CN103690543A

CN103690543A - 杀死烟曲霉菌的组合物及方法

Info

Publication number: CN103690543A
Application number: CN201310719704.XA
Authority: CN
Inventors: 陈一强; 黄宏; 孔晋亮
Original assignee: Guangxi Medical University
Current assignee: Guangxi Medical University
Priority date: 2013-12-24
Filing date: 2013-12-24
Publication date: 2014-04-02
Anticipated expiration: 2033-12-24
Also published as: CN103690543B

Abstract

一种杀灭烟曲霉菌的组合物和杀死烟曲霉菌的方法，属于生物技术领域。杀灭烟曲霉菌的方法，包括制备药物、收集菌株、制备载体、制备孢子悬液、药物敏感试验、制备烟曲霉菌生物膜载体、药物对烟曲霉生物膜作用、XTT减低法测代谢活性、荧光染液的配制和荧光染色及观察，用绿原酸和伏立康唑联合杀死烟曲霉菌。本发明提供的一种杀死烟曲霉菌的组合物及方法，能够杀死生物膜中的烟曲霉菌丝，解决抗真菌药物无法杀死生物膜中的烟曲霉菌的难题。

Description

杀死烟曲霉菌的组合物及方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及烟曲霉菌生物膜，具体涉及一种杀灭烟曲霉菌的组合物和杀死烟曲霉菌的方法。

背景技术

烟曲霉菌是一种条件致病菌，能导致免疫低下患者致命的感染，其引起的侵袭性曲霉病是免疫低下患者主要的死亡原因之一，死亡率达到30~100%。目前唑类抗真菌药是治疗侵袭性曲霉病的主要药物，其中的伏立康唑凭借更强的抗菌能力和更少的不良反应等优点成为治疗侵袭性曲霉病的首选药物，但是尽管其已经运用于治疗侵袭性曲霉病多年，此疾病的死亡率并未见明显的降低，并且唑类抗真菌药物的耐药率却不断升高，其中伊曲康唑的耐药率由1999年的0%上升到2007年的17%，而耐药菌株和敏感菌株引起的死亡率分别为88%和48%，现今如何控制耐药成为了临床面临的巨大难题。

研究发现，生物膜的形成是烟曲霉耐药的一个重要原因。体内外实验均表明烟曲霉能形成生物膜，由于其菌丝被胞外基质所包裹，药物难以渗透进去作用于菌丝，因此烟曲霉菌丝细胞得以逃避抗真菌药和机体免疫的伤害，从而能形成持续的感染源造成慢性而且耐药的感染，生物膜中的烟曲霉菌比没有胞外基质包裹的浮游菌耐药性高几十至上千倍，并且生物膜越成熟，胞外基质越致密，生物膜中的烟曲霉菌就会越耐药。目前治疗侵袭性曲霉病的常用抗真菌药物包括首选药物伏立康唑对没有胞外基质包裹的烟曲霉菌丝细胞具有较好的抗真菌作用，但对生物膜中的烟曲霉菌丝细胞效果欠佳，如何解决生物膜导致的烟曲霉耐药性问题，已成为侵袭性曲霉病成功治疗的一大难题。

发明内容

本发明的目的是解决以上技术问题，提供一种杀灭烟曲霉菌的方法，本发明所采用的技术方案是：一种杀灭烟曲霉菌的方法，包括制备药物、收集菌株、制备载体、制备孢子悬液、药物敏感试验、制备烟曲霉菌生物膜载体、药物对烟曲霉生物膜作用、XTT减低法测代谢活性、荧光染液的配制和荧光染色及观察，其特征在于，用绿原酸和伏立康唑联合杀死烟曲霉菌，具体步骤如下：

1）制备药物取400~500mg绿原酸(CRA)和4~5mg伏立康唑（VRC），分别用3~6ml 100%的二甲亚砜溶解，分别配制成浓度为102400μg/ml和1280μg/ml的溶液，于-20℃~-25℃储存；

2）收集菌株收集烟曲霉菌株，质控菌株为近平滑念珠菌；

3）制备载体将直径为10~15 mm玻璃细胞爬片进行高温高压灭菌，作为载体；

4）制备孢子悬液将步骤2）收集的菌株接种到PDA培养皿，置于35~37℃生化培养箱进行复苏，后转至另一个PDA培养皿并置于35~37℃生化培养箱活化3~5天后，用5~10ml含有0.025%吐温20的磷酸盐缓冲液冲洗平皿表面收集孢子，用20~30ml MOPS缓冲的RPMI-1640重悬孢子，用血细胞计数板调整孢子浓度，并用RPMI-1640液体培养液调整浓度为1~3×10⁶·孢子·ml^-1，再用RPMI-1640液体培养基稀释50倍，得到2倍终浓度的孢子悬液；

5）药物敏感试验微量液基稀释法，在无菌的96孔细胞培养板的第1至第10孔加入步骤4）制备的孢子悬液，再将步骤1）制备的绿原酸和伏立康唑分别置于两个无菌的96孔细胞培养板的第1至第10孔，第1孔加入量为100μl，第2~10孔依次倍比稀释至二倍终浓度，第11孔为步骤4）制备孢子悬液的生长对照孔，第12孔为MOPS缓冲的RPMI-1640液体培养基，静置于35~37℃培养48h；获得绿原酸和伏立康唑最低抑菌浓度MIC；最低抑菌浓度（MIC）的判定：肉眼观察判断终点：96培养板各个孔充分混匀之后与生长对照孔比较，100%生长抑制所对应的最低药物浓度为此药物的MIC。

最低杀真菌浓度（MFC）的测定：将MIC以上各孔各吸取100μl的液体放到SDA平板上，用无菌接种棒均匀涂布到平板各处后静置于35~37℃的生化培养箱进行孵育，3天后数平板上的菌落，小于5个菌落的最低药物浓度即为最低杀真菌浓度，测定获得伏立康唑的最低杀菌浓度MFC。

6）制备烟曲霉菌生物膜载体

A：早期模型建立将步骤2）收集的菌株接种到PDA培养皿，置于35~37℃培养箱培养活化3~5天，用5~10ml含有0.025%吐温20的磷酸盐缓冲液冲洗平皿表面收集孢子，用20~25ml MOPS缓冲的RPMI-1640重悬孢子，用血细胞计数板调整孢子浓度，并用RPMI-1640液体培养液调整浓度为1~5×10⁵·孢子·ml^-1，将1~2ml孢子悬液放在步骤3）制备的载体上，静置于35~37℃生化培养箱中培养；培养24h时载体上为早期烟曲霉菌生物膜；

B：成熟期模型建立按照步骤A制备的烟曲霉菌生物膜培养48h时载体上为成熟期烟曲霉菌生物膜；

7）药物对烟曲霉菌生物膜作用将步骤6）制备的两种模型烟曲霉菌生物膜载体用无菌磷酸盐缓冲液漂洗，后放入新的24孔板中，按步骤5）获得的绿原酸最低抑菌浓度MIC，加入亚抑菌浓度的绿原酸及最低杀菌浓度的伏立康唑，每个孔加入量为1ml，空白组为MOPS缓冲的1640液体培养基，静置于35~37℃培养48h，后取出载体，进行观察；

8）XTT减低法测代谢活性配制XTT溶液和维生素K₃溶液：（1）XTT粉末用PBS溶解，配成500mg/ml的饱和溶液；（2）将饱和溶液用0.22μm的滤器过滤除菌；（3）分装、避光保存在-70℃冰箱；（4）维生素K₃粉末用100%的丙酮溶解，配成10mmol/l的母液；（5）分装保存在-70℃冰箱，将配制好的维生素K₃溶液加入到XTT溶液中，使前者在XTT溶液中的终浓度为1~2μmol/l；XTT减低法：用枪头吸取磷酸盐缓冲液轻轻冲洗步骤7）含有药物的烟曲霉菌生物膜载体表面浮游菌，放到新的24孔板内，吸取400~500μl XTT和维生素K3混合溶液加入到装有载体的孔内，于35~37℃避光静置2~4h，后吸取100~150μl孔内的XTT和维生素K3混合液，置于96孔酶标板中，在波长为490nm处测各孔OD值；

9）荧光染液的配制

a．取1ml无菌去离子水加入到1.5ml的避光离心管中；

b．吸取2μl SYTO9染液加入到步骤a的避光离心管中；

c．吸取2μl PI染液加入到步骤b的避光离心管中；

d．用漩涡振荡器震荡此避光离心管30~60s；

e．将步骤d的避光离心管用离心机以2000rpm转速离心2~3min；

10）荧光染色及观察将步骤7）制备的烟曲霉菌生物膜载体置于无菌24孔板中，再取100μl 步骤9）配制的荧光染液上清液滴加到载体上，35~37℃培养2h，再用荧光显微镜观察，此过程全程避光操作。

以上所述的绿原酸浓度为亚抑菌浓度的绿原酸512~1024μg/ml。

以上所述的伏立康唑为最低杀菌浓度伏立康唑30~50μg/ml。

一种杀死烟曲霉菌的组合物，包括绿原酸和伏立康唑联合应用于生物膜中的烟曲霉菌。

以上所述的绿原酸的浓度为512~1024μg/ml，所述的伏立康唑的浓度为30~50μg/ml。

本发明突出的实质性进步和显著的特点是：运用本发明烟曲霉菌的药物组合及杀菌方法，能够杀死生物膜中的烟曲霉菌，单独使用抗真菌药物，无法杀死生物膜中的烟曲霉菌，使用本发明绿原酸和伏立康唑，便能够达到完全杀灭生物膜中烟曲霉菌的效果。

附图说明

图1是本发明实施例2早期烟曲霉生物膜用药干预后的死活菌变化情况；A：空白组；B：1024μg/ml绿原酸组；C：512μg/ml绿原酸组；D：VRC组；E：1024μg/ml绿原酸联合VRC组；F：512μg/ml绿原酸联合VRC组。

图2是本发明实施例2成熟期烟曲霉生物膜用药干预后的死活菌变化情况；A：空白组；B：1024μg/ml绿原酸组；C：512μg/ml绿原酸组；D：VRC组；E：1024μg/ml绿原酸联合VRC组；F：512μg/ml绿原酸联合VRC组。

具体实施方法

实施例1

1.1 材料

1.1.1 抗真菌药物绿原酸（CRA，国家食品药品检定研究院，批号110753-201314），伏立康唑（VRC，国家食品药品检定研究院，批号100862-200701）。均用100%的二甲亚砜溶解，分别配成浓度为102400μg/ml、1280μg/ml的储存液，分装后于-20℃储存。

1.1.2 菌株于2012年9月到2013年5月在广西医科大学第一附属医院检验科细菌室收集到的30个烟曲霉菌株，用结晶紫法选出形成生物膜能力最强菌株作为受试菌株。质控菌株为ATCC22019近平滑念珠菌，获赠于广西医科大学第一附属医院检验科细菌室。

1.1.3 载体玻璃细胞爬片，直径13mm（海门市盛邦实验器材有限公司），高温高压灭菌后备用。

1.1.4 试剂和器材马铃薯葡萄糖培养基PDA（北京路桥）、SDA沙堡氏琼脂培养基（北京路桥）、MOPS（Sigma）、RPMI-1640粉(Gibco)、二甲亚砜（Sigma）、XTT粉（生工生物公司）、丙酮（国产分析纯）、维生素K₃粉剂（生工生物公司）、无菌96孔细胞培养板（美国Corning）、生化培养箱（常州市伟嘉仪器制造有限公司，型号：SPX-250）、生物安全柜（苏州净化设备有限公司，型号：BHC-1300ⅡA/B₂）。

1.2 方法

1.2.1 孢子悬液的制备将储存的菌株接种到PDA培养皿，置于37℃生化培养箱进行复苏，再转种到另一个PDA培养皿并置于37℃生化培养箱活化3天之后用5ml含有0.025%吐温20的磷酸盐缓冲液冲洗平皿表面收集孢子，20ml MOPS缓冲的RPMI-1640重悬孢子，血细胞计数板调整孢子浓度为1×10⁶·ml^-1，再用RPMI-1640液体培养基稀释50倍，得到2倍终浓度的孢子悬液。

1.2.2 药物敏感试验微量液基稀释法：按照CLSI颁布的M38-A2的标准进行。把受试的药物倍比稀释到2倍终浓度，分别取100μl加入到无菌96孔细胞培养板的第1-10孔，第11孔为不含药物的生长对照孔，第12孔为不含药物且不含孢子的无菌对照孔。第1至第11孔分别加入100μl制备好的2倍终浓度的孢子悬液，静置于37℃孵育48h。

1.2.3 最低抑菌浓度（MIC）的判定：肉眼观察判断终点：96培养板各个孔充分混匀之后与生长对照孔比较，100%生长抑制所对应的最低药物浓度为此药物的MIC。

1.2.4 最低杀真菌浓度（MFC）的测定：将MIC以上各孔各吸取100μl的液体放到SDA平板上，用无菌接种棒均匀涂布到平板各处后静置于37℃的生化培养箱进行孵育，3天后数平板上的菌落，小于5个菌落的最低药物浓度即为最低杀真菌浓度。

1.2.5 质控按照CLSI的建议选用ATCC22019近平滑念珠菌作为质控菌株，其对伏立康唑的MIC参考范围是0.5~4μg/ml，本试验中质控菌株的伏立康唑的MIC为2μg/ml，同时实验过程中菌株生长状态良好，结果可靠。实验重复3次，结果均一致。

1.2.6 早期和成熟期烟曲霉生物膜模型建立以灭菌后的玻璃细胞爬片（直径13mm）作为载体。将受试烟曲霉菌株接种在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）平皿上，置于37℃培养，活化3天之后用5ml含有0.025%吐温20的磷酸盐缓冲液冲洗平皿表面收集孢子，20ml MOPS缓冲的RPMI-1640重悬孢子，血细胞计数板调整孢子浓度为（1~5）×10⁵/ml，将1ml孢子悬液加入24孔板中的无菌玻璃细胞爬片上，静置于37℃生化培养箱中孵育，每日用MOPS缓冲的RPMI-1640换液。孵育至24h时载体上为早期烟曲霉生物膜，48h时载体上为成熟期烟曲霉生物膜。

1.2.6 实验所用药物浓度空白组为MOPS缓冲的1640液体培养基，绿原酸组分为2个组，除了MOPS缓冲的1640液体培养基，其中还分别含有亚抑菌浓度的1024μg/ml和512μg/ml的绿原酸；伏立康唑的浓度为其最低杀真菌浓度32μg/ml。

1.2.7 绿原酸对早期和成熟期烟曲霉生物膜的作用观察把孵育了24、48h的载体用无菌磷酸盐缓冲液轻轻漂洗后放入新的24孔板中，按上述浓度加入药物，每个孔加入1ml，静置于37℃培养，继续孵育48h，期间每24h用相同的药物换液。于药物作用48h后，取出载体，分别行XTT减低法测定代谢活性和荧光死活菌染色后用激光共聚焦显微镜观察。

1.2.8 XTT减低法测代谢活性 XTT溶液和维生素K₃溶液的配制：（1）XTT粉末用磷酸盐缓冲液溶解，配成500mg/ml的饱和溶液；（2）将饱和溶液用0.22μm的滤器过滤除菌；（3）分装、避光保存在-70℃冰箱；（4）维生素K₃粉末用100%的丙酮溶解，配成10mmol/l的母液；（5）分装保存在-70℃冰箱；（6）临用前将配好的维生素K₃丙酮溶液加入到XTT溶液中，使前者在XTT溶液中的终浓度为1μmol/l。XTT减低法：用枪头取磷酸盐缓冲液轻轻冲洗载体表面浮游菌，放到新的24孔板内，吸取400μl XTT和维生素K3混合液加入到装有载体的孔内，于37℃避光静置2h，之后吸取100μl孔内的XTT和维生素K3混合液，置于96孔酶标板中，在波长为490nm处测各孔OD值。XTT%=OD_{药物处理组}/OD_空白组×100%。以上实验，每组4个标本，均独立重复3次。

1.2.9 荧光死活菌染色及观察荧光染液的配制：（1）取1ml无菌去离子水加入到1.5ml的避光离心管中；（2）吸取2μl SYTO9染液加入到上述的避光离心管中；（3）吸取2μl PI染液加入到上述的避光离心管中；（4）用漩涡振荡器震荡此避光离心管30秒；（5）将此避光离心管用离心机以2000rpm转速离心2分钟；（6）使用时吸取离心管中上部分的染液。激光共聚焦显微镜观察：用波长为488nm的激发光观察SYTO9标记的活菌，显示出绿光；用波长为543nm的激发光观察PI标记的死菌，显示出红光；两种颜色的光重叠部分显示为黄光。

实施例2

依据实施例1的实施，得出的结果，表1为XTT减低法测代谢活性，各组的XTT%

组别	早期烟曲霉生物膜	成熟期烟曲霉生物膜
			VRC组	71.07	85.29
512μg/ml CRA组	99.97	98.02
			1024μg/ml CRA组	99.12	98.68
512μg/ml CRA组+VRC	17.82	35.89
			1024μg/ml CRA组+VRC	10.23	19.21

荧光染色和观察荧光死活菌染色后用激光共聚焦显微镜观察，无论是早期或者是成熟期绿原酸干预组与空白组相比，无明显区别，菌丝同样密集并且均为有活力的绿色；伏立康唑组菌丝密度同空白组无明显差别，少数菌丝显示出无活力的红色及活力差的黄色，作用于早期生物膜时红色和黄色比成熟期多；绿原酸联合伏立康唑组与空白组相比菌丝明显减少，并且残留的菌丝多数呈现出红色或者黄色，1024μg/ml的绿原酸联合伏立康唑组与512μg/ml的绿原酸联合伏立康唑组相比，残留的菌丝更少。早期生物膜的用药后变化见图1，成熟期生物膜的用药后变化见图2。

Claims

1.一种杀灭烟曲霉菌的方法，包括制备药物、收集菌株、制备载体、制备孢子悬液、药物敏感试验、制备烟曲霉菌生物膜载体、药物对烟曲霉生物膜作用、XTT减低法测代谢活性、荧光染液的配制和荧光染色及观察，其特征在于，用绿原酸和伏立康唑联合杀死烟曲霉菌，具体步骤如下：

1）制备药物取400~500mg绿原酸和4~5mg伏立康唑，分别用3~6ml 100%的二甲亚砜溶解，分别配制成浓度为102400μg/ml和1280μg/ml的溶液，于-20℃~-25℃储存；

2）收集菌株收集烟曲霉菌株，质控菌株为近平滑念珠菌；

5）药物敏感试验微量液基稀释法，在无菌的96孔细胞培养板的第1至第10孔加入步骤4）制备的孢子悬液，再将步骤1）制备的绿原酸和伏立康唑分别置于两个无菌的96孔细胞培养板的第1至第10孔，第1孔加入量为100μl，第2~10孔依次倍比稀释至二倍终浓度，第11孔为步骤4）制备孢子悬液的生长对照孔，第12孔为MOPS缓冲的RPMI-1640液体培养基，静置于35~37℃培养48h；获得绿原酸和伏立康唑最低抑菌浓度MIC；由获得的最低抑菌浓度MIC 测定伏立康唑的最低杀菌浓度MFC；

6）制备烟曲霉菌生物膜载体

7）药物对烟曲霉菌生物膜作用将步骤6）制备的两种模型烟曲霉菌生物膜载体用无菌磷酸盐缓冲液漂洗，后放入新的24孔板中，按步骤5）获得的绿原酸最低抑菌浓度MIC，加入亚抑菌浓度的绿原酸及最低杀菌浓度MFC的伏立康唑，每个孔加入量为1ml，空白组为MOPS缓冲的1640液体培养基，静置于35~37℃培养48h，后取出载体，进行观察；

8）XTT减低法测代谢活性将配制好的维生素K₃溶液加入到XTT溶液中，使前者在XTT溶液中的终浓度为1-2μmol/l；XTT减低法：用枪头吸取磷酸盐缓冲液轻轻冲洗步骤7）含有药物的烟曲霉菌生物膜载体表面浮游菌，放到新的24孔板内，吸取400~500μl XTT和维生素K3混合溶液加入到装有载体的孔内，于35~37℃避光静置2~4h，后吸取100~150μl孔内的XTT和维生素K3混合液，置于96孔酶标板中，在波长为490nm处测各孔OD值；

9）荧光染液的配制

a．取1ml无菌去离子水加入到1.5ml的避光离心管中；

b．吸取2μl SYTO9染液加入到步骤a的避光离心管中；

c．吸取2μl PI染液加入到步骤b的避光离心管中；

d．用漩涡振荡器震荡此避光离心管30-60s；

e．将步骤d的避光离心管用离心机以2000rpm转速离心2~3min；

2.根据权利要求1所述的体外杀灭烟曲霉菌的方法，其特征在于，所述的绿原酸浓度为亚抑菌浓度的绿原酸512~1024μg/ml。

3.根据权利要求1所述的体外杀灭烟曲霉菌的方法，其特征在于，所述的伏立康唑为最低杀菌浓度伏立康唑30~50μg/ml。

4.一种杀死烟曲霉菌的组合物，其特征在于，包括绿原酸和伏立康唑联合应用于生物膜中的烟曲霉菌。

5.根据权利要求6所述的杀死烟曲霉菌的组合物，其特征在于，所述的绿原酸的浓度为512~1024μg/ml，所述的伏立康唑的浓度为30~50μg/ml。