CN105079007B - 水杨酸在制备抑制木糖葡萄球菌生物被膜药物中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了水杨酸在制备抑制木糖葡萄球菌生物被膜药物中的用途,属于水杨酸的新医药用途领域。本发明采用木糖葡萄球菌生物被膜体外模型研究水杨酸对木糖葡萄球菌生物被膜的体外干预作用,通过结晶紫法观察发现水杨酸对木糖葡萄球菌生物被膜的形成有显著抑制作用,通过XTT法和激光共聚焦显微镜观察发现水杨酸对成熟的木糖葡萄球菌被膜有明显的杀灭作用。因此,水杨酸对于抑制木糖葡萄球菌或干预木糖葡萄球菌生物被膜有确切的功效,能将其应用于制备抑制木糖葡萄球菌或杀灭木糖葡萄球菌生物被膜的药物。
Description
技术领域
本发明涉及水杨酸新医药用途,尤其涉及水杨酸在制备抑制木糖葡萄球菌或干预木糖葡萄球菌生物被膜的药物中的应用,属于水杨酸新医药用途领域。
背景技术
木糖葡萄球菌是一种血浆凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)。此菌广泛分布于自然界,以往认为是非致病菌。近几年,血浆凝固酶阴性葡萄球菌被认为是形成奶牛乳房炎的新兴病原菌。奶牛乳房炎是对奶业危害十分严重的疾病之一,也是导致奶牛淘汰的第三大疾病。引起奶牛乳房炎不易治愈和反复发作的最有说服力的说法就是其有很强的生物被膜(Biofilm,BF)形成能力。生物被膜是细菌产生的多聚复合物基质将自身包绕,黏附于无活性物体或活体表面,形成的有一定结构的细菌群体;它可以抵抗宿主免疫力和抗生素抑菌杀菌作用;生物被膜内细菌容易对抗生素产生广泛的耐药性,造成感染难以治愈,反复发作。
生物被膜状态的细菌与浮游态的细菌在组成结构、生理特性、耐药性等方面差异较大,生物被膜状态的细菌对抗生素及宿主的免疫反应是不敏感的,生物被膜状态的细菌对抗菌剂的耐药性是一个多因素过程,主要是生物被膜中细菌与其浮游态在生理性上有所不同。生物被膜形成后细菌可表达出独特的、不同于浮游菌的生物被膜表型,表达独特的抗性基因。由于细菌生物被膜的耐药机制完全不同于浮游菌,能够抑制浮游态的细菌的抗菌药物不一定能够干预或抑制细菌生物被膜;临床上发现即使反复试验证明有效的药物,但也不能清除生物被膜,导致感染迁延不愈,浪费了大量的人力及物力,形成了公共卫生问题。
水杨酸是植物柳树皮提取物,是一种天然的消炎药。水杨酸能够抑制表皮葡萄球菌,金黄色葡萄球菌等细菌生物被膜的形成,减小它们的毒性和黏附性。并且通过与高分子聚合物结合控制水杨酸的释放度可以很好的抑制生物被膜的形成。水杨酸也可以抑制群体感应系统。迄今为止,未见水杨酸对木糖葡萄球菌生物被膜具有干预或抑制作用的报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供水杨酸在制备抑制木糖葡萄球菌或干预木糖葡萄球菌生物被膜药物上的新用途。
为了解决上述技术问题,本发明所采用的技术方案是:
本发明通过体外建立木糖葡萄球菌生物被膜,通过结晶紫法、XTT法和激光共聚焦显微镜考察水杨酸对木糖葡萄球菌生物被膜的干预作用。
通过结晶紫法研究了不同药物浓度下水杨酸对木糖葡萄球菌生物被膜的干预作用,结果表明各个浓度药物的OD值随着药物浓度的增大而减小,呈现负相关。每个浓度的OD值与空白对照存在显著性差异。甲醇对照组和菌液对照组的OD值之间,没有显著性差异,说明水杨酸对木糖葡萄球菌的生物被膜有确切的干预作用。
通过XTT法和激光共聚焦显微镜观察了不同药物浓度下水杨酸对木糖葡萄球菌的细菌活性的影响:XTT法结果表明随着水杨酸药物浓度的加大,抑菌率不断变大,当浓度达到1/2MIC时,水杨酸对生物被膜里的活菌有很好的抑制杀灭作用;通过激光共聚焦显微镜观察,在没有加药的情况下生物被膜形成较厚。而当水杨酸药物浓度达到1/2MIC时,生物被膜明显变薄,细菌活力呈下降趋势,说明在水杨酸药物的作用下,药物可以渗透生物被膜作用到内部,生物被膜内的木糖葡萄球菌明显受到抑制。
综上所述,水杨酸对木糖葡萄球菌有杀菌作用并且对生物被膜有很好的干预或抑制作用。因此,水杨酸可以用于制备抑制木糖葡萄球菌的药物。
本发明公开了一种抑制木糖葡萄球菌的药物组合物,包括:预防或治疗上有效量的水杨酸和药学上可接受的辅料或载体。
本发明还公开了一种抑制木糖葡萄球菌生物被膜的药物组合物,包括:预防或治疗上有效量的水杨酸和药学上可接受的辅料或载体。
所述的抑制木糖葡萄球菌生物被膜包括干预木糖葡萄球菌生物被膜的形成或抑制成熟的木糖葡萄球菌生物被膜的木糖葡萄球菌。
所述的载体或辅料是指药学领域常规的载体或辅料,例如:稀释剂、崩裂剂、润滑剂、赋形剂、粘合剂、助流剂、填充剂、表面活性剂等;另外,还可以在组合物中加入其它辅助剂如香味剂和甜味剂。
所述稀释剂可以是一种或几种增加片剂重量和体积的成分;常用的稀释剂包括乳糖、淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、山梨醇、甘露醇以及无机钙盐等。其中最常用为乳糖、淀粉、微晶纤维素。
所述崩解剂可以为交联聚乙烯吡咯烷酮(与总重量比为2-6%),交联羧甲基纤维素钠(与总重量比为2-6%)、海藻酸(与总重量比为2-5%)、微晶纤维素(与总重量比为5-15%)中之一种或几种混合物。其中以交联聚乙烯吡咯烷酮(与总重量比为2-7%),交联羧甲基纤维素钠(与总重量比为2-6%)为佳。最佳为交联聚乙烯吡咯烷酮(与总重量比为2-6%)。
所述的润滑剂包括硬脂酸,硬脂酸钠,硬脂酸镁,硬脂酸钙,聚乙二醇,滑石粉,氢化植物油中之一种或几种混合物。其中以硬脂酸镁最为适宜。润滑剂的用量范围(与总重量比)为0.10-1%,一般用量为0.25-0.75%,最佳用量为0.5-0.7%。
所述的粘合剂可以是一种或几种有利于制粒的成分。可以是淀粉浆(10-30%,与粘合剂总重量比),羟丙基甲基纤维素(2-5%,与粘合剂总重量比),聚乙烯吡咯烷酮(2-20%,与粘合剂总重量比),以聚乙烯吡咯烷酮的乙醇水溶液为佳,最佳为聚乙烯吡咯烷酮的50%乙醇水溶液。
所述助流剂可以为微粉硅胶、滑石粉、三硅酸镁中之一种或几种混合物。
所述表面活性剂可以为一种或几种能够提高润湿性和增加药物溶出的成分。常用为十二烷基硫酸钠(常用范围为0.2-6%,与总重量比)。
水杨酸,别名为:2-羟基苯甲酸、柳酸、邻羟基苯甲酸、升华水杨酸、邻-羟基苯甲酸,植物柳树皮提取物,是一种天然的消炎药。其分子式为C7H6O3,分子量为138.12,分子结构(I)如下:
本发明技术方案与现有技术相比有以下有益效果:
本发明水杨酸对木糖葡萄球菌生物被膜具有显著的抑制作用,能有效的干预木糖葡萄球菌生物被膜的形成并杀灭成熟生物被膜内的木糖葡萄球菌,能应用于制备抑制木糖葡萄球菌或干预木糖葡萄球菌生物被膜形成的药物。
附图说明
图1为不同药物浓度下水杨酸对木糖葡萄球菌生物被膜的干预作用。
图2为不同药物浓度下水杨酸对木糖葡萄球菌的抑菌率。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明,本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的,不对本发明的范围构成限制。本领域技术人员应该理解的是,在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换,但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
1、材料
1.1实验菌株
木糖葡萄球菌ATCC700404购自美国标准菌种收藏中心。
1.2试剂
生理盐水购于哈尔滨三联药业有限公司
甲醇购于天津市科密欧化学试剂有限公司
TSB培养基购于青岛高科园海博生物技术有限公司
XTT试剂盒购于凯基生物科技发展有限公司
Live/dead试剂盒购于Molecular Probes
1.3主要试剂的配制
TSB液体培养基:称取4.5g培养基,加入200毫升蒸馏水,高压蒸汽灭菌。
99%甲醇溶液:1ml水加入99ml100%的甲醇,混匀。
0.1%结晶紫溶液:称取结晶紫0.1g,加入100ml蒸馏水,混匀。
33%冰醋酸溶液:量取33ml的冰醋酸,加入67ml的蒸馏水,混匀。
1.4实验仪器
高压灭菌器(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)
DH6000A电热恒温培养箱(天津市泰斯特仪器有限公司)
超净工作台(上海力申科学仪器有限公司)
XK96-A快速混匀器(江苏新康医疗器械有限公司)
96孔板(美国Corning公司)
6孔板(美国Corning公司)
电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司TD2002A)
酶标仪(美国Epoch公司)
激光共聚焦扫描电镜(莱卡Laica公司)
实验例1水杨酸对木糖葡萄球菌生物被膜的干预作用
1、实验方法
1.1药物的配制
精密称取水杨酸1.00g,溶于10mL甲醇中,配成浓度为100mg/mL的药物。作为储备液。取1mL药物。将药物过0.22μm的有机相滤膜,在用甲醇溶液倍比稀释。供测量MIC使用。
1.2菌液的配制
取在-20℃下保存的木糖葡萄球菌ATCC700404,在超净台中的点燃的酒精灯附近进行操作,分别用接种环蘸取菌液接种,培养于加入TSB的玻璃试管中,放入37℃恒温培养箱中培养12h。以相同接种方法对木糖葡萄球菌进行传代纯化培养后,即可备用。
取试管置于细菌比浊仪中,先加一定量的生理盐水,调比浊仪显示100,再加传代完的木糖葡萄球菌,调菌液的浓度显示到85。然后用培养液对菌做1000倍稀释备用(含菌量约1.0×107cfu/mL)。
1.3水杨酸对木糖葡萄球菌最小抑菌浓度(MIC,minimal inhibitoryconcentration)的测定
将调好的菌液用移液器加入96孔板中,每个孔加180μL菌液,然后吸取20μL稀释好的不同浓度的水杨酸药物,加到96孔板中。使得终体系为200uL。在分别做一个不加药物只含培养基的对照和只加菌液不加药物的对照。每种药做3组平行,于37℃恒温培养箱中培养24h观察结果,以无菌生长的药物最低浓度孔即为水杨酸对木糖葡萄球菌最小抑菌浓度(MIC)。
1.4不同药物浓度下水杨酸干预生物被膜形成能力的检测
1.4.1生物被膜的建立
将按1.2步骤配制菌液,药物按1.1配制。向96孔板中加入菌液和各个浓度药物共200μL(药物浓度分别为MIC,1/2MIC,1/4MIC,1/8MIC,1/16MIC)。另设空白对照孔(只含有培养基)、甲醇对照孔(加入与药物等量体积的甲醇)和阴性对照孔(不加药物的生物被膜生长对照)。每个浓度3组平行。于37℃恒温培养箱中培养24h。
1.4.2结晶紫染色
将培养好的96孔细胞培养板取出,弃去菌液,并用无菌PBS缓冲液轻轻冲洗3次。再用99%的甲醇固定30min晾干,然后用0.1%的结晶紫200μl染色30min,并冲洗晾干。加入33%的冰醋酸振荡器上作用30min。用酶标仪在570nm处,测定吸光度。
1.5不同药物浓度下水杨酸对生物被膜内细菌活性的分析
1.5.1 XTT分析法
1.5.1.1生物被膜的建立
将按1.2步骤配制菌液,药物按1.1配制。向96孔板中加入菌液和各个浓度药物共200μL(药物浓度分别为MIC,1/2MIC,1/4MIC,1/8MIC,1/16MIC)。另设空白对照孔(只含有培养基)、甲醇对照孔(加入与药物等量体积的甲醇)和阴性对照孔(不加药物的生物被膜生长对照)。每个浓度3组平行。于37℃恒温培养箱中培养24h。
1.5.1.2 XTT分析法
XTT工作液按照试剂盒的说明配制。将培养好的96孔细胞培养板取出,弃掉菌液,灭菌PBS冲洗2次,每孔分别加入100μL新TSB培养基和20μL XTT工作液,放入37摄氏度恒温孵箱中培养3h后用多功能酶标仪测定每孔在450nm处的吸光值。实际吸光值为每个实验孔的吸光值减去空白对照孔的吸光值。实验重复3次。
抑菌率的计算公式:
1.5.2 live/dead染色法
1.5.2.1生物被膜的建立
将按1.2步骤配制菌液,药物按1.1配制。取1.8mL稀释后的菌液加入到6孔板中,再加入200μL药物。最后使药物的终浓度达到1/2MIC。另设置一个对照孔(不加药)。把盖玻片用酒精消毒后,放入6孔板中,于37℃恒温培养箱中培养24h。
1.5.2.2 live/dead染色法
将盖玻片取出,用灭菌PBS轻轻漂洗,除去BF表面的游离细菌。在每张玻片BF表面滴加配制好的荧光染液(SYT09/PI),避光孵育15min,再用灭菌生理盐水漂洗掉未结合的荧光探针,置CLSM观察。分别采用绿色通道接收绿色信号,红色通道接收红色信号,每个标本取3个随机视野,每个视野根据BF的厚度,扫描8~30层。
1.6统计学数据分析
本实验采用SPSS 20.0软件对数据进行统计学处理与分析,数据以( )表示,采用多重比较和单因素方差分析对各组数据进行分析和比较。(P<0.05为差异性显著,p<0.01为差异性极显著)。
2实验结果
2.1水杨酸对木糖葡萄球菌ATCC700404的MIC测定结果
稀释法是通过测定等量的菌液在不同浓度的药物液体培养基中的生长有无,以及生长后的培养基的浊度来确定抗菌药物的抗菌效力,由稀释法所测得的抗菌药物抑制检测菌生长的最低浓度称为“最低抑菌浓度”。该法可以准确定量的测定待测药物的抗菌活性,方法简便,快捷,因此我们采用96孔板微量稀释法来测定抑菌活性。
通过实验可以明显得出,水杨酸的MIC为0.625mg/mL。
2.2不同药物浓度下对生物被膜形成能力的干预作用
结晶紫染色的方法可以快速简便的测量水杨酸对木糖葡萄球菌生物被膜的干预作用。通过不同药物浓度下OD值的大小,来反映药物干预生物被膜的强弱能力。
通过结晶紫染色,在酶标仪570nm处,测定各个药物浓度的OD值。OD值随着药物浓度的增大而减小,呈现负相关。经过SPSS软件分析,每个浓度的OD值与空白对照存在显著性差异,P<0.05。甲醇对照组和菌液对照组的OD值之间,没有显著性差异,P>0.05(图1)。说明水杨酸对木糖葡萄球菌的生物被膜有显著的干预作用。
3.3不同药物浓度下对生物被膜内细菌活性的影响
XTT法的机理为活细胞线粒体可将黄色的XTT还原成水溶性的橘黄色甲赞产物,其代谢物在450nm处的吸光值与细胞的活力成正比。XTT法的优点是XTT产物有良好的水溶性,能够透过细胞膜游离到上清液中,所以可以在不破坏BF完整结构的情况下来研究BF中细菌的活性,实验操作简单,使用96孔板可以同时大批量的对BF进行研究。
根据实验得到的数据显示,随着药物浓度的加大,抑菌率不断变大,表明细菌代谢减弱。当浓度达到1/2MIC时,水杨酸对生物被膜里的活菌有很好的抑制杀灭作用(图2),与结晶紫染色得到的结果相吻合。
激光共聚焦显微镜是观察BF的重要方法,通过荧光探针SYT09/PI染色,在不破坏BF完整性的情况下,能够确定BF的厚度,并且逐层观察BF内活菌和死菌的分布。从宏观上可以观察到生物被膜内活菌和死菌的分布。
实验结果显示,在没有加药的情况下生物被膜形成较厚。而当药物浓度达到1/2MIC时,生物被膜明显变薄,细菌活力呈下降趋势。说明在药物的作用下,生物被膜内的活菌受到抑制,药物可以渗透生物被膜作用到内部,即水杨酸对木糖葡萄球菌有杀菌作用并且对生物被膜有很好的干预作用。
Claims (3)
1.水杨酸制备抑制木糖葡萄球菌生物被膜的药物中的用途。
2.按照权利要求1所述的用途,其特征在于:所述的抑制木糖葡萄球菌生物被膜包括干预木糖葡萄球菌生物被膜的形成或杀灭成熟生物被膜内的木糖葡萄球菌。
3.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,所述的水杨酸为下列分子结构(I)的化合物:
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