CN110812359A

CN110812359A - 白屈菜红碱在制备抑制白色念珠菌和金黄色葡萄球菌双物种生物被膜药物中的应用

Info

Publication number: CN110812359A
Application number: CN201911279543.0A
Authority: CN
Inventors: 钱卫东; 张家宁; 王文静; 刘淼; 孙照欢; 杨敏; 付玉婷; 李鑫辰
Original assignee: Shaanxi University of Science and Technology
Current assignee: Shaanxi University of Science and Technology
Priority date: 2019-12-13
Filing date: 2019-12-13
Publication date: 2020-02-21

Abstract

本发明公开了白屈菜红碱在制备抑制白色念珠菌和金黄色葡萄球菌双物种生物被膜药物中的应用，本发明采用白色念珠菌与金黄色葡萄球菌双物种生物被膜体外模型研究白屈菜红碱对双物种生物被膜的体外干预作用；通过结晶紫法观察发现白屈菜红碱能有效干预白色念珠菌和金黄色葡萄球菌生物被膜的形成，通过场发射扫描电子显微镜观察发现白屈菜红碱对生物被膜内的白色念珠菌与金黄色葡萄球菌有显著的抑制与清除作用。因此，白屈菜红碱对于抑制白色念珠菌和金黄色葡萄球菌双物种生物被膜有确切的功效，能应用于制备抑制或清除白色念珠菌和金黄色葡萄球菌双物种生物被膜的药物，具有有效意义。

Description

白屈菜红碱在制备抑制白色念珠菌和金黄色葡萄球菌双物种生物被膜药物中的应用

技术领域

本发明属于医药和食品安全技术领域，涉及白屈菜红碱在制备抑制白色念珠菌和金黄色葡萄球菌双物种生物被膜药物中的应用。

背景技术

白色念珠菌(Candida albicans)又称白色假丝酵母菌，是口腔常见菌群，也是口腔中重要的条件致病性真菌。在一定条件下，可引起多种口腔黏膜病。它是临床上引起深部真菌感染最常见的病原菌之一。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)能够感染人和多种动物，造成局部感染、脓肿、蜂窝织炎，严重可致败血症甚至死亡。

近年来随着医疗技术的进步，医疗植入体如导管、人工瓣膜和关节置换物等用于临床治疗的几率增加，病原菌粘附在医疗植入体表面形成生物被膜，造成生物被膜相关的感染发病率上升。生物被膜的形成使其内部的菌产生极强的耐药性和抵抗机体免疫系统作用的能力，耐药性大大增强，治疗难度增大。白色念珠菌、金黄色葡萄球菌是导致相关生物被膜感染的常见分离菌，且有时呈混合感染。目前，虽有研究发现部分抗菌药物可以在一定程度上干扰细菌与真菌生物被膜的形成，如环丙沙星和阿奇霉素等，但其作用方式单一，长期使用也亦引起细菌与真菌的耐药。有研究表明，多种中药抗菌效果明显且能够抑制细菌与真菌生物被膜的形成，揭示了其在应对耐药菌的优势。同时中草药具有毒副作用小、药源广泛、价格便宜的优点及特性，在面对细菌耐药性增强的问题上其显示出得天独厚的优势，安全有效的中草药成为人们寻找高效低毒的抑制剂的新来源。

白屈菜有止咳、利尿、解毒等功效，还可治疗痢疾，黄疸等疾病，白屈菜红碱是白屈菜的主要有效抗菌成分，有抗细菌和真菌的作用。国内外对其在影响农作物种子及其幼苗萌发，抗内毒素作用等方面都有一定的研究，但是关于白屈菜红碱抑制和清除细菌和真菌生物被膜生长方面报道较少。

胡海军等报道了白屈菜红碱的抑菌和杀螨活性(胡海军.血根碱及白屈菜红碱抑菌和杀螨活性构效关系[D].西北农林科技大学，2008.)。韦庆慧等报道了白屈菜红碱提取及抑菌作用(韦庆慧.白屈菜红碱提取及抑菌作用研究[D].东北林业大学，2013.)。康伟松等研究了白屈菜红碱离子对化合物的体外抗菌活性(康伟松[1]，程辟[1，2]，et al.血根碱、白屈菜红碱离子对化合物的体外抗菌活性研究[J].中南药学，2014(5).)。白屈菜红碱对细菌和真菌有一定的抑制作用，但尚未见到白屈菜红碱对白色念珠菌和金黄色葡萄球菌双物种生物被膜生长应用的报道。

发明内容

本发明解决的技术问题在于提供白屈菜红碱在制备抑制与清除白色念珠菌和金黄色葡萄球菌双物种生物被膜药物中的应用，从现存的药用植物资源库入手，挖掘潜在的生物被膜清除剂，为缓解或解决白色念珠菌和金黄色葡萄球菌双物种生物被膜引起的感染问题和降低病死率，以及为解决白色念珠菌和金黄色葡萄球菌双物种生物被膜难以清除的难题提供实践基础。

本发明是通过以下技术方案来实现：

白屈菜红碱在抑制白色念珠菌和金黄色葡萄球菌双物种生物被膜生长中的应用。

进一步的，白色念珠菌为人源白色念珠菌；金黄色葡萄球菌为人源金黄色葡萄球菌。

进一步的，最低抑制白色念珠菌和金黄色葡萄球菌双物种生物被膜形成的浓度是通过结晶紫染色法确定的。

进一步的，白屈菜红碱分别对白色念珠菌生物被膜和金黄色葡萄球菌生物被膜的最低抑制浓度为4μg/mL和4μg/mL；对白色念珠菌和金黄色葡萄球菌双物种生物被膜的最低抑制浓度为6μg/mL。。

进一步的，白屈菜红碱对白色念珠菌和金黄色葡萄球菌双物种生物被膜具有体外抑制作用，以及分别抑制白色念珠菌与金黄色葡萄球菌的体外生长。

白屈菜红碱在制备抑制和杀灭白色念珠菌和金黄色葡萄球菌双物种生物被膜药物中的应用。

一种杀灭白色念珠菌和金黄色葡萄球菌双物种生物被膜药物组合物，包括预防或治疗上有效量的白屈菜红碱和药学上可接受的辅料或载体。

进一步的，杀灭白色念珠菌和金黄色葡萄球菌双物种生物被膜包括干预白色念珠菌和金黄色葡萄球菌双物种生物被膜的形成或清除成熟的白色念珠菌和金黄色葡萄球菌双物种生物被膜。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明白屈菜红碱对木糖葡萄球菌生物被膜的形成具有显著的抑制作用，能有效的干预白色念珠菌与金黄色葡萄球菌双物种生物被膜的形成，能应用于制备抑制白色念珠菌与金黄色葡萄球菌、干预白色念珠菌与金黄色葡萄球菌双物种生物被膜形成以及杀灭成熟的白色念珠菌与金黄色葡萄球菌双物种生物被膜的药物。

附图说明

图1为不同药物浓度下白屈菜红碱对白色念珠菌与金黄色葡萄球菌双物种生物被膜的干预作用；

图2为不同药物浓度下白屈菜红碱对白色念珠菌与金黄色葡萄球菌双物种生物被膜的结构影响。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细说明。所述实施例仅用于解释本发明的内容，并非对本发明的限定。

1、材料

1.1实验菌株

白色念珠菌SC5314购自美国标准菌种收藏中心；

金黄色葡萄球菌ATCC25923购自美国标准菌种收藏中心。

1.2试剂

二甲基亚砜DMSO购于上海西格玛奥德里奇贸易有限公司；

生理盐水购于上海西格玛奥德里奇贸易有限公司；

甲醇购于上海西格玛奥德里奇贸易有限公司；

酵母浸粉购于上海西格玛奥德里奇贸易有限公司；

葡萄糖购于上海西格玛奥德里奇贸易有限公司；

蛋白胨购于上海西格玛奥德里奇贸易有限公司；

戊二醛购于上海西格玛奥德里奇贸易有限公司；

无水乙醇购于上海西格玛奥德里奇贸易有限公司；

乙酸戊乙酯购于上海西格玛奥德里奇贸易有限公司。

1.3主要试剂的配制

YPD液体培养基：称取5g酵母浸粉、10g葡萄糖和10g蛋白胨，加入500mL蒸馏水，高压蒸汽灭菌。

1％DMSO溶液：99mL水加入1mL 100％的DMSO，混匀。

99％甲醇溶液：1mL水加入99mL 100％的甲醇，混匀。

0.1％结晶紫溶液：称取结晶紫0.1g，加入100mL蒸馏水，混匀。

33％冰醋酸溶液：量取33mL的冰醋酸，加入67mL蒸馏水，混匀。

1.4实验仪器

高压灭菌器(天津泰斯特仪器有限公司)

DH6000A电热恒温培养箱(天津市泰斯特仪器有限公司)

超净工作台(苏州苏洁净化设备有限公司)

96孔板(丹麦赛默飞世尔科技有限公司)

24孔板(丹麦赛默飞世尔科技有限公司)

电子天平(上海金科天美有限公司)

酶标仪(深圳迈瑞生物医疗有限公司)

场发射扫描电镜(美国FEI有限公司)

白屈菜红碱对白色念珠菌与金黄色葡萄球菌双物种生物被膜的干预作用

白屈菜红碱，是传统天然药用植物白屈菜的主要有效成分之一。除解热、镇痛、抗炎、抗肿瘤等作用外，还具有抗真菌和抗细菌等药理作用。其分子式为C₂₁H₁₈NO₄，分子量为348.37，分子结构如下：

1、实验方法

1.1药物的配制

精密称取白屈菜红碱0.01g，溶于10mL 1％的DMSO中，配成浓度为1mg/mL的药物，作为储备液。取1mL药物。将药物过0.22μm的有机相滤膜，再用1％的DMSO溶液倍比稀释。供测量MIC使用。

1.2菌液的配制

取在-20℃下保存的白色念珠菌SC5314与金黄色葡萄球菌ATCC25923，在超净台中的点燃的酒精灯附近进行操作，分别用接种环蘸取菌液接种，培养于含有YPD的玻璃试管中，放入37℃恒温培养箱中培养24h。以相同接种方法对白色念珠菌与金黄色葡萄球菌进行传代纯化培养后，稀释至1.0×10⁶CFU/mL即可备用。

1.3白屈菜红碱对白色念珠菌与金黄色葡萄球菌最小抑菌浓度MIC的测定

将稀释好的菌液用移液器加入96孔板中，每个孔加180μL菌液，然后吸取20μL稀释好的不同浓度的白屈菜红碱药物，加到96孔板中。使得终体系为200μL。再分别做一个不加药物只含培养基的对照组和只加菌液不加药物的对照组。每种药做3组平行，于37℃恒温培养箱中培养24h观察结果，以无菌生长的药物最低浓度孔即为白屈菜红碱对白色念珠菌与金黄色葡萄球菌最小抑菌浓度MIC。

1.4不同药物浓度下白屈菜红碱干预生物被膜形成能力的检测

1.4.1生物被膜的建立

按1.2菌液的配制步骤配制菌液，按药物的配制步骤配制药物。向96孔板中加入菌液和各个浓度药物共200μL(药物浓度分别为MIC，1/2MIC，1/4MIC，1/8MIC，1/16MIC)。另设空白对照孔(只含有培养基)、DMSO对照孔(加入与药物等量体积的甲醇)和阴性对照孔(不加药物的生物被膜生长对照)。每个浓度3组平行。于37℃恒温培养箱中培养24h。建立了体外白色念珠菌和金黄色葡萄球菌双物种生物被膜模型。

1.4.2结晶紫染色

将培养好的96孔细胞培养板取出，弃去菌液，并用无菌PBS缓冲液轻轻冲洗3次。再用99％的甲醇固定30min晾干，然后用0.1％的结晶紫200μL染色30min，并冲洗晾干。加入33％的冰醋酸振荡器上作用30min。用酶标仪在570nm处，测定吸光度。

1.4.3扫描电镜观察

1.4.3.1生物被膜的建立

按1.2菌液的配制步骤配制菌液，按药物的配制步骤配制药物。取1.8mL稀释后的菌液加入到96孔板中，再加入200μL药物。最后使药物的终浓度达到1/2MIC。另设置一个对照孔(不加药)。把细胞爬片用酒精消毒后，放入24孔板中，于37℃恒温培养箱中培养24h。

1.4.3.2扫描电镜观察

将细胞爬片取出，用无菌PBS轻轻漂洗，除去生物被膜表面的游离细菌。加入电镜用戊二醛，-4℃避光固定细胞生物被膜2h，再用不同梯度的乙醇(30％、50％、70％、90％、100％)进行脱水处理。最后使用乙酸戊乙酯进行避光固定5h，置场发射扫描电镜观察。每个标本取3个随机视野，观察不同浓度的白屈菜红碱对白色念珠菌与金黄色葡萄球菌双物种生物被膜的影响。

1.5统计学数据分析

本实验采用SPSS 20.0软件对数据进行统计学处理与分析，数据以±SD表示，采用多重比较和单因素方差分析对各组数据进行分析和比较。P<0.05为差异性显著，P<0.01为差异性极显著。

2实验结果

2.1白屈菜红碱对白色念珠菌SC5314与金黄色葡萄球菌ATCC25923的MIC测定结果

稀释法是通过测定等量的菌液在不同浓度的药物液体培养基中的生长有无，以及生长后的培养基的浊度来确定抗菌药物的抗菌效力，由稀释法所测得的抗菌药物抑制检测菌生长的最低浓度称为“最低抑菌浓度”。该法可以准确定量的测定待测药物的抗菌活性，方法简便，快捷，因此我们采用96孔板微量稀释法来测定抑菌活性。

通过结晶紫染色的方法可以明显得出，白屈菜红碱对白色念珠菌SC5314的MIC为4μg/mL、金黄色葡萄球菌ATCC25923的MIC为3μg/mL和白色念珠菌SC5314与金黄色葡萄球菌ATCC25923混合菌液的MIC为8μg/mL。

2.2不同药物浓度下对生物被膜形成能力的干预作用

结晶紫染色的方法可以快速简便的测量白屈菜红碱对白色念珠菌与金黄色葡萄球菌双物种生物被膜的干预作用。通过不同药物浓度下OD值的大小，来反映药物干预生物被膜的强弱能力。

如图1所示，在建立了体外金黄色葡萄球菌生物被膜模型的基础上，通过结晶紫染色法研究了不同药物浓度下白屈菜红碱对白色念珠菌和金黄色葡萄球菌双物种生物被膜的干预作用，使用酶标仪在吸光度为570nm处，测定各个药物浓度的OD值。OD值随着药物浓度的增大而减小，呈现负相关。经过SPSS软件分析，每个浓度的OD值与空白对照存在显著性差异，P<0.05。DMSO对照组和菌液对照组的OD值之间，没有显著性差异，P>0.05。说明白屈菜红碱对白色念珠菌与金黄色葡萄球菌双物种生物被膜有确切的干预作用。

2.3不同药物浓度下对生物被膜内细菌活性的影响

场发射扫描电镜是观察生物被膜的重要方法，可在不破坏生物被膜完整性的情况下，能够直观观察生物被膜形态，确定生物被膜的厚度，并且清晰观察生物被膜的分布与被其包裹的细菌的形态。

如图2所示，通过场发射扫描电子显微镜观察了不同浓度下的白屈菜红碱对白色念珠菌和金黄色葡萄球菌生物被膜活性的影响。通过场发射扫描电子显微镜观察，在没有加药的情况下生物被膜形成较厚。而当白屈菜红碱浓度达到1/8MIC时，生物被膜明显变薄，细菌活力呈下降趋势。当白屈菜红碱浓度达到1/4MIC时，生物被膜被明显抑制和清除，细菌密度呈下降趋势。说明在药物的作用下，生物被膜内的活菌受到抑制，白屈菜红碱可以渗透生物被膜作用到内部，即白屈菜红碱对白色念珠菌与金黄色葡萄球菌双物种生物被膜形成有很好的干预作用并且对成熟的白色念珠菌与金黄色葡萄球菌双物种生物被膜有显著的杀灭作用。

综上所述，白屈菜红碱对白色念珠菌与金黄色葡萄球菌有抑制作用并且对生物被膜有很好的杀灭作用。因此，白屈菜红碱可以用于制备抑制白色念珠菌与金黄色葡萄球菌双物种生物被膜的形成以及杀灭成熟的白色念珠菌与金黄色葡萄球菌双物种生物被膜的药物。

一种抑制白色念珠菌与金黄色葡萄球菌双物种生物被膜的药物组合物，包括：预防或治疗上有效量的白屈菜红碱和药学上可接受的辅料或载体。

其载体或辅料是指药学领域常规的载体或辅料，例如：稀释剂、崩裂剂、润滑剂、赋形剂、粘合剂、助流剂、填充剂、表面活性剂等；另外，还可以在组合物中加入其它辅助剂如香味剂和甜味剂。

稀释剂可以是一种或几种增加片剂重量和体积的成分；常用的稀释剂包括乳糖、淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、山梨醇、甘露醇以及无机钙盐等。其中最常用为乳糖、淀粉、微晶纤维素。

崩解剂可以为交联聚乙烯吡咯烷酮(与总重量比为2～6％)，交联羧甲基纤维素钠(与总重量比为2～6％)、海藻酸(与总重量比为2～5％)、微晶纤维素(与总重量比为5～15％)中之一种或几种混合物。其中以交联聚乙烯吡咯烷酮(与总重量比为2～7％)，交联羧甲基纤维素钠(与总重量比为2～6％)为佳。最佳为交联聚乙烯吡咯烷酮(与总重量比为2～6％)。

润滑剂包括硬脂酸，硬脂酸钠，硬脂酸镁，硬脂酸钙，聚乙二醇，滑石粉，氢化植物油中之一种或几种混合物。其中以硬脂酸镁最为适宜。润滑剂的用量范围为与总重量比为0.10～1％，一般用量为与总重量比为0.25～0.75％，最佳用量为与总重量比为0.5～0.7％。

粘合剂可以是一种或几种有利于制粒的成分。可以是淀粉浆(10～30％，与粘合剂总重量比)，羟丙基甲基纤维素(与粘合剂总重量比为2～5％)，聚乙烯吡咯烷酮(与粘合剂总重量比为2～20％)，以聚乙烯吡咯烷酮的乙醇水溶液为佳，最佳为聚乙烯吡咯烷酮的50％乙醇水溶液。

助流剂可以为微粉硅胶、滑石粉、三硅酸镁中之一种或几种混合物。

表面活性剂可以为一种或几种能够提高润湿性和增加药物溶出的成分。常用为十二烷基硫酸钠(与总重量比的常用范围为0.2～6％)。

Claims

1.白屈菜红碱在抑制白色念珠菌和金黄色葡萄球菌双物种生物被膜生长中的应用。

2.根据权利要求1所述的白屈菜红碱在抑制白色念珠菌和金黄色葡萄球菌双物种生物被膜生长中的应用，其特征在于，所述白色念珠菌为人源白色念珠菌；金黄色葡萄球菌为人源金黄色葡萄球菌。

3.根据权利要求1所述的白屈菜红碱在抑制白色念珠菌和金黄色葡萄球菌双物种生物被膜生长中的应用，其特征在于，所述最低抑制白色念珠菌和金黄色葡萄球菌双物种生物被膜形成的浓度是通过结晶紫染色法确定的。

4.根据权利要求1所述的白屈菜红碱在抑制白色念珠菌和金黄色葡萄球菌双物种生物被膜生长中的应用，其特征在于，所述白屈菜红碱分别对白色念珠菌生物被膜和金黄色葡萄球菌生物被膜的最低抑制浓度为4μg/mL和3μg/mL；对白色念珠菌和金黄色葡萄球菌双物种生物被膜的最低抑制浓度为8μg/mL。

5.根据权利要求1所述的白屈菜红碱在抑制白色念珠菌和金黄色葡萄球菌双物种生物被膜生长中的应用，其特征在于，所述白屈菜红碱对白色念珠菌和金黄色葡萄球菌双物种生物被膜具有体外抑制作用，以及分别抑制白色念珠菌与金黄色葡萄球菌的体外生长。

6.白屈菜红碱在制备抑制和杀灭白色念珠菌和金黄色葡萄球菌双物种生物被膜药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的白屈菜红碱在制备抑制和杀灭白色念珠菌和金黄色葡萄球菌双物种生物被膜药物中的应用，其特征在于，所述白色念珠菌为人源白色念珠菌；金黄色葡萄球菌为人源金黄色葡萄球菌。

8.一种杀灭白色念珠菌和金黄色葡萄球菌双物种生物被膜药物组合物，其特征在于，包括预防或治疗上有效量的白屈菜红碱和药学上可接受的辅料或载体。

9.根据权利要求8所述的一种杀灭白色念珠菌和金黄色葡萄球菌双物种生物被膜药物组合物，其特征在于，所述杀灭白色念珠菌和金黄色葡萄球菌双物种生物被膜包括干预白色念珠菌和金黄色葡萄球菌双物种生物被膜的形成或清除成熟的白色念珠菌和金黄色葡萄球菌双物种生物被膜。