CN111766225A - 一种羊肚菌细胞活性氧水平的检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种羊肚菌细胞活性氧水平的检测方法，属于食用菌菌丝细胞检测技术领域。步骤：羊肚菌菌丝培养；羊肚菌菌丝处理；去除羊肚菌菌丝细胞壁；收集羊肚菌菌丝细胞原生质体；装载探针；测定，将得到的装载探针的羊肚菌菌丝细胞原生质体制成玻片并采用荧光分光光度计、荧光酶标仪、流式细胞仪或激光共聚焦显微镜检测DCF荧光，再对DCF的荧光光谱进行实时或不同时间点检测实验组和对照组荧光的强弱，接着将玻片置于荧光显微镜下观察，根据对照组和实验组细胞原生质体激发光的数量和强弱统计羊肚菌菌丝细胞活性氧水平情况。能通过活性氧水平检测对羊肚菌的生长、发育、繁殖以及栽培之类的环节中的状况进行预判。
Description
技术领域
本发明属于食用菌菌丝细胞检测技术领域，具体涉及一种羊肚菌细胞活性氧水平的检测方法。
背景技术
羊肚菌（Morchella spp.）隶属于子囊菌门，广泛分布于全球各地并且种类较多，据报道全世界有60余种，中国约占30种，主要分布在云南、甘肃、四川、青海和江苏等地。羊肚菌味道鲜美，香味独特，营养丰富，保健功能齐全，受到全世界人民的青睐。从功效而论，羊肚菌还有补肾、提神、防癌的作用，所以羊肚菌与虫草均属于高级营养滋补品，是世界上最为名贵的食用菌，需求量日益增长，羊肚菌人工栽培技术也随之快速发展。
现有的人工栽培技术中多采用大棚种植羊肚菌，容易造成高温和缺氧的情况，导致羊肚菌出菇品质差异大，产量和品质档次低，甚至导致绝产。目前，温度胁迫对羊肚菌生长发育影响已有研究，而高温胁迫引发细胞凋亡的研究在羊肚菌中尚未见报道。
如业界所知，在凋亡的早期细胞都会出现ROS（活性氧簇）的迸发现象，而ROS累积可以通过氧化敏感的化学物质来检测。当ROS大量存在时，这些化学物质可以改变吸光度或发现荧光，且荧光强度与细胞内ROS含量成正比。
活性氧是体内一类氧的单电子还原产物，是电子在未能传递到末端氧化酶之前漏出呼吸链并消耗大约2%的氧生成的，包括氧的电子还原产物超氧阴离子、电子还原产物过氧化氢、电子还原产物羟基自由基以及一氧化氮等，它们来源于叶绿体、线粒体和过氧化物酶体等氧化代谢活动较为旺盛的细胞器，并随即被胞内抗氧化防卸组分清除。
由于ROS组分高度活跃，半衰期很短，在细胞中的产生和清除同时进行，大量ROS信号往往在数秒甚至数毫秒内便被传送到下游细胞器，因而必须通过高时空分辩而探索的分析手段才能精确地检测ROS的动态变化，从而探索ROS在生产调控中的作用。最初对ROS的检测多采用分光光度法（测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度）、电子自旋共振捕获法（也称“ESR捕获法”）和细胞内荧光探针标记法（可参见中国专利公布号CN108069967A提供的“一种用于细胞内蛋白标记的荧光探针及其合成方法和应用”），等等。
在迄今为止公开的中外专利和非专利文献中均未见与羊肚菌菌丝细胞活性氧水平检测相关的技术信息，然而经本申请人所作的实验表明：对羊肚菌细胞活性氧水平的检测能对羊肚菌菌丝细胞凋亡情况进行预判。下面将要介绍的技术方案便是在这种背景下产生的。
发明内容
本发明的任务在于提供一种羊肚菌细胞活性氧水平的检测方法，该方法能有效地检测羊肚菌菌丝细胞活性氧水平，并对菌丝的细胞凋亡情况进行预判而得以帮助了解羊肚菌的生长、发育、繁殖以及栽培诸环节中的状况。
本发明的任务是这样来完成的，一种羊肚菌细胞活性氧水平的检测方法，包括以下步骤：
A）羊肚菌菌丝培养，使用装有PDA培养基（马铃薯葡萄糖琼脂培养基）的无菌平皿进行羊肚菌菌丝培养，先用打孔器在长满羊肚菌菌丝的PDA培养基边缘处打孔，并且控制孔的直径，再接种至无菌平皿中的PDA培养基的中央，恒温培养，使羊肚菌菌丝长满平皿；
B）羊肚菌菌丝处理，先将步骤A）中所述的培养基上的羊肚菌菌丝用无菌勺全部刮取至试管并且分为对照组和实验组，对照组经不同处理后继续恒温培养，而对实验组经不同处理后进行高温胁迫，并且控制高温胁迫的温度和控制高温胁迫的时间，所述的对照组经不同处理以及对实验组经不同处理各包括加外源抑制剂和不加外源抑制剂，得到对照组试管和实验组试管；
C）去除羊肚菌菌丝细胞壁，向步骤B）所述的实验组试管及对照组试管中加入溶壁酶溶液进行水浴培养并且控制溶壁酶溶液的加入量以及控制水浴培养的工艺条件，得到实验组试管酶解后的溶液以及得到对照组试管酶解后的溶液；
D) 收集羊肚菌菌丝细胞原生质体，将步骤C）中实验组试管酶解后的溶液和对照组试管酶解后的溶液分别加入塞有棉花的注射器中过滤，将过滤得到的溶液分别置于离心管中，放入离心机中离心，离心结束后，吸出离心管中的上清液，羊肚菌菌丝细胞原生质体留在离心管底部，以供光学显微镜下观察原生质体制备的情况，并计数；
E) 装载探针，按照1:1000体积比用无血清培养液稀释DCFH-DA探针至10 µM浓度，加入步骤D）所述的离心管内并控制羊肚菌菌丝细胞原生质体的浓度，再引入细胞培养箱孵育并且控制孵育温度以及控制孵育时间，每隔3-5min将所述离心管颠倒混匀一次，使探针和羊肚菌菌丝细胞原生质体充分接触，而后用无血清细胞培养液洗涤未进入羊肚菌菌丝细胞原生质体内的所述DCFH-DA，得到装载探针的羊肚菌菌丝细胞原生质体；
F）测定，先将由步骤E）得到的装载探针的羊肚菌菌丝细胞原生质体制成玻片并采用荧光分光光度计、荧光酶标仪、流式细胞仪或激光共聚焦显微镜检测DCF荧光，再对DCF的荧光光谱进行实时或不同时间点检测实验组和对照组荧光的强弱，接着将玻片置于荧光显微镜下观察，根据对照组和实验组细胞原生质体激发光的数量和强弱统计羊肚菌菌丝细胞活性氧水平情况。
在本发明的一个具体的实施例中，步骤A）中所述的控制孔的直径是将孔的直径控制为4-6mm并且将孔打穿所述PDA培养基；所述恒温培养的温度为18-22℃，恒温培养的时间为72-100h。
在本发明的另一个具体的实施例中，步骤B）中所述的对照组经不同处理后继续恒温培养的时间为30-250min，温度为18-22℃，所述的控制高温胁迫的温度是将高温胁迫的温度控制为40-45℃，所述控制高温胁迫的时间是将时间控制为30-250 min。
在本发明的又一个具体的实施例中，步骤B）中所述的外源抑制剂为N-乙酰半脱氨酸（NAC）或寡霉素（oligomycin）。
在本发明的再一个具体的实施例中，步骤C）中所述的控制溶壁酶溶液的加入量是将溶壁酶溶液浸没位于所述实验组试管及对照组试管中的羊肚菌菌丝；所述溶壁酶溶液的质量百分比浓度为2%；所述控制水浴培养的工艺条件是指：水浴培养的温度为28-32℃，水浴培养的时间为220-260min。
在本发明的还有一个具体的实施例中，步骤D）中所述的离心管的容积为5ml，所述离心为低温离心，该低温离心的温度为3.5-4.5℃，离心机的转速为750-850rpm，离心时间为9-11 min。
在本发明的更而一个具体的实施例中，步骤E）中所述的控制羊肚菌菌丝细胞原生质体的浓度是将浓度控制为1×106-2×107 /ml；所述的控制孵育温度及孵育时间是将孵育温度及孵育时间分别控制为35-39℃以及18-22min。
在本发明的进而一个具体的实施例中，步骤F）中所述的将玻片置于荧光显微镜下观察是指在白光下检测所述实验组以及对照组细胞原生质体形态，荧光模式下观察对照组和实验组细胞原生质体激发光的数量及荧光强弱；所述检测实验组和对照组荧光的强弱是指：在激发波长480-520nm以及发射波长510-540nm处检测实验组和对照组细胞原生质体的数量及荧光强弱。
在本发明的又更而一个具体的实施例中，步骤A）至步骤F)所述的羊肚菌为六妹羊肚菌。
本发明提供的技术方案的技术效果在于：开创性地提供了对羊肚菌细胞活性氧水平进行检测，在羊肚菌栽培过程中受到高温伤害后，能通过活性氧水平检测对羊肚菌的生长、发育、繁殖以及栽培之类的环节中的状况进行预判。
附图说明
图1为实施例1对照组羊肚菌细胞活性氧检测的显微镜图。
图2为实施例1实验组羊肚菌细胞活性氧检测的显微镜图。
图3为实施例1对照组羊肚菌菌丝高温刺激后添加外源抑制剂后细胞活性氧检测的显微镜图。
图4为实施例1实验组羊肚菌菌丝高温刺激后添加外源抑制剂后细胞活性氧检测的显微镜图。
图5为实施例1对照组、实验组羊肚菌原生质体活性氧激发光数量变化图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
本实施例1对羊肚菌细胞活性氧水平的检测方法实质上针对的是六妹羊肚菌细胞活性氧水平的检测方法，其包括以下步骤：
A)六妹羊肚菌菌丝培养，使用装有PDA培养基即马铃薯葡萄糖琼脂的无菌平皿进行六妹羊肚菌菌丝培养，先用打孔器在长满六妹羊肚菌菌丝的并且位于所述无菌平皿内的PDA培养基即马铃薯葡萄糖琼脂培养基的边缘处打孔，具体是：围绕PDA培养基的边缘部位优选以等距离间隔状态打若干个直径为6mm的孔，并且将孔打穿PDA培养基，即自PDA培养基朝向上的一侧贯穿至朝向下的一侧，PDA培养基的厚度优选为0.4-0.6cm，本实施例为0.5cm，再接种至无菌平皿中的PDA培养基的中央，在18℃下恒温培养100h，使六妹羊肚菌菌丝爬满于所述的PDA培养基；
B）六妹羊肚菌菌丝处理，先将步骤A）中所述的培养基上爬满六妹羊肚菌菌丝用无菌勺全部刮取至试管并且分为对照组和实验组（在试管上作区别标记），对对照组经不同处理后继续恒温培养，这里所讲的不同处理是指：对对照组加外源抑制剂N-乙酰半脱氨酸（NAC）、对对照组加外源抑制剂寡霉素和对照组不加前述的外源抑制剂处理，在完成了前述的加外源抑制剂和不加外源抑制剂处理后，对照组继续恒温培养130min，继续恒温培养的温度为18℃，而对实验组经不同处理后进行高温胁迫，这里所讲的不同处理是指：对实验组加外源抑制剂N-乙酰半脱氨酸（NAC）、对实验组加外源抑制剂寡霉素和实验组不加前述的外源抑制剂处理，在完成了前述的加外源抑制剂和不加外源抑制剂处理后，在42℃进行高温胁迫130min，也就是将实验组加外源抑制剂和不加外源抑制剂的试管同在42℃进行高温胁迫130min，得到对照组盖试管和实验组试管；
C）去除六妹羊肚菌菌丝细胞壁，向步骤B）所述的实验组试管及对照组试管中加入质量浓度百分比为2 %的溶壁酶溶液进行水浴培养，溶壁酶溶液的加入量以分别浸没位于实验组试管以及对照组试管中的六妹羊肚菌菌丝为准，所述水浴培养的工艺条件为：水浴培养的温度为30℃，水浴培养的时间为240min，并在培养过程中适当震荡如摇震，得到实验组试管酶解后的溶液以及得到对照组试管酶解后的溶液；
D）收集六妹羊肚菌菌丝细胞原生质体，将步骤C）中实验组和对照组试管酶解后的溶液分别加入塞有棉花的注射器中过滤，将过滤得到的溶液即滤液分别置于即引入5 ml离心管中，放入离心机中离心，离心为低温离心，即在4℃离心，离心机的转速为800 rpm，离心时间为10 min，离心结束后，吸出离心管中的上清液，六妹羊肚菌菌丝细胞原生质体留在离心管底部，以供光学显微镜下观察原生质体制备情况，并计数；
E)装载探针，按照1:1000体积比用无血清培养液稀释DCFH-DA探针至10 µM浓度，加入步骤D)所述的离心管内并控制六妹羊肚菌菌丝细胞原生质体的浓度为1×106 /ml，再引入细胞培养箱孵育并且控制孵育温度为37℃，孵育时间为20min，每隔5min将所述离心管颠倒混匀一次，使探针和六妹羊肚菌菌丝细胞原生质体充分接触，而后用无血清细胞培养液洗涤未进入六妹羊肚菌菌丝细胞原生质体内的所述DCFH-DA，在活性氧存在的条件下，DCFH-DA探针被氧化生成绿色荧光物质DCF；
F）测定，先将步骤E）得到的装载探针的六妹羊肚菌菌丝细胞原生质体制成玻片并采用激光共聚焦显微镜检测DCF荧光，在502nm激发波长，530nm发射波长下对DCF的荧光光谱进行实时或不同时间点检测实验组和对照组荧光的强弱，接着将玻片置于优选由德国产的Axio imager A1荧光显微镜白光模式下观察对照组和实验组即观察细胞原生质体形态，荧光模式下观察对照组和实验组即观察细胞原生质体激发光的数量及荧光强弱，统计六妹羊肚菌菌丝细胞活性氧水平情况，具体是：在502nm激发波长，530nm发射波长荧光模式下观察细胞原生质体荧光激发情况，根据对照组和实验组原生质体激发光的数量和强弱，统计六妹羊肚菌菌丝细胞活性氧情况。
实施例1对六妹羊肚菌细胞活性氧情况的分析如下：本实施例1的对照组六妹羊肚菌菌丝细胞活性氧检测显微镜图即本实施例1的对照组六妹羊肚菌菌丝细胞在荧光显微镜下左图白光模式下细胞原生质体形态正常，右图荧光模式下细胞原生质体荧光显色微弱，具体由图1示意；本实施例1的实验组六妹羊肚菌菌丝细胞在荧光显微镜下左图白光模式下细胞原生质体中出现“气泡”，右图荧光模式下细胞原生质体荧光显色为强绿色荧光，具体由图2示意；本实施例1添加外源抑制剂处理后，对照组六妹羊肚菌菌丝细胞荧光显微镜下左图白光模式下细胞原生质体形态正常，右图荧光模式下细胞原生质体荧光显色很弱，具体可由图3示意；本实施例1添加外源抑制剂处理后，实验组六妹羊肚菌菌丝细胞荧光显微镜下左图白光模式下细胞原生质体中的“气泡”消失，右图荧光模式下细胞原生质体荧光显色强度明显降低，具体可由图4示意。
实施例2：
本实施例2对六妹羊肚菌细胞活性氧水平的检测方法包括以下步骤：
A)六妹羊肚菌菌丝培养，使用装有PDA培养基即马铃薯葡萄糖琼脂的无菌平皿进行六妹羊肚菌菌丝培养，先用打孔器在长满六妹羊肚菌菌丝的并且位于所述无菌平皿内的PDA培养基即马铃薯葡萄糖琼脂培养基的边缘处打孔，具体是：围绕PDA培养基的边缘部位优选以等距离间隔状态打若干个直径为5mm的孔，并且将孔打穿PDA培养基，即自PDA培养基朝向上的一侧贯穿至朝向下的一侧，PDA培养基的厚度优选为0.4-0.6cm，本实施例为0.4cm，再接种至无菌平皿中的PDA培养基的中央，在20℃下恒温培养80h，使六妹羊肚菌菌丝爬满于所述的PDA培养基；
B）六妹羊肚菌菌丝处理，先将步骤A）中所述的培养基上爬满六妹羊肚菌菌丝用无菌勺全部刮取至试管并且分为对照组和实验组（在试管上作区别标记），如同对实施例1所述的那样，对照组经不同处理后继续恒温培养，继续恒温培养的温度改为20℃，时间改为250min，以及对实验组经不同处理后进行高温胁迫，在完成了前述的即如同实施例1所述的加外源抑制剂和不加外源抑制剂处理后，在40℃进行高温胁迫250min，也就是将加外源抑制剂和不加外源抑制剂的盖玻片同在40℃进行高温胁迫250min，得到对照组试管和实验组试管；
C）去除六妹羊肚菌菌丝细胞壁，向步骤B）所述的实验组试管及对照组试管中加入质量浓度百分比为2 %的溶壁酶溶液进行水浴培养，溶壁酶溶液的加入量以分别浸没位于实验组试管以及对照组试管中的六妹羊肚菌菌丝为准，所述水浴培养的条件为：水浴培养的温度为28℃，水浴培养的时间为260min，并在培养过程中适当震荡如摇震，得到实验组试管酶解后的溶液以及得到对照组试管酶解后的溶液；
D）收集六妹羊肚菌菌丝细胞原生质体，将步骤C）中实验组和对照组试管酶解后的溶液分别加入塞有棉花的注射器中过滤，将过滤得到的溶液即滤液分别置于即引入5 ml离心管中，放入离心机中离心，离心为低温离心，即在3.5℃离心，离心机的转速为850 rpm，离心时间为9 min，离心结束后，吸出离心管中的上清液，六妹羊肚菌菌丝细胞原生质体留在离心管底部，以供光学显微镜下观察原生质体制备情况，并计数；
E)装载探针，按照1:1000体积比用无血清培养液稀释DCFH-DA探针至10 µM浓度，加入步骤D)所述的离心管内并控制六妹羊肚菌菌丝细胞原生质体的浓度为1×107 /ml，再引入细胞培养箱孵育并且控制孵育温度为39℃，孵育时间为18min，每隔3min将所述离心管颠倒混匀一次，使探针和六妹羊肚菌菌丝细胞原生质体充分接触，而后用无血清细胞培养液洗涤未进入六妹羊肚菌菌丝细胞原生质体内的所述DCFH-DA，在活性氧存在的条件下，DCFH-DA探针被氧化生成绿色荧光物质DCF；
F）测定，先将步骤E）得到的装载探针的六妹羊肚菌菌丝细胞原生质体制成玻片并采用荧光分光光度计检测DCF荧光，在480nm激发波长，510nm发射波长下对DCF的荧光光谱进行实时或不同时间点检测实验组和对照组荧光的强弱，接着将玻片置于优选由德国产的Axioimager A1荧光显微镜白光模式下观察对照组和实验组即观察细胞原生质体形态，荧光模式下观察对照组和实验组即观察细胞原生质体激发光的数量及荧光强弱，具体是：在480nm激发波长，510nm发射波长荧光模式下观察细胞原生质体荧光激发情况，根据对照组和实验组原生质体激发光的数量和强弱，统计六妹羊肚菌菌丝细胞活性氧情况。
实施例3：
本实施例3对六妹羊肚菌细胞活性氧水平的检测方法包括以下步骤：
A)六妹羊肚菌菌丝培养，使用装有PDA培养基即马铃薯葡萄糖琼脂的无菌平皿进行六妹羊肚菌菌丝培养，先用打孔器在长满六妹羊肚菌菌丝的并且位于所述无菌平皿内的PDA培养基即马铃薯葡萄糖琼脂培养基的边缘处打孔，具体是：围绕PDA培养基的边缘部位优选以等距离间隔状态打若干个直径为4mm的孔，并且将孔打穿PDA培养基，即自PDA培养基朝向上的一侧贯穿至朝向下的一侧，PDA培养基的厚度优选为0.4-0.6cm，本实施例为0.6cm，再接种至无菌平皿中的PDA培养基的中央，在22℃下恒温培养72h，使六妹羊肚菌菌丝爬满于所述的PDA培养基；
B）六妹羊肚菌菌丝处理，先将步骤A）中所述的培养基上爬满六妹羊肚菌菌丝用无菌勺全部刮取至试管并且分为对照组和实验组（在试管上作好对照组以及实验组的区别标记），如同对实施例1所述的那样，对照组经不同处理后继续恒温培养，继续恒温培养的温度改为22℃，时间改为30min，以及对实验组经不同处理后进行高温胁迫，在完成了前述的即如同实施例1所述的加外源抑制剂和不加外源抑制剂处理后，在45℃进行高温胁迫30min，也就是将加外源抑制剂和不加外源抑制剂的盖玻片同在45℃进行高温胁迫30min，得到对照组试管和实验组试管；
C）去除六妹羊肚菌菌丝细胞壁，向步骤B）所述的实验组试管及对照组试管中加入质量浓度百分比为2 %的溶壁酶溶液进行水浴培养，溶壁酶溶液的加入量以分别浸没位于实验组试管以及对照组试管中的六妹羊肚菌菌丝为准，所述水浴培养的条件为：水浴培养的温度为32℃，水浴培养的时间为220min，并在培养过程中适当震荡如摇震，得到实验组试管酶解后的溶液以及得到对照组试管酶解后的溶液；
D）收集六妹羊肚菌菌丝细胞原生质体，将步骤C）中实验组和对照组试管酶解后的溶液分别加入塞有棉花的注射器中过滤，将过滤得到的溶液即滤液分别置于即引入5 ml离心管中，放入离心机中离心，离心为低温离心，即在4.5℃离心，离心机的转速为750 rpm，离心时间为11 min，离心结束后，吸出离心管中的上清液，六妹羊肚菌菌丝细胞原生质体留在离心管底部，以供光学显微镜下观察原生质体制备情况，并计数；
E)装载探针，按照1:1000体积比用无血清培养液稀释DCFH-DA探针至10 µM浓度，加入步骤D)所述的离心管内并控制六妹羊肚菌菌丝细胞原生质体的浓度为2×107 /ml，再引入细胞培养箱孵育并且控制孵育温度为35℃，孵育时间为22min，每隔4min将所述离心管颠倒混匀一次，使探针和六妹羊肚菌菌丝细胞原生质体充分接触，而后用无血清细胞培养液洗涤未进入六妹羊肚菌菌丝细胞原生质体内的所述DCFH-DA，在活性氧存在的条件下，DCFH-DA探针被氧化生成绿色荧光物质DCF；
F）测定，先将步骤E）得到的装载探针的六妹羊肚菌菌丝细胞原生质体制成玻片并采用荧光酶标仪检测DCF荧光，在520nm激发波长，540nm发射波长下对DCF的荧光光谱进行实时或不同时间点检测实验组和对照组荧光的强弱，接着将玻片置于优选由德国产的Axioimager A1荧光显微镜微白光模式下观察对照组和实验组即观察细胞原生质体形态，荧光模式下观察对照组和实验组即观察细胞原生质体激发光的数量及荧光强弱，具体是：在520nm激发波长，540nm发射波长荧光模式下观察细胞原生质体荧光激发情况，根据对照组和实验组原生质体激发光的数量和强弱，统计六妹羊肚菌菌丝细胞活性氧情况。
由图5所示，实施例1对照组六妹羊肚菌菌丝的细胞活性氧比例为约10%，加入外源抑制剂N-乙酰半脱氨酸（NAC）、寡霉素的活性氧比例下降。实验组羊肚菌菌丝细胞42℃高温胁迫30min时活性氧比例约占23%，明显明显高于未经高温处理的对照组。高温胁迫处理2h后，活性氧水平达到最高，约38%，高温处理2.5h后活性氧下降为36%。在高温胁迫处理2h时，检测加入了外源抑制剂活性氧抑制剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）、线粒体F0F1-ATPase的特异抑制剂寡霉素（oligomycin）的六妹羊肚菌菌丝细胞，发现活性氧比例明显下降，比例分别为5%和12%。
实施例2图略，实施例2对照组六妹羊肚菌菌丝的细胞核活性氧比例约为12%，加入外源抑制剂N-乙酰半脱氨酸（NAC）、寡霉素的活性氧比例下降。实验组羊肚菌菌丝细胞40℃高温胁迫30min时活性氧比例约占18%，明显明显高于未经高温处理的对照组。高温胁迫处理3h后，活性氧水平达到最高，约34%，高温处理3.5h后活性氧比例下降为30%。在高温胁迫处理3h时，检测加入了外源抑制剂活性氧抑制剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）、线粒体F0F1-ATPase的特异抑制剂寡霉素（oligomycin）的六妹羊肚菌菌丝细胞，发现活性氧比例明显下降，比例分别为4%和10%。
实施例3图略，实施例3对照组六妹羊肚菌菌丝的细胞核活性氧比例约为14%，加入外源抑制剂N-乙酰半脱氨酸（NAC）、寡霉素的活性氧比例下降。实验组羊肚菌菌丝细胞45℃高温胁迫10min时活性氧比例约占21%，明显明显高于未经高温处理的对照组。高温胁迫处理20min后，活性氧水平达到最高，约42%，高温处理30min后活性氧比例下降为40%。在高温胁迫处理20min时，检测加入了外源抑制剂活性氧抑制剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）、线粒体F0F1-ATPase的特异抑制剂寡霉素（oligomycin）的六妹羊肚菌菌丝细胞，发现活性氧比例明显下降，比例分别为7%和12%。
综上所述，高温胁迫下羊肚菌菌丝细胞活性氧水平显著升高，加入外源的抑制剂活性氧抑制剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）、线粒体F0F1-ATPase的特异抑制剂寡霉素（oligomycin）后，活性氧水平降低，这表明高温胁迫下羊肚菌细胞内活性氧的迸发，可能是线粒体在起作用，因而有助于对羊肚菌的生长、发育、繁殖、衰老以及栽培过程中的长势和产量之类的因素了解并且利于进行预判。
Claims (9)
1.一种羊肚菌细胞活性氧水平的检测方法，其特征在于包括以下步骤：
A)羊肚菌菌丝培养，使用装有PDA培养基的无菌平皿进行羊肚菌菌丝培养，先用打孔器在长满羊肚菌菌丝的PDA培养基边缘处打孔，并且控制孔的直径，再接种至无菌平皿中的PDA培养基的中央，恒温培养，使羊肚菌菌丝长满平皿；
B)羊肚菌菌丝处理，先将步骤A）中所述的培养基上的羊肚菌菌丝用无菌勺全部刮取至试管并且分为对照组和实验组，对照组经不同处理后继续恒温培养，而对实验组经不同处理后进行高温胁迫，并且控制高温胁迫的温度和控制高温胁迫的时间，所述的对照组经不同处理以及对实验组经不同处理各包括加外源抑制剂和不加外源抑制剂，得到对照组试管和实验组试管；
C)去除羊肚菌菌丝细胞壁，向步骤B）所述的实验组试管及对照组试管中加入溶壁酶溶液进行水浴培养并且控制溶壁酶溶液的加入量以及控制水浴培养的工艺条件，得到实验组试管酶解后的溶液以及得到对照组试管酶解后的溶液；
D)收集羊肚菌菌丝细胞原生质体，将步骤C）中实验组试管酶解后的溶液和对照组试管酶解后的溶液分别加入塞有棉花的注射器中过滤，将过滤得到的溶液分别置于离心管中，放入离心机中离心，离心结束后，吸出离心管中的上清液，羊肚菌菌丝细胞原生质体留在离心管底部，以供光学显微镜下观察原生质体制备的情况，并计数；
E)装载探针，按照1:1000体积比用无血清培养液稀释DCFH-DA探针至10 µM浓度，加入步骤D）所述的离心管内并控制羊肚菌菌丝细胞原生质体的浓度，再引入细胞培养箱孵育并且控制孵育温度以及控制孵育时间，每隔3-5min将所述离心管颠倒混匀一次，使探针和羊肚菌菌丝细胞原生质体充分接触，而后用无血清细胞培养液洗涤未进入羊肚菌菌丝细胞原生质体内的所述DCFH-DA，得到装载探针的羊肚菌菌丝细胞原生质体；
F)测定，先将由步骤E）得到的装载探针的羊肚菌菌丝细胞原生质体制成玻片并采用荧光分光光度计、荧光酶标仪、流式细胞仪或激光共聚焦显微镜检测DCF荧光，再对DCF的荧光光谱进行实时或不同时间点检测实验组和对照组荧光的强弱，接着将玻片置于荧光显微镜下观察，根据对照组和实验组细胞原生质体激发光的数量和强弱统计羊肚菌菌丝细胞活性氧水平情况。
2.根据权利要求1所述的一种羊肚菌细胞活性氧水平的检测方法，其特征在于步骤A）中所述的控制孔的直径是将孔的直径控制为4-6mm并且将孔打穿所述PDA培养基；所述恒温培养的温度为18-22℃，恒温培养的时间为72-100h。
3.根据权利要求1所述的一种羊肚菌细胞活性氧水平的检测方法，其特征在于步骤B）中所述的对照组经不同处理后继续恒温培养的时间为30-250min，温度为18-22℃，所述的控制高温胁迫的温度是将高温胁迫的温度控制为40-45℃，所述控制高温胁迫的时间是将时间控制为30-250 min。
4.根据权利要求1所述的一种羊肚菌细胞活性氧水平的检测方法，其特征在于步骤B）中所述的外源抑制剂为N-乙酰半脱氨酸或寡霉素。
5.根据权利要求1所述的一种羊肚菌细胞活性氧水平的检测方法，其特征在于步骤C）中所述的控制溶壁酶溶液的加入量是将溶壁酶溶液浸没位于所述实验组试管及对照组试管中的羊肚菌菌丝；所述溶壁酶溶液的质量百分比浓度为2%；所述控制水浴培养的工艺条件是指：水浴培养的温度为28-32℃，水浴培养的时间为220-260min。
6.根据权利要求1所述的一种羊肚菌细胞活性氧水平的检测方法，其特征在于步骤D）中所述的离心管的容积为5ml，所述离心为低温离心，该低温离心的温度为3.5-4.5℃，离心机的转速为750-850rpm，离心时间为9-11 min。
7.根据权利要求1所述的一种羊肚菌细胞活性氧水平的检测方法，其特征在于步骤E）中所述的控制羊肚菌菌丝细胞原生质体的浓度是将浓度控制为1×106-2×107 /ml；所述的控制孵育温度及孵育时间是将孵育温度及孵育时间分别控制为35-39℃以及18-22min。
8.根据权利要求1所述的一种羊肚菌细胞活性氧水平的检测方法，其特征在于步骤F）中所述的将玻片置于荧光显微镜下观察是指在白光下检测所述实验组以及对照组细胞原生质体形态，荧光模式下观察对照组和实验组细胞原生质体激发光的数量及荧光强弱；所述检测实验组和对照组荧光的强弱是指：在激发波长480-520nm以及发射波长510-540nm处检测实验组和对照组细胞原生质体的数量及荧光强弱。
9.根据权利要求1所述的一种羊肚菌细胞活性氧水平的检测方法，其特征在于步骤A）至步骤F)所述的羊肚菌为六妹羊肚菌。
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN117589729A (zh) * | 2023-03-13 | 2024-02-23 | 大理大学 | 黄酮类化合物对活体细胞内活性氧清除效应的检测方法 |
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