CN1321636C - 大黄酸在抑制血管生成中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了大黄酸在抑制血管生成中的新用途，研究表明，大黄酸具有抑制血管生成的作用，本发明的技术方案是：大黄酸在制备抑制血管生成的治疗和/或预防药物中的应用，其有效剂量为0.5～3.0mg/kg体重/天。本发明巧妙地以血管生成作为治疗疾病的靶点，具有以下优点：1.治疗针对已经启动的新生血管进行，具有特异性；2.由于血管内皮细胞暴露于血流中，药物直接发挥作用，故剂量小，疗效高，副作用小；3.由于内皮细胞基因表达相对稳定，故不易产生耐药性。

Description

大黄酸在抑制血管生成中的应用

技术领域

本发明涉及化合物的新用途，特别是涉及大黄酸的新用途。

背景技术

研究表明，肿瘤自身具备启动和促进新生血管生成的能力，以满足自身的新陈代谢和营养物质供应的需要。肿瘤新生血管的生成(angiogenesis)从已有血管床开始。如果没有血管生成，原发肿瘤的生长不会超过1～2mm，也不会出现浸润和转移。抑制肿瘤血管生成，与阻断肿瘤的发生、发展、浸润和转移密切相关。抑制肿瘤血管生成，还可阻止癌前病变向癌的恶性转变。不仅实体肿瘤的生长、浸润和转移依赖新生血管生成，血液系统恶性肿瘤(如恶性淋巴瘤、淋巴细胞白血病等)的生长和转移也与血管生成密切相关。肿瘤的生长、转移、复发、预后与血管生成密切相关，以肿瘤的血管生成为靶点，开发血管生成抑制剂，不但可用于大多数实体肿瘤的治疗，还可用于癌的预防和血液系统恶性肿瘤的治疗，同时对其他与血管生成有关的疾病如：糖尿病视网膜病变、风湿性关节炎、银屑病、血管瘤、动脉粥样硬化等的预防与治疗，都具有重要的理论及现实意义。

大黄酸是中药大黄的一种游离型蒽醌成分，式I为其结构式，分子式为：CH₁₅H₈O₆，大黄酸为黄色针状结晶，熔点321-322℃，330℃分解，几乎不溶于水，溶于碱和吡啶，略溶于乙醇、苯、氯仿、乙醚和石油醚。大黄酸的来源很广，蓼科植物掌叶大黄(Rheumpalmatum L.)的根茎，何首乌(Polvgonum multiforum Thunb.)的根，豆科植物狭叶番泻(Cassia angustifolia Vahl.)的荚，芸香科植物芸香(Tuta Grave-olensL.)的全草，百合科植物麝香萱(Hemerocallis thunbergii Bak.)的根均含有大黄酸。

(式I)

大黄酸具有显著的抗菌活性，对葡萄糖球菌、链球菌、伤寒杆菌、痢疾杆菌等具有抑制作用，临床上主要与其它药物配合用于治疗淋病。有实验研究报道，大黄酸有一定的抗肿瘤作用，5mg/kg大黄酸对小鼠黑色素瘤的抑制率为76％，对艾氏腹水癌也有抑制作用，能通过抑制P388癌细胞的DNA、RNA和蛋白质的生物合成而延长P388白血病小鼠的存活期。中医临床已将大黄应用于癌肿的治疗，但由于其抗癌作用机制还不明确，限制了其抗癌作用的发挥。

发明内容

本发明的目的是提供大黄酸的一种新用途。

本发明发明人的研究表明，大黄酸具有抑制血管生成的作用。因此本发明的技术方案是：

大黄酸在制备抑制血管生成的治疗和/或预防药物中的应用。

大黄酸在制备抑制血管生成的治疗和/或预防药物中的应用时，其有效剂量为0.5～3.0mg/kg体重/天。

需要的时候，在上述式I化合物制备抑制血管生成的治疗和/或预防药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等，必要时还可以加入香味剂、甜味剂等。

本发明的药物可以制成注射液、片剂、粉剂、粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

本发明的研究表明，除了治疗和/或预防癌症，以大黄酸为活性成分的抑制血管生成的治疗和/或预防药物，对于与血管生成有关的疾病如糖尿病、视网膜病变、早熟视网膜病、视网膜静脉闭塞、老年盘状斑变性、风湿性关节炎、银屑病、血管瘤、动脉粥样硬化等疾病具有确切的治疗和预防作用，同时对伤口愈合中的斑痕形成也有显著的抑制作用。

本发明巧妙地以血管生成作为治疗疾病的靶点，具有以下优点：1、治疗针对已经启动的新生血管进行，具有特异性；2、由于血管内皮细胞暴露于血流中，药物直接发挥作用，故剂量小，疗效高，副作用小；3、由于内皮细胞基因表达相对稳定，故不易产生耐药性。

附图说明

图1为大黄酸对人类血管内皮细胞增殖的剂量依赖性抑制作用曲线。

图2为不同浓度大黄酸处理后人类血管内皮细胞管形成的光学显微镜照片。

图3为不同浓度大黄酸处理后人类血管内皮细胞迁移结果的光学显微镜照片。

具体实施方式

实施例1：大黄酸对人类血管内皮细胞增殖的抑制作用。

将人类脐静脉内皮细胞(HUVEC，购自Cascade Biologics公司，Cot：C-003-5C)置于含10％胎牛血清(FBS)的Medium200(购自Cascade Biologics公司)中培养(37℃、5％CO₂、95％湿度)，取第四代细胞按密度4000/250ul接种于96孔培养板中，设定对照组、各个浓度梯度的用药组及空白对照，每组均做3个复孔。待细胞生长密度达80％，分别加入5ul各浓度梯度的大黄酸(以DMSO溶解)，使终浓度分别为1000uM、100uM、10uM、5uM和1uM，对照组加入5ulDMSO，继续培养(M200培养基，2％FBS)48小时后，加入5mg/ml的四唑溴盐(MTT)20ul，37℃继续孵育4小时，终止培养，弃上清，每孔加入150ulDMSO，轻轻振荡，1小时后在490nm波长处用BIO-RAD Model3500微板读数仪测定各孔吸光值，以吸光值表示各孔中活细胞的数量。上述实验重复3次。结果如图1所示，图中横坐标是药物浓度，纵坐标是吸光值(与活细胞数量成正比)。结果显示，大黄酸对人类脐静脉内皮细胞的增殖呈剂量依赖性抑制作用，其半数抑制量为20uM。

实施例2：大黄酸对人类血管内皮细胞管形成能力的抑制作用。

24孔培养板每孔加入BD Matrigel^TM Matrix原胶200ul，使之聚合成胶，第四代人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)悬液按30000cell/500ul密度接种至涂有Matrigel胶的24孔板中，设定对照组、各个浓度梯度的用药组，用药组分别加入10ul有浓度梯度的大黄酸(分别为1uM、10uM、100uM、1000uM，以DMSO溶解)，对照组加入无菌DMSO10ul，每组均做3个复孔。37℃、5％CO₂、95％湿度培养24小时，OLYMPUS CK40-RFL光学显微镜观察血管内皮细胞管的形成，每孔取4个低倍视野计数，以OLYMPUS CK40数码照相机拍照。结果如图2所示，表明大黄酸对人类血管内皮细胞管形成能力呈剂量依赖性抑制，其半数抑制量为10uM。

实施例3：大黄酸对人类血管内皮细胞迁移能力的抑制作用。

1、制备趋化因子

取传代后第二天长势良好的NIH3T3细胞。无血清DMEM轻柔漂洗2次。无血清DMEM，5％CO₂，37℃培养24-48hours。收集细胞上清。离心(12000g，4℃，10min)。上清滤菌(0.22um滤膜)，分装保存(-20℃)。

2、Matrigel侵袭实验

取稀释的Matrigel 25ul(原胶以DMEM按1∶2比例稀释)加入Transwell板上室，覆盖整个聚酯膜表面，37℃孵育30min，使Matrigel聚合成胶。第四代人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)悬液按30000/250ul密度接种至上室，PBS洗涤3次从培养瓶中消化并收获细胞。用无血清DMEM制成单细胞悬液，5×10⁵cells/ml，用药组加入各浓度梯度的药物(分别为1uM、10uM、100uM、1000uM，以DMSO溶解)，对照组加入同体积的DMSO。Transwell板下室加入500ul步骤1制备的趋化因子。5％CO₂，37℃培养24小时。用DMEM湿棉签轻轻擦去凝胶及聚酯膜上表面的细胞。小心取出上室，用冰预冷的甲醇固定30分钟。苏木素染色1分钟。梯度酒精脱水(80％，95％，100％，100％)，二甲苯透明。小心将聚酯膜从上室切取下来，置于载玻片上中性树脂封片。附着于聚酯膜下表面的细胞在高倍镜下(400×)随机取6个视野计数取平均值并拍照。重复实验2次。结果如图3所示，表明大黄酸对人类血管内皮细胞的迁移能力呈剂量依赖性抑制作用，其半数抑制量为10uM。

实施例4：荷瘤裸鼠体内试验。

收获人类结肠癌细胞系LoVo细胞，用PBS制成细胞悬液，以200万/200ul接种至8周大的BALB/cAnN-nu/nu裸鼠的右股部皮下。待瘤体生长至5mm×5mm大小时，随机分成两组，每组5只。大黄酸用药组给药剂量为8mg/kg(药物以含10％DMSO的PBS溶液溶解)，对照组给含10％DMSO的PBS溶液200ul，连续给药60天，每天记录瘤体的长径和短径。用药期间，小鼠未出现不良反应。处死小鼠后，取出肿瘤，检测肿瘤的微血管密度。结果显示，用药组瘤体较对照组缩小，生长明显减慢，微血管密度明显低于对照组。说明该药具有体内抑制肿瘤的作用，而且副作用很小。

Claims (4)

1、大黄酸在制备抑制血管生成的药物中的应用。

2、根据权利要求1所述的应用，其特征在于：在制备抑制血管生成的药物中还加入一种或多种药学上可接受的载体。

3、根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述药物为治疗和/或预防癌症的药物。

4、根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述药物为治疗和/或预防血管瘤的药物。

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