CN104611234B - 一种木生药用真菌的分离方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种木生药用真菌的分离方法，包括在密闭条件下，使药用真菌子实体萌发，进行菌丝培养。本发明方法中采用新鲜的子实体作为最适宜菌丝萌发的天然基质进行分离、纯化培养，显著提高了木生真菌的分离成功率，木生真菌的分离成功率高达85％以上，采用本发明方法已成功分离了多种应用价值很高的药用真菌，例如桑黄、槐耳、杨黄、灵芝、桦茸等，为具有高药用价值的真菌提供了新的培养途径。

Description

一种木生药用真菌的分离方法
技术领域
本发明涉及一种大型真菌的分离方法，特别涉及木生药用真菌的分离方法，属于微生物领域。
背景技术
木生真菌是指生长在木材上如各种活立木、枯立木、倒木、落枝、伐桩、贮木场的原木、矿木、枕木、桥梁等建筑材料和各种木制品上的一类真菌，能够降解木材中组成植物细胞壁多的木质素、纤维素或半纤维素。木生真菌是高等真菌的重要类群，作为森林生态的组成部分，它们通过分泌产生各种生物酶，将木材中的纤维素、半纤维素和木质素分解成为可被其他生物利用的营养物质，是分解纤维素和木材原始成分木质素的主要动力，在森林生态系统物质循环和能量流动中起着关键的降解还原作用。同时，木生真菌还是重要的生物资源，与人类的生产和生活密切相关，具有重要的应用和经济价值。
其中，木生药用真菌泛指一类以木材为生长基质，在立木、树桩、倒木或腐木上能够形成大型子实体或菌核且具有一种或多种药用功能的真菌类群。药用真菌的绝大多数野生种类生长在森林中，有的是在树木上寄生或腐生，有的则与林木共生。
药用真菌在中国传统医药中起着十分重要的作用，是中草药的重要组成部分，其所含的真菌多糖或多肽等活性物质，具有降血压、降血脂、降血糖、降低胆固醇、清除血液垃圾、软化血管、预防血管内壁粥样硬化、抗血栓、保肝、健肾、补血、促进胃肠蠕动、加速排毒、减缓艾滋病症状等诸多功能，药用真菌具有其他植物药材所不可代替的功效，特别是含有大量的真菌多糖和三萜类化合物，因此药用真菌在治疗慢性疾病、增强人体免疫力、提高人体健康水平等方面发挥着越来越重要的作用。如具有抗肿瘤活性的著名真菌桑黄Inonotussanghuang S.H.Wu,T.Hatt.&Y.C.Dai、灵芝Gannoderma lingzhi H.Wu,Y.C Dai&Y.Cao和桦褐孔菌Inonotus obliquus(Ach.ex Pers.)Pilát等都是重要的木生药用真菌。
我国是世界上生物资源最为丰富的国家之一，同样，药用真菌也十分丰富。菌种是药用真菌产业发展的基本生物资源和生产材料，在药用真菌产业发展和技术研发中都有着不可替代的作用，对药用真菌的研究也需要获得菌株，而药用真菌的绝大多数野生种类生长在森林中，因此，从野生子实体上分离出菌种显得尤为重要。
硬质的木生药用真菌，其子实体种类新鲜时木栓质至木质，不易与基物分离。目前的分离方法是将木生真菌的子实体直接放入培养皿的培养基中，但由于木生真菌生长缓慢，被污染的概率很高，成功分离目的菌株率极低(约为15％)。
目前的基质分离法：从新鲜的木生真菌子实体中切出干净的组织块，在酒精灯火焰上快速移动几次进行表面消毒灭菌，然后在无菌条件下将其切成2mm×4mm的小块接种于麦芽汁培养基(麦芽浸粉20.0g/L，琼脂粉18.0g/L，葡萄糖10g/L，pH自然，121℃高压灭菌30min)上，在25℃条件下恒温培养，3–5天后可见白色或黄色菌丝出现，挑取菌丝进行纯化后保存，每个子实体重复10次。
发明内容
本发明的目的是针对现有硬质木生药用真菌组织块的分离纯化过程中存在的分离成功率低的技术缺陷，提供一种硬质木生药用真菌的分离方法，本发明方法的分离成功率高，纯化效果显著，为今后木生药用真菌的分离和保藏提供了一种高效的新途径。
为实现本发明的目的，本发明一方面提供一种硬质木生药用真菌的分离方法，包括对新鲜真菌的子实体进行萌发培养，获得真菌菌丝。
其中，所述新鲜真菌子实体的含水率≥40％，子实体在放大镜下边缘呈絮状。
特别是，所述放大镜放大倍数≥10倍。
其中，所述子实体萌发培养是将新鲜真菌的子实体置于无菌密封容器中，子实体自身萌发菌丝。
特别是，在子实体萌发过程中真菌的子实体自身作为营养基质，萌发菌丝。
其中，所述子实体萌发培养的培养温度为20±2℃。
特别是，所述子实体萌发培养的相对湿度为60-70％。
特别是，还包括对新鲜的子实体进行表面消毒处理，即采用75％的酒精擦拭新鲜木生药用真菌子实体表面，对子实体的表面进行酒精消毒，获得表面消毒子实体，然后在进行所述的子实体萌发培养。
尤其是，还包括在萌发培养之前，将子实体于无菌密封容器中静置10±2h，进行相对湿度的确定。
特别是，静置过程中的温度为20±2℃。
特别是，还包括将靠近基部的新鲜真菌子实体分割成子实体块后再进行所述的子实体萌发培养。
尤其是，所述子实体块的大小为(2-6)cm×(2-6)cm×(2-6)cm，优选为3cm×2cm×3cm。
其中，还包括将萌发培养获得的菌丝接种于麦芽汁平板培养基中，进行分离、纯化培养，获得纯化的木生药用真菌菌落。
特别是，所述分离、纯化培养的培养温度为25±2℃。
其中，每升所述麦芽汁培养基中含有麦芽浸粉为20.0g、琼脂为18.0g、葡萄糖10.0g、KH2PO43g、青霉素0.2g、链霉素0.2g，pH为5.0±0.2，即所述麦芽汁培养基的配方为麦芽浸粉20.0g/L，琼脂为18.0g/L、葡萄糖10.0g/L、KH2PO43.0g/L、青霉素0.2g/L、链霉素0.2g/L。
特别是，所述麦芽汁培养基按照如下方法配制而成：
1)按照如下配比备料
麦芽浸粉为20.0g/L、琼脂为18.0g/L、葡萄糖10.0g/L、KH2PO43g/L、青霉素0.2g/L、链霉素0.2g/L；
2)首先将麦芽浸粉、琼脂、葡萄糖溶于无菌水中，搅拌均匀；接着加入HCl溶液调节培养基的pH调至5.0±0.2；然后在121℃下进行高压灭菌30min，最后待培养基温度降低至50℃以下后加入青霉素、链霉素，摇匀，即得。
尤其是，步骤2)中所述HCl溶液的浓度为0.5-1mol/L；温度降低至50℃以下后加入青霉素、链霉素。
特别是，还包括对分离、纯化培养后的木生药用真菌菌落进行菌丝质量检测，采用引物ITS4/ITS5对分离、纯化后的药用真菌的核糖体RNA(rRNA)的内转录间隔区(InternalTranscribed Spacer，ITS)进行PCR扩增，接着将PCR扩增产物进行测序，将所得序列在GenBank中进行BLAST比较、搜索，即可确定分离纯化是否成功。
特别是，所述木生药用真菌为桑黄、灵芝、槐耳、瓦宁纤孔菌(又称杨黄)、迪氏迷孔菌、木蹄层孔菌，优选为灵芝、杨黄。
尤其是，所述灵芝为灵芝Ganoderma lingzhi BJFC-C1265，其微生物保藏号是：CGMCC NO.10310；分类命名是：Ganoderma lingzhi；保藏时间：2015年01月07日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)。其中，灵芝Ganoderma lingzhi BJFC-C1265与灵芝Ganoderma lingzhi S.H.Wu,Y.C.Dai&Y.Cao的序列完全一致。
尤其是，所述杨黄(学名瓦宁纤孔菌)为瓦宁纤孔菌Inonotus vaninii BJFC-C0301，其微生物保藏号是：CGMCC NO.10309；分类命名是：Inonotus vaninii；保藏时间：2015年01月07日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)。其中，杨黄(瓦宁纤孔菌)Inonotus vaninii BJFC-C0301与杨黄Inonotus vaninii(Ljub.)T.Wagner&M.Fisch的序列完全一致。
本发明方法与目前硬质木生真菌的分离方法的重要不同是将采集的新鲜的子实体上作为菌丝萌发的生长基质，萌发产生菌丝，新鲜的子实体是最适宜菌丝萌发的天然基质，而目前方法是将子实体直接插入培养基，以培养基为营养基质，产生菌落。此外，硬质的木生真菌喜弱酸性，将萌发后的菌丝束转接入酸性培养基，比pH自然的培养基更有利于木生真菌的分离和纯化。
本发明的硬质木生药用真菌的分离方法具有如下优点：
1、本发明方法分离硬质木生药用真菌的成功率高，达到85％以上，显著提高了硬质木生药用真菌的分离成功率(现有硬质木生药用真菌分离技术成功分离目的菌株率极低，约为15％)。
2、本发明分离硬质木生药用真菌的培养基为弱酸性培养基，其酸碱性与硬质木生药用真菌天然生长基质相类似，利于硬质木生药用真菌的分离和纯化。
3、本发明方法从硬质木生药用真菌子实体直接培养出菌丝后在接种于弱酸性培养基进行分离、纯化，将木生药用真菌的子实体作为天然基质，为菌丝萌发提供了最适宜的天然环境，不但操作简单、节约成本，而且菌丝萌发快，长势强。
4、采用本发明方法应用广泛，已成功分离了多种应用价值很高的药用真菌，例如桑黄、槐耳、杨黄、灵芝、桦茸等，为高药用价值的真菌提供了新的培养途径。
总之，本发明硬质木生药用真菌的分离方法操作简捷，成本低，菌丝分离成功率高，菌丝萌发快，长势强，适用主要木生真菌的组织分离，应用范围较广。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1配制培养基
1、按照表1的配方备料
表1本发明麦芽汁培养基配方
成分 含量(g/L) 成分 含量(g/L)
麦芽浸粉 20.0 KH2PO4 3.0
琼脂粉 18.0 链霉素 2.0
葡萄糖 10.0g 青霉素 2.0
麦芽汁培养基的配方：麦芽浸粉、琼脂粉、葡萄糖、KH2PO4、链霉素、青霉素、无菌水。
2、配制方法
根据配制培养基的量称取麦芽浸粉、琼脂粉、葡萄糖、KH2PO4，溶于相应体积的无菌水中，搅拌均匀后加入稀HCl(浓度为0.5-1mol/L)，调节培养基的pH调至5.0±0.2；接着在121℃下进行高压灭菌30min，然后待培养基温度降低至50℃以下后加入食量的青霉素、链霉素，摇匀后制得麦芽汁培养基。
本发明实施例中称取麦芽浸粉20.0g，琼脂粉18.0g、葡萄糖10.0g、KH2PO43.0g溶于1L无菌水中，搅拌均匀后加入稀HCl(浓度为0.5-1mol/L)，调节培养基的pH调至5.0±0.2；接着在121℃下进行高压灭菌30min，然后待培养基温度降低至50℃以下后加入青霉素0.2g、链霉素0.2g，摇匀后制得麦芽汁培养基。
3、制备平板培养基和斜面培养基
3-1)平板培养基的配制方法：
将步骤2制备的麦芽汁培养基趁热分装在直径为60mm的平板培养皿中，装液量约10mL。
优点：菌丝生长迅速，是否感染杂菌一目了然，很容易鉴别。
3-2)斜面培养基的配制方法：
将步骤2制备的麦芽汁培养基趁热分装于规格为18×18mm的试管中，装液量为试管高度的1/4，塞上硅胶塞，捆扎，经高压灭菌后再将试管倾斜放置得到斜面培养基。
硬质木生大型真菌适于在酸性调节下生长，喜弱酸性基质，将培养基调节成弱酸性更有利于木质要用真菌的分离和纯化，本发明硬质木生药用真菌的培养基呈酸性。
实施例2：灵芝分离：
1、木生药用真菌的初步鉴定
2010年08月于山东省泰安市泰山景区，用刀割取栎树腐根上的野生灵芝(Ganoderma lingzhi BJFC-C1265)的子实体，置于无菌密封袋中，低温保存，备用；野外采集灵芝子实体：灵芝子实体一年生，具中生或侧生菌柄；菌盖平展盖形，新鲜时软木栓质，干燥后变为木栓质，外伸可达16cm，宽可达12cm，基部厚可达2.6cm；菌盖上表面幼时浅黄褐色，具似漆样光泽，成熟时颜色为黄褐色至紫褐色，具同心环带，通常被褐色的孢子粉覆盖；边缘钝或锐，干后常内卷；管口表面新鲜时奶油色，干后污白色至浅褐色，不育边缘明显，宽可达4mm；管口边薄且全缘；菌肉木材色至浅褐色，双层，上层菌肉颜色浅，下层菌肉颜色深，软木栓质，厚可达1cm，菌管褐色，木栓质，明显比菌肉颜色深。子实体不易腐烂，与基物着生紧密；子实体的含水率≥40％(约为50％)，子实体在放大镜下边缘呈絮状。
2、制备新鲜的子实体块
将经过宏观特征初步鉴定的新鲜、野生的灵芝(Ganoderma lingzhi BJFC-C1265)子实体去除与子实体无关的其他杂质后，在无菌操作台上，无菌条件下，用75％的酒精棉球擦拭新鲜灵芝子实体表面，对灵芝子实体的表面进行酒精消毒，获得表面消毒子实体；
用已消毒的刀切取表面消毒子实体靠近基部的菌肉组织块，并切成尺寸为3cm×2cm×3cm的子实体块；
3、子实体萌发培养
3-1)在无菌条件下，用无菌镊子将子实体小块放入无菌的密封袋(5#)中，于(20±2)℃条件下，静置(10±1)小时，接着用手持电子温湿度计测量密封袋中的相对湿度，控制密封袋内相对湿度为(65±5)％，即采用在密封袋内放置干燥的无菌滤纸吸收子实体过多的水分或放置湿润的无菌滤纸补充密封袋内的湿度，使得密封袋内的相对湿度保持为60-70％；
3-2)在保持温度为(20±2)℃条件下，将密封袋放置3-7天，每天用手持电子温湿度计检测密封袋内的相对湿度，使密封袋内相对湿度保持为(65±5)％，子实体块萌发，每天在体视显微镜下观察菌丝萌发情况，直至观察到子实体小块切面出现白色菌丝束。
4、分离、纯化培养
4-1)挑取子实体切面萌发出的白色菌丝接种于平板培养基中，于25±2℃的恒温培养箱中倒置培养，期间每天在体视显微镜下观察菌丝生长情况，直至培养基中生长出菌落。
4-2)挑取平板培养基上远离杂菌的菌丝接种到新的平板培养基中，于25±2℃的恒温箱中倒置培养，每天在体视显微镜下观察菌丝生长情况(灵芝的菌丝为白色，观察为细密的绒毛状)，发现杂菌菌落后，重复挑取远离杂菌菌落的菌丝再接种到新的平板培养基中，于25±2℃的恒温箱中倒置培养，直至培养基中为纯净的灵芝菌落。
5、菌丝质量检测
5-1)挑取适量的纯净灵芝菌落的菌丝，利用CTAB植物基因组DNA快速提取试剂盒提取DNA；
5-2)采用目前真菌鉴定中应用最广泛的通用引物ITS4/ITS5对其核糖体RNA(rRNA)的内转录间隔区(Internal Transcribed Spacer,ITS)进行PCR扩增，接着将PCR扩增产物由英潍捷基(上海)贸易有限公司测序，然后在GenBank中进行BLAST比较、搜索，确定分离纯化成功，比对结果与灵芝Ganoderma lingzhi S.H.Wu,Y.C.Dai&Y.Cao的序列完全一致，鉴定为灵芝Ganoderma lingzhi S.H.Wu,Y.C.Dai&Y.Cao。
本发明的野外采集的灵芝为灵芝Ganoderma lingzhi BJFC-C1265，其微生物保藏号是：CGMCC NO.10310；分类命名是：Ganoderma lingzhi；保藏时间：2015年01月07日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路，中国科学院微生物研究所；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)。
实施例3：杨黄(即瓦宁纤孔菌)分离
1、木生药用真菌的初步鉴定
2007年08月于吉林长白山，用刀割取阔叶树倒木上的野生杨黄(Inonotusvaninii BJFC-C0301)的子实体，置于无菌密封袋中，低温保存，备用；野外采集杨黄子实体：担子果多年生，平伏至无柄盖型，新鲜时无嗅无味；菌盖表面红褐色至灰黑色，具有不明显的环带；边缘鲜黄色，在KOH试剂中变血红色；孔口表面栗褐色，具折光反应；不育边缘明显，鲜黄色，宽可达1mm，管口边缘薄，全缘或撕裂；菌肉鲜黄色至乌褐色，硬木质，具同心环带，厚可达3cm，有时具一层薄的黑色环纹，通常具有白色菌丝束，成熟后菌盖覆盖一层黑色的薄皮壳；菌管与孔口表面同色，硬木栓质，菌管分层明显，长达20mm；子实体的含水率≥40％(约为50％)，子实体在放大镜下边缘呈絮状。
2、制备新鲜的真菌子实体块
将经过宏观特征初步鉴定的新鲜、野生的杨黄(Inonotus vaninii BJFC-C0301)子实体去除与子实体无关的其他杂质后，在无菌操作台上，无菌条件下，用75％的酒精棉球擦拭新鲜杨黄子实体表面，对杨黄子实体的表面进行酒精消毒，获得表面消毒子实体；
用已消毒的刀切取表面消毒子实体靠近基部的菌肉组织块，并切成尺寸为3cm×2cm×2cm的子实体块；
子实体块的大小尺寸根据新鲜杨黄子实体的大小进行切取，尺寸大小为(2-6)cm×(2-6)cm×(2-6)cm的子实体块均适用于本发明方法。
3、子实体萌发培养
3-1)在无菌条件下，用无菌镊子将子实体小块放入无菌的密封袋(5#)中，于(20±2)℃条件下，静置(10±1)小时，接着用手持电子温湿度计测量密封袋中的相对湿度，，控制密封袋内相对湿度为(65±5)％，即采用在密封袋内放置干燥的无菌滤纸吸收子实体过多的水分或放置湿润的无菌滤纸补充密封袋内的湿度，使得密封袋内的相对湿度保持为60-70％；
若相对湿度大于70％，说明子实体水分过量，需在密封袋内放入干燥无菌的吸水滤纸，具体放入量：相对湿度为70％-80％，放入1张滤纸(直径7cm)；相对湿度为80％-90％，放入2张滤纸(直径7cm)；相对湿度>90％，将子实体块取出密封袋，放在无菌台中5-8小时后再装入干燥无菌的密封袋中；
3-2)在保持温度为(20±2)℃条件下，将密封袋放置3-7天，每天用手持电子温湿度计检测密封袋内的相对湿度，使密封袋内相对湿度保持为(65±5)％，子实体块萌发，每天在体视显微镜下观察菌丝萌发情况，直至观察到子实体小块切面出现黄褐色菌丝束。
4、分离、纯化培养
4-1)挑取子实体萌发出的黄褐色菌丝接种于平板培养基中，于25±2℃的恒温培养箱中倒置培养，期间每天在体视显微镜下观察菌丝生长情况，直至培养基中生长出菌落。
4-2)挑取平板培养基上远离杂菌的杨黄菌丝接种到新的平板培养基中，于25±2℃的恒温箱中倒置培养，每天在体视显微镜下观察菌丝生长情况(杨黄的菌丝为黄色至黄褐色，观察为细密的绒毛状)，发现杂菌菌落后，重复挑取远离杂菌菌落的菌丝再接种到新的平板培养基中，于25±2℃的恒温箱中倒置培养，直至培养基中为纯净的杨黄菌落。
5、菌丝质量检测
5-1)挑取适量的纯净杨黄菌落的菌丝，利用CTAB植物基因组DNA快速提取试剂盒提取杨黄菌落菌丝的DNA；
5-2)采用目前真菌鉴定中应用最广泛的通用引物ITS4/ITS5对其核糖体RNA(rRNA)的内转录间隔区(Internal Transcribed Spacer,ITS)进行PCR扩增，接着将PCR扩增产物由英潍捷基(上海)贸易有限公司测序，然后在GenBank中进行BLAST比较、搜索，确定分离纯化成功，比对结果与杨黄Inonotus vaninii(Ljub.)T.Wagner&M.Fisch的序列完全一致，鉴定为杨黄Inonotus vaninii(Ljub.)T.Wagner&M.Fisch(学名瓦宁纤孔菌)。
6、保存菌株
挑取纯化成功的菌落转入斜面培养基，放入25±2℃的恒温培养箱中倒置培养，待菌丝长满斜面培养基后(长势强的菌丝约10天即可长满斜面培养基，长势较弱的菌丝约15天长满)，放入4℃冰箱冷藏保存。
本发明的野外采集的杨黄为瓦宁纤孔菌Inonotus vaninii BJFC-C0301，其微生物保藏号是：CGMCC NO.10309；分类命名是：Inonotus vaninii；保藏时间：2015年01月07日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路，中国科学院微生物研究所；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)。
实施例4：桑黄分离
1、木生药用真菌的初步鉴定
2014年07月于云南省昆明市黑龙潭公园，用刀割取桑树上的野生桑黄的子实体，置于无菌密封袋中，低温保存，备用；野外采集的桑黄子实体：担子果多年生，无柄盖形，通常单生，新鲜时具酸味，木栓质，干后木质；菌盖马蹄形，外伸可达5cm，宽可达7cm，基部厚4cm，菌肉黄色，比菌管颜色浅，菌盖表面黄褐色至灰褐色，被纤细的绒毛至光滑，具明显的环沟和环区；边缘钝，鲜黄色；孔口表面新鲜时黄色，干后褐色，略具折光反应；不育边缘明显，宽可达3mm；孔口圆形至多角形，每毫米8-9个；孔口边缘薄，全缘；菌肉黄色，比菌管颜色浅，硬木栓质，环区明显，具黑线，厚可达3.5cm，菌管褐色，木栓质，不易腐烂，与基物着生紧密；子实体的含水率≥40％(约为60％)，子实体在放大镜下边缘呈絮状。
2、制备新鲜的子实体块
将经过宏观特征初步鉴定的新鲜、野生的桑黄子实体去除与子实体无关的其他杂质后，在无菌操作台上，无菌条件下，用75％的酒精棉球擦拭新鲜桑黄子实体表面，对桑黄子实体的表面进行酒精消毒，获得表面消毒子实体；
用已消毒的刀切取表面消毒子实体靠近基部的菌肉组织块，并切成尺寸为3cm×2cm×3cm的子实体块；
子实体块的大小尺寸根据新鲜桑黄子实体的大小进行切取，尺寸大小为(2-6)cm×(2-6)cm×(2-6)cm的子实体块均适用于本发明方法。
发明人通过实验发现，靠近子实体基部的菌肉组织块，相对来说，一是杂菌污染少，二是该部位是营养菌丝生长活力相最旺盛。操作重复5次。
3、子实体萌发培养
3-1)在无菌条件下，用无菌镊子将子实体小块放入无菌的密封袋(5#)中，于(20±2)℃条件下，静置(10±1)小时，接着用手持电子温湿度计测量密封袋中的相对湿度，控制密封袋内相对湿度为(65±5)％，即采用在密封袋内放置干燥的无菌滤纸吸收子实体过多的水分或放置湿润的无菌滤纸补充密封袋内的湿度，使得密封袋内的相对湿度保持为60-70％；
若相对湿度大于70％，说明子实体水分过量，需在密封袋内放入干燥无菌的吸水滤纸，具体放入量：相对湿度为70％-80％，放入1张滤纸(直径7cm)；相对湿度为80％-90％，放入2张滤纸(直径7cm)；相对湿度>90％，将子实体块取出密封袋，放在无菌台中5-8小时后再装入干燥无菌的密封袋中；
3-2)在保持温度为(20±2)℃的条件下，将密封袋放置3-7天，每天用手持电子温湿度计检测密封袋内的相对湿度，使密封袋内相对湿度保持为(65±5)％，子实体块萌发，每天在体视显微镜下观察菌丝萌发情况，直至观察到子实体小块切面出现淡黄色菌丝束。
将木生药用真菌的子实体作为天然基质，为菌丝萌发提供了最适宜的天然环境。湿度是影响真菌菌丝萌发主要因素，此法不需要大型设备和复杂的操作，即可通过密封袋控制湿度，保持水分不流失的同时，又避免野外采集时，对新鲜子实体的二次污染。
4、分离、纯化培养
4-1)挑取子实体萌发出的淡黄色菌丝接种于平板培养基中，于25±2℃的恒温培养箱中倒置培养，期间每天在体视显微镜下观察菌丝生长情况，直至培养基中生长出菌落。
4-2)挑取平板培养基上远离杂菌的菌丝接种到新的平板培养基中，于25±2℃的恒温箱中倒置培养，每天在体视显微镜下观察菌丝生长情况(桑黄的菌丝为淡黄色至黄色，观察为细密的绒毛状)，发现杂菌菌落后，重复挑取远离杂菌菌落的菌丝再接种到新的平板培养基中，于25±2℃的恒温箱中倒置培养，直至培养基中为纯净的桑黄菌落。
5、菌丝质量检测
5-1)挑取适量的纯净桑黄菌落的菌丝，利用CTAB植物基因组DNA快速提取试剂盒提取桑黄菌落菌丝的DNA；
5-2)采用目前真菌鉴定中应用最广泛的通用引物ITS4/ITS5对其核糖体RNA(rRNA)的内转录间隔区(Internal Transcribed Spacer,ITS)进行PCR扩增，接着将PCR扩增产物由英潍捷基(上海)贸易有限公司测序，然后在GenBank中进行BLAST比较、搜索，确定分离纯化成功，比对结果与桑黄Inonotus sanghuang S.H.Wu,T.Hatt.&Y.C.Dai的序列完全一致，鉴定为桑黄Inonotus sanghuang S.H.Wu,T.Hatt.&Y.C.Dai。
6、菌株保存
挑取纯化成功的菌落转入斜面培养基，放入25±2℃的恒温培养箱中倒置培养，待菌丝长满斜面培养基后，放入4℃冰箱冷藏保存。
实施例5：槐耳分离
1、木生药用真菌的初步鉴定
2010年08月于山东省泰安市泰山景区，用刀割取刺槐活树树干上的野生槐耳子实体，置于无菌密封袋中，低温保存，备用；野外采集的槐耳子实体：担子果通常多年生，盖状，通常覆瓦状叠生，新鲜时无特殊气味，革质至木栓质，干后木栓质；菌盖半圆形，外伸可达6cm，宽可达10cm，基部厚可达2.2cm；菌盖上表面浅黄色至红褐色或污褐色，同心环带不明显，活跃生长期间具细绒毛，后期脱落，表面变为粗糙至光滑；边缘锐或钝；孔口表面灰褐色，手触后变为浅棕褐色，无折光反应；孔口圆形，每毫米4-6个；管口边缘钝，全缘；菌肉浅黄色，干后木栓质，厚可达10mm；菌管与菌肉同色，木栓质，长可达12mm；子实体的含水率≥40％(约为50％)，子实体在放大镜下边缘呈絮状。
槐耳一般生长在槐、洋槐及青檀等阔叶树树干上。
2、制备新鲜的真菌子实体块
将经过宏观特征初步鉴定的新鲜、野生的槐耳子实体去除与子实体无关的其他杂质后，在无菌操作台上，无菌条件下，用75％的酒精棉球擦拭新鲜槐耳子实体表面，对槐耳子实体的表面进行酒精消毒，获得表面消毒子实体；
用已消毒的刀切取表面消毒子实体靠近基部的菌肉组织块，并切成尺寸为3cm×2cm×2cm的子实体块；
3、子实体萌发培养
3-1)在无菌条件下，用无菌镊子将子实体小块放入无菌的密封袋(5#)中，于(20±2)℃条件下，静置(10±1)小时，接着用手持电子温湿度计测量密封袋中的相对湿度，控制密封袋内相对湿度为(65±5)％，即采用在密封袋内放置干燥的无菌滤纸吸收子实体过多的水分或放置湿润的无菌滤纸补充密封袋内的湿度，使得密封袋内的相对湿度保持为60-70％；
若相对湿度大于70％，说明子实体水分过量，需在密封袋内放入干燥无菌的吸水滤纸，具体放入量：相对湿度为70％-80％，放入1张滤纸(直径7cm)；相对湿度为80％-90％，放入2张滤纸(直径7cm)；相对湿度>90％，将子实体块取出密封袋，放在无菌台中5-8小时后再装入干燥无菌的密封袋中；
3-2)在保持温度为(20±2)℃的条件下，将密封袋放置3-7天，每天用手持电子温湿度计检测密封袋内的相对湿度，使密封袋内相对湿度保持为(65±5)％，子实体块萌发，每天在体视显微镜下观察菌丝萌发情况，直至观察到子实体小块切面出现黄褐色菌丝束。
4、分离、纯化培养
4-1)挑取子实体萌发出的黄褐色菌丝接种于平板培养基中，于25±2℃的恒温培养箱中倒置培养，期间每天在体视显微镜下观察菌丝生长情况，直至培养基中生长出菌落。
4-2)挑取平板培养基上远离杂菌的菌丝接种到新的平板培养基中，于25±2℃的恒温箱中倒置培养，每天在体视显微镜下观察菌丝生长情况(槐耳的菌丝为黄色至黄褐色，观察为细密的绒毛状)，发现杂菌菌落后，重复挑取远离杂菌菌落的菌丝再接种到新的平板培养基中，于25±2℃的恒温箱中倒置培养，直至培养基中为纯净的槐耳菌落。
5、菌丝质量检测
5-1)挑取适量纯净槐耳菌落的菌丝，利用CTAB植物基因组DNA快速提取试剂盒提取槐耳菌落菌丝的DNA；
5-2)采用目前真菌鉴定中应用最广泛的通用引物ITS4/ITS5对其核糖体RNA(rRNA)的内转录间隔区(Internal Transcribed Spacer,ITS)进行PCR扩增，接着将PCR扩增产物由英潍捷基(上海)贸易有限公司测序，然后在GenBank中进行BLAST比较、搜索，确定分离纯化成功，比对结果与槐耳Perenniporia robiniophila(Murrill)Ryvarden(槐生多年卧孔菌)的序列完全一致，鉴定为槐耳Perenniporia robiniophila(Murrill)Ryvarden。
6、保存菌株
挑取纯化成功的菌落转入斜面培养基，放入25±2℃的恒温培养箱中倒置培养，待菌丝长满斜面培养基后(长势强的菌丝约10天即可长满斜面培养基，长势较弱的菌丝约15天长满)，放入4℃冰箱冷藏保存。
实施例6：迪氏迷孔菌分离
1、木生药用真菌的初步鉴定
2009年07月于河北省兴隆县雾灵山自然保护区，用刀割取栎树倒木上的野生迪氏迷孔菌的子实体，置于无菌密封袋中，备用；野外采集迪氏迷孔菌子实体：担子果多年生，无柄盖形，覆瓦状叠生，新鲜时木栓质，干后硬木质；菌盖半圆形，单个菌盖外伸可达10cm，宽可达20cm，中部厚可达5cm；菌盖表面初期为浅黄色或浅肉色，被细绒毛，后期变为浅肉褐色至深黑褐色，光滑，具同心环带和不明显的放射状纵条纹，有事具小疣和瘤状突起；边缘锐或钝，浅黄色至浅黄褐色；孔口表面浅黄褐色至深褐色；不育边缘明显，宽1-2mm；孔口变化较大，近圆形、多角形、迷宫形或不规则形、几乎褶状，每毫米1-2个；管口边缘薄或厚，全缘；菌肉肉色或浅黄褐色，硬木栓质，无环区，厚可达25mm；菌管单层或多层，与菌肉同色，比管口颜色略浅，硬木栓质。其子实体韧革质或木栓质，不易腐烂，与基物着生紧密；子实体的含水率≥40％(约为50％)，子实体在放大镜下边缘呈絮状。
2、制备新鲜的真菌子实体块
将经过宏观特征初步鉴定的新鲜、野生的迪氏迷孔菌子实体去除与子实体无关的其他杂质后，在无菌操作台上，无菌条件下，用75％的酒精棉球擦拭新鲜迪氏迷孔菌子实体表面，对迪氏迷孔菌子实体的表面进行酒精消毒，获得表面消毒子实体；
用已消毒的刀切取表面消毒子实体靠近基部的菌肉组织块，并切成尺寸为3cm×2cm×2cm的子实体块；
子实体块的大小尺寸根据新鲜迪氏迷孔菌子实体的大小进行切取，尺寸大小为(2-6)cm×(2-6)cm×(2-6)cm的子实体块均适用于本发明方法。
3、子实体萌发培养
3-1)在无菌条件下，用无菌镊子将子实体小块放入无菌的密封袋(5#)中，于(20±2)℃条件下，静置(10±1)小时，接着用手持电子温湿度计测量密封袋中的相对湿度，控制密封袋内相对湿度为(65±5)％，即采用在密封袋内放置干燥的无菌滤纸吸收子实体过多的水分或放置湿润的无菌滤纸补充密封袋内的湿度，使得密封袋内的相对湿度保持为60-70％；
若相对湿度大于70％，说明子实体水分过量，需在密封袋内放入干燥无菌的吸水滤纸，具体放入量：相对湿度为70％-80％，放入1张滤纸(直径7cm)；相对湿度为80％-90％，放入2张滤纸(直径7cm)；相对湿度>90％，将子实体块取出密封袋，放在无菌台中5-8小时后再装入干燥无菌的密封袋中；
3-2)在温度保持为(20±2)℃条件下，将密封袋放置3-7天，每天用手持电子温湿度计检测密封袋内的相对湿度，使密封袋内相对湿度保持为(65±5)％，子实体块萌发，每天在体视显微镜下观察菌丝萌发情况，直至观察到子实体小块切面出现白色菌丝束。
4、分离、纯化培养
4-1)挑取子实体萌发出的白色菌丝接种于平板培养基中，于25±2℃的恒温培养箱中倒置培养，期间每天在体视显微镜下观察菌丝生长情况，直至培养基中生长出菌落。
4-2)挑取平板培养基上远离杂菌的白色菌丝接种到新的平板培养基中，于25±2℃的恒温箱中倒置培养，每天在体视显微镜下观察菌丝生长情况(迪氏迷孔菌的菌丝为纯白色，观察为细密的绒毛状)，发现杂菌菌落后，重复挑取远离杂菌菌落的菌丝再接种到新的平板培养基中，于25±2℃的恒温箱中倒置培养，直至培养基中为纯净的迪氏迷孔菌菌落。
5、菌丝质量检测
5-1)挑取适量纯净迪氏迷孔菌菌落的菌丝，利用CTAB植物基因组DNA快速提取试剂盒提取迪氏迷孔菌菌落菌丝的DNA；
5-2)采用目前真菌鉴定中应用最广泛的通用引物ITS4/ITS5对其核糖体RNA(rRNA)的内转录间隔区(Internal Transcribed Spacer,ITS)进行PCR扩增，接着将PCR扩增产物由英潍捷基(上海)贸易有限公司测序，然后在GenBank中进行BLAST比较、搜索，确定分离纯化成功，比对结果与迪氏迷孔菌Daedalea dickinsii Yasuda。的序列完全一致，鉴定为迪氏迷孔菌Daedalea dickinsii Yasuda。
6、保存菌株
挑取纯化成功的菌落转入斜面培养基，放入25±2℃的恒温培养箱中倒置培养，待菌丝长满斜面培养基后，放入4℃冰箱冷藏保存。
实施例7：木蹄层孔菌分离
1、木生药用真菌的初步鉴定
2009年09月于吉林省安图县长白山自然保护区，用刀割取杨树腐木上的野生木蹄层孔菌的子实体，置于无菌密封袋中；野外采集木蹄层孔菌芝子实体：担子果多年生，蹄型，新鲜时木栓质，无嗅无味，干后硬木质；菌盖外伸可达20cm，宽可达30cm，中部厚可达12cm；菌盖表面灰色至灰黑色，具同心环带和浅的环沟；边缘浅褐色，钝；菌肉浅黄褐色或锈褐色，硬纤维质，通常比菌管层薄，厚可达5cm；孔口圆形，每毫米3-4个；管口边缘厚且全缘；菌管浅褐色，比菌肉颜色略深，木栓质，长达7cm，菌管分层明显，菌管层中间有时具白色的菌丝束；其子实体韧革质或木栓质，不易腐烂，与基物着生紧密；子实体的含水率≥40％(约为50％)，子实体在放大镜下边缘呈絮状。
2、制备新鲜的真菌子实体块
将经过宏观特征初步鉴定的新鲜、野生的木蹄层孔菌子实体去除与子实体无关的其他杂质后，在无菌操作台上，无菌条件下，用75％的酒精棉球擦拭新鲜木蹄层孔菌子实体表面，对木蹄层孔菌子实体的表面进行酒精消毒，获得表面消毒子实体；
用已消毒的刀切取表面消毒子实体靠近基部的菌肉组织块，并切成尺寸为3cm×3cm×3cm的子实体块；
子实体块的大小尺寸根据新鲜木蹄层孔菌子实体的大小进行切取，尺寸大小为(2-6)cm×(2-6)cm×(2-6)cm的子实体块均适用于本发明方法。
3、子实体萌发培养
3-1)在无菌条件下，用无菌镊子将子实体小块放入无菌的密封袋(5#)中，于(20±2)℃条件下，静置(10±1)小时，接着用手持电子温湿度计测量密封袋中的相对湿度，控制密封袋内相对湿度为(65±5)％，即采用在密封袋内放置干燥的无菌滤纸吸收子实体过多的水分或放置湿润的无菌滤纸补充密封袋内的湿度，使得密封袋内的相对湿度保持为60-70％；
若相对湿度大于70％，说明子实体水分过量，需在密封袋内放入干燥无菌的吸水滤纸，具体放入量：相对湿度为70％-80％，放入1张滤纸(直径7cm)；相对湿度为80％-90％，放入2张滤纸(直径7cm)；相对湿度>90％，将子实体块取出密封袋，放在无菌台中5-8小时后再装入干燥无菌的密封袋中；
3-2)在保持温度为(20±2)℃条件下，将密封袋放置3-7天，每天用手持电子温湿度计检测密封袋内的相对湿度，使密封袋内相对湿度保持为(65±5)％，子实体块萌发，每天在体视显微镜下观察菌丝萌发情况，直至观察到子实体小块切面出现白色菌丝束。
4、分离、纯化培养
4-1)挑取子实体切面萌发出的白色菌丝接种于平板培养基中，于25±2℃的恒温培养箱中倒置培养，期间每天在体视显微镜下观察菌丝生长情况，直至培养基中生长出菌落。
4-2)挑取平板培养基上远离杂菌的木蹄层孔菌菌丝接种到新的平板培养基中，于25±2℃的恒温箱中倒置培养，每天在体视显微镜下观察菌丝生长情况(木蹄层孔菌的菌丝为纯白色，观察为细密的绒毛状)，发现杂菌菌落后，重复挑取远离杂菌菌落的菌丝再接种到新的平板培养基中，于25±2℃的恒温箱中倒置培养，直至培养基中为纯净的木蹄层孔菌菌落。
5、检测菌丝质量
5-1)挑取适量纯净木蹄层孔菌菌落的菌丝，利用CTAB植物基因组DNA快速提取试剂盒提取木蹄层孔菌菌落菌丝的DNA；
5-2)采用目前真菌鉴定中应用最广泛的通用引物ITS4/ITS5对其核糖体RNA(rRNA)的内转录间隔区(Internal Transcribed Spacer,ITS)进行PCR扩增，接着将PCR扩增产物由英潍捷基(上海)贸易有限公司测序，然后在GenBank中进行BLAST比较、搜索，确定分离纯化成功，比对结果与木蹄层孔菌Fomes fomentarius(L.)J.J.Kickx的序列完全一致，鉴定为木蹄层孔菌Fomes fomentarius(L.)J.J.Kickx。
6、保存菌株
挑取纯化成功的菌落转入斜面培养基，放入25±2℃的恒温培养箱中倒置培养，待菌丝长满斜面培养基后，放入4℃冰箱冷藏保存。

Claims (7)

1.一种硬质木生药用真菌的分离方法，其特征是：首先将新鲜真菌的子实体置于无菌密闭容器中，进行萌发培养，子实体自身萌发菌丝，获得真菌菌丝；然后将获得的菌丝接种于麦芽汁培养基中，进行分离、纯化培养，获得纯化的药用真菌菌落，其中每升所述麦芽汁培养基中含有麦芽浸粉20.0g，琼脂为18.0g、葡萄糖10.0g、KH2PO43.0g、青霉素0.2g、链霉素0.2g，pH为5.0±0.2，其中，所述硬质木生药用真菌为桑黄、槐耳、瓦宁纤孔菌、迪氏迷孔菌、木蹄层孔菌。
2.如权利要求1所述的方法，其特征是所述子实体萌发培养的培养温度为20±2℃。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征是所述子实体萌发培养的相对湿度为60-70％。
4.如权利要求1或2所述的方法，其特征是所述分离、纯化培养的温度为25±2℃。
5.如权利要求1或2所述的方法，其特征是所述麦芽汁培养基按照如下方法配制而成：
1)按照如下配比备料
麦芽浸粉20.0g/L，琼脂为18.0g/L、葡萄糖10.0g/L、KH2PO43.0g/L、青霉素0.2g/L、链霉素0.2g/L；
2)首先将麦芽浸粉、琼脂、葡萄糖、KH2PO4溶于无菌水中，搅拌均匀；接着加入HCl溶液调节培养基的pH调至5.0±0.2；然后在121℃下进行高压灭菌30min，最后待培养基温度降低至50℃以下后加入青霉素、链霉素，摇匀，即得。
6.如权利要求1或2所述方法，其特征是还包括将新鲜真菌的靠近基部的子实体分割成子实体块，然后再进行所述的子实体萌发培养。
7.如权利要求1或2所述方法，其特征是还包括对分离、纯化培养后的木生药用真菌菌落进行质量检测，采用引物ITS4/ITS5对分离、纯化后的药用真菌的核糖体RNA的内转录间隔区进行PCR扩增，接着将PCR扩增产物进行测序，将所得序列在GenBank中进行BLAST比较、搜索，即可确定分离是否成功。
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Inventor after: Yuan Huan

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