，培养温度为5-8℃，湿度为80-85％，间断给予光刺激。搔菌后第25-26d，开始采收。测量和记录不同杂交菌株的现原基时间、子实体颜色、菌盖直径、菌柄直径、菌柄长度和单瓶产量等农艺性状数据。
‘上研1820’氨基酸测定及评价：UHPLC-MS/MS测定实体中的氨基酸含量：称取适量25mg样本加入含钢珠和1000μL(体积比为乙腈：甲醇：水＝2:2:1)提取液的EP管中，提取液内含同位素标记内标混合物。35Hz研磨处理4min，冰水浴条件下超声5min，重复研磨超声3次，-40℃静置1h后，12000r/min离心15min。取上清液稀释25倍后移至LC进样瓶中备用。流动相柱温箱温度为35℃，样品盘设为4℃，进样体积为1μL。质谱的离子源参数为电压+4000V/-3500V,电喷雾电压+500V/-500V,离子源温度300℃,离子流速5L/min,气温度250℃,气流量11L/min,雾化气压力45psi。
实验结果：
本发明毛柄金钱菌菌种菌丝阶段特性：
1)生长速度：0.442cm/d(±0.012cm/d)，菌丝体外观：菌丝体边缘平整、整齐，菌丝生长迅速，颜色洁白。培养条件：PDA培养基，温度：20℃。
2)菌落特征：菌落呈灰白色，毡毛状，菌落形状圆整。本发明毛柄金钱菌菌种上研1820与亲本0747的菌种形态对比如图1所示。
本发明毛柄金钱菌菌种子实体特征：
1)本发明毛柄金钱菌菌子实体呈浅黄色，菌柄长度为16-18cm，菌褶排列规则，为平形；距离根部10cm处切根计算平均有效茎数为630个，菌盖直径为：0.3-1.0cm，菌盖纵切面顶端呈山形；菌柄为柱状，直径0.2-0.3cm；菌盖形状为：球形内扣。
上研1820的现原基时间：4天。
上研1820的栽培周期(出菇周期)：25天。
产量：平均每瓶350.15g(1100mL，75mm口径)。
2)同样条件下栽培亲本上研1号，其子实体为白色，菌柄长度14cm，菌褶排列规则，为平形；距离根部10cm处切根计算平均有效茎数为1191个；菌盖球形内扣；菌盖直径0.3-1.0cm，菌盖纵切面顶端呈山形；菌柄为柱状，直径0.2-0.3cm。
同样条件下，亲本上研1号的栽培周期(出菇周期)：29-30天。
3)同样条件下栽培亲本0747，其子实体黄色，菌柄为柱状，直径0.2-0.3cm，菌柄长度为12-15cm，菌褶排列规则，为平形；距离根部10cm处切根计算平均有效茎数为453个。菌盖半球形；菌盖直径0.2-0.8cm，菌盖纵切面顶端呈山形。
同样条件下，亲本0747的栽培周期(出菇周期)：32天。
产量：平均每瓶223.1g(1100mL，75mm口径)。
图2为本发明毛柄金钱菌菌种与亲本菌种及目前市售白色主要栽培品种在同样栽培条件下的生长情况对照。图2从左到右依次为：亲本上研1号、亲本上研1820号、亲本0747号、市售白色主要栽培品种。从图2可以直观的看出，本发明选育出的毛柄金钱菌菌种，生长速度明显更快，生长周期更短。
‘上研1820’及其亲本的氨基酸组成结果见表1。
表1
注：TAA为总氨基酸；IAA为必需氨基酸；NIAA为非必需氨基酸。
‘上研1820’的SRC值为70.62，高于大米，低于鸡蛋，明显高于亲本0747(SRC56.35)。
本研究以白色菌株‘上研1号’和黄色菌株‘0747’为亲本，对2个亲本的孢子进行单单杂交构建杂交群体，以菌丝生长速度、摇瓶生长情况、单瓶产量、出芽数、子实体外观、子实体密度、菌柄粘连度、现原基时间和栽培周期等农艺性状为筛选指标选育金针菇新品种。其中菌丝生长速度、单瓶产量、现原基时间和出芽数是金针菇工厂化生产的重要栽培性状。杂交群体中大部分菌株的菌丝生长速度、现原基时间和栽培周期快于白色亲本‘上研1号’。‘上研1820’品种适用于瓶栽、袋栽工厂化周年生产，具有菌丝长势强，平均生长速度快、栽培周期短、有效芽数多，且生产同步性好、出菇整齐等特性。本研究不仅为金针菇杂交选育新品种提供了数据和理论支撑，对创制金针菇新的种质资源、推动金针菇品质差异化和促进金针菇产业转型升级也具有重要意义。
实施例2：
为从众多品种中鉴定出本发明选育的具有短生长周期特性的毛柄金钱菌菌种，本发明基于分析毛柄金钱菌菌种的基因组简单重复序列片段，对大量引物进行筛选，并收集105种主要栽培的毛柄金钱菌菌种，最终开发出特异性微卫星标记引物，其引物组合如下：
引物1：上游引物：cctaatggcgttcagccaa，下游引物：ctctgaatcggatgccttc；
引物2：上游引物：gtctttcgcgcaggtt，下游引物：tgaggggacgggtatgaga；
引物3：上游引物：ggtgcacgctcctaaaccta，下游引物：cttgtcgaggaagatccatg；
引物4：上游引物：atttcttcggatgctttgga，下游引物：ttctctttgcacacgtcgaa；
引物5：上游引物：agtcgtcgttcaaggtgtcg，下游引物：cggttgtttgttccactttt；
引物6：上游引物：agacccaacaccggacatat，下游引物：ggttagggatgtgacgcggt。
引物1-6依次对应的基因片段分子量分别为：
基因片段1：430-430.99bp和438-438.99bp，
基因片段2：105-105.99bp和109-109.99bp，
基因片段3：266.00-266.99bp和287-287.99bp，
基因片段4：229.00-229.99bp，
基因片段5：264-264.99bp和246-246.99bp，
基因片段6：292-292.99bp和294-294.99bp。
鉴定方法：将所述毛柄金钱菌菌种接种到马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基，室温下培养7-10天后，提取菌丝体DNA，并用上述引物组合进行PCR扩增，进行数据分析，若条带符合上述基因片段分子量，则鉴定出该菌种为本发明毛柄金钱菌菌种。
本发明上述特异性微卫星标记引物组合能够从105种现有主要栽培品种中特异性的鉴定出本发明的毛柄金钱菌菌种。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，依据本发明的技术方案所进行的任何简单修改或等同置换，尽属于本发明要求保护的范围。
Claims (5)
1.一种黄色毛柄金钱菌的栽培方法，其特征在于：所述黄色毛柄金钱菌，其保藏编号为GDMCC No：61532，其生物学名称为Flammulina filiformis 上研1820；
所述栽培方法为：将栽培瓶灭菌接种后移入培菌培养室，黑暗培养；黑暗培养22d后搔菌，移入出菇培养室，在菌丝恢复阶段控制温度为14-15℃，湿度保持在90%以上，在搔菌9d后将温度控制在3-4℃之间，湿度保持在90%以上，搔菌15d后温度控制在5-8℃，湿度为80-85% ，搔菌25d后开始采收。
2.根据权利要求1所述的黄色毛柄金钱菌的栽培方法，其特征在于：所述黑暗培养，培养温度为14-19°C。
3.根据权利要求1或2所述的黄色毛柄金钱菌的栽培方法，其特征在于：所述黑暗培养，湿度保持在85%以上。
4.权利要求1所述的黄色毛柄金钱菌的分子鉴定方法，其特征在于：所述分子鉴定方法，包括使用以下引物组合：
引物1：上游引物：cctaatggcgttcagccaa，下游引物：ctctgaatcggatgccttc；
引物2：上游引物：gtctttcgcgcaggtt，下游引物：tgaggggacgggtatgaga；
引物3：上游引物：ggtgcacgctcctaaaccta，下游引物：cttgtcgaggaagatccatg；
引物4：上游引物：atttcttcggatgctttgga，下游引物：ttctctttgcacacgtcgaa；
引物5：上游引物：agtcgtcgttcaaggtgtcg，下游引物：cggttgtttgttccactttt；
引物6：上游引物：agacccaacaccggacatat，下游引物：ggttagggatgtgacgcggt。
5.根据权利要求4所述的黄色毛柄金钱菌的分子鉴定方法，其特征在于：将所述黄色毛柄金钱菌菌种接种到马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基，20~25℃下培养7-10天后，提取菌丝体DNA，并用所述引物组合对提取出的菌丝体DNA进行PCR扩增，进行数据分析，引物1-6依次得到的基因片段分子量为：
基因片段1：430-430.99 bp和438-438.99 bp；
基因片段2：105-105.99 bp和109-109.99 bp；
基因片段3：266.00-266.99 bp和287-287.99 bp；
基因片段4：229.00-229.99 bp；
基因片段5：264-264.99 bp和246-246.99 bp；
基因片段6：292-292.99 bp和294-294.99 bp。
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