CN104958284B - 大黄酸在制备抑制木糖葡萄球菌生物被膜药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了大黄酸在制备抑制木糖葡萄球菌生物被膜药物中的用途，属于大黄酸的新医药用途领域。本发明采用木糖葡萄球菌生物被膜体外模型研究大黄酸对木糖葡萄球菌生物被膜的体外干预作用，通过结晶紫法和扫描电镜观察发现大黄酸有确切的抑制或干预木糖葡萄球菌生物被膜形成的作用，能将其应用于抑制木糖葡萄球菌、干预木糖葡萄球菌生物被膜的形成或杀灭成熟的生物被膜内的木糖葡萄球菌。

Description

大黄酸在制备抑制木糖葡萄球菌生物被膜药物中的用途

技术领域

本发明涉及大黄酸新医药用途，尤其涉及大黄酸在制备抑制木糖葡萄球菌或木糖葡萄球菌生物被膜的药物中的应用，属于大黄酸新医药用途领域。

背景技术

木糖葡萄球菌是一种血浆凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)。此菌广泛分布于自然界，以往认为是非致病菌。近几年，血浆凝固酶阴性葡萄球菌被认为是形成奶牛乳房炎的新兴病原菌。奶牛乳房炎是对奶业危害十分严重的疾病之一，也是导致奶牛淘汰的第三大疾病。引起奶牛乳房炎不易治愈和反复发作的最有说服力的说法就是其有很强的生物被膜(Biofilm,BF)形成能力。生物被膜是细菌产生的多聚复合物基质将自身包绕，黏附于无活性物体或活体表面，形成的有一定结构的细菌群体；它可以抵抗宿主免疫力和抗生素抑菌杀菌作用；生物被膜内细菌容易对抗生素产生广泛的耐药性，造成感染难以治愈，反复发作。

生物被膜状态的细菌与浮游态的细菌在组成结构、生理特性、耐药性等方面差异较大。生物被膜状态的细菌对抗生素及宿主的免疫反应是不敏感的，生物被膜状态的细菌对抗菌剂的耐药性是一个多因素过程，主要是生物被膜中细菌与其浮游态在生理性上有所不同。生物被膜形成后细菌可表达出独特的、不同于浮游菌的生物被膜表型，表达独特的抗性基因。由于细菌生物被膜的耐药机制完全不同于浮游菌，能够抑制浮游态的细菌的抗菌药物不一定能够干预或抑制细菌生物被膜；临床上发现即使反复试验证明有效的药物，但也不能清除生物被膜，导致感染迁延不愈，浪费了大量的人力及物力，形成了公共卫生问题。

大黄酸，化学名称为1,8-二羟基-3-羧基蒽醌，是从大黄属、蓼属、鼠李属和番泻叶等中药中分离得到的活性成分。近年来，对大黄酸药理作用机制进行的大量深入研究发现，大黄酸具有广泛的药理作用，主要集中在抑制细胞增殖、抗炎、抑制肝脏和肾脏纤维化等方面。

迄今为止，尚无大黄酸对木糖葡萄球菌生物被膜具有干预或抑制作用的报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供大黄酸在制备抑制木糖葡萄球菌或干预木糖葡萄球菌生物被膜的药物上的新用途。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：

本发明首先体外建立了木糖葡萄球菌生物被膜，在此基础上，通过结晶紫法以及扫描电镜研究了大黄酸对木糖葡萄球菌生物被膜的干预作用。

本发明通过结晶紫法研究了不同药物浓度下大黄酸对木糖葡萄球菌生物被膜的干预作用，结果表明在1/2MIC、1/4MIC以及1/8MIC时，大黄酸对木糖葡萄球菌生物被膜形成的抑制作用，呈现剂量依赖性。

通过扫描电镜观察发现，大黄酸有显著的抑制木糖葡萄球菌生物被膜形成的活性。

综上所述，大黄酸对木糖葡萄球菌生物被膜有很好的干预和抑制作用，因此，大黄酸可以用于制备抑制木糖葡萄球菌生物被膜的药物。

本发明进一步公开了一种抑制木糖葡萄球菌的药物组合物，包括：预防或治疗上有效量的大黄酸和药学上可接受的辅料或载体。

本发明还公开了一种抑制木糖葡萄球菌生物被膜的药物组合物，包括:预防或治疗上有效量的大黄酸和药学上可接受的辅料或载体。

所述的抑制木糖葡萄球菌生物被膜包括干预木糖葡萄球菌生物被膜的形成或杀灭成熟的生物被膜内的木糖葡萄球菌。

所述的载体或辅料是指药学领域常规的载体或辅料，例如：稀释剂、崩裂剂、润滑剂、赋形剂、粘合剂、助流剂、填充剂、表面活性剂等；另外，还可以在组合物中加入其它辅助剂如香味剂和甜味剂。

所述稀释剂可以是一种或几种增加片剂重量和体积的成分；常用的稀释剂包括乳糖、淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、山梨醇、甘露醇以及无机钙盐等。其中最常用为乳糖、淀粉、微晶纤维素。

所述崩解剂可以为交联聚乙烯吡咯烷酮(与总重量比为2－6％)，交联羧甲基纤维素钠(与总重量比为2－6％)、海藻酸(与总重量比为2－5％)、微晶纤维素(与总重量比为5－15％)中之一种或几种混合物。其中以交联聚乙烯吡咯烷酮(与总重量比为2－7％)，交联羧甲基纤维素钠(与总重量比为2－6％)为佳。最佳为交联聚乙烯吡咯烷酮(与总重量比为2－6％)。

所述的润滑剂包括硬脂酸，硬脂酸钠，硬脂酸镁，硬脂酸钙，聚乙二醇，滑石粉，氢化植物油中之一种或几种混合物。其中以硬脂酸镁最为适宜。润滑剂的用量范围(与总重量比)为0.10－1％，一般用量为0.25－0.75％，最佳用量为0.5－0.7％。

所述的粘合剂可以是一种或几种有利于制粒的成分。可以是淀粉浆(10－30％，与粘合剂总重量比)，羟丙基甲基纤维素(2-5％，与粘合剂总重量比)，聚乙烯吡咯烷酮(2-20％，与粘合剂总重量比)，以聚乙烯吡咯烷酮的乙醇水溶液为佳，最佳为聚乙烯吡咯烷酮的50％乙醇水溶液。

所述助流剂可以为微粉硅胶、滑石粉、三硅酸镁中之一种或几种混合物。

所述表面活性剂可以为一种或几种能够提高润湿性和增加药物溶出的成分。常用为十二烷基硫酸钠(常用范围为0.2－6％，与总重量比)。

大黄酸，化学名称为1,8-二羟基-3-羧基蒽醌，是从大黄属、蓼属、鼠李属和番泻叶等中药中分离得到的活性成分，具有抗肿瘤活性、抗菌活性、免疫抑制作用等药效。其分子式为C₁₅H₈O₆，分子量为284.21，分子结构(I)如下：

本发明技术方案与现有技术相比有以下有益效果：

本发明发现大黄酸对木糖葡萄球菌生物被膜的形成具有显著的抑制作用，能有效的干预木糖葡萄球菌生物被膜的形成，能应用于制备成抑制木糖葡萄球菌或干预木糖葡萄球菌生物被膜形成的药物。

附图说明

图1为亚MIC浓度的大黄酸抑制木糖葡萄球菌生物被膜的形成的干预作用；

图2为大黄酸对木糖葡萄球菌生物被膜干预作用的扫描电镜观察。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

1、材料

1.1 实验菌株

木糖葡萄球菌ATCC700404购自美国标准菌种收藏中心

大黄酸购于上海融禾医药科技发展有限公司

生理盐水购于哈尔滨三联药业有限公司

甲醇购于天津市科密欧化学试剂有限公司

TSB培养基购于青岛高科园海博生物技术有限公司

1.3 主要试剂的配制

TSB液体培养基：称取4.5g培养基，加入200毫升蒸馏水，高压蒸汽灭菌。

99％甲醇溶液：1ml水加入99ml100％的甲醇，混匀。

0.1％结晶紫溶液：称取结晶紫0.1g，加入100ml蒸馏水，混匀。

33％冰醋酸溶液：量取33ml的冰醋酸，加入67ml的蒸馏水，混匀。

1.4 实验仪器

高压灭菌器(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)

DH6000A电热恒温培养箱(天津市泰斯特仪器有限公司)

超净工作台(上海力申科学仪器有限公司)

XK96-A快速混匀器(江苏新康医疗器械有限公司)

96孔板(美国Corning公司)

电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司TD2002A)

酶标仪(美国Epoch公司，SN239591)

扫描电镜(日本，S-3400N，)

实验例1 大黄酸对木糖葡萄球菌生物被膜的干预作用

1、实验方法

1.1 大黄酸对木糖葡萄球菌最小抑菌浓度(MIC,minimal inhibitoryconcentration)的测定

实验操作及结果按照美国临床实验室国家标准委员会(NCCLS)推荐的标准微量稀释法进行判定。将木糖葡萄球菌菌株接种于TSB琼脂平板，37℃培养过夜。取单个菌落接种于TSB培养基中，37℃培养12h～16h。比浊法将菌液浓度先调整为0.5麦氏管悬液(1.0×10⁸cfu·mL^-1)，然后用THB培养基稀释为约1.0×10⁶cfu·mL^-1。依次向无菌96孔细胞培养板加入TSB培养基，除第1孔加入160μL TSB培养基外，其余每管加入100μL TSB，在第1孔加入大黄酸40μL混匀，然后吸取100μL至第2孔，混匀后再吸取100μL至第3孔，如此连续倍比稀释至第11孔，并从第11孔中吸取100μL弃去，第12孔为不含药物的生长对照。然后在每孔内加入上述制备好的接种物各100μL，使每管最终菌液浓度约为5×10⁵CFU/ml。混匀后盖好，于37℃孵育24h。以肉眼观察，无细菌生长的药物最低浓度孔，即为大黄酸对木糖葡萄球菌的MIC。

1.2 亚MIC浓度的大黄酸抑制木糖葡萄球菌生物被膜形成的测定

将木糖葡萄球菌菌株接种于TSB琼脂平板，37℃培养过夜。取单个菌落接种于TSB培养基中，37℃培养12h～16h。将浊度为0.5麦氏单位的菌液稀释为约1.0×10⁶cfu·mL^-1，取180μL接种于96孔细胞培养板中，加入大黄酸20μL(大黄酸浓度为1/2MIC,1/4MIC,1/8MIC,1/16MIC)，设立阳性对照及阴性对照组。混匀后盖好，37℃，静止培养24h。取出96孔细胞培养板，用移液枪弃去培养基并用灭菌的PBS(pH 7.2)轻轻洗涤三次以去除游离菌。将仍然附着在96孔细胞培养板上的被膜菌用200μL甲醇固定30min。弃去固定液待自然风干后，室温下用200μL 0.1％的结晶紫对生物被膜染色30min。染色完毕，弃去染色液，流水冲洗，风干，然后每孔加入200μL浓度为33％的冰乙酸溶液，置于振荡器10min以释放生物被膜中的结晶紫。酶标仪570nm处测定OD值。实验重复3次。

1.4 大黄酸对木糖葡萄球菌生物被膜作用的扫描电镜观察

首先从卡尔加里生物被膜装置上取下形成生物被膜的桩钉(1/2MIC大黄酸组及对照组)，并使用灭菌PBS(pH值7.2)轻轻洗涤三次以去除游离菌，用pH值7.2戊二醛固定，并置于4℃冰箱中固定1.5h。依次用pH值7.2PBS冲洗两次，每次均为10min，再用50％、70％、90％进行脱水各一次，每次15min，然后用100％乙醇脱水二次，每次15min，最后100％乙醇与叔丁醇(1∶1)，纯叔丁醇各脱水一次后，每次15min，用冷冻干燥仪对样品进行干燥4h。样品表面在真空条件下镀一层厚100A的金属膜，扫描电镜下观察。

2 实验结果

2.1 大黄酸对木糖葡萄球菌的最小抑菌浓度(MIC)试验结果

通过微量稀释法测定了大黄酸对木糖葡萄球菌的最小抑菌浓度(MIC)，MIC值为0.25mg/mL。结果表明，大黄酸能抑制木糖葡萄球菌的生长。

2.2 亚MIC浓度的大黄酸抑制木糖葡萄球菌生物被膜的形成

用亚MIC浓度(1/2MIC,1/4MIC,1/8MIC,1/16MIC)的大黄酸和木糖葡萄球菌菌液共同培养24h后染色，酶标仪测定OD570值。结果显示，1/2MIC大黄酸组、1/4MIC大黄酸组以及1/8MIC大黄酸组OD570值明显低于对照组OD570值，差异显著(P＜0.05)(图1)。表明在1/2MIC、1/4MIC以及1/8MIC时，大黄酸对木糖葡萄球菌生物被膜形成具有抑制作用。1/16MIC大黄酸组OD570值与对照组OD570值差异不显著(P＞0.05)。表明在1/16MIC时，大黄酸对木糖葡萄球菌生物被膜形成不具有抑制作用。在1/2MIC、1/4MIC以及1/8MIC时，大黄酸对木糖葡萄球菌生物被膜形成的抑制作用，呈现剂量依赖性。

2.3 1/2MIC大黄酸对木糖葡萄球菌生物被膜作用的扫描电镜观察

通过扫描电镜观察了木糖葡萄球菌在干预生物被膜后的形态学。结果表明(图2)，对照组的木糖葡萄球菌镶嵌于生物被膜中，细菌周围有厚厚的黏液层(图2A)；而1/2MIC大黄酸组的木糖葡萄球菌清晰可见菌数明显减少，未见有黏液组成(图2B)，表明大黄酸有显著的抑制木糖葡萄球菌生物被膜形成的作用。

Claims (6)

1.大黄酸在制备抑制木糖葡萄球菌药物中的用途。

2.大黄酸在制备抑制木糖葡萄球菌生物被膜药物中的用途。

3.按照权利要求2所述的用途，其特征在于：所述抑制木糖葡萄球菌生物被膜包括抑制木糖葡萄球菌生物被膜的形成或杀灭成熟的生物被膜内的木糖葡萄球菌。

4.按照权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物包括：预防或治疗上有效量的大黄酸和药学上可接受的辅料或载体。

5.按照权利要求2所述的用途，其特征在于，所述药物包括：预防或治疗上有效量的大黄酸和药学上可接受的辅料或载体。

6.根据权利要求1-5任何一项所述的用途，其特征在于，所述的大黄酸为下列分子结构(I)的化合物：