CN116948898A - 筛选赋予植物有效特性的微生物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及选择能够赋予植物一个或多个有益表型的一个或多个微生物的方法，所述方法包括下述步骤：a)使一个或多个植物在存在第一集合的一个或多个微生物的情况下经受生长培养基；b)基于所述植物相对于所述一个或多个植物的其他植物表现出的一个或多个期望的特征，从步骤a)所述的一个或多个植物选择一个或多个种子；c)从步骤b)中选择的所述一个或多个种子获取第二集合的一个或多个微生物；以及d)重复步骤a)至c)一次或多次，其中步骤c)中获取的第二集合的一个或多个微生物用作任何接连重复的步骤a)中的第一集合微生物。通过使用本发明的方法能容易鉴定能够赋予一个或多个植物一个或多个有益的特性的微生物。

Description

筛选赋予植物有效特性的微生物的方法
本申请是申请日为2013年09月19日，国际申请号PCT/NZ2013/000171，国家申请号为201380053496.2，发明名称为“筛选赋予植物有效特性的微生物的方法”的申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及筛选、鉴定和/或应用用于赋予植物有益的特性的微生物的方法。
背景技术
已知的赋予植物有益的特性的方法，比如选择性培育，可非常昂贵、缓慢、范围受限和担心管理困难。从该技术二十年的大规模研究，已经出现了数个商业成功。
尽管数十年的成功科学研究高产量作物的常规培育和开发转基因作物，但是相对少的研究努力涉及经其他方式开发植物特征。
本文引用的出版物的书目详情收集在说明的结尾处。
发明目的
本发明的目的是提供克服或减轻已知方法的至少一种劣势的选择用于赋予植物一个或多个有益的特性的一个或多个微生物和/或组合物的方法。
可选地，本发明的目的是提供帮助改善一个或多个植物的方法和/或系统。
可选地，目的是至少为大众提供有用的选择。
发明内容
在本发明的第一宽泛方面中，提供选择能够赋予植物一个或多个有益特性的一个或多个微生物的方法，该方法至少包括下述步骤：
a)使一个或多个植物(包括例如种子、秧苗、插条和/或其繁殖体)在存在第一集合的一个或多个微生物的情况下经受生长培养基；
b)步骤a)之后选择一个或多个植物；
c)获取与步骤b)中选择的所述一个或多个植物相关联的第二集合的一个或多个微生物；
d)重复步骤a)至c)一次或多次，其中步骤c)中获取的第二集合的一个或多个微生物用作任何接连重复的步骤a)中的第一集合微生物。
在一种实施方式中，第二集合的一个或多个微生物分离自步骤c)中的所述一个或多个植物。
在一种实施方式中，第一集合的一个或多个微生物和/或第二集合的一个或多个微生物选自本文下面详述的微生物。
在一种实施方式中，生长培养基选自本文下面详述的生长培养基。
在一种实施方式中，使一个或多个植物经受生长培养基的步骤涉及使植物生长或增殖。
在一种实施方式中，两个或更多个植物在存在一个或多个微生物的情况下经受生长培养基。在其他实施方式中，10至20个植物在存在第一集合微生物的情况下经受生长培养基。在其他实施方式中，20或更多，100或更多，300或更多，500或更多，或1000或更多个植物在存在第一集合微生物的情况下经受生长培养基。
在一种实施方式中，基于一个或多个选择标准选择一个或多个植物。在一种实施方式中，基于一个或多个表型特征选择一个或多个植物。在一种优选的实施方式中，基于存在的期望的表型特征选择一个或多个植物。在一种实施方式中，表型特征是本文下面详述的那些之一。在一种实施方式中，基于一个或多个遗传特征选择一个或多个植物。在一种优选的实施方式中，基于存在的期望的遗传特征选择一个或多个植物。在一种实施方式中，基于一个或多个遗传和一个或多个表型特征的组合选择一个或多个植物。在一种实施方式中，不同选择标准可用于本发明方法的不同迭代。
在一种实施方式中，第二集合的一个或多个微生物分离自选择的一个或多个植物的根、茎和/或叶(包括生殖)组织。可选地，第二集合的一个或多个微生物分离自选择的一个或多个植物的全植物组织。在另一实施方式中，植物组织可被表面杀菌和然后从一个或多个植物的任何组织分离一个或多个微生物。该实施方式允许靶向选择内生菌微生物。在另一实施方式中，第二集合的一个或多个微生物可分离自围绕选择植物的生长培养基。
在另一实施方式中，以粗制形式获取第二集合的一个或多个微生物。
在一种实施方式中，在步骤c)中发芽后的任何时间获取一个或多个微生物。
在一种实施方式中，步骤c)中获取两个或更多个微生物的情况下，方法进一步包括步骤：将两个或更多个微生物分离成个体隔离群、选择两个或更多个个体隔离群，和然后合并选择的两个或更多个隔离群。
在另一实施方式中，方法进一步包括重复步骤a)至c)一次或多次，其中步骤c)中获取两个或更多个微生物的情况下，两个或更多个微生物分离成个体隔离群，选择和然后合并两个或更多个个体隔离群，和合并的隔离群用作接连重复的步骤a)中第一集合的一个或多个微生物。因此，在提及使用方法的步骤a)的步骤c)中获取的一个或多个微生物情况下，其应包括使用本发明的该实施方式的合并的隔离群。
在另一实施方式中，本发明的两个或更多个方法可分开进行和组合每个分开方法的步骤c)中获取的第二集合的一个或多个微生物。在一种实施方式中，组合的微生物用作本发明方法的任何接连重复的步骤a)中的第一集合的一个或多个微生物。
在一种实施方式中，本发明第一方面的方法也可用于鉴定和/或选择能够赋予植物一个或多个有益的特性的一个或多个内生菌微生物。
在一种实施方式中，植物材料(包括例如种子、秧苗、插条和/或其繁殖体)可用作步骤a)的微生物来源。在优选的实施方式中，用作步骤a)中微生物来源的植物材料是种子材料。优选地，植物材料是表面杀菌的。
在另一实施方式中，本发明第一方面的方法可用于鉴定和/或选择能够赋予植物一个或多个有益的特性的一个或多个不可培养的微生物。在该实施方式中，植物材料(包括例如种子、秧苗、插条和/或其繁殖体)可用作步骤a)的微生物来源。在优选的实施方式中，用作步骤a)中微生物来源的植物材料是外植体材料(例如，植物插条)。优选地，植物材料是表面杀菌的。
在第二宽泛方面中，提供根据本文描述的方法帮助改善一个或多个植物的方法，包括在存在一个或多个微生物和/或组合物的情况下安排评估所述植物(一个或多个)。方法优选地至少包括本发明第一、第七(和/或相关的)方面，和/或第八(和/或相关的)方面的步骤。
根据一种实施方式，植物(一个或多个)在第一区域中生长。微生物(一个或多个)可存在或可不存在(或至少在很大程度上)于第一区域中。
“区域”和“第一区域”宽泛地解释为意思是一个或多个陆地区域。陆地区域可由地理/政治/私人陆地边界限定或由具有类似的特性比如气候、土壤特性、存在具体的害虫等的陆地区域限定。
优选地，评估在其中存在微生物(一个或多个)的第二区域中进行，但是这绝不是必须的。微生物可获得自其他来源，包括微生物保藏位置并且人工与植物材料和/或土壤相关联。此外，尽管植物(一个或多个)可以以基本上常规的方式栽培，但是在具有通常与植物(一个或多个)基本上不相关的微生物的区域中，至少第一区域中，人工生长环境可以可选地使用，如本领域技术人员认识到。因此，可鉴定没必要通常使用的可能有益的微生物/植物关系。
优选地，安排的步骤包括安排下述的一个或多个：
-接收或传递待评估的一个或多个植物或植物类型的身份；
-接收或传递来自待评估的一个或多个植物或植物类型的植物材料；
-鉴定和/或选择微生物(一个或多个)和/或组合物(一个或多个)；
-获取微生物(一个或多个)和/或组合物(一个或多个)；和
-使微生物(一个或多个)和/或组合物(一个或多个)与植物材料相关联。
优选地，方法包括在存在所述微生物(一个或多个)和/或组合物(一个或多个)的情况下评估所述植物(一个或多个)(或安排所述评估)。
评估的步骤优选地包括进行本文所述的方法的一个或多个步骤，在具体的实施方式中，本发明第一方面、第七(和/或相关的)方面或第八(和/或相关的)方面的一个或多个的方法的一个或多个步骤。
上面鉴定的各种步骤可通过单个实体进行，尽管优选地涉及至少两个部门，第一个部门发出请求和第二个部门处理请求。注意，各种试剂可用于一个或两个部门并且可使用不同自动化水平。例如，响应具体的请求，可通过处理器查询数据库基于与该植物或类似的植物(一个或多个)已知的微生物关联，几乎不需要或不需要来自操作人员的输入来选择微生物(一个或多个)。
此外，评估可通过请求部门和/或在第一区域中进行。在第一区域中进行评估更好地确保评估是精确的并且不必考虑可影响植物(一个或多个)或微生物(一个或多个)的不可预料的环境因素。
评估之后或其过程期间，方法优选地进一步包括下述的一个或多个：
-接收或发送一个或多个微生物(或至少其身份)和/或组合物(一个或多个)至第一区域，包括结合植物材料；和
-使所述植物(一个或多个)或其他植物(优选地具有类似的特性)在第一区域中在存在所述微生物(一个或多个)和/或组合物(一个或多个)的情况下生长。
第二方面的方法可通过第一部门具体化：
-鉴定改善植物(一个或多个)的需要；
-发送其身份和/或相关的植物材料以及任何相关的信息至第二部门，和
-接收植物材料和/或一个或多个微生物和/或其身份和/或组合物(一个或多个)。
接收的步骤优选地在评估植物/微生物和/或植物/组合物关联之后进行或作为其结果进行。优选地，评估使用如本文所描述方法，在具体的实施方式中，使用第一方面、第七(和/或相关的)方面或第八(和/或相关的)方面的方法进行。
第二方面的方法可另外或可选地通过第二部门具体化：
-从第一部门接收植物(一个或多个)的身份和/或相关的植物材料以及任何相关的信息，和
-发送植物材料和/或一个或多个微生物(一个或多个)和/或其身份和/或组合物(一个或多个)至第一部门。
发送的步骤优选地在评估植物/微生物和/或植物/组合物关联之后进行或作为其结果进行。优选地，评估使用本文所述的方法，在具体的实施方式中，使用第一方面、第七(和/或相关的)方面或第八(和/或相关的)方面的方法进行。
根据第三方面，提供实施第二方面的方法的系统。
第三方面的系统优选地包括下述的一个或多个：
-接收或传递待评估的一个或多个植物的身份或植物类型的工具；
-从待评估的一个或多个植物或植物类型接收或传递植物材料的工具；
-鉴定和/或选择微生物(一个或多个)和/或组合物(一个或多个)的工具；
-获取微生物(一个或多个)和/或组合物(一个或多个)的工具；
-使微生物(一个或多个)和/或组合物(一个或多个)与植物材料相关联的工具；
-在存在所述微生物(一个或多个)和/或组合物(一个或多个)的情况下评估所述植物(一个或多个)的工具；
-接收或发送一个或多个微生物(或至少其身份)和/或组合物(一个或多个)至第一区域，包括结合植物材料的工具；和
-使所述植物(一个或多个)或其他植物(优选地具有类似的特性)在第一区域中在存在所述微生物(一个或多个)和/或组合物(一个或多个)的情况下生长的工具。
本领域技术人员已知的工具可用于提供第三方面的系统中需要的功能。例如，常规的通信工具，包括因特网，可用于传输植物/微生物的身份；常规的载体工具可用于传输植物材料/微生物/组合物(一个或多个)；常规的工具和方法可用于使微生物和/或组合物与植物材料相关联并且可使用评估所述植物(一个或多个)和/或植物/微生物和/或植物/组合物关联的常规工具。
根据优选的实施方式，本发明的系统通过配置为传递改善植物(一个或多个)的请求(一个或多个)和随后接收植物材料和/或一个或多个微生物和/或其身份的设施具体化，优选地在评估植物/微生物关联之后或作为其结果。优选地，使用本文所述的方法，在具体的实施方式中，使用第一方面、第七(和/或相关的)方面，或第八(和/或相关的)方面的方法进行评估。
第二方面的系统可另外或可选地通过配置为接收植物(一个或多个)的身份和/或相关的植物材料以及任何相关的信息；和发送植物材料和/或一个或多个微生物和/或其身份和/或组合物(一个或多个)的设施具体化，优选地在评估植物/微生物或植物/组合物关联之后进行或作为其结果进行。优选地，使用本文所述的方法，在具体的实施方式中，使用第一方面、第七(和/或相关的)方面或第八(和/或相关的)方面的方法进行评估。
因此，本发明的第四宽泛方面，提供了通过本文之前描述的方法获取、选择或分离的微生物。在一种实施方式中，微生物是内生菌。在一种实施方式中，微生物是不可培养的。
在本发明的第五宽泛方面中，提供了产生支持植物生长、质量和/或健康的组合物或阻止或抑制植物的生长、质量和/或健康的组合物的方法，方法包括本文之前描述的方法的步骤和另外的使通过方法选择的一个或多个微生物与一个或多个另外成分结合的步骤。
在本发明的第六宽泛方面中，提供了包括第四宽泛方面的一个或多个微生物或如通过第五宽泛方面的方法制备的一个或多个微生物的组合物。
在本发明的第七宽泛方面中，提供了选择能够赋予植物一个或多个有益的特性的组合物的方法，方法包括至少下述步骤：
a)在一个或多个培养基中培养通过本发明的第一方面的方法选择的一个或多个微生物，以提供一个或多个培养物；
b)一段时间之后从一个或多个培养物的一个或多个培养基分离一个或多个微生物，以提供一个或多个基本上不含微生物的组合物；
c)使一个或多个植物(包括例如种子、秧苗、插条和/或其繁殖体)经受步骤b)的一个或多个组合物；
d)如果观察到赋予一个或多个植物一个或多个有益的特性从步骤c)选择一个或多个组合物。
在与本发明的第七宽泛方面相关的(但是不同的)本发明的方面中，提供了选择能够赋予植物一个或多个有益的特性的组合物的方法，方法包括至少下述步骤：
a)在一个或多个培养基中培养通过本发明的第一方面的方法选择的一个或多个微生物，以形成一个或多个培养物；
b)使步骤a)的一个或多个培养物灭活，以提供包含一个或多个灭活微生物的一个或多个组合物；
c)使一个或多个植物(包括例如种子、秧苗、插条和/或其繁殖体)经受步骤b)的一个或多个组合物；
d)如果观察到赋予一个或多个植物一个或多个有益的特性，从步骤c)选择一个或多个组合物。
在本发明的第八宽泛方面中，提供了选择能够产生能够赋予植物一个或多个有益的特性的组合物的一个或多个微生物的方法，方法包括至少下述步骤：
a)在一个或多个培养基中，培养通过本发明的第一方面的方法选择的一个或多个微生物，以提供一个或多个培养物；
b)一段时间之后从步骤a)的一个或多个培养物的一个或多个培养基分离一个或多个微生物，以提供一个或多个基本上不含微生物的组合物；
c)使一个或多个植物(包括例如种子、秧苗、插条和/或其繁殖体)经受来自步骤b)的一个或多个组合物；
d)选择与观察到赋予一个或多个植物一个或多个有益的特性的一个或多个组合物相关联的(或换句话说用于产生一个或多个组合物的)一个或多个微生物。
在与本发明的第八宽泛方面相关(但是不同的)方面中，提供了选择能够产生能够赋予植物一个或多个有益的特性的组合物的一个或多个微生物的方法，方法包括至少下述步骤：
a)在一个或多个培养基中培养一个或多个微生物，以提供一个或多个培养物；
b)一段时间之后从一个或多个培养物的一个或多个培养基分离一个或多个微生物，以提供一个或多个基本上不含微生物的组合物；
c)使一个或多个植物(包括例如种子、秧苗、插条和/或其繁殖体)经受步骤b)的一个或多个组合物；
d)选择与观察到赋予一个或多个植物一个或多个有益的特性相关的一个或多个组合物相关联的(或换句话说用于产生一个或多个组合物的)一个或多个微生物；和，
e)使用本发明的第一、第八或第九方面的方法的步骤a)中的步骤d)选择的一个或多个微生物。
在相关的方面中，第八(和/或相关的)方面的方法的步骤b)可用使步骤a)的一个或多个培养物灭活，以提供包含一个或多个灭活微生物的一个或多个组合物步骤b)替换，和然后在该方法的步骤c)中使用该组合物。
应当认识到，第一、第七(和/或相关的)和第八(和/或相关的)方面的方法可以任何组合结合，包括方法同时进行或以任何数量的迭代顺序进行，从方法中选择或分离的组合物和/或微生物单独或组合使用并且在任何一种方法的迭代轮回中使用。作为例子，可进行第七(和/或相关的)方面的方法并且选择组合物。组合物的选择指示从步骤b)的培养基分离的一个或多个微生物期望赋予一个或多个植物有益的特性(因为一个或多个微生物能够产生选择的组合物)。一个或多个微生物可然后用于第一方面、第七(和/或相关的)方面或第八(和/或相关的)方面另一轮的方法。可选地，方法的组合可反向进行。这可以任何顺序和组合重复任何次数。所以，本发明提供了通过本发明的获取、选择或分离的一个或多个微生物、组合物或植物在本发明任何其他方法中的用途。
在本发明的第九宽泛方面中，提供了由本发明的第七(和/或相关的)或第八(和/或相关的)宽泛方面获得的组合物。
在本发明的第十宽泛方面中，提供了通过本文之前描述的方法获取、选择或分离的两个或更多个微生物的组合。
在另一方面中，本发明提供了通过本发明的方法获取、选择或隔离的一个或多个组合物和/或微生物赋予一个或多个植物一个或多个有益的特性。
应当认识到，本发明的方法也可涉及第一方面方法的步骤a)至d)应用在两个或更多个不同的植物物种，从而鉴定可同时赋予一个物种正面效果和赋予另一物种负面效果的微生物的组合。例如，人们可希望鉴定可同时改善食物作物的生长和生存和阻止或抑制竞争性作物或杂草生长的一组微生物。这可通过在步骤a)中使用两个或更多个不同的植物物种或对不同物种进行各自的方法和在适当的点结合在那些方法中获取的微生物和进行进一步迭代实现。
本发明也提供了本发明的方法中选择的植物。
本发明也提供了本发明的方法在植物培育程序中的用途，植物培育程序包括进行本发明的方法。
在另一方面中，本发明提供了包含表4中列举的一个或多个微生物的组合物。在一种实施方式中，一个或多个微生物是内生菌。
在另一方面中，本发明提供了包含表3中列举的一个或多个微生物的组合物。
在另一方面中，本发明提供了包含表2中列举的一个或多个微生物的组合物。
在另一方面中，本发明提供了表4中列举的一个或多个微生物或包含其的组合物增加植物生物质的用途。在一种实施方式中，植物是玉米。在一种实施方式中，一个或多个微生物是内生菌。
在另一方面中，本发明提供了表3中列举的一个或多个微生物或包含其的组合物增加一个或多个植物中碳水化合物浓度的用途。在一种实施方式中，一个或多个植物是罗勒。
在另一方面中，本发明提供了表2中列举的一个或多个微生物或包含其的组合物增加植物生物质的用途。在一种实施方式中，一个或多个植物是黑麦草。
本发明也可宽泛地说单独地或总体地由本申请说明书中引用或指示的部分、要素和特征以两个或更多个所述部分、要素或特征的任何或所有组合组成，并且在本文提到整数的情况下——其具有本发明所述领域已知的等价物，这种已知的等价物视为如同单独阐释并入本文。
附图
参考附图，从下述的说明中，在所有其新的方面中应考虑的仅仅作为例子给出的本发明的这些和其他方面变得显而易见，其中：
图1:显示根据本发明的实施方式的系统；
图2:显示本发明实施方式的方法的工艺流程。
优选的实施方式(一个或多个)
下述是概况给出的本发明优选形式的说明。从下文提供的实施例中，进一步阐释本发明。
本发明人已经发现通过使用本发明的方法可容易鉴定能够赋予一个或多个植物一个或多个有益的特性的微生物。方法宽泛地基于使用的植物和微生物群体中存在变异性(比如遗传变异性，或例如表型的变异性)。发明人已经鉴定了该变异性可用于支持选择对植物有用的一个或多个微生物的直接方法和用于鉴定对具体目的有益的具体的植物/微生物组合，和其可能使用常规的技术从未识别。
本发明的方法可用作植物培育程序的一部分。方法除了鉴定能够赋予一个或多个植物一个或多个特性的微生物和/或组合物之外，可允许，或至少帮助选择具有受微生物菌丛影响的具体的基因型/表型的植物。
在一个方面中，本发明涉及选择能够赋予植物一个或多个有益的特性的一个或多个微生物(一个或多个)的方法。应当认识到，如本文引用“植物有益的特性”应宽泛地解释为意思是对于任何具体的目的有益的任何特性，包括可能对人类、其他动物、环境、栖息地、生态系统、经济有益的特性、商业益处，或对任何实体或系统的何其他益处。因此，术语应包括可阻止、降低、或阻碍植物的一个或多个特征，包括抑制、降低或抑制植物的生长或生长速度的特性。可从鉴定对一个或多个植物或改善植物的积极益处的角度，在本文描述仅仅作为例子本发明。但是，应当认识到，本发明同样适于鉴定可赋予植物的负面益处。
这种有益的特性包括但不限于例如：改善的生长、健康和/或生存特征、植物对于目的的适宜性或质量、结构、颜色、化学组合物或特征、味觉、气味、改善的质量。在其他实施方式中，有益的特性包括但不限于例如：降低、压制或抑制鉴定为是杂草的植物的生长；约束植物的高度和宽度至期望的观赏尺寸；限制地面覆盖应用中比如高速路和路边坡和腐蚀控制工程的植物的高度；减缓在草皮应用比如草地、草地保龄球场和高尔夫球场以减少修剪必要的植物的生长；减少观赏开花灌木中的叶子/花之比；调节产生和/或响应于植物信息素(导致增加周围植物团体的单宁酸产生和减少对觅食物种的吸引)。
如本文所使用，“改善的”应宽泛地包括改善在应用本发明之前已经在一个或多个植物中存在的植物的特征，或出现在应用本发明之前一个或多个植物中不存在的特征。作为例子，“改善的”生长应包括植物先前不知道在相关条件下生长的情况下植物的生长。
如本文所使用，“抑制和压制“和类似的术语应宽泛地解释并且不应解释为需要完全抑制或压制，尽管这在一些实施方式中期望的。
为了帮助描述本发明，术语“第一集合的一个或多个微生物“和”第二集合的一个或多个微生物“可在本文中使用，以区分本发明的方法的步骤a)中应用的微生物(一个或多个)的集合或组和步骤c)中获取的微生物(一个或多个)的集合或组。在某些实施方式中，微生物的集合应是不同的；例如，第二集合可以是第一集合的子集，这是由于组合第一集合与植物和然后基于一个或多个选择标准选择一个或多个植物。但是，应当认识到，这可能不总是这种情况并且因此，该术语的使用不应以这种限制的方式解释。
在某些实施方式中，本发明的方法涉及选择能够赋予植物一个或多个有益的特性的一个或多个微生物。如本文下面进一步描述的，这种微生物(一个或多个)可包含在植物中、植物上，和/或植物根围中。因此，在本文提及“从”植物获取第二集合的一个或多个微生物的情况下，除非上下文以其他方式规定，其应包括提及获取植物中、植物上和/或植物根围中包含的第二集合的微生物。为了引用方便，措辞“与……相关联”可同义地用于指植物中、植物上和/或植物根围中包含的微生物(一个或多个)。
宽泛地，方法包括至少下述步骤：a)使一个或多个植物在生长培养基中在存在第一集合的一个或多个微生物的情况下生长；b)步骤a)之后选择一个或多个植物；和c)获取与步骤b)中选择的所述一个或多个植物相关的第二集合的一个或多个微生物。在步骤a)之后，可分别提供和以任何适当的顺序组合一个或多个植物、生长培养基和一个或多个微生物。尤其，本发明提供了迭代方法，其中步骤a)至c)可重复一次或多次，其中步骤c)中获取的一个或多个微生物在方法接下来循环的步骤a)中使用。在一种实施方式中，步骤a)至c)重复一次。在另一实施方式中，步骤a)至c)重复两次。在另一实施方式中，步骤a)至c)重复三次。在另一实施方式中，至少重复步骤a)至c)直到观察到期望的有益的特性。
认识到，在期望的步骤a)至c)重复次数之后，方法可以从步骤c)获取一个或多个微生物集合结束。
应当认识到，方法不需要鉴定步骤c)中获取的群体中的微生物，它们也不需要测定获取的个体微生物或微生物的组合的特性。但是，如果期望，可进行有益的特性的评估、鉴定和/或测定。例如，在一些情况下可优选的是在本发明的方法的最终步骤分离和鉴定微生物，以确定它们商业使用的安全性和满足法规要求。在这种情况下，可进行基因型和/或表型分析。
在一种实施方式中，使用至少两个植物进行步骤a)。在其他实施方式中，使用10至20个植物。在仍其他实施方式中，使用20或更多，50或更多，100或更多，300或更多，500或更多或1000或更多个植物。如本文之前所描述，在本发明的具体的方法中使用两个或更多个植物的情况下，它们不需要是相同品种或物种。例如，在一种实施方式中，其可能期望的是选择可赋予一个植物品种或物种正面效果和赋予另一植物品种或物种负面效果的微生物。
在一种实施方式中，步骤c)中获取两个或更多个微生物的情况下，方法可进一步包括步骤：将两个或更多个微生物分离成个体隔离群，选择两个或更多个个体隔离群，和然后组合选择的两个或更多个隔离群。该可产生在本发明方法结束时获取的微生物的集合。但是，在一种实施方式中，合并的隔离群可然后用于本方法随后轮的步骤a)。作为例子，可组合来自二、三、四、五、六、七、八、九或十个体隔离群。本发明人想到迭代方法，其中步骤a)至c)重复一次或多次，使用分离的这些另外步骤、选择和组合方法的每次重复，或散布或以其他方式结合其中个体隔离群未被选择和组合的方法。
预期这些组合将检测先前未知的、期望的特性促进(比如植物生长)、微生物之间的协同相互作用。使用迭代步骤a)至c)将驱动开始两个或更多个微生物的群体朝向与植物相互作用以赋予期望的特性或特征的微生物。换句话说，该方法允许在植物菌群中富集适当的微生物。
可基于任何适当的选择标准选择个体隔离群。例如，其可以是随机的，其可基于通过实施本发明的方法观察的有益的特性或特性，或其中关于微生物的身份的信息是已知的，其可基于微生物先前已经识别为具有具体的有益的特性。
另外，本发明的两个或更多个方法可分开或平行进行，并且源自每个方法的微生物组合成单个组合物。例如，可进行两个分开的方法，一个方法鉴定能够赋予一个或多个第一有益的特性的微生物，和第二个方法鉴定能够赋予一个或多个第二有益的特性的微生物。分开的方法可涉及鉴定具有相同有益的特性或具有不同有益的特性的微生物。在分开的方法中使用的微生物和植物可以相同或不同。如果期望进一步优化微生物，微生物的单个组合物可施加至一轮或多轮进一步的本发明的方法。可选地，如期望地，微生物的单个组合物可用于赋予植物作物相关的特性，而不必进一步优化。以此方式组合两个或更多个本发明的方法允许选择和组合可通常在具体的环境中根据时间和/或空间分开的的微生物。
在本发明的某些实施方式中，方法可包括使方法的步骤c)中选择的一个或多个植物生长或繁殖，以使与选择的一个或多个植物相关联的第二集合的一个或多个微生物群体生长，所述选择在本发明的方法的结束时，或在使用方法的任何接连重复的步骤a)中的第二集合的一个或多个微生物之后。如果一个或多个植物(以及相关联的微生物)在本发明的方法中生长或繁殖，它们可然后以该形式使用或售卖。可选地，一个或多个微生物可分离自一个或多个植物，或一个或多个植物组织和/或一个或多个植物部分，相关联的微生物可用作本发明任何接连重复中的一个或多个微生物的原始来源，或在方法结束时用于任何其他目的。在一种实施方式中，可获得已经生长或繁殖的一个或多个植物的种子(以及相关联的微生物)并且用作方法的任何接连重复的一个或多个微生物的来源。可选地，如果在本发明的方法结束时获得，种子和相关的微生物可被售卖或用于任何其他目的。
本文下面描述本发明的进一步方法和方面。
微生物
如本文所使用，应宽泛地解释术语“微生物”。其包括但不限于两个原核生物域，细菌和古细菌，以及真核真菌和原核生物。作为例子，微生物可包括蛋白菌(比如假单胞菌、肠杆菌、寡养单胞菌、伯克氏菌、根瘤菌、草螺菌、泛菌、沙雷氏菌、拉恩氏菌、固氮螺菌、固氮根瘤菌、固氮菌、杜杆氏菌(Duganella)、代尔夫特菌、慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhizobiun)、中华根瘤菌和盐单胞菌)、硬壁菌门(比如杆菌、类芽孢杆菌、乳酸菌、支原体、和醋杆菌属)、放线菌(比如链霉菌、红球菌、微杆菌、和短小杆菌)、和真菌子囊菌门(比如木霉属、白粉寄生菌属、盾壳霉属、拟青霉属、青霉菌、枝孢菌、肉座菌、白僵菌、绿僵菌属、轮枝菌、虫草菌、毕赤菌，和念珠菌、担子菌门(比如鬼伞菌、伏革菌属、和落叶松蕈)和卵菌门(比如腐霉属、毛霉属和被孢霉属)。
在尤其优选的实施方式中，微生物是内生菌或体表寄生菌或占据在植物根围的微生物。在一种实施方式中，微生物是种子负载的内生菌。
在某些实施方式中，微生物是不可培养的。该应理解为意思是使用本领域技术人员已知的方法，微生物是已知不可培养的或难以培养。
本发明的方法中使用的微生物(例如，第一集合的一个或多个微生物)可被收集或获得自任何来源或包含在收集自任何来源的材料中和/或与收集自任何来源的材料相关联。
在一种实施方式中，第一集合的一个或多个微生物获得自任何一般的陆生环境，包括其土壤、植物、真菌、动物(包括无脊椎动物)和其他生物群，包括沉积物、水和湖和水的生物群；来自海洋环境，其生物群和沉积物(例如海水、海泥、水生植物、水生无脊椎动物(例如海绵动物)、水生脊椎动物(例如，鱼))；陆生和水生岩石圈(表土和岩石，例如碾碎的地下岩石、砂和粘土)；冰冻圈和其融化的水；大气(例如，过滤的大气灰尘、云和雨滴)；城市、工业和其他人造环境(例如，混凝土上积聚的有机和矿物质材料、路边排水沟、屋顶表面、道路表面)。
在另一实施方式中，第一集合的一个或多个微生物获得自可能有利于选择适当的微生物的来源。作为例子，来源可以是期望其他植物生长，或认为与风土条件相关联的具体环境。在另一实施例中，来源可以是具有一个或多个期望的特征的植物，例如天然生长在具体的环境或在感兴趣的某些条件下生长的植物。作为例子，某些植物可天然生长在砂质土壤或高盐沙地，或在极端温度下，或以非常少的水，或其可抵抗环境中存在的某些害虫或疾病，和其可期望的商业作物在这些条件下生长，尤其，例如，如果它们是在具体的地理位置中唯一可用的条件。通过进一步的实施例，微生物可收集自在这种环境下生长的商业作物，或更具体地收集自在任何具体的环境下生长的作物中最佳展示感兴趣的特征的个体作物植物：例如在生理盐水-限制的土壤中生长的作物中生长最快的植物，或暴露严厉的昆虫损伤或疾病流行病的作物中最少受损的植物，或具有期望数量的某些代谢分子和其他化合物，包括纤维含量、油含量等的植物，或展示期望的颜色、味觉或气味的植物。微生物可收集自感兴趣的植物或感兴趣的环境中存在的任何材料，所述环境包括真菌和其他动物和植物生物群、土壤、水、沉积物，和先前提到的环境的其他要素。
在某些实施方式中，微生物源自先前实施的本发明的方法(例如，方法的步骤c)中获取的微生物)，包括分离自步骤c)中分离的第二集合的微生物的个体隔离群的组合或源自两个或更多个分开实施的本发明的方法的微生物的组合。
尽管本发明不需要提前了解有关具体植物物种的微生物的期望的特性，但是在一种实施方式中，本发明的方法中使用的微生物或微生物的组合可选自基于一些它们对植物可能的或预测的益处的知识而提前存在的个体微生物物种或菌株的收集。例如，微生物可被预测：改善固氮；从土壤有机物质中释放磷酸盐；从无机形式的磷酸盐(例如岩石磷酸盐)释放磷酸盐；在根微球中“固碳”；活在植物的根围中，从而帮助植物从周围的土壤中吸收养分并且然后将这些养分更容易地提供给植物；增加植物根上节的数量并且从而增加每个植物共生固氮细菌(例如根瘤菌物种)的数量和植物固氮的量；引起植物防御应答，比如ISR(诱导系统性抗性)或SAR(系统性获取抗性)，其有助于植物抵抗病原性微生物的侵入和扩散；通过对抗与对于植物生长或健康有害的微生物竞争，或竞争性利用资源，比如养分或空间；改变植物的一个或多个部分的颜色，或改变植物的化学特征，其气味、味觉或一个或多个其他质量。
在一种实施方式中，微生物或微生物的组合(第一集合的一个或多个微生物)选自没有为可能或预测对植物有益处的知识的个体微生物物种或菌株的先前存在的收集。例如，分离自植物组织而没任何改善植物生长或健康的知识的未鉴定的微生物的收集，或收集以研究它们对产生可导致开发药学药物的化合物的潜能的微生物的收集。
在一种实施方式中，微生物分离自其中天然居住的来源材料(例如，土壤、岩石、水、空气、灰尘、植物或其他生物体)。就其在本发明的方法中打算的用途而言，可以任何适当的形式提供微生物。但是，仅仅作为例子，微生物可提供为水悬浮液、凝胶、匀浆、细粒、粉末、淤浆、活的生物体或干燥材料。可以基本上纯的或混合培养物分离微生物。它们可以是浓缩的、稀释的或提供为其中在来源材料中存在的天然浓度。例如，通过将沉淀悬浮在淡水中并且允许沉淀落入底部而分离用于本发明的来自生理盐水沉积物的微生物。可在适当的时间的沉淀之后通过倾析去除包含大量微生物的水并且直接施用至植物生长培养基，或通过过滤或离心浓缩，稀释至适当的浓度和施加至植物生长培养基，去除了大量的盐。作为进一步的实施例，来自矿化的或毒性来源的微生物可被类似地处理，以回收微生物用于应用至植物生长材料，以使对植物的损伤可能性最小化。
在另一实施方式中，微生物(包括第一集合的一个或多个微生物和/或第二集合的一个或多个微生物)以粗糙形式使用，其中它们不与它们天然居住的来源材料分离。例如，结合它们居住的来源材料提供微生物；例如，作为土壤，或植物的根、种子或叶子提供。在该实施方式中，来源材料可包括微生物的一个或多个物种。
优选地，本发明的方法使用微生物的混合群体。
在微生物与来源材料(例如，它们天然居住的材料)分离的本发明的实施方式中，可使用技术人员容易知道的任何一个标准技术或许多标准技术的组合。但是，作为例子，这些一般而言采用下述方法：通过其可以基本上纯的形式获得单个微生物的固体或液体培养物，通常通过在固体微生物生长培养基表面上的物理分离或通过体积稀释分离进入液体微生物生长培养基。这些方法可包括从干燥材料、液体悬液、淤浆或匀浆中分离，其中材料以薄层在适当的固体凝胶生长培养基上扩散，或将材料连续稀释进入无菌培养基并且接种至液体或固体培养基。
尽管不是必须的，但是在一种实施方式中，包含微生物的材料可在分离方法之前被预处理，从而使材料中的所有微生物增殖，或选择部分微生物群体，通过用微生物养分(例如，硝酸盐、糖或蔬菜，微生物或动物提取物)富集材料，或通过应用一种方式确保仅仅一部分材料中多样的微生物选择性生存(例如，通过在60℃-80℃使样品巴士德消毒10-20分钟，以选择抵抗热暴露的微生物(例如，杆菌)，或通过将样品暴露于低浓度的有机溶剂或消毒剂(例如，25％乙醇10分钟)，以增强放线菌和形成孢子的或抵抗溶剂的微生物的生存)。然后可从如上述富集的材料或处理用于选择性生存的材料分离微生物。
在本发明优选的实施方式中，从植物材料分离内生菌或附生的微生物。可使用本领域已知的任何数量的标准技术并且微生物可分离自任何植物中的适当的组织，包括例如根、茎和叶，以及植物生殖组织。作为例子，从植物分离的常规方法通常包括无菌切除感兴趣的植物材料(例如根或茎长度、叶)、用适当的溶液(例如2％次氯酸钠)的表面消毒，其后将植物材料放置在用于微生物生长的养分培养基上(见，例如，Strobel G和Daisy B(2003)微生物内生菌的生物勘探和它们的天然产品(Bioprospecting for microbialendophytes and their natural products)，Microbiology and Molecular BiologyReviews 67(4)：491-502；Zinniel DK等(2002)来自农业作物和牧场植物的内生菌克隆细菌的分离和表征(Isolation and characterisation of endophytic colonisingbacteria from agronomic crops and prairie plants)，Applied and EnvironmentalMicrobiology 68(5)：2198-2208)。在本发明一种优选的实施方式中，微生物分离自根组织。本文下面详述了从植物材料分离微生物的进一步的方法。
如本文所使用，“分离”、“分离的”和类似的术语应被宽泛地解释。这些术语旨在意思是一个或多个微生物(一个或多个)已经被至少部分从与其相关联的具体环境(例如土壤、水、植物组织)的至少一种材料分离。“分离”、“分离的”和类似的术语不应指示微生物(一个或多个)已经被纯化的程度。
如本文所使用，“个体隔离群”应理解为意思是与一个或多个其他微生物分离之后，主要包含微生物的单个属、物种或菌株的组合物或培养物。短语不应指示微生物已经被分离或纯化的程度。但是，“个体隔离群”优选地基本上包含微生物的仅仅一个属、物种或菌株。
在一种实施方式中，微生物群体暴露于(在方法之前或在方法的任何阶段)选择压力，以增强最终选择的植物具有可能具有期望的特性的微生物聚集的概率。例如，将微生物暴露于巴士德消毒，然后将它们添加至植物生长培养基(优选地无菌的)可能提高为期望的特征选择的植物与形成孢子的微生物相关联的概率，其在不利条件下、在商业储存下，或如果作为包衣施加至种子在不利环境下可能更容易生存。
应当认识到，本发明的方法步骤c)获取的第二集合的微生物可使用本领域已知的任何适当的技术分离自植物或植物材料、与选择的植物相关联的地表或生长培养基，所述技术包括但不限于本文所述的那些技术。但是，在某些实施方式中，如本文之前提到的，微生物(一个或多个)可以粗糙形式使用并且不需要与植物或培养基分离。例如，可获得包括鉴定为对选择的植物有益的微生物的植物材料或生长培养基并且用作微生物的粗来源，用于下一轮的方法或在方法结束时作为微生物粗来源。例如，可获得完整植物材料并且任选地处理，比如覆盖或碾碎。可选地，可从植物分离个体组织或部分选择的植物(比如叶、茎、根和种子)并且任选地处理，比如覆盖或碾碎。在某些实施方式中，可从一个或多个选择的植物去除与第二集合的一个或多个微生物相关联的一个或多个部分的植物，并且在进行方法的任何接连重复的情况，嫁接在步骤a)中使用的一个或多个植物上。
本文可从分离自来源材料的第二集合的一个或多个微生物角度描述本发明的方法。但是，除非上下文以其他方式规定，这也应理解包括提及以它们还未与来源材料分离的粗制形式的微生物的使用。
植物
任何数量的多种不同植物，包括苔藓植物和地衣和藻类，可用于本发明的方法。在优选的实施方式中，植物具有经济、社会和/或环境价值。例如，植物可包括用作下述的那些：食物作物、纤维作物、油料作物、森林工业中使用的、纸浆和纸工业、用于生物燃料产生的进料、和/或观赏植物。在其他实施方式中，植物可以是经济、社会和/或环境非期望的，比如杂草。下面列举了可施用本发明的方法的植物类型的非限制例子：
食物作物：
-谷物(玉米、水稻、小麦、大麦、高粱、小米、燕麦、黑麦、黑小麦、荞麦)；
-叶菜(十字花科植物比如卷心菜、西兰花，白菜、麻菜；色拉用绿叶蔬菜比如菠菜、水芹、莴苣)；
-果实和开花蔬菜(例如鳄梨、甜玉米、洋蓟、葫芦例如南瓜、黄瓜、西瓜、绿皮南瓜，小南瓜；solononaceous蔬菜/水果例如番茄、茄子、辣椒)；
-结荚蔬菜(花生、花生米、豌豆、黄豆、大豆、扁豆、鹰嘴豆、秋葵)；
-球茎蔬菜和茎蔬菜(天门冬属，芹菜，葱属作物例如大蒜、洋葱、韭菜)；
-根和块茎蔬菜(胡萝卜、甜菜、竹笋、木薯、山药、姜、洋姜、防风草、萝卜、马铃薯、红薯、芋头、萝卜、山葵)；
-糖作物包括糖甜菜(beta vulgaris)、甘蔗(Saccharum officinarum)；
-生长用于生产非酒精性饮品和刺激剂的作物(咖啡、红茶、花草茶和绿茶、可可、烟草)；
-水果作物比如浆果水果(例如奇异果、葡萄、小葡萄干、鹅莓、番石榴、费约果、石榴)，柑桔水果(例如柑橘、柠檬、青柠、葡萄柚)，上生水果(例如香蕉、蔓越橘、蓝莓)，聚集水果(黑莓、树莓、杂交草莓)，复果(例如菠萝、无花果)、核果作物(例如杏、桃、樱桃、李子)，果仁-水果(例如苹果、梨)和其他的比如草莓、向日葵种子；
-烹调用和药用草本植物例如迷迭香、罗勒、月桂树、胡荽、薄荷、莳萝、金丝桃、毛地黄、芦荟(alovera)、玫瑰果)；
-产生香料的作物植物例如黑胡椒、孜然肉桂、肉豆蔻、姜、丁香、番红花、小豆蔻、豆蔻香料、辣椒粉、马沙拉、八角茴香；
-生长产生坚果的作物例如杏仁和核桃、巴西坚果、腰果、椰子、栗子、澳洲坚果、开心果；花生、山核桃；
-生长生产啤酒、葡萄酒和其他酒精饮品的作物例如葡萄、啤酒花；
-含油种子作物例如大豆、花生、棉花、橄榄、向日葵、芝麻、羽扇豆物种和芸苔属作物(例如菜籽/油菜籽)；和，
-可食用真菌例如白蘑菇、香菇和平菇；
草地农业中使用的植物：
-豆科植物：三叶草属物种、苜蓿物种和荷花物种；白三叶(T.repens)；红三叶草(T.pratense)；高加索三叶草(T.ambigum)；地三叶(T.subterraneum)；苜蓿/紫花苜蓿(Medicago sativum)；一年生苜蓿；桶苜蓿、黄花苜蓿；红豆草(Onobrychis viciifolia)；牛角花三叶草(Lotus corniculatus)；大牛角花三叶草(Lotus pedunculatus)；
-种子豆科植物/干豆包括豌豆(Pisum sativum)，菜豆(Phaseolus vulgaris)、蚕豆(Vicia faba)，绿豆(Vigna radiata)，豇豆(Vigna unguiculata)，嘴豆(Cicerarietum)，羽扇豆(Lupinus物种)；
-谷物包括玉米/玉米(Zea mays)，高粱(Sroghum spp.)、小米(Panicummiliaceum，P.sumatrense)、水稻(Oryza sativa indica，Oryza sativa japonica)、小麦(Triticum sativa)、大麦(Hordeum vulgare)、黑麦(Secale cereale)、黑小麦(TriticumX Secale)，燕麦(Avena fatua)；
-饲料和美化草：温带草比如黑麦草属物种；羊茅属物种；剪股颖属，多年生黑麦草(Lolium perenne)；杂交黑麦草(Lolium hybridum)；一年生黑麦草(Loliummultiflorum)，牛尾草(Festuca arundinacea)；草原羊茅(Festuca pratensis)；红狐茅(Festuca rubra)；羊茅(Festuca ovina)；Festuloliums(Lolium X Festuca杂交)；鸭茅(Dactylis glomerata)；肯塔基蓝草草地早熟禾(Poa pratensis)；泽地早熟禾(Poapalustris)；林地早熟禾(Poa nemoralis)；普通早熟禾(Poa trivialis)；Poa compresa；雀麦属物种；虉草属(梯牧草属物种)；燕麦草(Arrhenatherum elatius)；冰草属物种；Avena strigosa；小米(Setaria italic)；
-热带草比如：虉草属物种；臂形草属物种；Eragrostis物种；黍属物种；Bahai草(Paspalumnotatum)；Brachypodium物种；和，
-用于生产生物燃料的草，比如柳枝稷(Panicum virgatum)和芒草物种；
纤维作物：
-棉花、大麻、黄麻、椰子、剑麻、亚麻(亚麻属)、新西兰亚麻(Phormium spp.)；收获的用于纸和工程化的木材纤维产品的栽植和天然森林物种，比如松柏科和阔叶森林物种；
用于栽植森林和生物燃料作物的树木和灌木物种：
-松树(Pinus物种)；冷杉(Pseudotsuga物种)；云杉(Picea物种)；柏树(Cupressus物种)；金合欢树(阿拉伯胶物种)；赤杨木(Alnus物种)；橡树物种(Quercus物种)；红杉(Sequoiadendron物种)；柳树(柳树物种)；桦树(Betula物种)；雪松(Cedurus物种)；水曲柳(Fraxinus物种)；落叶松(落叶松属物种)；桉树属物种；竹(Bambuseae物种)和白杨木(Populus物种)。
通过提取、生物、物理或生物化学处理生长用于转化能量、生物燃料或工业产品的 植物：
-产油植物，比如油棕、麻疯树、大豆、棉花、亚麻籽；
-产乳胶植物，比如橡胶树Heveabrasiliensis和橡胶树Castillaelastica；
-用作直接或间接进料的植物，用于生产生物燃料即生产生物燃料期间，化学、物理(例如热或催化)或生物化学(例如酶预处理)或生物(例如微生物发酵)转化之后，工业溶剂或化学产品，例如乙醇或丁醇、丙二醇，或其他燃料或工业材料，包括糖作物(例如甜菜、甘蔗)、产淀粉作物(例如C3和C4谷类作物和块茎作物)、纤维素作物比如森林树木(例如古松、桉树)和草本和禾本植物，比如竹子、柳枝稷、芒草；
-用于经气化和/或微生物或催化转化气体至生物燃料或其他工业原料比如溶剂或塑料，产生或不产生生物碳的能量、生物燃料或工业化学产生的作物(例如生物质作物比如松柏科、桉树、热带或阔叶森林树木、草本和禾本作物比如竹子、柳枝稷、芒草、甘蔗、或大麻或软木比如白杨、杨柳；和，
-用于产生生物碳的生物质作物；
产生用于药学、农业功能食物和药用化妆品工业的天然产品的作物：
-产生药学前体或化合物或功能食物和药用化妆品化合物和材料的作物例如，八角茴香(莽草酸)、虎杖(白藜芦醇)、奇异果(可溶性纤维、蛋白水解酶)；
生长使用它们的美学或环境特性的花卉、观赏和市容植物：
-花，比如玫瑰、郁金香、菊花；
-观赏灌木，比如黄杨、赫柏、蔷薇、杜鹃花、常春藤
-市容植物，比如法国梧桐、墨西哥桔、虎耳草、鼬瓣花属、苔属植物
-苔藓植物比如泥炭藓
生长用于生物修复的植物：
-向日葵属、芸苔属、柳树、杨树、桉树属
应当认识到，可以种子、秧苗、插条、繁殖体或任何其他能够生长的植物材料或组织的形式提供植物。在一种实施方式中，种子可用材料比如次氯酸钠或氯化汞表面-杀菌，以去除表面-污染微生物。在一种实施方式中，繁殖体在无生物培养物中生长，然后放置在植物生长培养基中，例如作为组织培养物中的无菌苗木。
生长培养基
术语“生长培养基”如本文所使用，应宽泛地意思是适于植物生长的任何培养基。作为例子，培养基可以是天然的或人工的，包括但不限于土壤、栽培混合土、树皮、蛭石、单独的水培溶液并且施加至固体植物支持系统，和组织培养物凝胶。应当认识到，培养基可单独使用或结合一个或多个其他培养基使用。也可在添加或不添加外源性养分和用于根和叶子物理支持系统的情况下使用。
在一种实施方式中，生长培养基是天然存在的培养基比如土壤、沙子、泥浆、粘土、腐殖质、表土、岩石或水。在另一实施方式中，生长培养基是人工的。可构建这种人工生长培养基，以模仿天然存在的培养基的条件，但是，该不是必须的。人工生长培养基可由包括沙子、矿物质、玻璃、岩石、水、金属、盐、养分、水的材料的任何数目的一个或多个和组合制造。在一种实施方式中，生长培养基是无菌的。在另一实施方式中，生长培养基不是无菌的。
培养基可用另外化合物或组分改进或浓缩，所述组分例如，可参与特异性微生物组与植物以及彼此的相互作用和/或选择。
在本发明的某些实施方式中，可预处理生长培养基，以帮助某些微生物的生存和/或选择。例如，可通过在富集培养基中孵育，预处理培养基，以鼓励可存在于其中的内源微生物增殖。例如进一步实施例，可通过在选择性培养基中孵育，预处理培养基，以鼓励特异性微生物组的增殖。进一步的实施例包括正在预处理以去除微生物装配体其中的具体元件的生长培养基；例如，巴氏消毒(以去除形成孢子的细菌和真菌)或用有机溶剂比如各种醇类处理，以去除对这些材料敏感的微生物但是允许例如放线菌和形成孢子的细菌生存。
可通过提供信息关于微生物一致性或存在的微生物组的培养物非依赖性微生物团体成形技术，得到预处理或富集方法。这些方法可包括但不限于，包括高通量测序的测序技术和系统发生分析，或编码rRNA操纵子组件的核酸的基于微阵列的筛选或其他分类学上有益的基因座。
生长条件
使根据本发明的方法一个或多个植物经受一个或多个微生物和生长培养基。在存在一个或多个微生物(一个或多个)和生长培养基的情况下，植物被优选地生长或允许增殖。(一个或多个)微生物可在没有添加其他微生物的生长培养基天然中，例如在天然土壤中存在。生长培养基、植物和微生物可以任何适当的顺序合并或彼此接触。在一种实施方式中，将植物、种子、秧苗、插条、繁殖体等等种植或播种至先前用一个或多个微生物接种的生长培养基。可选地，一个或多个微生物可施加至植物、种子、秧苗、插条、繁殖体等等，其然后种植或播种至生长培养基(其可包含或不包含其他微生物)。在另一实施方式中，植物、种子、秧苗、插条、繁殖体等等首先种植或播种至生长培养基，允许生长，和在稍后的时间一个或多个微生物施加至植物、种子、秧苗、插条、繁殖体等等和/或生长培养基本身用一个或多个微生物接种。
微生物可施加至植物、秧苗、插条、繁殖体等等和/或生长培养基使用本领域已知的任何适当的技术。但是，作为例子，在一种实施方式中，一个或多个微生物通过喷雾或撒粉施加至植物、秧苗、插条、繁殖体等等。在另一实施方式中，微生物直接施加至种子(例如作为包衣)然后播种。在进一步的实施方式中，微生物或来自微生物的孢子配制成颗粒剂并且在播种期间与种子一起施加。在另一实施方式中，微生物可通过切割根或茎并且将植物表面通过喷雾、浸渍或以其他方式施用液体微生物悬液或凝胶或粉末暴露于微生物接种至植物。在另一实施方式中，微生物(一个或多个)可直接注入叶或根组织，或以其他方式直接接种至叶或根伤口或其上，或否则进入离体的胚芽，或幼根或胚芽鞘。这些接种植物可然后进一步暴露于包含进一步微生物的生长培养基，但是，这不是必须的。在某些实施方式中，微生物施加至植物、秧苗、插条、繁殖体等等和/或与植物材料相关的生长培养基(例如，与微生物相关的植物材料)。
在其他实施方式中，尤其微生物是不可培养的情况下，微生物可通过下述的任何一种或组合转移至植物：嫁接、外植体的插入、吸气、电穿孔、创伤、根系修剪、气孔的诱导或提供微生物进入植物细胞或细胞间空间机会的任何物理、化学或生物处理。本领域技术人员可容易认识到，可使用许多可选的技术。
应当认识到，当在方法接连重复的步骤a)中使用时，这些技术同样适于第一集合的一个或多个微生物和第二集合的微生物的应用。
在一种实施方式中，微生物渗入部分植物，比如根、茎、叶和/或生殖植物部分(变成内生菌)，和/或在根、茎、叶和/或生殖植物部分的表面上生长(变成附生的)和/或在植物根围中生长。在优选的实施方式中，微生物(一个或多个)与植物形成共生关系。
如本领域技术人员认识到，取决于植物物种，可改变使用的生长条件。但是，作为例子，对于三叶草，在生长室中人们通常使植物在包含约1/3泥煤形式的有机物质、1/3堆肥和1/3筛选浮石粉，补充通常包含硝酸盐、磷酸盐、钾盐和镁盐和微量营养素的化肥并且pH在6和7之间的土壤中生长。植物可在22-24℃之间的温度下以16:8的日光：黑暗时间生长，并且自动浇水。
例如，在主要播种在北半球的冬小麦品种的情况下，选择在将种子暴露于包含微生物的生长培养基中在与北半球的冬小麦种子经历的那些类似的光和温度的条件下展示早分蘖的植物是重要的，因为早分蘖是与冬天生存、生长和夏天最终颗粒产率相关的特征。或，可选择在4-6个月为改善的生长和健康的树木物种，因为这些特征与使用本发明不切实际的时间产品开发的10年后树木的健康和生长速度和尺寸相关。
选择
典型地，在存在一个或多个微生物的情况下一个或多个植物生长后，基于一个或多个选择标准选择一个或多个植物。在一种实施方式中，基于一个或多个表型特征，选择植物。技术人员容易认识到，这种特征包括植物的任何可观察的特征，包括例如生长速度、高度、重量、颜色、味觉、气味、通过植物的一个或多个化合物的生产改变(包括例如，代谢分子、蛋白质、药物、碳水化合物、油和任何其他化合物)。基于遗传信息选择植物的也被设计(例如，包括对微生物响应的植物基因表达的模式、基因型、存在基因标记物)。应当认识到，在某些实施方式中，可基于与某些特征或特征(比如期望的特征或特征)相对的某些特征或特征(比如非期望的特征或特征)的缺乏、抑制或阻止，选择植物。
评估一个或多个基因标记物存在时，一个或多个标记物可以已经已知和/或与植物的具体特征关联；例如，与增加的生长速度或代谢物特征关联的标记物或标记物。该信息可与基于本发明的方法中的其他特征的评估组合使用，以选择可被期望的不同植物特征的组合。这种技术可用于鉴定新的QTLs，所述QTLs将期望的植物特征与具体微生物菌丛相连接–例如将植物基因型与菌群类型匹配。
作为例子，可基于如本文前面所描述的生长速度、尺寸(包括但不限于重量、高度、叶尺寸、茎尺寸、分叉模式或植物的任何部分的尺寸)、一般健康和生存，以及其他特征，选择植物。进一步的非限制性实施例包括基于下述选择植物：种子萌发速度；产生的生物质的量；增加的根，和/或导致产率(草或颗粒或纤维或油)增加的叶/新芽(shoot)生长或生物质产生；对导致作物种子产率增加的植物生长的作用，所述作物可尤其与谷类作物比如小麦，大麦，燕麦，黑麦、玉米，水稻，高粱，含油种子作物比如大豆，油菜，棉花，向日葵，和种子豆科植物比如豌豆，大豆相关；对导致油产率增加的植物生长的作用，所述油可尤其与油种子作物比如大豆，油菜，棉花，麻疯树和向日葵相关；对导致(例如在棉花、亚麻和亚麻籽中的)纤维产率增加的植物生长的作用或导致作物比如马铃薯和糖甜菜中块茎产率增加的作用；对导致生物质消化率增加的植物生长的作用，所述生物质可尤其与饲料作物比如饲料豆科植物(苜蓿、三叶草、苜蓿)、饲料草(黑麦草属物种；羊茅属物种；雀稗属物种；臂形草属物种；画眉草属物种)，用于青贮饲料比如玉米和饲料谷物(小麦、大麦、燕麦)的生长的饲料作物相关；对导致水果产率增加的植物生长的作用，所述水果可尤其与果仁水果树(比如苹果，梨等等)、浆果类水果(比如草莓、覆盆子、蔓越橘)、核果(比如油桃、杏)，和柑桔水果、葡萄、无花果、坚果树相关；对植物生长的作用，其导致对疾病包括真菌、病毒或细菌疾病或害虫，比如昆虫、螨虫或线虫增加的抗性或耐受，其中由减少的叶症状，比如细菌或真菌损害的发病的损伤，或损伤叶子的面积，或植物根线虫囊肿或擦伤数量的减少是可测量的，或改善在存在植物害虫和疾病的情况下植物产率；对植物生长的作用，其导致增加代谢物产率，例如生长用于药学、功能食物或药用化妆品目的的植物中，其可尤其与植物，比如生长用于产生莽草酸的八角茴香，其对于生产抗流感药物奥司他韦是关键的，或产生用于提取白藜芦醇的虎杖，或产生来自奇异果的可溶性纤维和膳食酶产品，或例如增加“浓缩的单宁酸”或用于抑制产生温室气体比如牧草动物中的甲烷的其他代谢分子的产率；对植物生长的作用，其改善可在植物生长中对它们的形态、颜色或味觉，例如颜色强度和观赏花的形态、水果或蔬菜的味觉，或来自用微生物处理的葡萄树的葡萄酒的味觉尤其重要的的美学吸引；和，对植物生长的作用，其导致改善的被生长用于生物修复目的的植物吸收或解毒的毒性化合物的浓度。
基于表型或遗传信息选择植物可使用下述技术进行，比如，但不限于：植物起源的化学组分的高通量筛选、测序技术，包括遗传物质的高通量测序，差分显示技术(包括DDRT-PCR，和DD-PCR)、核酸微阵列技术、RNA-seq(全转录组鸟枪测序)、qRT-PCR(定量实时PCR)。
在本发明的某些实施方式中，可期望选择植物特征的组合。这可以许多方式实现。在一种实施方式中，保持多轮的迭代改善一个特征，例如优势的生长，直到获得可接受水平的生长。类似地，但是进行完全分开轮的选择，以鉴定可赋予至少不同期望的特征，例如改善的花颜色的微生物。这种分开轮的选择可使用迭代或堆积方法进行或可使用方法的组合，来自那些分开轮或方法的微生物组合在单个组合物中。此时，微生物(一个或多个)可开发成包含分开发酵微生物的组合产品，其每个显示改善不同植物特性。在进一步的实施方式中，分开选择的微生物集合可组合在两个或更多个集合中并且用在本发明的进一步方法中。在另一实施方式中，分开选择的微生物组可分成个体隔离群并且然后个体隔离群组合在两个或更多个集合中并且用在本发明的进一步方法中。在一种实施方式中，组合的微生物以相同的迭代循环施加至植物和/或生长培养基。例如，在一种组合中，能够改善植物生长的微生物与能够增强化颜色的微生物结合。然后，将组合的微生物添加至植物生长培养基，其中植物在适当的条件下生长适当的时间。评估生长的程度和化颜色并且分离自最佳表现植物的微生物用于接下来的迭代。可进行类似的迭代轮，直到获得可接受水平的植物生长和花颜色。该方法帮助选择协同改善植物性能的微生物；作为非限制实施例，改善植物生长和花颜色至比如果微生物简单地作为两个分开选择的集合的组合施加更好的实现。
收获
选择之后，收获一个或多个植物并且可检查植物组织，以检测与植物形成关联的微生物(例如，内生菌，附生的或根际关联)。
本文所描述的技术可用于在本发明的方法结束时，或用于本发明的方法的任何接连重复中获取第二集合的微生物。
一个或多个微生物可分离自任何适当的选择的植物组织；例如，全植物、叶组织、茎组织、根组织和/或种子。在优选的实施方式中，微生物分离自选择的一个或多个植物的根组织、茎或叶组织和/或种子。
在本发明的某些实施方式中，可以粗制形式获取微生物，其中它们不与它们居住的来源材料分离(比如植物组织或生长培养基)。
在进行微生物的分离时，它们可使用本领域已知的任何适当的方法分离自植物。但是，作为例子，用于分离内生菌微生物的方法可包括无菌切除感兴趣的植物材料(例如根、茎长度、种子)，用适当的溶液(例如2％次氯酸钠)表面消毒，其后将植物材料放置在养分培养基上，用于微生物生长，尤其丝状真菌。可选地，表面杀菌的植物材料可被在无菌液体(通常水)中碾碎并且包括小片碾碎植物材料的液体悬液扩散在适当的固体琼脂培养基，或培养基的表面，其可以是选择性的或不是选择性(例如仅仅包含肌醇六磷酸作为磷源)。该方法尤其用于形成分离菌落的细菌和酵母，并且可被单独挑取至各自养分培养基平板，并且通过熟知的方法进一步纯化至单个物种。可选地，植物根或叶子样品可不被表面杀菌，而是仅仅轻轻冲洗，因此分离步骤中包括表面居住的附生的微生物，或附生的微生物可分开分离，通过压印和留下植物根、叶茎在琼脂培养基的表面上并且然后如上分离个体菌落。该方法尤其用于例如细菌和酵母。可选地，根可被处理，而不冲洗小量的连接至根的土壤，因此包括居住在植物根围的微生物。否则，附着至根的土壤可去除、稀释和扩散在适当的选择性和非选择性培养基的琼脂上，以分离根际微生物的个体菌落。进一步示例性方法可见：Strobel G和Daisy B(2003)微生物内生菌的生物勘测和它们的天然产品(Bioprospectingfor microbial endophytes and their natural products)，Microbiology andMolecular Biology Reviews67(4)：491-502；Zinniel DK等(2002)来自农作物和牧场植物的内生菌细菌的分离和表征(Isolation and characterisation of endophyticcolonising bacteria from agronomic crops and prairie plants)，Applied andEnvironmental Microbiology 68(5)：2198-2208；环境微生物学手册(Manual ofEnvironmental Microbiology)，Hurst等，ASM Press，WashingtonDC。
可通过提供关于给定样品中存在的微生物身份和活性的信息的培养物非依赖性群体成形技术获知分离的方法。这些方法可包括，但不限于，包括高通量测序的测序技术和系统发生分析，或基于微阵列的筛选编码rRNA操纵子或其他分类学信息基因座的组分的核酸。
在其中两个或更多个微生物分离自植物材料和然后分成个体隔离群的本发明的实施方式中，可使用任何适当的方法用于彼此分离一个或多个微生物。但是，作为例子，从植物材料制备的微生物提取物可扩散在琼脂平板上，在适当的温度下生长适当的时间段，并且所得微生物菌落随后适当的培养基中选择和生长在(例如，划线在新鲜平板上或生长在液体培养基中)。可基于形态或如本领域理解的任何其他适当的选择标准选择菌落。通过进一步的例子，可使用选择性培养基。
可从植物(包括如本文之前所描述的根围)在任何适当的时间点收获一个或多个微生物(包括分离形式的或粗糙形式)。在一种实施方式中，在植物发芽之后的任何时间收获它们。例如，它们可从发芽之后的时间分离(其中发芽之后前几天的生存是有问题的，例如具有细菌和真菌根和茎腐病)，然后在之后的任何阶段，这取决于生长植物的要求，从而显现确保其从植物群体中选择的可辨别的益处(例如，区分是200个植物的前10个)。
本发明人(一个或多个)已经观察到不同的微生物可与在不同植物生命阶段的植物相关联。因此，在不同的时间点收获植物可导致选择不同群体的微生物。这种微生物可在其生命的关键时间对改善植物条件、生存和生长尤其有益。
在本发明的另一实施方式中，在与允许从一代或繁殖体向下一代垂直传递的植物形成关系的微生物(例如种子-内生菌或-附生的关联，或内生菌和与生长繁殖的植物/繁殖体附生的关联)的情况下，微生物可不与植物(一个或多个)分离。在本发明的方法结束时，目标或选择的植物本身可通过种子或生长繁殖(以及相关联的微生物)，以赋予下一代或繁殖阶段的“子”植物好处(一个或多个)。类似地，当期望方法的接连重复时，包括一个或多个微生物集合的植物材料(全植物、植物组织、部分植物)可用于任何接连重复的步骤a)。
堆叠
本发明人(一个或多个)想到通过在本发明方法的重复轮中堆叠植物的选择(或选择标准)的方式获得优势。这可允许获取可帮助植物具有例如许多不同期望的特征的微生物的群体。
在本发明的该实施方式中，如先前描述从选择的一个或多个植物获取的一个或多个微生物，用于方法的第二轮或循环。在第一轮中，可基于生物质选择一个或多个植物。在第二轮中，可基于具体化合物的产生选择一个或多个植物。从方法的第二轮分离的微生物可然后用于随后的轮等等。如果期望的或适当的，在方法的连续轮中可采用任何数量的不同选择标准。
在一种实施方式中，在方法的每次重复中采用的选择标准是不同的。但是，在本发明的其他实施方式中，在每轮中采用的选择标准可以相同。其可也以相同，但是每轮采用不同的强度。例如，选择标准可以是纤维水平并且方法的连续轮中，可增加对于待选择的植物要求的纤维水平。连续轮中选择标准可以线性、阶梯或曲线的方式增加或下降。
也应认识到，在本发明的某些实施方式中，一个或多个微生物(一个或多个)与允许从一代或繁殖体向下一代垂直传递的植物形成内生菌或附生的关系的情况下，微生物不需要与植物(一个或多个)分离。在本发明的方法结束时，目标或选择的植物本身可通过种子或生长繁殖(以及相关联的微生物)，以赋予下一代或繁殖阶段的“子”植物好处(一个或多个)。类似地，期望方法的接连重复的情况下，包括一个或多个微生物集合的植物材料(全植物、植物组织、部分植物)可用于接连重复的步骤a)。
应进一步认识到，两个或更多个选择标准可用于方法的每次迭代。
微生物和包含其的组合物
除了本文之前所描述的方法，本发明涉及通过这种方法选择、获取或分离的微生物，以及包括这种微生物的组合物。在其最简单的形式中，包含一个或多个微生物的组合物包括活微生物的培养物，为活的状态但是不活动状态的微生物(一个或多个)，包括冷冻的、冻干的或干燥培养物。但是，组合物可包括其他成分，如下面所讨论。
本发明应也理解为包括支持植物生长、质量和/或健康的组合物或阻止或抑制植物生长、质量和/或健康的组合物的产生，该方法包括本文之前描述的方法的步骤和使一个或多个微生物与一个或多个另外成分组合的另外步骤。
“支持植物生长、健康和/或质量的组合物”应宽泛地理解为包括可帮助植物生长、一般健康和/或生存植物的条件，或帮助保持或促进任何期望的特征、质量和/或特征的组合物。其应包括保持或改变植物的一个或多个代谢物或其他化合物的产生，以及改变基因表达等。短语不应理解为暗示组合物本身能够支持植物生长、质量和/或健康。但是，在一种实施方式中，组合物适于该目的。本发明该方面的示例性组合物包括但不限于植物生长培养基、植物矿物质补充物和微量营养素、堆肥、化肥、盆栽混合土、农药、杀菌剂、抗感染或害虫和疾病侵扰的培养基、组织培养基、种子包衣、水培培养基、赋予干旱或非生物压力比如金属毒性耐受的组合物、改良土壤pH的组合物。
“抑制或阻止植物生长、健康和/或质量的组合物”应宽泛地理解为包括可帮助抑制或压制植物的一个或多个特征、质量和/或特性的组合物，包括其生长，一般健康和/或生存。其应包括保持或改变植物的一个或多个代谢物或其他化合物的产生，以及改变基因表达等。短语不应理解为暗示组合物本身能够阻止或抑制植物生长、质量和/或健康。但是，在一种实施方式中，组合物不适于该目的。本发明该方面的示例性组合物包括但不限于植物生长抑制培养基、除草剂、化肥、盆栽混合土、植物矿物质补充物和微量营养素、堆肥、混合、农药、杀菌剂、组织培养基、种子包衣、水培培养基、赋予干旱或非生物压力比如金属毒性耐受的组合物、改良土壤pH的组合物。
考虑待制备的组合物的性质、待使用的微生物和/或递送组合物至植物或其环境的方法，技术人员容易认识到可结合一个或多个微生物的另外成分的类型。但是，作为例子，成分可包括液体和/或固体载体、微生物防腐剂、诱导具体代谢活性的微生物激活剂、延长微生物生命的添加剂(比如凝胶和粘土)，湿润的粉末、粒状载体、土壤、砂、已知对微生物生存和生长以及植物的一般健康有益的试剂、泥煤、有机物质、有机和无机填充剂、其他微生物、湿润剂、有机和无机养分和矿物质。
考虑待使用成分的性质，可使用标准方法制备这种组合物。
由本发明的方法开发的组合物可通过本领域技术人员已知的任何数量的方法施加至植物。这些包括例如：喷雾、灰尘、颗粒剂、种子包衣、施用时的种子喷雾或撒粉、在包含适当的浓度的组合物的床中使种子发芽然后秧苗的发芽和种植、播种或种植期间挨着种子或植物施加的小颗粒或颗粒剂，或通过比如直接钻孔的方法施加至现存的作物、通过将切割表面或繁殖体浸渍在液体中或在种植之前使微生物基质粉末化，施加至植物插条或其他植物繁殖体、在作物的播种或种植之前或之后，作为喷雾、灰尘、颗粒剂或堆肥组合物形式的“土壤处理”施加至土壤，其可与或不与植物化肥一起施用、施加至水培生长培养基、在无污染条件下经注射组合物或以其他方式经这种组织的切口接种接种至植物组织，用于随后与延伸至种子的植物建立内生菌关系，或繁殖的组织，使得植物可经常规的农业实践繁殖，以及内生菌微生物为植物提供了益处(一个或多个)。
在一种实施方式中，本发明提供包含表4中列举的一个或多个微生物的组合物。在另一实施方式中，本发明提供包含表3中列举的一个或多个微生物的组合物。在另一实施方式中，本发明提供包含表2中列举的一个或多个微生物的组合物。
产生可选组合物的方法
当培养微生物时，它们可产生一个或多个代谢分子并且其进入它们居住的培养基。这种代谢分子可赋予植物有益的特性。
因此，本发明也提供了选择或产生能够赋予植物一个或多个有益的特性，例如支持植物生长、质量和/或健康，或例如阻止或抑制植物生长、质量和/或健康的组合物，或鉴定能够产生这种组合物的微生物的方法。在一种实施方式中，组合物是基本上不含微生物。
在一种实施方式中，方法用于选择能够赋予植物一个或多个有益的特性的组合物，并且包括至少下述步骤：
a)通过本文之前描述的方法在一个或多个培养基中培养一个或多个微生物选择，以提供一个或多个培养物；
b)一段时间之后从一个或多个培养基中分离一个或多个微生物，以提供一个或多个基本上不含微生物的组合物；
c)使一个或多个植物(包括例如种子、秧苗、插条和/或其繁殖体)经受来自步骤b)的一个或多个组合物；
d)如果观察到赋予一个或多个植物一个或多个有益的特性，选择步骤c)的一个或多个组合物。
在另一实施方式中，方法用于选择能够赋予植物一个或多个有益的特性的组合物，并且包括下述步骤：
a)在一个或多个培养基中培养通过本发明的第一方面的方法选择的一个或多个微生物，以形成一个或多个培养物；
b)使步骤a)的一个或多个培养物灭活，以提供包含一个或多个灭活微生物的一个或多个组合物；
c)使一个或多个植物(包括例如种子、秧苗、插条和/或其繁殖体)经受步骤b)的一个或多个组合物；
d)如果观察到赋予一个或多个植物一个或多个有益的特性，从步骤c)选择一个或多个组合物。
在一种实施方式中，方法用于选择能够产生能够赋予植物一个或多个有益的特性的组合物的一个或多个微生物，并且包括至少下述步骤；
a)在一个或多个培养基中培养通过本发明的第一方面的方法选择的一个或多个微生物，以提供一个或多个培养物；
b)一段时间之后从步骤a)的一个或多个培养物的一个或多个培养基分离一个或多个微生物，以提供一个或多个基本上不含微生物的组合物；
c)使一个或多个植物(包括例如种子、秧苗、插条和/或其繁殖体)经受来自步骤b)的一个或多个组合物；
d)选择与观察到赋予一个或多个植物一个或多个有益的特性的一个或多个组合物相关联的(或换句话说用于产生一个或多个组合物的)一个或多个微生物。
另一本发明的方法包括至少下述步骤：
a)在一个或多个培养基中培养一个或多个微生物，以提供一个或多个培养物；
b)一段时间之后从一个或多个培养物的一个或多个培养基分离一个或多个微生物，以提供一个或多个基本上不含微生物的组合物；
c)使一个或多个植物(包括例如种子、秧苗、插条和/或其繁殖体)经受步骤b)的一个或多个组合物；
d)选择与观察到赋予一个或多个植物一个或多个有益的特性相关的一个或多个组合物相关联的(或换句话说用于产生一个或多个组合物的)一个或多个微生物；和，
e)使用本发明第一或第八(和/或相关的)方面的方法步骤d)步骤a)选择一个或多个微生物。
在之前两段的方法的一种实施方式中，方法的步骤b)可用下述步骤b)替换：使步骤a)的一个或多个培养物灭活，以提供包含一个或多个灭活微生物的一个或多个组合物，和然后使用该方法步骤c)中的该组合物。
如本文所使用“灭活”一个或多个培养物和“灭活的微生物”和类似的术语应宽泛地理解为意思是微生物基本上是灭活的、固定的、杀死的或以其他方式破坏的。术语不应理解为意思是所以的微生物是被灭活的、杀死的或破坏的，但是，这可以是优选的。在一种实施方式中，微生物是被灭活、固定、杀死或破坏至自我维持的复制是使用本领域技术人员已知的技术不可检测到的程度。
可使用本领域已知的任何适当的技术灭活、固定、杀死或破坏微生物。但是，作为例子，人们可使用化学试剂和/或物理方式这样做。在一种实施方式中，细胞被裂解。在另一实施方式中，细胞通过化学方式被固定，从而使得生物体是非活性的，但是仍保持它们的结构完整性。
如本文所使用，“基本上不含微生物的组合物”应宽泛地解释为并且不解释为意思是不存在微生物，尽管这可以是优选的。
在这些方法的某些实施方式中，微生物在两个或更多个(优选地大量的，例如，从至少约10至多达约1000个)混合培养物中使用可支持各种微生物生长的培养基中培养。可使用本领域已知的任何适当的培养基。但是，作为例子，生长培养基可包括TSB(胰酶大豆发酵液)、Luria-Bertani(LB)发酵液或R2A发酵液。在另一实施方式中，可使用能够支持具有一系列分开的但是期望特性的微生物生长的选择性或富集培养基。作为例子，可使用本文其他地方提及的富集培养基。
微生物可在培养基中培养任何期望的时间。培养之后，微生物与培养基分开并且储存稍后使用。也产生单独的组合物。然后，适当的生长培养基中的一个或多个植物经受组合物(使用任何已知方法，或如本文之前所描述的方法)。一段时间之后，评估植物的生长并且选择植物(例如，如本文之前所描述)。优选地，基于尺寸选择植物。但是，可使用本文提及的其他选择标准。
在一种实施方式中，从储存中回收产生与选择的植物相关联的组合物的微生物(一个或多个)子集。两个或更多个微生物分开的培养物可然后混合在一起并且分成两个或更多个在两个或更多个不同培养基中生长的子培养物。
该方法可迭代重复尽可能许的次数，只要认为有效，渐进步骤精选至数个培养基并且缩窄微生物的多样性，直到用微生物的混合物对生长的植物实现期望的效果，所述微生物的混合物可作为标准开始接种体鉴定、生长和储存用于产生组合物。
本发明该方面的组合物可它们单独或结合一个或多个另外成分使用或配制。
应当认识到，本文之前所描述的一般方法可适用于本发明的该方面，包括但不限于生长培养基、植物、微生物、时机、迭代处理和其组合。
另外的方法
下述方法可应用于本发明的方法，用于鉴定如本文之前描述的一个或多个微生物。
图1显示根据本发明实施方式的系统10。系统10包括请求人11、请求处理器12、生长设施13、数据库或文库14和仓库15。
图2提供了图解根据本发明的实施方式的方法20的流程图。将参考图1中显示的系统10描述图2中显示的步骤。
从鉴定可赋予一个或多个植物一个或多个期望的特性的一个或多个微生物角度描述本发明的该方面，具体参考本发明的第一或第八(和/或相关的)方面。但是，应当认识到，其同样适于鉴定可赋予一个或多个植物一个或多个期望的特性的一个或多个组合物，或产生可赋予一个或多个植物一个或多个期望的特性的组合物的一个或多个微生物，如本文之前描述，并且总结在本发明的第七(和/或相关的)和第八(和/或相关的)方面中。因此，除非上下文另外规定，当在说明书的该章节描述本发明的实施方式时，提及本发明的第一方面应理解为也包括提及本发明的第七(和/或相关的)和第八(和/或相关的)方面并且提及一个或多个微生物应理解为包括提及一个或多个组合物。
方法开始于步骤21，鉴定植物(或一类或一组植物)的请求人11。为什么可鉴定具体的植物或植物类型的原因是本领域技术人员显而易见的。但是，作为例子，其可能已经发现一般记载为具有高生长速度的植物以较低的速度生长或根本不生长，可简单地期望改善现有的生长速度或可期望将植物引入至不同的气候/环境/地理区域。本发明不限于赋予对具体植物(一个或多个)的改善并且可用于抑制生长或以其他方式不利影响植物(一个或多个)。
在步骤22，请求人11发送植物和/或其身份至请求处理器12。请求人11可提供进一步相关信息，比如为什么或他们寻求改善什么特性。尽管仅仅显示了一个请求处理器12，但是认识到，系统10中可提供多于一个请求处理器12。
请求人11鉴定一类或一组植物的情况下，可评估多于一个植物品种。可选地或另外，基于鉴定的组或类可在系统10的其他地方选择一个或多个植物品种，包括评估不同的品种之后，包括根据本发明的方法使用不同微生物。
请求可方便地经浏览器在因特网上接收，尽管本发明不限于此。浏览器的使用可另外或可选地用于确保请求人11能够看到有关响应他们请求的处理的报告。例如，可提供生长的测量。
在步骤23，请求处理器12接收和处理请求，基本上通过启动实施根据本发明第一方面的选择一个或多个微生物的方法。注意，请求处理器12可积极实施或不实施第一方面的方法，或可仅仅实施其一部分。根据具体的实施方式，请求处理器12可用作请求人11和能够实施第一方面方法的部门之间的中介或代理。而且，响应不同的请求进行不同的布置。例如，对于一个请求，请求处理器12周围的环境可适于评估具体植物但是不适于另一个，请求第三方设施的帮助。这可能是由于期望测试具体的土壤类型、海拔或气候。其他因素也是显而易见的，尽管认识到可使用“人工”环境。此外，改变使用者相互作用的程度可发生在请求处理器12。根据一种实施方式，计算机处理器基于请求人11的数据输入选择用于研究的参数或条件。如认识到，提供结构化的信息请求可有助于实现这，并且必要时，可参考包括数据库14的数据库。
在步骤24，选择评估过程的参数。例如，可参考可为植物(一个或多个)提供期望的改善的微生物的数据库14。尽管迄今本领域提供了与具体植物品种有益的关联的微生物的较少数据，当进行本发明的方法的操作时这应改善并且储存在数据库14中。也可选择其他参数，比如植物类型(一个或多个)和环境条件。
在步骤25，将请求(或其部分)和评估参数发送至可从仓库15获得适当的微生物的生长设施13。这些先前已经被鉴定或为鉴定。尽管仅仅显示了一个生长设施13和一个仓库15，但是认识到本发明并不限于此。此外，任何两个或更多个请求处理器12、生长设施13、数据库14和仓库15可位于相同位置和/或处于相同控制。
在步骤26，进行选择过程，优选地根据第一方面的选择方法。
在步骤27，向请求发送响应。可将响应发送至请求人11和/或发送至第三方和优选地包括至少一个在步骤26产生的至少结果的子集，植物(一个或多个)的鉴定、植物(一个或多个)、微生物(一个或多个)的鉴定、微生物(一个或多个)，或结合微生物提供的植物(一个或多个)，即在步骤26已经显示提供益处的那些。
在步骤28，可用步骤26的选择过程的结果更新数据库14。该步骤可在步骤27之前进行，包括周期性地或在进行选择方法的其他各个阶段。优选地，至少记录植物(一个或多个)和微生物之间新的有益的关联的细节。认识到不相容的或较少有益的关联也优选地被记录，从而随着时间的推移建立植物和微生物的知识框架。
认识到，图2的一个或多个步骤可被省略或重复。例如，生长设施13可在步骤26产生结果并且对其响应，一个或多个步骤21至26可被重复。
因此，本发明提供了改善植物(一个或多个)(或其生长或其他特征)的方式和方法。这通过如下实现：确保第一地理区域(例如国家)或以其他方式限定环境(例如通过影响生长条件的参数或特征，比如这种土壤盐度或酸度)的请求人11为了第一或另一区域中植物改善的目的获取第一区域中不存在的或受限的微生物学生物多样性。其他区域可以是外国或在外国，但是可通过影响植物的环境特征以其他方式限定而不是通过政治边界限定。从而，本发明可使得请求人获得具体微生物(一个或多个)对第一区域中具体植物(一个或多个)的有益的作用，即使这种微生物(一个或多个)可能不存在于第一区域中或第一区域中的存在受限。
下面提供本发明的实例实施。
1、例如，新西兰的公司(本国公司)，与第二个例如海外的公司(海外公司)建立合同关系。
2、海外公司同意从适于其本身环境(一个或多个)，或其他外国的植物栽培品种发送种子、插条或其他植物繁殖体(外国栽培品种)至本国公司，从而有权使用新西兰的陆生和水生微生物生物多样性的、能够与外国栽培品种形成有益的植物-微生物关联的要素。
3、好处的本质可包括增加的植物产率，例如通过下述的任何一个或多个，但不限于下述：增加根或叶质量，或通过自身固氮微生物(diazatrophs)比如克雷伯氏菌或根瘤菌的固氮，增加养分利用的效率，或通过从土壤释放植物养分，比如通过产生微生物植酸酶的磷酸盐释放的土壤，或通过改善植物表型，例如开花日期，或改变物理形式，例如颜色，根或叶分叉的频率，或改变化学特征，包括与味觉、气味相关联的化合物或使得植物适于具体目的的特性。
4、在新西兰，本国公司通过如下鉴定哪种本土微生物可形成与外国植物的关联；通过将种子暴露于微生物，有或没有它们可能影响植物的知识、通过使种子发芽和使植物在生长材料中生长的方法，所述生长材料确保植物在其生长期间经种子包衣、直接接种至种子或发芽秧苗和/或污染生长培养基与本土微生物接触。本发明不限于该布置或方法。例如，其可显而易见的是，新西兰之外的土壤中存在的微生物可提供益处并且可除了新西兰之外或代替新西兰在这些区域进行测试。而且，建立了人工环境。参考就在之前的实施例，这可通过从这些区域获得土壤和/或微生物并且在例如新西兰进行实验来实现。如显而易见，这种实施方式可包括提供人工控制的气候条件，以及其他参数。因此，本发明不限于在区域中进行测试基于其本土微生物–微生物可被人工引入从而在微生物天然环境之外的地方进行测试。
5、可根据植物物种和具体的植物改善特征，包括基于期望的或海外公司指定的参数大幅度改变生长的时间和它们生长的物理条件。在修改的植物生长时间之后，可通过微生物学评估确定可能的植物-微生物关联的、以确定微生物是否与外国作物已经形成内生菌、附生的或根际关联。
6、在表明这种关联(一个或多个)的情况下，微生物形成(例如新西兰本土)微生物的收集，其能够与(例如外国)作物或植物相关联。
7、在本发明的一种实施方式中，收集的微生物隔离群可，例如，涂布在种子上、接种至种子或秧苗，或接种至可能是或不是无菌的生长培养基。
8、在适当的时间之后，评估植物改善的根和叶生长或其他期望的特征，其设计为鉴定最能够为植物以海外公司期望的方式提供益处的植物-微生物关联。
9、本文之前提供了选择标准的例子，并且其中第二海外环境的相同参数在本土或测试区域(即，该实施例中的新西兰)中不存在的情况下，可选择与海外环境那些最类似的并且可被海外公司认为可接受的类似的参数。如在上面4中提到，本发明也包括引入外国材料或在本土或测试区域以其他方式产生人工条件。
10、使包括使一个或多个植物在存在一个或多个微生物的情况下生长、选择具有期望的特征的一个或多个植物，和获取与植物形成关联的微生物(一个或多个)的步骤重复一次或多次。
11、通过该方法鉴定为外国栽培品种的生长提供商业上显著益处的精选微生物并且可运输至海外公司，用于在外国环境中进一步测试和选择。
12、在进一步实施方式中，海外公司同意出现在外国栽培品种子、插条或繁殖体上或外国栽培品种的种子、插条或繁殖体中的微生物添加至本国公司的收集，以扩大收集用于该栽培品种上或接收用于来自其他公司的类似的测试的其他外国栽培品种上。
在可选的实施方式中，能够与外国栽培品种即，收集形成植物-微生物关联的微生物隔离群发送至第二公司，用于测试和选择，使得通过和/或在第二公司的土地上进行上面的7-11项。这可通过或在第一公司的控制下进行。
作为进一步的选择，不鉴定和使用预定的收集的微生物(一个或多个)，本国公司可简单地将种子暴露于本土微生物，有或没有他们对植物可能作用的知识，例如通过使种子发芽和使植物在生长材料中生长，所述生长材料确保植物在其生长期间与本土微生物经种子包衣、直接接种至种子或使秧苗发芽和/或污染生长培养基或以其他方式接触。如显而易见，本国公司可另外或可选地安排用于可出现相同或不同微生物的其他区域中类似的测试。可根据植物物种和海外公司具体的期望的植物特征大范围改变生长时间和它们生长的物理条件。在植物生长时间之后，可以如上述类似的方式确定可能的植物-微生物关联的性质。
实施例
现通过下述非限制实施例进一步描述本发明。
实施例1
鉴定能够改善饲料作物比如黑麦草的糖含量的微生物：
步骤1.未处理的黑麦草种子种植在小罐的各种土壤中。土壤可包括另外修饰包括微生物的纯培养物，微生物的混合物或包含源自其他来源的微生物的材料。
步骤2.适当的生长时间之后，例如1个月之后，冲洗掉植物的土壤，并且从根和茎/叶子分离微生物，作为纯培养物中的个体隔离群，或作为混合种群例如作为来自水性根碾碎和/或茎/叶碾碎的微生物悬液。
步骤3.然后将微生物添加至其中已经种植未处理的黑麦草种子的植物生长培养基。可选地，微生物(一个或多个)混合成适当的种子包衣材料例如凝胶，并且在种植进入类似的植物培养基之前包被在种子上。可选地，使种子发芽并且然后暴露于微生物一段短的时间(通常1-24小时之间，以使微生物可与发芽植物形成内生菌或附生的关联性的改变最大化)并且然后种植至类似的生长培养基。在每种这些情况下，生长培养基可起初是无菌的，尽管这不是必须的。
步骤4.在适当的生长时间之后，例如4–6周，评估叶生长和使用折射计或本领域技术人员已知的其他方法确定碾碎的叶子的糖含量。选择对于叶产率和/或糖含量具有最高值的植物，并且如步骤2中分离和制备它们的根和叶微生物。可然后迭代重复从步骤2至步骤3的方法，修饰或不修饰糖含量相对于叶产率的选择标准。
步骤5.该迭代之后，方法进行至糖含量的改善视为足够的点，选择最佳表现植物并且分离与它们相关的微生物并且用于开发改善黑麦草糖含量商业产品。
实施例2
鉴定能够改善颗粒作物比如小麦分蘖的微生物：
在主要播种在北半球的冬小麦品种的情况下，选择在将种子暴露于包含微生物的生长培养基中在与北半球的冬小麦种子经历的那些类似的光和温度的条件下展示早分蘖的植物是重要的，因为早分蘖是与冬天生存、生长和夏天最终颗粒产率相关的特征。
步骤1.将未处理的小麦种子种植在小罐的各种土壤或微生物基质中。土壤可包括另外的修饰，包括微生物的纯培养物、微生物的混合物或包含源自其他来源微生物的材料。
步骤2.适当的生长时间之后，例如1个月，冲洗掉植物的土壤，并且从根和茎/叶子分离微生物，作为纯培养物中的个体隔离群，或作为混合种群例如作为来自水性根碾碎和/或茎/叶碾碎的微生物悬液。
步骤3.然后将微生物添加至其中已经种植未处理的小麦种子的植物生长培养基。可选地，微生物(一个或多个)混合成适当的种子包衣材料例如凝胶，并且在种植进入类似的植物培养基之前包被在种子上。可选地，使种子发芽并且然后暴露于微生物一段短的时间(通常1-24小时之间，以使微生物可与发芽植物形成内生菌或附生的关联性的改变最大化)并且然后种植至类似的生长培养基。在每种这些情况下，生长培养基可起初是无菌的，尽管这不是必须的。
步骤4.适当的生长时间之后评估分蘖。选择在规定时间段内首先分蘖和/或最大分蘖数的植物，并且如步骤2中分离和制备它们的根和叶微生物。可然后迭代重复从步骤2至步骤3的方法，修饰或不修饰用于相对于终颗粒产率的分蘖的选择标准。
步骤5.该迭代之后，方法进行至分蘖的改善视为是足够的点，选择最佳表现的植物并且分离与它们相关联的微生物并且用于开发改善小麦分蘖的速度和程度的商业产品。
实施例3：
选择输送有益的作物特征的种子负载的内生菌的方法的用途
经种子负载的真菌Neotyphodium sp.菌株表达有益的特征，比如昆虫抗性和改善的耐受生物和非生物压力二者的饲料草已经被新西兰和其他地方的农民广泛采用。期望扩展与该种子负载的真菌和真菌家族中其他类似的物种表达的那些类似的特征的好处，至更宽范围的种子负载的内生菌微生物，从而提供更宽范围的有益的作物特征。
步骤1.未处理的黑麦草种子种植在小罐的各种土壤中。土壤可包括另外的修饰，包括微生物的纯培养物、微生物的混合物或包含源自其他来源的微生物的材料。
步骤2.适当的生长时间之后，冲洗掉植物的土壤，用乙醇和次氯酸钠的组合或本领域技术人员已知的其他方法表面杀菌，并且从根和茎/叶子和种子的内部组织分离内生菌微生物(内生菌)，作为纯培养物中的个体隔离群，或作为混合种群，例如作为来自水性根碾碎和/或茎/叶碾碎的微生物悬液。
步骤3.然后将内生菌微生物添加至其中已经种植预先发芽的表面杀菌的黑麦草种子的植物生长培养基(通过在营养琼脂平板上发芽检查不育的种子)。可选地，微生物(一个或多个)混合成适当的种子包衣材料，例如凝胶，并且包被在表面杀菌的种子上，然后种植进入类似的植物培养基。可选地，表面杀菌的使种子在营养琼脂平板上发芽，检查不育并且然后暴露于微生物一段短的时间(通常1-24小时之间，以使微生物可与发芽植物形成内生菌或附生的关联性的改变最大化)并且然后种植至类似的生长培养基。在每种这些情况下，生长培养基可起初是无菌的，尽管这不是必须的和进一步微生物可施加至生长培养基和/或植物。
步骤4).在适当的生长时间之后，例如4-6周，评估植物期望的表型的表达。表型可包括改善的颜色、植物形态、代谢物表达等等。
步骤5).允许选择的植物进一步生长至种子集的点。在该阶段，可使用培养物依赖或非依赖性方法，筛选来自每个植物的种子的子集的内生菌携带。在进一步轮的选择中，使来自筛选中产生积极结果的植物的剩余的种子发芽并且种植而没有微生物添加，以富集内生菌携带和传递期望的表型的能力，如步骤3-5中描述。
可选地，内生菌微生物可获取自来自每个植物的种子的子集，作为来自表面杀菌的种子的隔离群或作为外植体，或作为例如，通过在水溶液中破碎表面杀菌种子制备的微生物悬浮。隔离群和制品用作源自表面杀菌种子的植物的接种体，如步骤3中描述。
在方法的进一步变型中，选择传递特征的种子可在下一代中通过下述进行：表面杀菌来自上一代选择的植物的种子的子集(提前筛选或不筛选)并且允许它们发芽和生长一定的时间，此时如步骤3和4中一般描述进行表型筛选(即种子集之前)。选择在该代中展示期望的表型的植物(即通过种子传递)，并且制备组织外植体，和/或从植物组织分离微生物，和/或通过在水溶液中碾碎表面叶子或根制备粗微生物悬液。这些制品的一个或组合用作接种体，用于进一步迭代轮的生长和选择和种子收获，如步骤3-5中描述。可选地，在进一步轮的选择中，可使展示期望的种子负载的特征的植物的剩余的种子发芽并且种植，而没有微生物添加，以富集内生菌携带和传递期望的表型的能力，如步骤3-5中描述。
步骤6).在连续轮的该迭代方法结束时，如通过阐释期望的种子负载的表型所确定，选择最佳种子行，用于商业评估和栽培品种开发。
实施例4
获取能够改善黑麦草(Loliumperenne)生长的微生物的方法的用途。
黑麦草通常生长在肥沃土壤并且是饲料生产的重要的作物。所以，期望使用定向选择的方法，以鉴定能够在肥沃基质中增加黑麦草生物质的微生物组，而不用实验施加的选择压力。
来自新西兰北岛的七十三个土壤样品(处理)用作方法开始时的微生物多样性来源。根据增加排水和体积的要求，用砂:蛭石(1:1或1:2)混合土壤样品。将样品放置在十个重复的28ml管中，并且种植黑麦草种子(Lolium perenne cultivar一个50nil内生菌)。用雾化软管对种子浇水，直到发芽，然后淋浴至饱和每周三次，另外根据需要浇水，以防止秧苗干燥。对于标准生长条件，见表1。
表1.标准生长条件
第1轮选择
播种后六十天(DAS)，选择来自每个样品的四个植物，并且处理以为第一轮选择提供微生物接种体。在基质上方2cm切割植物并且丢弃。振动根和附着的茎去掉土壤，冲洗以去除大部分土壤块并且流干，然后将根和茎结合在塑料袋中。然后，将该材料在袋子中用添加以使根材料悬浮的10ml的水碾碎。所得悬浮的液体部分用作初始微生物接种体。对于每个样品，将表面杀菌的种子在1ml的根悬液中浸透一个小时。然后，将浸透的种子种植在包含盆栽填料(Kings Plant Barn，新西兰；粒状树皮、泥煤苔、浮石粉和缓释化肥)，用自来水湿润的28ml管中(每个处理15个重复)。用SDW将剩余的根悬液制备足够的终体积，并且将2ml用移液器吸取在种植的种子上。在种植之后，用新鲜干燥基质稀薄覆盖。随后，对罐用自来水每周3次浇水。
第2轮选择
在118DAS，收获叶子、称重并且选择处理，以提供用于第二轮选择的微生物接种体。仅仅选择来自起初73处理的21个处理的每个的具有最大平均叶重量的8个最大植物用于加工。除了四个复合，四个植物的处理的每一个产生自具有最大叶生物质的十六个体植物。切割基质水平上方2cm的叶子和称重。振动每个植物的根和基部茎去除基质，然后冲洗，在塑料袋中结合，碾碎并且以如选择轮1相同的方式用于接种第二轮的选择，不同之处是每个处理种植30个重复并且接种体的终体积是65ml。
第3轮选择
在39DAS收获来自第二轮选择的植物。切割基质2cm上方叶子，称重并且丢弃。选择来自前15次处理的三个最大植物，以产生用于3轮选择的接种体。如上述碾碎根和茎并且用于每次处理的30个重复。
微生物分离
在63DAS收获3轮选择的叶子并且称重，以及选择来自五次处理的具有最大平均叶重量的最大的植物，以为微生物分离提供接种体。冲洗根和2cm茎和然后如先前描述在塑料袋中碾碎。提取小体积的接种体制备十倍稀释系列铺平板在R2A上。来自每个制品的碾碎的根片也接种至10ml N-缺陷半固体苹果酸(NDSM)培养基(Eckford等，2002)中。在室温下孵育2-4天，提取所得薄片并且扩散在R2A琼脂上，用于分离个体菌落。进行用于放线菌的选择性分离步骤，其中乙醇以25％的终浓度添加至根悬液，在室温下(RT)孵育30min，然后铺平板在R2A上。对于真菌分离，将碾碎的根片嵌入熔融的PDA(冷却至45℃)。在25℃下孵育24-72hr之后，在解剖显微镜下检查R2A和PDA平板。评估细菌和真菌菌落的丰度，根据形态分组并且挑取代表性隔离群以及划线在新鲜R2A或PDA平板上。用标准方法鉴定隔离群通过DNA提取、PCR扩增和16S rRNA基因(细菌)或ITSS区域(真菌)的测序至物种水平。
微生物评估
对61个体隔离群进行微生物评估并且基于丰度、多样性和物种特征选择28个共生体。选择的隔离群扩散在R2A(细菌)或PDA(真菌)上，在25℃下孵育72小时，然后用添加的SDW刮下琼脂表面进入无菌容器。将细菌收获至2ml的SDW。通过5-10ml SDW的无菌滤茶器筛滤真菌，以去除菌丝的团块和附着的琼脂片。使收获的细胞的连续稀释铺平板并且在25℃下孵育24小时，以评估每个悬液中菌落形成单位(CFU)的数量。从这些板计数来计算相当于1x107(细菌)和1x103(真菌)CFU每ml的稀释体积。将黑麦草种子(One50 nil内生菌)在微生物悬液中浸透一小时，然后单独种植在包含湿润的盆栽填料的28ml管中。两毫升的分离悬液用移液器吸取在种子中，其然后用基质覆盖。所有的植物随后用自来水浇水，每周3次。在41DAS切割叶子和称重。冲洗根、吸水干燥和称重。导致植物生物质增加超过无微生物对照至少5％的微生物处理显示在表2中。
表2.与增加黑麦草生物质相关的微生物处理
FW＝新鲜叶重量；RW＝新鲜根重量；BM＝植物生物质(根+叶子)
斜体指示显著的IOC(相对于对照的增加；Fisher’s LSD)
ID-基于RDPII和/或NCBI数据库中最近序列比对推测的身份
导致叶重量(Fisher's LSD)的显著增加的三个微生物处理都分离自第三轮选择中产生叶重量最大增加的位置。
这些结果提供了证据表明本发明描述定向选择微生物的方法能够鉴定显著改善黑麦草在适宜的生长条件下生长的微生物的集合。
实施例5
鉴定能够改善罗勒(Ociumbasilicum)水溶性碳水化合物含量的微生物的方法的用途。
来自新西兰北岛的43个位置的土壤样品用作该方法的微生物多样性来源。
根据增加排水和体积的要求，样品与砂:蛭石(1:2)混合。每个样品用于填充五个复制28ml管，其每个管种植3–5个罗勒种子(Ociumbasilicum，品种甜Genovese)。秧苗在植物生长室中下表1中描述的条件下发芽。根据需要，用自来水进行浇水，以防止枯萎。
约14DAS收获植物，并且切割叶子和丢弃。对于每个样品，振动基部茎和根去除土壤，在无菌蒸馏水(SDW)中冲洗并且在塑料袋中结合重复。然后在塑料袋中充分碾碎植物材料。将10ml SDW添加至碾碎的根中，并且所得悬液用作第一选择轮的微生物接种体。
将罗勒种子在根提取物中浸透最小一小时，然后种植在包含盆栽填料(40％v/v泥煤、30％堆肥松树树皮、30％细浮石粉，用石灰调整至pH 6.1)，用6ml的液体化肥(Miracle-Gro，Scotts Australia Pty Ltd)湿润的28ml管中。剩余的根悬液用40ml的SDW稀释，并且将2ml用移液器吸取在种子上。每个样品制备十个重复管，以及一组20个使用将种子浸透在无菌蒸馏水中制备的无微生物对照。所有的管随机横跨在架子上。秧苗在植物生长室中在上述条件下发芽。发芽之后，为每个管除去杂草，以留下一个随机选择的秧苗。
第1轮选择
在20DAS，随机选择来自每个处理的一半的植物，用于收获。剩余的植物保留在生长室中，用于制备提取物，以接种第二轮的选择。从罐去除用于收获选择的植物，冲洗以去除黏附的盆栽填料，在纸巾上干燥并且称重，然后放入包含单个不锈钢滚珠的2ml管。然后，将样品冷冻在-20℃下等待分析水溶性的碳水化合物。
使用Yemm和Willis一般描述的蒽酮方法(Biochem.J.1954，57：508–514)确定植物提取物中水溶性的碳水化合物(WSC)的浓度。通过以22hz珠击2分钟制备全植物提取物。然后将一ml的无菌蒸馏水添加至每个样品。混合之后，0.5ml的液体悬液转移至96孔微管块，其放置在沸腾水浴中30分钟。然后，将每个块转移至冷水浴五分钟，随后以3000rcf离心10分钟至小球碎片。去除上清液，在SDW中1:25稀释，并且将40μL样品转移至新的96孔微管块。然后，用200μL的新鲜制备的蒽酮溶液(70％硫酸中2mg/mL)覆盖样品。将块在冰冷水浴中冷却5分钟，通过倒置混合，放置在沸腾水浴中60秒，然后立即返回冷水浴。一旦冷却，每个反应100ul的样品转移至平底微孔板，并且在SpectraMax M5e分光光度计上测量在600nm下的吸收。在超纯水中制备葡萄糖标准并且根据植物提取物处理，以产生校准曲线。结果报告为葡萄糖当量(mg)每克的植物组织。
43个处理中的二十个导致相对于无微生物对照培养基中糖含量的积极增加。
第2轮选择
选择产生最大培养基糖含量的13个处理用于第二选择轮。从每个处理中剩余的5个植物制备微生物提取物并且根据上述程序施加至罗勒种子，不同之处是每个处理的重复的数量增加至30和无微生物对照增加至60。
播种后(DAS)十五天，收获来自每个处理的15个植物。将剩余的植物的剩余的植物保留在生长室，用于随后的分离实验。从罐中去除选择用于收获的植物，并且如先前描述处理用于水溶性碳水化合物的分析,不同之处是在80％硫酸中制备蒽酮溶液，以减少沉淀的形成。
13个处理中的八个相对于无微生物对照产生培养基糖含量的积极增加。在该点，结束迭代选择轮并且进行微生物分离。
微生物分离
从来自具有最大培养基WSC的七个处理的每个中的多达五个剩余的植物分离细菌和真菌。对于每个处理，振动来自每个植物的根和更低的1cm的茎材料去除基质并且在无菌蒸馏水中冲洗，然后分成两个部分。一部分在6.6％ (活性成分：氯二甲苯酚4.8％)中表面灭菌1分钟随后在SDW中漂洗3次，每次1min。使用无菌剪刀将表面灭菌根切成片(约1-2cm长)并且下降至包含NDSM培养基的试管(Eckford等，2002)。在室温下孵育2-4天之后，观察管并且去除明显的薄片，并且通过在R2A琼脂(Difco)上继代培养纯化。
来自一个部分的根在塑料袋中结合，并且在袋中用添加以使根材料悬浮的10ml的水碾碎。回收碾碎根的片并且放置在PDA平板，或嵌入45℃熔融的PDA中。在SDW中制备悬液的十倍连续稀释并且用于制备R2A琼脂(Difco)上扩散的平板。将R2A和PDA平板在25℃下孵育并且24–72小时孵育之后，在解剖显微镜下检查。评估菌落的丰度、根据形态分组并且挑取代表性隔离群以及划线用于在新鲜R2A或PDA平板上纯化。标准方法用于鉴定隔离群通过DNA提取、PCR扩增和16S rDNA(细菌)或ITSS区域(真菌)的测序至物种水平。
微生物评估
基于丰度、多样性和物种特征，对选择的隔离群进行两轮的微生物评估。在第一轮评估中，测试80个处理，包括68个体隔离群和12个共生体。
分别在R2A和PDA平板上培养选择的细菌和真菌隔离群，并且在SDW中制备悬液，用于如实施例4中一般描述接种种子。
将悬液稀释至1x107(细菌)和1x103(真菌)每ml，用作个体处理。使用等体积的每个个体微生物悬液制备共生体。将罗勒种子在微生物悬液中浸透一小时，然后种植至包含商业盆栽填料(实施例4中描述)的28ml管中，其已经用6ml的自来水湿润。两ml的微生物悬液用移液器吸取在每个种子的顶部。对每个处理制备三十个重复并且为无微生物对照制备45个重复。
十三DAS之后，选择来自每个处理的15个植物和22个无微生物对照用于收获和WSC测定。如先前描述进行样品的制备，不同之处是珠击之后，将0.8ml的SDW添加至每个管并且进行第二轮的珠击。然后，将所得混合悬液的0.5mL样品转移至96孔微管稀释块并且储存在-20℃下。融化块并且如先前描述评估碳水化合物。
总共36个微生物处理产生培养基碳水化合物浓度大于无微生物对照。该数据用于产生优化组的44个处理，其包括34个体隔离群和10个共生体，用于第二轮的微生物评估。基于增加WSC的结果选择处理和包括在共生体中表现好的个体隔离群，以及高排位微生物制备的新共生体。
制备微生物处理并且如上述浸透和种植罗勒种子，不同之处是处理重复的数量增加至45个和无微生物对照增加至90个。
播种14天之后，收获所有的植物并且处理用于如上述WSC分析，不同之处是块在前30分钟加热步骤之后冷冻过夜。然后，融化样品并且如先前描述处理。将单个罗勒样品的稀释系列加载在块上，用作内部对照并且使得块之间的变化归一化。
总共20个微生物处理产生的培养基WSC浓度大于无微生物对照，11个处理产生相对于对照大于5％的增加(IOC；表3)。产生最高培养基碳水化合物浓度的处理是来自第一轮微生物评估的前三位个体隔离群的新的共生体。
表3.轮2微生物评估中产生碳水化合物浓度大于无微生物对照的微生物处理。
ID–基于NCBI和/或RDPII数据库总最接近的匹配推测的身份
这些结果提供了证据表明本发明描述的定向选择微生物的方法能够产生改善罗勒中产生水溶性的碳水化合物的微生物集合。
实施例6
鉴定改善玉米(Zea mays)生长的内生菌微生物。
内生菌微生物与植物组织密切相关或包含在植物组织中，所以可与植物根围相关联的微生物相比较少暴露于竞争和压力。期望产生能够通过比如增加植物生物质或颗粒产率来促进玉米生长的内生菌微生物。在该实施例中，内生菌微生物定义为在玉米植物组织用6.6％(活性成分：氯二甲苯酚4.8％)表面消毒1分钟之后仍存活的微生物。
来自新西兰北岛的七十三个土壤样品用作微生物多样性来源。根据增加排水和体积的需要，土壤样品(处理)与无菌砂:蛭石(1:1或1:2)混合。所得混合物放置在28ml管中并且种植，每个处理中15个重复的玉米(Pioneer玉米杂交种子37Y12)。用雾化软管对秧苗浇水，直到发芽，然后淋灌直到饱和，每周三次，另外根据需要浇水。对于剩余的标准生长条件见表1。
在播种(DAS)后60天选择来自每个处理的三个植物。在土壤上方5cm切割玉米植物的茎并且丢弃。振动根和附着的茎去除土壤，冲洗以去除土壤片段和流干，然后在塑料袋中结合根和茎。然后，将该材料在袋中用添加以使根材料悬浮的10ml水碾碎。所得悬液的液体部分用作微生物接种体，用于非选择性富集轮。该额外轮的目的是增加玉米组织中生长的微生物的丰度。每个样品，将表面杀菌的玉米(37Y12)种子在1ml的根悬液中浸透一小时。然后，将浸透的种子种植在用6ml可溶性植物食品(无菌蒸馏水中1/450v/v稀释)湿润的包含无菌砂和蛭石1:2的28ml管中(每个处理15个重复)。使用无菌蒸馏水(SDW)制备剩余的根悬液多达40ml的终体积，并且将2ml用移液器吸取在种植的种子上。
第1轮选择
播种(DAS)六十天，选择每个处理中的五个最大植物并且处理以提供微生物接种体，用于第一轮的选择。在基质水平上方上方5cm切割每个选择的植物的叶子并且丢弃。在自来水中充分冲洗剩余的基部茎和根，以去除任何附着的土壤并且然后在塑料袋中结合处理，然后用6.6％的表面杀菌1分钟，以选择内生菌微生物。接着在SDW中在1、5然后10分钟搅拌冲洗3次根。如上述在塑料袋中碾碎冲洗的根，并且悬浮在20ml SDW的终体积中。通过将它们在10ml的接种体中浸透一小时，将所得悬液用于接种15个表面杀菌的玉米种子(Pioneer玉米P9400)，然后将它们种植在用无菌合成化肥(Fahraeus，1957)湿润的1:3的无菌砂:蛭石中。对于每个处理制备剩余的悬液多达40ml的终体积，并且将2ml用移液器吸取在每个种植种子的顶上。三十个无微生物种子对照的复制管浸透在SDW中并且在无微生物接种体的重复的过程中每管用移液器吸取2ml的水。在种植之后，用新鲜干燥基质覆盖种子。在种植后第一周用SDW对罐浇水，以维持无菌条件，然后用自来水浇水，每周三次
第2轮选择
在26DAS收获植物。切割叶子并且如上述称重。冲洗清洁每个植物剩余的基部茎和根，用新鲜纸巾吸水干燥，然后称重和单独装袋。从20次处理产生最大平均生物质和来自所有处理的五个最大个体植物制备用于第二轮选择的接种体。合并来自每次选择处理的10个最大植物的根和基部茎，表面杀菌和如上述碾碎。如上单独处理五个最大个体植物。对于在用无菌合成化肥湿润的1:3无菌砂:蛭石中中25次处理的每一次，种植三十个重复(PioneerP9400种子)。
第3轮选择
在26DAS收获植物并且如先前描述处理。选择来自7个处理产生最大平均生物质的六个最大的植物，以产生用于第三轮选择的接种体。植物生长28天，收获并且如对之前轮描述评估。合并来自前三次处理的三最大植物的根和基部茎，并且单独选择实验中的两个最大植物，以提供用于微生物分离的接种体。
微生物分离
对用于接种R3选择的根悬液进行微生物分离和对从上面选择的R3植物制备的悬液进行微生物分离。如上面通常描述使用R2A、PDA和NDSM培养基进行细菌和真菌分离。进行放线菌的选择性分离步骤，其中乙醇以25％的终浓度添加至根悬液，在室温下孵育30min，然后在R2A上铺平板。在25℃下孵育1-7天后检查平板。评估菌落的丰度，根据形态分组并且挑选代表性隔离群继代培养在R2A上。标准方法用于鉴定隔离群，通过DNA提取、PCR扩增和16S rRNA基因(细菌)或ITSS区域(真菌)的测序至物种水平。
微生物评估轮
进行两轮的微生物评估。在第一评估轮中，基于丰度、多样性和物种特征选择79个菌株。制备细菌隔离群并且用于接种表面杀菌的种子如实施例4中描述，不同之处是使用玉米种子(P9400)。真菌菌株铺平板在PDA上，在25℃下孵育7天，然后用5-10ml SDW刮下板并且通过滤茶器筛滤，以去除菌丝的团块和附着的琼脂片。使用Neubauer改良的血球计和复显微镜确定孢子/菌丝的数量，并且制备5x102、1x103和2x103的稀释系列。然后，每个稀释用移液器吸取在10个种植种子上，从而每个复制总计30个种子，每个为3个剂量水平。对于真菌和细菌二者，表面杀菌的玉米种子(Pioneer P9400)种植在包含无菌盆栽填料(40％泥煤、30％堆肥松树树皮、30％细浮石粉，石灰调整至pH 6.1)，用Fahraeus溶液(Fahraeus，1957)湿润的28ml管中，然后用新鲜干燥基质覆盖。随后，用自来水对所有的植物每周3次浇水。
24DAS收获植物并且称重叶子和根。选择相对于无微生物对照产生增加的叶和/或根平均重量的微生物隔离群，用于第二轮的评估。如上述处理和种植选择的菌株，不同之处是浸透种子并且用浓度为1x103而不是三个稀释的真菌菌株接种并且对于所有的菌株种植15个重复。在20DAS收获叶子和根并且称重。结果显示在表4中。四个隔离群产生比无微生物对照显著更高的生物质。
表4.内生菌微生物产生增加玉米生物质
斜体指示与无微生物对照(Fisher’s LSD)的显著差异；％IOC，相对于对照的百分数增加基于RDPII数据库中与部分16S rRNA序列最接近的匹配而推测的ID
这些结果提供了证据，表明本发明描述的微生物的定向选择的方法能够产生改善玉米生长的内生菌微生物的集合。
本文已经参考某些优选的实施方式描述了本发明，从而使得读者能够在不过度实验的情况能够实施本发明。但是，本领域普通技术人员容易认识到，许多组分和参数可某些程度上被改变或修饰或替换已知的等价物，而不背离本发明的范围。应当认识到，这些修饰和等价物如同单独阐释并入本文。另外，提供题目、标题等等以加强读者对该文档的理解，并且不应理解为限制本发明的范围。
上面和下面引用的如果存在的所有申请、专利和出版物的内容通过引用并入本文。但是，本说明书中引用任何申请、专利和出版物不，并且不应理解为承认或任何形式的提示它们在世界上的任何国家构成有效的现有技术或形成公知常识的一部分。
贯穿本说明书和下述任何权利要求，除非上下文另外规定，词“包括”、“包含”等解释为包含性的，而不是排他性的，也就是说“包括但不限于”的意思。
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Yemm and Willis(Biochem.J.1954,57:508–514)

Claims (21)

1.选择能够赋予植物一个或多个有益表型的一个或多个微生物的方法，所述方法包括下述步骤：
a)使一个或多个植物在存在第一集合的一个或多个微生物的情况下经受生长培养基；
b)基于所述植物相对于所述一个或多个植物的其他植物表现出的一个或多个期望的特征，从步骤a)所述的一个或多个植物选择一个或多个种子；
c)从步骤b)中选择的所述一个或多个种子获取第二集合的一个或多个微生物；以及
d)重复步骤a)至c)一次或多次，其中步骤c)中获取的第二集合的一个或多个微生物用作任何接连重复的步骤a)中的第一集合微生物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中使一个或多个植物经受生长培养基的步骤包括使所述植物生长或增殖。
3.根据权利要求1所述的方法，其中使两个或更多个植物在第一集合的微生物存在的情况下经受生长培养基。
4.根据权利要求1所述的方法，其中基于一个或多个选择标准选择所述一个或多个种子。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述期望的特征为期望的表型特征。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述期望的特征为期望的遗传特征。
7.根据权利要求4所述的方法，其中所述期望的特征为一个或多个期望的遗传特征和一个或多个期望的表型特征的组合。
8.根据权利要求4所述的方法，其中在所述方法的不同的迭代中使用不同的选择标准。
9.根据权利要求1所述的方法，其中以粗制形式获取所述第二集合的一个或多个微生物。
10.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤c)中获取两个或更多个微生物，所述方法进一步包括：将所述两个或更多个微生物分离成为个体隔离群，选择两个或更多个个体隔离群，和接着合并所选择的两个或更多个隔离群。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述合并的隔离群用作所述方法的任何接连重复的步骤a)中的所述第一集合的一个或多个微生物。
12.根据权利要求1所述的方法，其中本发明的两个或更多个方法可分开进行并且合并每一分开方法的步骤c)中获取的第二集合的一个或多个微生物。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述合并的微生物用作所述方法的任何接连重复的步骤a)中的第一集合的一个或多个微生物。
14.根据权利要求1所述的方法，其中植物材料用作步骤a)的微生物来源。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法用于选择一个或多个不可培养的微生物或一个或多个内生菌。
16.用于产生支持植物生长、质量和/或健康的组合物的方法，所述方法包括权利要求1所述的方法和将通过所述方法选择的一个或多个微生物与一个或多个另外成分合并的另外步骤。
17.用于产生阻止或抑制植物生长、质量和/或健康的组合物的方法，所述方法包括权利要求1所述的方法和将通过所述方法选择的一个或多个微生物与一个或多个另外成分合并的另外步骤。
18.选择能够赋予植物一个或多个有益表型的组合物的方法，所述方法包括至少下述步骤：
a)在一个或多个培养基中培养通过权利要求1所述方法选择的一个或多个微生物以提供一个或多个培养物；
b)一段时间之后在所述一个或多个培养物中从所述一个或多个培养基中分离所述一个或多个微生物，以提供一个或多个基本上不含微生物的组合物；
c)使一个或多个植物经受步骤b)的一个或多个组合物；和
d)如果观察到赋予所述一个或多个植物一个或多个有益表型，从步骤c)选择一个或多个组合物。
19.选择能够赋予植物一个或多个有益表型的组合物的方法，所述方法包括至少下述步骤：
a)在一个或多个培养基中培养通过权利要求1所述的方法选择的一个或多个微生物以形成一个或多个培养物；
b)使步骤a)的一个或多个培养物灭活，以提供包含一个或多个灭活微生物的一个或多个组合物；
c)使一个或多个植物经受步骤b)的一个或多个组合物；和
d)如果观察到赋予所述一个或多个植物一个或多个有益表型，从步骤c)选择一个或多个组合物。
20.选择能够产生能够赋予植物一个或多个有益表型的组合物的一个或多个微生物的方法，所述方法包括至少下述步骤：
a)在一个或多个培养基中培养通过权利要求1所述的方法选择的一个或多个微生物，以提供一个或多个培养物；
b)从步骤a)的所述一个或多个培养物的一个或多个培养基分离所述一个或多个微生物，以提供一个或多个基本上不含微生物的组合物；
c)使一个或多个植物经受来自步骤b)的一个或多个组合物；和
d)选择与观察到赋予所述一个或多个植物一个或多个有益表型的一个或多个组合物相关联的一个或多个微生物。
21.选择能够产生能够赋予植物一个或多个有益表型的组合物的一个或多个微生物的方法，所述方法包括至少下述步骤：
a)在一个或多个培养基中培养通过权利要求1所述的方法选择的一个或多个微生物，以提供一个或多个培养物；
b)使步骤a)的一个或多个培养物灭活，以提供包含一个或多个灭活的微生物的一个或多个组合物；
c)使一个或多个植物经受步骤b)的一个或多个组合物；和
d)选择与观察到赋予所述一个或多个植物一个或多个有益表型的一个或多个组合物相关联的一个或多个微生物。
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