CN106591145B - 一种从三叶青块根中分离的小不整球菌ef01及其应用 - Google Patents

一种从三叶青块根中分离的小不整球菌ef01及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种从三叶青块根中分离的小不整球菌EF01及其促进三叶青生长、提高总黄酮含量中的应用，本发明从三叶青球形块根中分离到1株内生真菌，即小不整球壳菌EF01，具有促进三叶青的生长、提高总黄酮含量的功效，植株鲜重提高近1倍以上，根长也为对照组的1倍以上，叶青叶、茎和根中Th‑exp表达量均上调，总黄酮含量提高了87‑121％。

Description

一种从三叶青块根中分离的小不整球菌EF01及其应用
(一)技术领域
本发明涉及一种提高三叶青生长发育的菌株，特别涉及一种小不整球壳菌(Plectosphaerella sp.)EF01在促进三叶青生长、提高总黄酮含量中的应用。
(二)背景技术
三叶青(Tetrastigma hemsleyanum Diels&Gilg ex Diels)是珍稀的药用植物，主要以球形块根入药，含黄酮、类黄酮、维生素、氨基酸等多种药用成分，能清热解毒、消炎止痛。近年来发现有抗肿瘤功效。在自然生长条件下，对环境条件(如：温度、湿度和光照等条件等)要求苛刻，生长缓慢，通常需3-5年方能形成球形块根(钱丽华,戴丹丽,姜慧燕,林蔚红.濒危药用植物三叶青研究进展.浙江农业学报,2015,27(7):1301-1308)。
另一方面，内生真菌是生活在健康植物组织内部，不引起宿主植物出现明显病症的一类真菌。在长期的进化过程中，内生真菌与宿主互惠共生，既从宿主中吸收营养供自身生长，产生的代谢物又促进宿主植物的生长发育，增强宿主植物对病虫害、干旱、高温等生物及非生物胁迫的抗性(Jia M,Chen L,Xin HL,Zheng CJ,Rahman K,Han T,Qin LP.AFriendly relationship between endophytic fungi and medicinal plants:Asystematic review.Front Microbiol,2016,7:906)。
寻找、分离、鉴定并分析三叶青的内生真菌，探究内生真菌与三叶青块根生长发育的相关性，可将内生真菌应用于三叶青的人工栽培，以便缩短三叶青的生长周期，对增加三叶青中药材资源具有重要意义。本发明从三叶青块根中分离纯化获得1株内生真菌(命名为EF01)。进一步对该内生真菌进行鉴定和分析，结果显示，EF01菌株具有促进三叶青的生长、提高总黄酮含量的功效。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种小不整球壳菌EF01及其在促进三叶青生长、提高总黄酮含量中的应用；可以克服三叶青生长过程中形成球形块根时间长、块根发育缓慢等问题。本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种从三叶青块根中分离的小不整球壳菌(Plectosphaerella sp.)EF01，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期2016年10月13日，保藏编号CGMCC NO.12968，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。
本发明还提供一种所述小不整球壳菌EF01在促进三叶青生长、提高总黄酮含量中的应用，具体所述的应用为：所述的应用为：将小不整球壳菌EF01接种在PDA固体培养基上，室温培养1-5d；取菌饼接于PDA液体培养基中，25-30℃、50-200r/min培养1-10天，将培养液进行过滤，所得滤液与MS液体培养基按体积比1:5-20混合，加入终浓度1-20g/L琼脂后灭菌，获得组培苗培养基；接种三叶青无菌组培苗于所述的组培苗培养基中，在18-25℃、1000-3000lux、5-15h/d条件下培养，获得所述的生长加速、总黄酮含量提高的三叶青植株。更优选所述的应用为：将小不整球壳菌EF01接种在PDA固体培养基上，室温℃培养3d；取菌饼接于PDA液体培养基中，28℃、100r/min培养5天，培养液经滤纸过滤，所得滤液与MS液体培养基按体积比1:9混合，加入终浓度10g/L琼脂后灭菌，获得组培苗培养基；接种三叶青无菌组培苗于所述的组培苗培养基，在18-25℃、2000lux、12h/d条件下培养，获得所述的生长加速、总黄酮含量提高的三叶青植株。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明从三叶青球形块根中分离到1株内生真菌，即小不整球壳菌EF01，具有促进三叶青的生长、提高总黄酮含量的功效，植株鲜重提高近1倍以上，根长也为对照组的1倍以上，叶青叶、茎和根中Th-exp表达量均上调，总黄酮含量提高了87-121％。
(四)附图说明
图1块根切块在PDA培养基上培养3天照片，左边切块未有内生真菌，右边切块长出内生真菌。
图2菌株EF01菌落形态。
图3菌株EF01的ITS rDNA电泳图，第1泳道为DS2000标准分子量，第2泳道为扩增的ITS产物。
图4菌株EF01对三叶青组培苗生长的影响，左侧为实验组，右侧为对照组。
图5菌株EF01对三叶青扩展蛋白基因表达的影响。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例1
1、材料和方法
(1)块根中内生真菌的分离纯化
采于浙江省缙云县山区的野生三叶青，取直径约2cm的球形块根，自来水冲掉表面泥土，置于洗洁精中浸泡10min，流水冲洗干净后，在操净台中将块根浸泡在稀释1倍的饱和次氯酸钠(安替福民)溶液中30min，最后用无菌水冲洗3次。切割成长宽3-5mm的小块，置于含50mg/L Str(链霉素)的PDA培养基(马铃薯200g/L(去皮切块，水中煮沸后纱布过滤除渣)、葡萄糖20g/L和琼脂14g/L，溶剂为去离子水，pH7.0)，切面朝向培养基，每皿4-6块。同时，收集最后一次冲洗块根的无菌水涂布于培养基上，并且将上述同样处理过的块根未经切割直接滚印于培养基上，作为对照，用于检测块根表面灭菌效果。28℃、黑暗培养5天。待菌丝体从切块面长出，挑取边缘菌丝转至含50mg/L Str的PDA培养基上继续培养。重复3-5次获得纯化的菌株EF01。
(2)内生真菌的形态和分子鉴定
参照《真菌的形态和分类》(戴芳澜，真菌的形态和分类。北京：科学出版社，1987年，第1-352页)，依据菌落的表面形态、边缘形态、颜色、生长速度等对分离到的菌株EF01进行形态鉴定。
用真菌基因组DNA抽提试剂盒(生工公司)提取菌株EF01基因组DNA。根据真菌rDNA的ITS序列，设计引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)(Valente P,Gouveia FC,de Lemos GA,Pimentel D,vanElsas JD,-Hagler LC,Hagler AN.PCR amplification of the rDNAinternal transcribed spacer region for differentiation of Saccharomycescultures.FEMS Microbiol Lett,1996,137(2-3):253-256).PCR扩增条件为：95℃变型2min，随后30个循环：95℃45s，55℃45s和72℃45s，最后在72℃延伸10min。PCR产物回收、纯化后，连接到测序载体pMD19-T(TaKaRa公司)，连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞。筛选的阳性克隆由生工公司测序。利用NCBI在线Blast软件(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)对所得序列进行比对分析，确定分离到内生真菌菌株EF01的种属。
(3)真菌发酵液的制备和接种
取菌株EF01在PDA固体培养基上，室温(25℃)培养3d。用打孔器在菌落边缘取直径约5mm的菌饼3块，接于100mL PDA液体培养基(固体培养基去除琼脂)中，28℃，100r/min培养5天。培养液经滤纸过滤，所得滤液与MS液体培养基按体积比1:9混合，加入终浓度10g/L琼脂后灭菌，作为实验组培养基，用于培养三叶青无菌组培苗；以等量的无菌水与MS液体培养基体积比1:9的混合作为对照组培养基。
(4)三叶青生长情况的分析
取形态及生长状况一致的组培苗(组培苗的获取方法来源同文献：Du S,Xiang T,Song Y,Huang L,Sun Y,Han Y.Transgenic hairy roots of Tetrastigma hemsleyanum:induction,propagation,genetic characteristics and medicinal components.PlantCell,Tissue and Organ Culture,2015,122(2):373-382)，在超净工作台上用电子天平称取0.3g鲜重的无菌苗枝条，分别插入步骤(3)实验组和对照组培养基上。每组处理重复3次，25℃/18℃(昼/夜)，2000lux，12h/d。30天后，取出无菌苗洗去根部琼脂，测量鲜重。
(5)三叶青扩展蛋白基因表达的分析
在步骤(4)实验组和对照组上培养30天的三叶青组培苗，利用生工RNA抽提试剂盒分别提取叶、茎和细根的RNA，用cDNA合成试剂盒(TransGen公司)获取cDNA第一链。以actin基因作为内参，设计actin引物actin-F(5’-GCCCTTGACTATGAGCAGGA-3’)和actin-R(5’-GAAAAGGACTTCAGGGCAGC-3’)。根据GenBank登录号：KP693606，设计三叶青扩展蛋白基因(Th-exp)引物Thexp-F:(5’-CCCTGGTAGATGGCGAACTT-3’)和Thexp-R(5’-AACCGCCACTAATTTCTGCC-3’)。利用Bestar SybrGreen qPCR Mastermix Kit(DBIBioscience公司)配制qRT-PCR反应体系。使用Step One PlusTM Real-Time PCR System(Applied Biosystems公司)进行扩增，PCR反应程序为95℃预变性2min，按照95℃变性10s，55℃退火31s，72℃延伸30s，进行40个循环。根据Schmittgen and Livak(2008)报道的方法计算Th-exp基因的相对表达量(Schmittgen TD,Livak KJ.Analyzing real-time PCRdata by the comparative C(T)method.Nat Protoc,2008,3(6):1101-1108)。
(6)三叶青总黄酮含量的测定
剪取步骤(4)实验组和对照组三叶青的叶，70℃烘干，用粉碎机研成粉末。称取0.1g放入5mL的离心管，加入1.5mL体积浓度50％乙醇水溶液。使用超声提取仪提取0.5h，11000r/min离心后，取上清加入体积浓度50％乙醇水溶液至2.5mL，即为总黄酮溶液。吸取得到的总黄酮溶液1.0mL置于25mL容量瓶中，加入体积浓度50％乙醇水溶液至9mL，加入质量浓度5％NaNO2水溶液1mL摇匀，放置6min，再加入质量浓度10％的Al(NO3)3水溶液1mL，摇匀后放置6min，最后加入质量浓度10％的NaOH水溶液10mL，用体积浓度50％乙醇水溶液定容至25mL，摇匀，静置15min，对样品进行显色。用紫外分光光度计测定500nm处的吸光值，并根据制定的标准曲线(标准曲线的准备同文献：Du S,Xiang T,Song Y,Huang L,Sun Y,HanY.Transgenic hairy roots of Tetrastigma hemsleyanum:induction,propagation,genetic characteristics and medicinal components.Plant Cell,Tissue and OrganCulture,2015,122(2):373-382)计算各个样品中总黄酮含量。芦丁作为总黄酮的标准品(生工公司)。
2、结果
(1)块根内生真菌的分离
块根切块在PDA培养基上培养3天左右，菌丝体开始从切口处长出(图1，图中左边切块未有内生真菌，右边切块长出内生真菌)，而对照无菌体生长，表明外植体表面消毒彻底，长出的菌丝体为三叶青块根的内生真菌。挑取菌丝体尖端在PDA平板上纯化3-5次后可获得单一的菌落。在10次独立的实验中，根据菌落形态学特征的鉴定，共分离获得45株真菌。其中编号EF01菌株菌落形态见图2。
(2)菌株EF01的分类鉴定
使用引物ITS1和ITS4，对EF01株内生真菌ITS rDNA序列进行PCR扩增，均扩增出条带，大小约550bp(图3，图中第1泳道是DNA标准分子量，第2泳道是扩增的产物)。经过连接到克隆载体pMD19-T，挑选转化的阳性克隆测序，获得ITS序列，长度为558bp(SEQ ID NO.1所示)。ITS序列通过Blast比对结果表明，EF01菌株属于小不整球壳属(Plectosphaerellasp.)，即为小不整球壳菌(Plectosphaerella sp.)EF01。
EF01株内生真菌ITS rDNA序列(SEQ ID NO.1)：
TCCTCCGCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTATTCCTACCTGATCCGAGGTCAACCTTGGTGCCGCCGGAGCGGGCTTGTTGGGGGGTTTAGAGGCAGGAGAGCCCGCCGGCTCCCGATGCGAGGCTAATGCTACTACGCAAAGGAAGGGCCTAACGGGTCCGCCACTGTATTTCGGGGCCTGCCGTGGCAGATCCCCAACGCCGGGCCACGAGGGCTCGAGGGTTGAAACGACGCTCGGACAGGCATGCCTCCCAGGATACTGGAAGGCGCCATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACATATCGCGTTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCTGGAGCCAAGAGATCCGTTGTTAAAAGTTTTGACAGTTCGCTAAGAACACTCAGAAGTATCGTCGGGTTCGAAAACAGAGATTCTGATGAGACCGGCGGGCGCCCGCGAGGGACGCCGCCGAAGCAACAGGTATAATGGTTCACAAAGGGTAGTGAGTGTAGTACTCGGTAATGATCCCTCCGCAGGTTCACCTACGGA。
(3)EF01对三叶青植株生长的影响
EF01菌株对三叶青组培苗生长的影响表现。在实验组培养基上培养的无菌苗，与对照组相比，表现为新生叶片稍增大，植株生长加快，根系生长加快(图4，图中左边：在实验组培养基上生长的植株，右边：在对照组培养基上生长的植株)。0.3g的枝条，在实验组培养基上培养30天后，鲜重增加量为0.426g；而对照组鲜重增加量为0.230g，实验组比对照组提高近1倍以上。而且，实验组植株的根长也为对照组的1倍以上。由此可见，EF01菌株显著促进植株的生长发育，尤其是能促进根的生长。
(4)EF01对三叶青扩展蛋白基因表达的影响
三叶青在实验组培养基上生长30d，荧光定量PCR检测Th-exp基因的相对表达量。与对照相比，实验组的三叶青叶、茎和根中Th-exp表达量均上调(图5)。
(5)EF01对三叶青总黄酮含量的影响
总黄酮含量测定结果显示，虽然三叶青根、茎和叶黄酮含量的不同，但在EF01处理后，三叶青根、茎和叶中总黄酮含量分别可达约为36.50mg/gDW、41.32mg/g·DW和20.51mg/gDW。而对照根、茎和叶中约为19.51mg/gDW、22.09mg/gDW和9.26mg/gDW。EF01发酵液处理，植株根、茎和叶中黄酮含量均显著增加。
SEQUENCE LISTING
<110> 杭州师范大学
<120> 一种从三叶青块根中分离的小不整球菌EF01及其应用
<130>
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 558
<212> DNA
<213> Plectosphaerella sp.
<400> 1
tcctccgctt attgatatgc ttaagttcag cgggtattcc tacctgatcc gaggtcaacc 60
ttggtgccgc cggagcgggc ttgttggggg gtttagaggc aggagagccc gccggctccc 120
gatgcgaggc taatgctact acgcaaagga agggcctaac gggtccgcca ctgtatttcg 180
gggcctgccg tggcagatcc ccaacgccgg gccacgaggg ctcgagggtt gaaacgacgc 240
tcggacaggc atgcctccca ggatactgga aggcgccatg tgcgttcaaa gattcgatga 300
ttcactgaat tctgcaattc acattacata tcgcgtttcg ctgcgttctt catcgatgct 360
ggagccaaga gatccgttgt taaaagtttt gacagttcgc taagaacact cagaagtatc 420
gtcgggttcg aaaacagaga ttctgatgag accggcgggc gcccgcgagg gacgccgccg 480
aagcaacagg tataatggtt cacaaagggt agtgagtgta gtactcggta atgatccctc 540
cgcaggttca cctacgga 558
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 2
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<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 3
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<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 4
ccctggtaga tggcgaactt 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 5
aaccgccact aatttctgcc 20

Claims (4)

1.一种从三叶青块根中分离的小不整球壳菌(Plectosphaerella sp.)EF01，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期2016年10月13日，保藏编号CGMCC NO.12968，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。
2.一种权利要求1所述小不整球壳菌EF01在促进三叶青生长、提高总黄酮含量中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的应用为：将小不整球壳菌EF01接种在PDA固体培养基上，室温培养1-5d；取菌饼接于PDA液体培养基中，25-30℃、50-200r/min培养1-10天，将培养液进行过滤，所得滤液与MS液体培养基按体积比1:5-20混合，加入终浓度1-20g/L琼脂后灭菌，获得组培苗培养基；接种三叶青无菌组培苗于所述的组培苗培养基，在18-25℃、1000-3000lux、5-15h/d条件下培养，获得所述的三叶青植株。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的应用为：将小不整球壳菌EF01接种在PDA固体培养基上，室温培养3d；取菌饼接于PDA液体培养基中，28℃、100r/min培养5天，培养液经滤纸过滤，所得滤液与MS液体培养基按体积比1:9混合，加入终浓度10g/L琼脂后灭菌，获得组培苗培养基；接种三叶青无菌组培苗于所述的组培苗培养基，在18-25℃、2000lux、12h/d条件下培养，获得所述的三叶青植株。
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