CN111693499A - 一种用于食用菌菌丝的活性氧自由基检测方法及其在菌株活力检测的应用 - Google Patents

一种用于食用菌菌丝的活性氧自由基检测方法及其在菌株活力检测的应用 Download PDF

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CN111693499A CN202010528633.5A CN202010528633A CN111693499A CN 111693499 A CN111693499 A CN 111693499A CN 202010528633 A CN202010528633 A CN 202010528633A CN 111693499 A CN111693499 A CN 111693499A
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Abstract

本发明公开了一种用于食用菌菌丝的活性氧自由基检测方法及其在菌株活力检测的应用。本发明公开的用于食用菌菌丝的活性氧自由基检测方法包括：将待测样品在探针溶液中进行处理，得到处理后的样品；探针溶液由溶剂与溶质组成，溶剂为0.1MPBS，溶质及其在探针溶液中的浓度为10μM二氯二氢荧光黄双乙酸钠；2)检测处理后的样品的荧光信号，如处理后的样品发出荧光信号，待测真菌样品含有或候选含有活性氧自由基，如处理后的样品不发出荧光信号，待测真菌样品不含有或候选不含有活性氧自由基。本发明的方法可通过标记细胞凋亡特征以辅助评价菌丝细胞衰老程度，进对菌株活力进行检测，具有很好的应用前景。

Description

一种用于食用菌菌丝的活性氧自由基检测方法及其在菌株活 力检测的应用
技术领域
本发明涉及生物化学领域中，一种用于食用菌菌丝的活性氧自由基检测方法及其在菌株活力检测的应用。
背景技术
食用菌菌种质量是食用菌产业健康发展的基础。目前食用菌菌种活力退化机制尚不清楚，并缺乏高效、快速和特异性的食用菌菌株活力检测方法。细胞凋亡与丝状真菌衰老等多种生命过程密切相关。丝状真菌的凋亡具有类似于多细胞生物凋亡的形态学和生物化学特点，如在丝状真菌中绝大多数细胞凋亡反应都依赖于活性氧自由基(ROS)的作用。二氯二氢荧光黄双乙酸钠(DCFH-DA)是一种高效的用于细胞内氧化物质检测的荧光染料。ROS产生时能将DCFH-DA氧化成显示绿色荧光的DCF，并且荧光强度与细胞内ROS含量成正比。在人体、动物和植物细胞中多采用二甲基亚砜(DMSO)溶液将DCFH-DA稀释，再加入到相应的细胞培养溶液中进行孵育，随后对细胞内ROS含量进行定性定量检测。在人体及动物细胞中利用DCFH-DA等荧光探针在进行定量检测时，可直接利用流式细胞仪进行定量检测。由于植物和真菌细胞拥有细胞壁，需要制备原生质体或进行菌丝原位破壁，将菌丝还原成单细胞状态再利用流式细胞仪进行定量分析。细胞壁的去除将导致对菌丝细胞结构造成破坏，诱导菌丝产生凋亡信号，从而影响对凋亡标记准确性及凋亡时期的判断。此外，有报道利用插片培养方式培养丝状真菌菌丝，装载探针后利用荧光显微镜照相，再用ImageJ等软件定量分析荧光量从而定量分析菌丝内ROS含量。但该方法操作繁琐，且由于单视野下菌丝密度不同，对荧光量会造成极大的影响，从而影响检测菌丝内ROS含量精度。同时，食用菌原生质体及插片培养菌丝处于非自然生长状态，菌龄、活力、生长状态等都与原始菌丝体不同，无法对现菌株活力做出精准判断。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何定性定量检测真菌活性氧自由基及其活力。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了定量检测真菌活性氧自由基的方法，所述方法包括：
1)将两种待测真菌样品在探针溶液中分别进行处理，得到两种处理后的样品；所述探针溶液由溶剂与溶质组成，所述溶剂为0.1M PBS，所述溶质及其在所述探针溶液中的浓度为10μM二氯二氢荧光黄双乙酸钠；
2)分别检测两种处理后的样品的荧光信号，荧光信号强的待测真菌样品的活性氧自由基含量高于或候选高于荧光信号弱的待测真菌样品。
本发明还提供了检测真菌活性氧自由基的方法，所述方法包括：
1)将待测真菌样品在探针溶液中进行处理，得到处理后的样品；所述探针溶液由溶剂与溶质组成，所述溶剂为0.1M PBS，所述溶质及其在所述探针溶液中的浓度为10μM二氯二氢荧光黄双乙酸钠；
2)检测所述处理后的样品的荧光信号，如所述处理后的样品发出荧光信号，所述待测真菌样品含有或候选含有活性氧自由基，如所述处理后的样品不发出荧光信号，所述待测真菌样品不含有或候选不含有活性氧自由基。
本发明还提供了检测真菌活力的方法，所述方法包括：
1)将两种待测真菌样品在探针溶液中分别进行处理，得到两种处理后的样品；所述探针溶液由溶剂与溶质组成，所述溶剂为0.1M PBS，所述溶质及其在所述探针溶液中的浓度为10μM二氯二氢荧光黄双乙酸钠；
2)分别检测两种处理后的样品的荧光信号，荧光信号强的待测真菌样品的活力低于或候选低于荧光信号弱的待测真菌样品。
本发明还提供了检测真菌细胞氧化损伤程度的方法，所述方法包括：
1)将两种待测真菌样品在探针溶液中分别进行处理，得到两种处理后的样品；所述探针溶液由溶剂与溶质组成，所述溶剂为0.1M PBS，所述溶质及其在所述探针溶液中的浓度为10μM二氯二氢荧光黄双乙酸钠；
2)分别检测两种处理后的样品的荧光信号，荧光信号强的待测真菌样品的细胞氧化损伤程度高于或候选高于荧光信号弱的待测真菌样品。
上文中，所述0.1M PBS由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质及其在所述0.1M PBS中的浓度分别为0.1M KH2PO4和0.1M Na2HPO4·12H2O，pH＝7.2。
上文中，荧光信号的检测在荧光显微镜(激发波长：420nm-485nm；发射片波长：515nm)或荧光酶标仪(激发波长：450nm；发射波长：580nm)下进行。
上文中，所述待测真菌样品在所述探针溶液中处理的时间可大于等于30分钟(如30-50分钟)。所述待测真菌样品在所述探针溶液中处理可在22-28℃(如25℃)下进行。
上文中，定性检测所述处理后的样品的荧光信号时，可将所述处理后的样品置于所述探针溶液或所述0.1M PBS中进行检测。定量检测处理后的样品的荧光信号时，可直接检测所述处理后的样品。
上文中，所述真菌可为香菇。
上文中，所述待测真菌样品可为真菌菌丝。
本发明还提供了下述任一产品：
X1、一种产品，为所述探针溶液；
X2、成套试剂，由所述探针溶液与激光发射仪器组成；
X3、成套试剂，由所述0.1M PBS与二氯二氢荧光黄双乙酸钠组成；
X4、成套试剂，由所述0.1M PBS、二氯二氢荧光黄双乙酸钠与激光发射仪器组成；
X5、MG培养基：由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及其在培养基中的浓度分别为20％麦芽浸粉和10％葡萄糖，％为质量百分比。
上述产品中，所述激光发射仪器能发射激发DCFH-DA的激光。所述激光发射仪器可为荧光显微镜或荧光酶标仪。
X1-X4所述的产品均可具有如下任一用途：
Y1、检测真菌活性氧自由基；
Y2、定量检测真菌活性氧自由基；
Y3、检测真菌活力；
Y4、检测真菌细胞氧化损伤程度；
Y5、制备检测真菌活性氧自由基产品；
Y6、制备定量检测真菌活性氧自由基产品；
Y7、制备检测真菌活力产品；
Y8、制备检测真菌细胞氧化损伤程度产品。
所述产品的下述任一应用，也属于本发明的保护范围：
Y1、检测真菌活性氧自由基；
Y2、定量检测真菌活性氧自由基；
Y3、检测真菌活力；
Y4、检测真菌细胞氧化损伤程度；
Y5、制备检测真菌活性氧自由基产品；
Y6、制备定量检测真菌活性氧自由基产品；
Y7、制备检测真菌活力产品；
Y8、制备检测真菌细胞氧化损伤程度产品。
所述检测真菌活性氧自由基的方法或所述定量检测真菌活性氧自由基的方法在检测真菌活力中的应用，也属于本发明的保护范围。
所述检测真菌活性氧自由基的方法或所述定量检测真菌活性氧自由基的方法在检测真菌细胞氧化损伤程度中的应用，也属于本发明的保护范围。
所述MG培养基在培养香菇中的应用，也属于本发明的保护范围。
上文中，所述真菌可为香菇。
上文中，所述检测样品可为真菌菌丝。
本发明与现有方法相比，具有以下有益效果：无需制备原生质体或进行菌丝原位破壁，使用的菌丝细胞处于自然生长状态，活性氧自由基检测的准确性高；适用范围广，对PDA平皿及液体菌种均可适用；使用PBS作为荧光探针稀释剂，并且封片时再次滴加DCFH-DA荧光染料，获得的阳性荧光信号强且背景极弱；可同时对液体菌种菌丝细胞内ROS含量进行定性定量分析，操作简单、迅速、准确性高，可以用于评价食用菌活力，解决了目前无精准评价液体菌株活力的难题。本发明的方法，可通过标记细胞凋亡特征以辅助评价菌丝细胞衰老程度，进对菌株活力进行检测，具有很好的应用前景。
附图说明
图1为实施例1的DCFH-DA染色结果。Bar＝50μm。DCFH表示荧光探针DCFH-DA。
图2为不同取样方式菌丝的染色结果。A和B中左图均为明场结果，右图均为荧光检测结果，玻片表示载玻片培养菌丝体的染色结果，带琼脂表示含少量琼脂基内菌丝的染色结果，玻璃纸表示平皿玻璃纸上培养菌丝体染色结果，气生菌丝表示平皿上刮取的气生菌丝染色结果。Bar＝50μm。
图3为固定后菌丝样品染色观察结果。左图为明场结果，右图为荧光检测结果。Bar＝50μm。
图4为利用ddH2O(水)和DMSO作为稀释剂的染色结果。左图均为明场结果，右图均为荧光检测结果。Bar＝50μm。
图5为不同浓度DCFH-DA的染色结果。左图均为明场结果，右图均为荧光检测结果。Bar＝50μm。
图6为不同染色时间的结果。左图均为明场结果，右图均为荧光检测结果。Bar＝50μm。
图7为不同封片剂封片的结果。PBS表示0.1M PBS，DCFH表示荧光探针DCFH-DA；左图均为明场结果，右图均为荧光检测结果。Bar＝50μm。
图8为不同公司DCFH-DA探针的染色结果。左图均为明场结果，右图均为荧光检测结果。Bar＝50μm。
图9为利用酶标仪定量检测香菇液体菌丝细胞中ROS含量。Bar＝50μm。
图10为利用荧光显微镜观察验证定量检测结果。最下图为菌丝质量为0.01g的结果。Bar＝50μm。
图11为利用荧光探针DCFH-DA检测PDA平皿继代M0和M8菌株菌丝中ROS差异。Bar＝50μm。
图12为漆酶活力、超氧化物歧化酶(SOD)活力和丙二醛(MDA)含量检测结果。各图横坐标从左至右依次为M1、M3、M5、M8、M13；*表示与M1相比，差异达到显著水平(p＜0.05)，**表示与M1相比，差异达到极显著水平(p＜0.01)。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中所用菌丝均为香菇菌丝。
MG液体培养基：由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及其在培养基中的浓度分别为20％麦芽浸粉和10％葡萄糖，％为质量百分比。
实施例1、食用菌菌株活力的定性检测
本实施例利用荧光探针DCFH-DA(碧云天生物技术公司的活性氧检测试剂(产品编号S0033S))对菌丝进行染色，以检测菌丝的活力，步骤如下：
(1)采用0.1M PBS(0.1M PBS由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及其在0.1M PBS中的浓度分别为0.1M KH2PO4和0.1M Na2HPO4·12H2O，pH＝7.2)作为稀释剂将荧光探针DCFH-DA稀释至工作浓度10μM，得到探针溶液。
(2)收集液体菌丝、气生菌丝和含少量琼脂的基内菌丝作为待测菌丝置于离心管中，用0.1M PBS冲洗2-3次，吸净残留液体，得到待测菌丝。其中液体菌丝为在MG液体培养基中25℃，160rmp摇床培养15天的香菇菌丝体；气生菌丝为在PDA培养基上培养15天后的表面气生菌丝；含少量琼脂的基内菌丝为提取气生菌丝后的琼脂，用解剖刀切成0.5cm×0.5cm的小块，琼脂内包含大量基内菌丝且琼脂量较少。
(3)将步骤(2)所得待测菌丝放入1.5ml离心管中滴加步骤(1)所得探针溶液70μL，使探针溶液覆盖全部菌丝，22-28℃下染色30min，得到装载好探针的菌丝。
(4)步骤(3)完成后，挑取装载好探针的菌丝于载玻片上，滴上30-50μL的步骤(1)所得探针溶液，盖上盖玻片，轻轻压散菌丝。
(5)步骤(4)完成后，根据荧光探针的激发光谱(激发波长450-500nm，发射波长510-580nm)，将制备好的玻片在荧光显微镜(激发波长：420nm-485nm；发射波长：515nm)下进行定性观察。
结果如图1所示，可清晰看到菌丝上ROS亮点，且背景色极弱，表明利用上述方法可以成功检测菌丝的活力状态。
不同菌丝取样方式对结果的影响：
按照上述步骤(1)-(5)的方法，将步骤(2)中的待测菌丝替换为载玻片培养菌丝体(琼脂相对较厚)、平皿玻璃纸上培养菌丝体(含玻璃纸)、平皿上刮取的气生菌丝(无玻璃纸或琼脂)和含少量琼脂基内菌丝，其他步骤均不变，利用荧光探针DCFH-DA进行检测，部分结果见图2。其中载玻片培养菌丝为在载玻片上涂上葡萄糖琼脂培养基(由水、葡萄糖和琼脂组成，葡萄糖质量百分比浓度为0.2％)再接种香菇菌丝，25℃培养7-9天后的菌丝体。平皿玻璃纸上培养菌丝体为在PDA平皿培养基上放置无菌的玻璃纸后接种香菇菌丝，培养7天后揭掉玻璃纸，玻璃纸及玻璃纸表面上的菌丝体；气生菌丝为去除玻璃纸后的菌丝体或在PDA培养基上培养15天后的表面气生菌丝；含少量琼脂的基内菌丝为提取气生菌丝后的琼脂，用解剖刀切成0.5cm×0.5cm的小块，琼脂内包含大量基内菌丝且琼脂量较少。
结果表明，无论何种来源的菌丝中均可观察到ROS荧光亮点，但玻片上及玻璃纸上培养菌丝染色观察时背景色过亮不利于观察，含有少量琼脂的基内菌丝和气生菌丝背景不影响观察。
样品前处理对结果的影响：
按照上述步骤(1)-(5)的方法，步骤(2)结束后将所得待测菌丝放入1.5ml离心管中，加入100μL 2.5％戊二醛固定液，于冰浴中固定20min，然后将菌丝利用0.1M PBS冲洗2-3次，吸净PBS后，再将菌丝按照步骤(3)-(5)的方法进行检测，结果见图3。
结果显示，固定后的菌丝中完全无荧光显色，无法对固定食用菌菌丝细胞中ROS含量进行染色观察。
稀释剂对结果的影响：
按照上述步骤(1)-(5)的方法，将稀释剂分别替换为ddH2O和DMSO，其他步骤均不变，检测不同稀释剂对检测结果的影响，结果见图4。
在动植物细胞ROS检测中，常用DMSO作为DCFH-DA探针的稀释剂，本实验表明利用ddH2O和DMSO作为稀释剂稀释DCFH-DA后，菌丝中完全无荧光显色而无法对食用菌菌丝细胞中ROS含量进行染色观察。
探针浓度对结果的影响：
按照上述步骤(1)-(5)的方法，将探针的浓度分别替换为2μM、5μM、10μM、20μM和50μM，其他步骤均不变，检测不同探针浓度对结果的影响，结果见图5。
结果表明工作浓度小于10μM(2μM和5μM)时，在菌丝上观察不到ROS染色亮点，超过10μM(20μM和50μM)可对菌丝中ROS进行观察但背景色过亮，菌丝密集时影响观察效果。因此DCFH-DA探针的最适工作浓度为10μM。
染色时间对结果的影响：
按照上述步骤(1)-(5)的方法，将染色时间由“30min”分别替换为10min、20min、30min和50min，其他步骤均不变，检测不同染色时间对结果的影响，结果见图6。
结果表明，染色时间小于30min(10min和20min)时荧光反应微弱或无荧光亮点，染色时间超过30min可看到明显ROS荧光亮点。
封片剂对结果的影响：
按照上述步骤(1)-(5)的方法，将步骤(4)中的探针溶液分别替换为ddH2O(水)、抗荧光淬灭剂(碧云天生物技术公司，产品编号P0128M，抗淬灭剂)、0.1M PBS和步骤(1)所得探针溶液，其他步骤均不变，检测不同封片试剂对结果的影响，结果见图7。
在常规荧光染色制片中常用水和抗荧光淬灭剂作为封片剂来保持样品湿润并且防止荧光淬灭。本实验结果表明利用水和抗荧光淬灭剂封片后，无法观察到菌丝中ROS结果，采用0.1M PBS和步骤(1)所得探针溶液封片后均可起到良好的染色观察效果。
不同厂家探针对结果的影响：
按照上述步骤(1)-(5)的方法，将所用荧光探针DCFH-DA分别替换为碧云天生物技术公司的活性氧检测试剂(产品编号S0033S)和北京普利莱基因技术有限公司的活性氧检测试剂(货号C1300)中的荧光探针DCFH-DA，其他步骤均不变，检测不同厂家探针对结果的影响，结果见图8。
有报道称不同公司的DCFH-DA探针对真菌菌丝中ROS染色结果差异明显，这不利于对食用菌菌丝活性进行广泛大量检测。按照本发明的检测方法进行检测时，两个公司的探针均可以对香菇菌丝进行染色，染色结果无显著差异。
实施例2、食用菌菌株活力的定量检测
(1)称取0.003-0.050g不同鲜重梯度的液体继代原始菌株菌丝(M0)、液体培养基中连续继代两次的菌丝(M2)和连续继代三次的菌丝(M3)样品作为待测菌丝，每个样品取4组，置于离心管中，用0.1M PBS冲洗2-3次，吸净PBS。阳性对照组为200mM H2O2中处理1h的菌丝。
其中，菌株培养方法为：液体继代M0菌株为从PDA平皿上取接种块，接种到MG液体培养基中培养15天的香菇液体菌丝。此后，从液体M0菌株继续接种到新的液体培养基中为M1菌株，继代两次为M2菌株，3次为M3菌株。
(2)向待测菌丝中滴加实施例1步骤(1)的探针溶液覆盖菌丝25℃下染色30min，得到装载好探针的菌丝；装载好探针的菌丝，用0.1M PBS清洗2-3次后，3000rmp离心10min，去除上清，将沉淀的菌丝细胞放入96孔板中，利用全波长荧光酶标仪，在激发波长450nm，发射波长580nm条件下进行检测。
(3)以菌丝质量为X轴，酶标仪检测出荧光量为Y轴绘制散点图，并绘制拟合线，截距为96孔板中未点样空白孔荧光量。拟合线斜率为该菌丝样品中活性氧自由基数值，对比各个样品间拟合线斜率值，即可对各个菌丝样品中自由基含量进行相对定量检测。
(4)将已经过酶标仪检测后的菌丝样品，利用定性检测中制片方法制片，利用荧光显微镜观察及ImageJ软件分析，验证酶标仪定量检测结果。
具体结果见图9、图10。M0拟合线：y＝391537x+228，R2＝0.9787；M2拟合线：y＝656231x+228，R2＝0.9396；M3拟合线：y＝1507649x+228，R2＝0.9554。
结果表明，香菇液体菌丝质量在0.003-0.050g范围中与荧光量成线性正相关，相关系数均超过0.9。酶标仪定量检测结果表明随着在液体培养基中继代次数增加，斜率逐渐上升表明单位重量菌丝中ROS积累量逐渐上升。M3代样品菌丝细胞中ROS含量是初始M0代样品3倍以上。通过荧光显微镜定性观察结果与酶标仪定量结果一致，利用ImageJ软件分析单视野下荧光强度其结果也与酶标仪定量结果一致。上述证明，该发明方法可以对食用菌菌丝细胞中ROS含量进行定量检测。
注意事项：香菇菌丝质量超过0.05g时，由于菌丝细胞量过大导致染色及检测不均一，荧光量变化成波动形态不能用于定量检测。此外，当菌丝内ROS含量过高时易出现检测结果为“溢出”，此时应适当调整激发波长和发射波长间隔，但需保证所有检测样品在同一激发波长和发射波长下检测，避免由于操作错误造成的菌丝中ROS含量差异。
实施例3、香菇菌种活力检测
将香菇菌丝在PDA平皿培养基上进行连续继代培养，选取母种(简写为M0)和连续继代培养1、3、5、8和13代的菌株(分别简写为M1、M3、M5、M8和M13)接种至MG液体培养基培养，分别收集M1、M3、M5、M8和M13液体菌丝。
分别以M1和M8液体菌丝作为待测菌丝，利用荧光探针DCFH-DA检测ROS，步骤如下：
(1)采用0.1M PBS作为稀释剂将荧光探针DCFH-DA稀释至工作浓度10μM，得到探针溶液。
(2)将待测菌丝置于离心管中，用0.1M PBS冲洗2-3次，吸净残留液体。
(3)步骤(2)完成后，向离心管中滴加步骤(1)的探针溶液覆盖全部菌丝，室温下染色30min，得到装载好探针的菌丝。
(4)步骤(3)完成后，挑取装载好探针的菌丝于载玻片上，滴上30-50μL步骤(1)的探针溶液，盖上盖玻片，轻轻压散菌丝。
(5)步骤(4)完成后，根据荧光探针的激发光谱，将制备好的玻片在荧光显微镜下观察。
分别以M1、M3、M5、M8和M13液体菌丝作为待测菌丝，检测漆酶活力、超氧化物歧化酶(SOD)活力和丙二醛(MDA)含量，反映香菇菌丝的生理生化特性。其中利用ABTS法测定漆酶活力，反映菌株对基质组分的降解能力；利用WST法测定SOD活力、利用TBA法测定MDA含量，反映活性氧自由基(ROS)在分离菌株菌丝中的积累情况。
结果见图11-12。比对酶活结果与荧光染色结果的一致性。
荧光探针DCFH-DA检测结果显示，M8代菌株菌丝中ROS含量显著高于M1代菌株。该结果与活性氧自由基相关酶活结果一致，在菌株继代培养过程中超氧化物歧化酶(SOD)活力和丙二醛(MDA)在第8代达到最高值，此时细胞氧化损伤程度最高；在菌株继代培养过程中漆酶活力减弱，木质素降解能力逐代下降。综合表明M8代继代培养菌株的活力明显减弱。说明利用荧光探针DCFH-DA检测ROS可以用于评价食用菌活力，其荧光标记结果与胞外酶、保护酶活力结果相一致。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.定量检测真菌活性氧自由基的方法，包括：
1)将两种待测真菌样品在探针溶液中分别进行处理，得到两种处理后的样品；所述探针溶液由溶剂与溶质组成，所述溶剂为0.1M PBS，所述溶质及其在所述探针溶液中的浓度为10μM二氯二氢荧光黄双乙酸钠；
2)分别检测两种处理后的样品的荧光信号，荧光信号强的待测真菌样品的活性氧自由基含量高于或候选高于荧光信号弱的待测真菌样品。
2.检测真菌活性氧自由基的方法，包括：
1)将待测真菌样品在探针溶液中进行处理，得到处理后的样品；所述探针溶液由溶剂与溶质组成，所述溶剂为0.1M PBS，所述溶质及其在所述探针溶液中的浓度为10μM二氯二氢荧光黄双乙酸钠；
2)检测所述处理后的样品的荧光信号，如所述处理后的样品发出荧光信号，所述待测真菌样品含有或候选含有活性氧自由基，如所述处理后的样品不发出荧光信号，所述待测真菌样品不含有或候选不含有活性氧自由基。
3.检测真菌活力的方法，包括：
1)将两种待测真菌样品在探针溶液中分别进行处理，得到两种处理后的样品；所述探针溶液由溶剂与溶质组成，所述溶剂为0.1M PBS，所述溶质及其在所述探针溶液中的浓度为10μM二氯二氢荧光黄双乙酸钠；
2)分别检测两种处理后的样品的荧光信号，荧光信号强的待测真菌样品的活力低于或候选低于荧光信号弱的待测真菌样品。
4.检测真菌细胞氧化损伤程度的方法，包括：
1)将两种待测真菌样品在探针溶液中分别进行处理，得到两种处理后的样品；所述探针溶液由溶剂与溶质组成，所述溶剂为0.1M PBS，所述溶质及其在所述探针溶液中的浓度为10μM二氯二氢荧光黄双乙酸钠；
2)分别检测两种处理后的样品的荧光信号，荧光信号强的待测真菌样品的细胞氧化损伤程度高于或候选高于荧光信号弱的待测真菌样品。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述待测真菌样品在所述探针溶液中处理的时间大于等于30分钟。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：检测所述处理后的样品的荧光信号时，所述处理后的样品处于所述探针溶液或所述0.1M PBS中。
7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：所述真菌为香菇。
8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于：所述待测真菌样品为真菌菌丝。
9.下述任一产品：
X1、一种产品，为权利要求1中所述探针溶液；
X2、成套试剂，由权利要求1中所述探针溶液与激光发射仪器组成；
X3、成套试剂，由权利要求1中所述0.1M PBS与二氯二氢荧光黄双乙酸钠组成；
X4、成套试剂，由权利要求1中所述0.1M PBS、二氯二氢荧光黄双乙酸钠与激光发射仪器组成；
X5、MG培养基：由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及其在培养基中的浓度分别为20％麦芽浸粉和10％葡萄糖，％为质量百分比。
10.权利要求9所述产品的下述任一应用：
Y1、检测真菌活性氧自由基；
Y2、定量检测真菌活性氧自由基；
Y3、检测真菌活力；
Y4、检测真菌细胞氧化损伤程度；
Y5、制备检测真菌活性氧自由基产品；
Y6、制备定量检测真菌活性氧自由基产品；
Y7、制备检测真菌活力产品；
Y8、制备检测真菌细胞氧化损伤程度产品；
或，权利要求1或2所述方法在检测真菌活力中的应用；
或，权利要求1或2所述方法在检测真菌细胞氧化损伤程度中的应用；
或，权利要求9中所述MG培养基在培养香菇中的应用。
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