CN109999045A - 替唑尼特和硝唑尼特在制备自噬诱导剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了替唑尼特和/或硝唑尼特及其药学上可接受的盐的新的医药用途，即其在制备制备自噬诱导剂中的用途，及用于治疗与抑制mTOR表达相关的疾病的药物的用途。在所述用途中，替唑尼特和/或硝唑尼特及其药学上可接受的盐可以通过降低PI3K、AKT蛋白磷酸化，以及降低ERK蛋白磷酸化起到相关药效，从而实现降低细胞内的自噬抑制作用，诱导细胞发生自噬。

Description

替唑尼特和硝唑尼特在制备自噬诱导剂中的应用

技术领域

本发明涉及细胞自噬领域，具体涉及一种以替唑尼特和/或硝唑尼特为活性及含有替唑尼特和/或硝唑尼特的药物组合物，更具体地，涉及替唑尼特和硝唑尼特在诱导细胞自噬上的应用。

背景技术

替唑尼特(Tizoxanide，TIZ)和硝唑尼特(nitazoxanide，NTZ)都是硝噻柳酸酰胺的衍生物，其中替唑尼特是硝唑尼特在体内的主要活性代谢产物。自1970年代开始，人们发现替唑尼特和硝唑尼特对感染人和动物的厌氧菌及多种蠕虫、原虫等都有抑制作用。硝唑尼特作为抗寄生虫药已经于2002年被美国FDA批准用于治疗儿童蓝氏贾第鞭毛虫、隐孢子虫等肠道原虫感染引起的疾病。该药在非洲及南美多个国家使用结果表明，其抗寄生虫感染效果好，且无不良反应。研究认为硝唑尼特抗寄生虫及厌氧微生物的机制是干扰其丙酮酸：铁氧还蛋白还原酶(PFOR)所依赖的电子转移反应，这是寄生虫及厌氧菌能量代谢的重要步骤。另外，硝唑尼特抗某些病毒感染的机制尚未完全阐明。

由于硝唑尼特化学结构上的乙酰基很容易水解，因此硝唑尼特在动物或人体内都迅速地代谢成为替唑尼特(Tizoxanide，TIZ)，在机体内基本上检测不到硝唑尼特。替唑尼特在各种体内外药理和毒理学研究中的作用与硝唑尼特一致，因此，替唑尼特是硝唑尼特的体内活性物质，硝唑尼特是替唑尼特的前药形式，在其活性研究中常以替唑尼特替代硝唑尼特。

自噬(autophagy)是存在于真核细胞内的一种普遍生理现象，是真核细胞对抗压力与感染的保护机制，具体地讲是一个吞噬自身细胞质蛋白或细胞器并使其包被进入囊泡，并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物的过程，藉此实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新。由Ashford和Porter在1962年发现并提出，自发现以来受到越来越多科研工作者的关注。自噬分为三类：巨自噬(Macroautophagy)、微自噬(Microautophagy)及分子伴侣介导的自噬(Chaperonemediated autophagy，CAM)。一般研究所指的自噬是巨自噬(以下简称“自噬”)。正常培养的细胞自噬活性很低，不适于观察，因此，必须对自噬进行人工干预和调节。在自噬研究中，寻找能够有效诱导细胞自噬的化学小分子至关重要。

目前，仅有研究表明替唑尼特和硝唑尼特能够抗各类寄生虫、厌氧细菌和某些病毒，但对于替唑尼特和硝唑尼特诱导细胞自噬未见任何报道。

我们对替唑尼特和硝唑尼特及其生物活性进行了较为系统的研究，尤其对其进行了诱导细胞自噬活性的研究。本专利即首次报道了替唑尼特和硝唑尼特的诱导细胞自噬活性。

发明内容

本发明提供了两种可诱导细胞自噬的药物：替唑尼特和硝唑尼特。该药物通过影响细胞mTOR信号通路相关蛋白的表达变化，从而诱导细胞自噬。

为实现上述目的，替唑尼特和硝唑尼特在制备诱导细胞自噬上的药物中的应用。

所述药物对细胞自噬的诱导作用是通过抑制细胞mTOR蛋白的表达和磷酸化发挥作用的。

所述细胞为哺乳动物或人源细胞，如RAW264.7细胞、HepG2细胞、Vero细胞、293T细胞、A549细胞、MDCK细胞等。

所述的细胞自噬过程中的诱导因素为抑制细胞中的mTOR蛋白的表达。

根据需求再提供一种替唑尼特和硝唑尼特在制备mTOR蛋白抑制剂、PI3K或ERK蛋白抑制剂中的应用。

根据需求再提供一种替唑尼特和硝唑尼特在制备mTOR、PI3K或ERK蛋白的研究制剂上的应用。

根据需求再提供一种替唑尼特和硝唑尼特在研究mTOR、PI3K或ERK蛋白，以及它们的底物蛋白的生物学功能上的应用。

根据需求再提供一种替唑尼特和硝唑尼特在制备细胞自噬启动剂和/或诱导剂上的应用。

所述的细胞为哺乳动物或人源细胞，如RAW264.7细胞、HepG2细胞、Vero细胞、293T细胞、A549细胞等。

本发明的优点在于，

1.本发明公开了替唑尼特和硝唑尼特在诱导细胞自噬方面的作用，通过诱导细胞自身调控(自噬作用)，帮助机体内的细胞回归其正常状态或通过过度自噬作用诱导其走向凋亡途径。

2.替唑尼特和硝唑尼特可以通过抑制细胞自噬通路(mTOR信号通路)以实现其对细胞自噬的诱导作用。具体来说，替唑尼特和硝唑尼特可作用于mTOR的上游蛋白ERK，通过抑制ERK的表达及磷酸化以实现对mTOR蛋白表达的抑制；同时替唑尼特和硝唑尼特也可以通过上调mTOR上游PI3K蛋白的表达及磷酸化，负作用于mTOR从而使得mTOR表达受到抑制，进一步诱导细胞自噬。

附图说明

图1透射电镜观察替唑尼特诱导细胞自噬。透射电镜观察细胞内自噬小体的超微结构(0为空白对照组，75、100分别为75μmol/L和100μmol/L替唑尼特诱导组)，黄色箭头所指为吞噬泡，红色箭头所指为自噬体，蓝色箭头所指为自噬溶酶体。从图中可见细胞胞浆中的自噬小泡数量显著增多。说明替唑尼特可有效地促进细胞自噬作用的发生。

图2免疫荧光染色观察替唑尼特诱导细胞自噬。检测LC3II的免疫荧光染色结果，说明随着替唑尼特浓度的升高，增加细胞内绿色荧光争夺，说明细胞自噬信号呈点状聚集增多，在胞浆中呈现弥散分布，而对照组的细胞内LC3II的免疫绿色荧光极少，说明其很少自噬小体形成。说明LC3II型蛋白在细胞中的含量随替唑尼特浓度的升高而增高，说明替唑尼特能有效诱导细胞自噬。

图3用Western Blotting法检测替唑尼特对细胞LC3II、LC3I、P62蛋白的浓度依赖作用。LC3II型蛋白的表达量随着替唑尼特作用浓度的增高而显著性地升高，LC3II/LC3I的比值也显著性升高，而P62蛋白的表达量随着硝唑尼特作用浓度的增高而显著性地降低，说明替唑尼特能有效诱导细胞自噬(*或**：药物处理组与对照组比较P＜0.05或0.01。)。

图4用Western Blotting法检测替唑尼特对细胞LC3II、LC3I、P62蛋白的时间依赖作用。LC3II型蛋白的表达量随着替唑尼特作用时间的延长而显著性地升高，LC3II/LC3I的比值也显著性升高，而P62蛋白的表达量随着硝唑尼特作用时间的延长而显著性地降低，说明替唑尼特能有效诱导细胞自噬(*或**：药物处理组与对照组比较P＜0.05或0.01。)。

图5用Western Blotting法检测硝唑尼特对细胞LC3II、LC3I、P62蛋白的浓度依赖作用。LC3II型蛋白的表达量随着硝唑尼特作用浓度的增高而显著性地升高，LC3II/LC3I的比值也显著性升高，而P62蛋白的表达量随着硝唑尼特作用浓度的增高而显著性地降低，说明硝唑尼特也能有效诱导细胞自噬(*或**：药物处理组与对照组比较P＜0.05或0.01。)。

图6用Western Blotting法检测替唑尼特对细胞mTOR、PI3K、Akt和ULK1蛋白的抑制作用。磷酸化的mTOR、PI3K、Akt蛋白和ULK1蛋白量随着替唑尼特作用浓度的增高而显著性地降低，说明替唑尼特能有效地通过mTOR信号通路上的关键蛋白相互作用，诱导细胞自噬(*或**：药物处理组与对照组比较P＜0.05或0.01。)。

图7用Western Blotting法检测替唑尼特对细胞ERK蛋白的抑制作用。磷酸化的ERK蛋白与ERK的比值随着替唑尼特作用浓度的增高而显著性地降低，说明替唑尼特能有效地通过抑制ERK蛋白激活，诱导细胞自噬(*或**：药物处理组与对照组比较P＜0.05或0.01。)。

图8免疫荧光染色观察替唑尼特雨自噬诱导剂、抑制剂的联合作用。图8激光共聚焦结果显示，对照组和LY294002组细胞内极少有自噬小体形成，绿色荧光暗淡，但替唑尼特组和雷帕霉素(rapamycin)组以及替唑尼特+雷帕霉素(rapamycin)组细胞绿色荧光增强，增加细胞内自噬信号呈点状聚集增多，在胞浆中呈现弥散分布。而替唑尼特+LY294002组出现少量绿色荧光分布，比LY294002组的绿色荧光增多，但比替唑尼特组和雷帕霉素(rapamycin)组明显减少(图8)。以上结果说明LC3II型蛋白在自噬抑制剂的作用下含量减少，而在替唑尼特等诱导剂的作用下浓度显著升高，进一步说明替唑尼特能有效诱导细胞自噬。

具体实施方式

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。

实施例中所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。

实施例1

透射电镜检测替唑尼特对RAW264.7细胞自噬的诱导作用

1、RAW264.7细胞株体外培养

本试验所用细胞为RAW264.7细胞，使用添加10％胎牛血清(fetal bovineserum，FBS，Gibco)的DMEM培养液，在37℃，5％CO₂培养箱中进行细胞培养，待细胞生长至占培养皿底部80～90％时，使用0.25％胰酶-EDTA消化并传代。

2、药物对细胞存活率的影响

将生长良好的细胞以5×104个/mL密度接种于96孔板，每孔100μL，置于37℃、5％CO2培养箱中培养12h后加入不同浓度的替唑尼特或硝唑尼特，每组设5个复孔，继续培养12h后，吸弃原培养液，每孔加入CCK-8试剂10μL，继续培养30min，置于摇床上震荡混匀，使结晶完全溶解，读取酶标仪在450nm下波长的吸光度(OD值)，计算细胞活性。细胞活性(％)＝[OD(加药)-OD(空白)]/[OD(对照)-OD(空白)]×100％。

3、替唑尼特诱导RAW264.7细胞自噬的检测

试验方法：本试验使用电镜法对替唑尼特诱导RAW264.7细胞自噬的能力进行检测。替唑尼特(Tizoxanide，TIZ)溶解于二甲亚砜(DMSO)中，配制成100mmol/L储备液，-20℃保存，使用时分别稀释为75μmol/L和100μmol/L。将细胞消化，离心并重悬浮于相应培养液中，以1×10⁶/孔的密度种植于细胞培养的6孔板，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养过夜后，移除原培养液，加入新鲜配制的，含有75μmol/L和100μmol/L替唑尼特的培养液继续培养，于培养的12h终止培养，500×g离心5min，预冷的PBS清洗两次，轻柔吹打收集细胞，加入4℃预冷的2.5％戊二醛溶液放置于4℃冰箱内固定过夜，PBS清洗细胞3次，每次10min。将细胞用含0.8％焦磷酸钾的1％四氧化锇进行后固定，置于冰上；不同浓度无水乙醇依次梯度脱水，无水丙酮和环氧树脂渗透、包埋、固定，随后用超微切片机切片，将制作好的切片安装在聚醋酸甲基乙烯酯包被的铜网格上，最后用2％的乙酸铀酰着色后进行电镜观察。

4、试验结果：

细胞活性随着替唑尼特或硝唑尼特药物浓度的升高而呈现降低趋势。经150μM的替唑尼特或硝唑尼特作用后，细胞活性分别降至74.91％、80.65％，而100μM以下浓度细胞活性仍维持在85％以上。因此，替唑尼特或硝唑尼特的研究浓度设定为25μM至150μM。

通过透射电子显微镜拍摄到的结果可以看出，替唑尼特可有效诱导RAW264.7细胞发生自噬作用，且自噬作用的强度与替唑尼特的浓度呈正相关。在无替唑尼特作用时，胞浆中仅可见少量的自噬小泡(图1)；经75μmol/L替唑尼特作用12h后，胞浆中的自噬小泡数量明显增加(图1)；经100μmol/L替唑尼特作用12h后，胞浆中的自噬小泡数量显著增多(图1)。说明替唑尼特可有效地促进细胞自噬作用的发生。

实施例2

通过LC3蛋白及p62蛋白检测替唑尼特对细胞自噬的诱导作用

LC3是细胞自噬信号通路中的一个标志性蛋白，具有LC3I和LC3II两种亚型。在无自噬作用发生的时候，该蛋白在胞质中以水溶性的LC3I亚型存在，在细胞发生自噬作用时，该蛋白会转化为水不溶性的LC3II亚型。通过检测细胞中LC3II含量的变化，可以判定细胞发生自噬作用的强弱。

另外，p62也被称为SQSTM1，在多种细胞和组织中都有表达，可作为一个货车蛋白参与多种信号转导过程。p62可连接LC3和泛素化的底物，随后被整合到自噬体中，并在自噬溶酶体中被降解；当自噬被激活时自噬体与溶酶体融合，自噬囊泡中p62等蛋白或细胞器被溶酶体酶降解，p62水平降低；当自噬被抑制时自噬体积累，p62水平升高。因此，可以用Western blot方法检测p62的水平，作为自噬能力变化的指征。

试验方法：

(1)免疫荧光检测

替唑尼特(Tizoxanide，TIZ)溶解于二甲亚砜(DMSO)中，配制成100mmol/L储备液，-20℃保存，使用时用DMEM完全培养基稀释至终浓度。将细胞消化，离心并重悬浮于相应培养液中，细胞以2×10⁵/mL的密度接种于6孔板爬片，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养过夜后，移除原培养液，加入新鲜配制的，含有0、25、50、75μmol/L和100μmol/L替唑尼特的培养液继续培养，于培养的12h终止培养。PBS洗涤三次后，4％多聚甲醛室温固定细胞20min，0.2％Triton X-100透膜15min，3％的胎牛血清封闭1h，加入LC3多克隆抗体(1∶200)4℃孵育过夜。PBS洗涤三次后，加入Alexa Fluor 488标记的荧光二抗，室温避光孵育1h，经DAPI染细胞核后，用荧光淬灭剂封片，共聚焦显微镜下观察自噬表达情况，即LC3蛋白免疫荧光表达情况。

(2)Western Blotting法检测

替唑尼特(Tizoxanide，TIZ)溶解于二甲亚砜(DMSO)中，配制成100mmol/L储备液，-20℃保存，使用时用DMEM完全培养基稀释至终浓度。将细胞消化，离心并重悬浮于相应培养液中，细胞以2×10⁵/mL的密度接种于6孔板爬片，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养过夜后，移除原培养液，加入新鲜配制的，含有25、50、75μmol/L和100μmol/L替唑尼特的培养液继续培养，溶剂对照组为0.1％的DMSO(V组)，于培养的12h终止培养。细胞终止培养后立即收集细胞总蛋白，Western Blotting法检测LC3I型LC3II型蛋白的表达量的变化。

另外，以含有75μmol/L的替唑尼特培养液分别培养细胞3h、6h、9h、12h终止培养，细胞终止培养后立即收集细胞总蛋白，Western Blotting法检测LC3I型LC3II型蛋白的表达量的变化以及p62蛋白的表达量的变化。

试验结果：

(1)激光共聚焦结果显示，随着替唑尼特浓度的升高(图2)，增加细胞内自噬信号呈点状聚集增多，在胞浆中呈现弥散分布，而对照组的细胞内极少有自噬小体形成。说明LC3II型蛋白在细胞中的含量随替唑尼特浓度的升高而增高，进一步说明替唑尼特能有效诱导细胞自噬。

(2)Western Blotting结果显示，LC3II型蛋白的表达量随着替唑尼特作用浓度的增高而有升高趋势(图3)；同时，LC3II型蛋白的表达量也会随着替唑尼特作用时间的增加而升高(图4)。另外，p62检测结果发现其蛋白水平也随药物剂量和时间显著性降低(图3和图4)。这些证据说明替唑尼特能有效诱导细胞自噬。

实施例3

通过LC3蛋白及p62蛋白检测硝唑尼特对细胞自噬的诱导作用

LC3是细胞自噬信号通路中的一个标志性蛋白，具有LC3I和LC3II两种亚型。在无自噬作用发生的时候，该蛋白在胞质中以水溶性的LC3I亚型存在，在细胞发生自噬作用时，该蛋白会转化为水不溶性的LC3II亚型。通过检测细胞中LC3II含量的变化，可以判定细胞发生自噬作用的强弱。

p62也被称为SQSTM1，在多种细胞和组织中都有表达，可作为一个货车蛋白参与多种信号转导过程。p62可连接LC3和泛素化的底物，随后被整合到自噬体中，并在自噬溶酶体中被降解；当自噬被激活时自噬体与溶酶体融合，自噬囊泡中p62等蛋白或细胞器被溶酶体酶降解，p62水平降低；当自噬被抑制时自噬体积累，p62水平升高。因此，可以用Westernblot方法检测p62的水平，作为自噬能力变化的指征。

试验方法：

硝唑尼特(nitazoxanide，NTZ)溶解于二甲亚砜(DMSO)中，配制成100mmol/L储备液，-20℃保存，使用时用DMEM完全培养基稀释至终浓度。将细胞消化，离心并重悬浮于相应培养液中，细胞以2×10⁵/mL的密度接种于6孔板爬片，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养过夜后，移除原培养液，加入新鲜配制的，含有25、50、75μmol/L和100μmol/L替唑尼特的培养液继续培养，溶剂对照组为0.1％的DMSO(V组)，于培养的12h终止培养。细胞终止培养后立即收集细胞总蛋白，Western Blotting法检测LC3I型LC3II型蛋白的表达量以及p62蛋白的表达量的变化。

试验结果：

Western Blotting结果显示，LC3II型蛋白的表达量随着硝唑尼特作用浓度的增高而有升高趋势(图5)；同时，p62检测结果发现其蛋白水平显著性降低(图5)。这些证据说明硝唑尼特能有效诱导细胞自噬。

实施例4

替唑尼特对mTOR相关蛋白表达影响的Western Blotting检测

mTOR蛋白(雷帕霉素靶蛋白)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，可对细胞外的生长因子、胰岛素、营养素、氨基酸、葡萄糖等多种刺激产生应答，也是一种在细胞自噬早期抑制自噬的蛋白，抑制mTOR1蛋白的表达，可以诱发细胞的自噬作用。磷酸化状态的p-mTOR是mTOR蛋白的激活状态，是其发生生物学作用的主要方式。mTOR1的上下游信号通路是细胞自噬作用的经典通路。它主要通过PI3K/Akt/mTOR途径来实现对细胞生长、细胞周期等多种生理功能的调控作用。

mTOR信号通路为细胞中抑制自噬的主要信号通路，通路中mTOR蛋白对细胞自噬作用起抑制作用。因此mTOR蛋白表达量的下调代表细胞中抑制自噬作用的能力降低，细胞内自噬作用增强。在mTOR通路中，mTOR蛋白表达量主要由三种蛋白调控：PI3K，ERK和AMPK。其中PI3K和ERk蛋白促进mTOR的表达，AMPK抑制mTOR表达。当替唑尼特作用于细胞时，可检测到PI3K、Akt、ERK表达量明显下调，从而对mTOR表达的促进作用减弱从而解除了细胞自身对自噬作用的抑制作用，使得细胞自噬增强。

另外，ULK1蛋白是自噬泡形成所必需的一种蛋白，以复合物的形式存在。蛋白复合物的形成对维持ULK1的稳定性和激酶活性十分重要。mTORC1具有活性并通过磷酸化ULK1和ATG13来抑制自噬。当mTORC1活性被抑制，ULK1快速去磷酸化，导致ULK1激酶的活化并诱导自噬发生。

试验方法：

替唑尼特(Tizoxanide，TIZ)溶解于二甲亚砜(DMSO)中，配制成100mmol/L储备液，-20℃保存，使用时用DMEM完全培养基稀释至终浓度。将细胞消化，离心并重悬浮于相应培养液中，以1×10⁶/皿的密度种植于60mm直径的细胞培养皿，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养过夜后，将细胞分为两组，第一组移除原培养液，加入新鲜配制的，含有25、50、75μmol/L和100μmol/L替唑尼特的培养液继续培养，溶剂对照组为0.1％的DMSO(V组)，于培养的12h终止培养。细胞终止培养后立即收集细胞总蛋白，Western Blotting法检测mTOR通路中主要蛋白的表达量的变化。

试验结果：

Western Blotting结果显示，在替唑尼特作用下，替唑尼特达25μmol/L能使mTOR蛋白的表达量显著降低(图6)。在对mTOR通路中主要蛋白表达量的检测结果显示，PI3K的85亚基均显著性地降低其磷酸化，且下游Akt的表达和磷酸化均显著性地下降，同时ULK1的表达和磷酸化均显著性地下降。说明替唑尼特是通过mTOR通路诱导细胞自噬的，更进一步地，替唑尼特在25μmol/L以上剂量是通过影响PI3K/Akt/mTOR途径来实现其自噬诱导作用的。

实施例5

替唑尼特对脂多糖诱导的ERK蛋白抑制的Western Blotting检测

ERK是extracellular regulated protein kinases的英文缩写，指细胞外调节蛋白激酶，包括ERK1和ERK2，是将信号从表面受体传导至细胞核的关键。ERK的激活能抑制PI3K/Akt/mTOR途径，而抑制自噬。相反地，ERK的抑制也能抑制mTOR途径而诱发自噬。试验方法：

替唑尼特(Tizoxanide，TIZ)溶解于二甲亚砜(DMSO)中，配制成100mmol/L储备液，-20℃保存，使用时用DMEM完全培养基稀释至终浓度。将细胞消化，离心并重悬浮于相应培养液中，以1×10⁶/皿的密度种植于60mm直径的细胞培养皿，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养过夜后，随后细胞被分为0.1％的DMSO溶剂对照组(V组)、脂多糖刺激模型组(LPS组1μg/mL)、替唑尼特处理组(1μg/mL LPS和50、75、100μmol/L替唑尼特)，培养6h后终止培养；细胞终止培养后立即收集细胞总蛋白，Western Blotting法检测ERK1蛋白及其磷酸化的表达量变化。

试验结果：

Western Blotting结果显示，脂多糖显著性地诱导p-ERK/ERK的量增加，而在替唑尼特作用下，p-ERK/ERK的表达量显著降低(图7)。说明替唑尼特是通过抑制p-ERK/ERK的量诱导细胞自噬的，更进一步地，是通过影响PI3K-ERK-mTOR途径来实现其自噬诱导作用的。

实施例6

替唑尼特能增强自噬诱导剂的诱导作用，也能抑制自噬抑制剂的抑制自噬的作用

LY294002是一种有效的、细胞通透性的、选择性的和可逆的I类磷酸肌醇3-激酶(PI3Ks)抑制剂，也是一种有效的自体吞噬抑制剂，阻断自噬体的形成。

雷帕霉素(rapamycin)是一种有效的自噬诱导剂，是mTOR最常用的抑制剂。

通过替唑尼特与自噬诱导剂和抑制剂的联合使用，检测器对自噬标志物的作用，可以证明替唑尼特自噬诱导的能力。

试验方法：

免疫荧光检测

替唑尼特(Tizoxanide，TIZ)溶解于二甲亚砜(DMSO)中，配制成100mmol/L储备液，-20℃保存，使用时用DMEM完全培养基稀释至终浓度。将细胞消化，离心并重悬浮于相应培养液中，细胞以2×10⁵/mL的密度接种于6孔板爬片，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养过夜后，移除原培养液，加入新鲜配制的，设0.1％的DMSO溶剂对照组(V组)、75μmol/L的替唑尼特组、雷帕霉素(rapamycin)组、LY294002组以及替唑尼特+雷帕霉素(rapamycin)组、替唑尼特+LY294002组，于培养的12h终止培养。PBS洗涤三次后，4％多聚甲醛室温固定细胞20min，0.2％Triton X-100透膜15min，3％的胎牛血清封闭1h，加入LC3多克隆抗体(1∶200)4℃孵育过夜。PBS洗涤三次后，加入Alexa Fluor 488标记的荧光二抗，室温避光孵育1h，经DAPI染细胞核后，用荧光淬灭剂封片，共聚焦显微镜下观察自噬表达情况，即LC3蛋白免疫荧光表达情况。

试验结果：

激光共聚焦结果显示，对照组和LY294002组细胞内极少有自噬小体形成，绿色荧光暗淡，但替唑尼特组和雷帕霉素(rapamycin)组以及替唑尼特+雷帕霉素(rapamycin)组细胞绿色荧光增强，增加细胞内自噬信号呈点状聚集增多，在胞浆中呈现弥散分布。而替唑尼特+LY294002组出现少量绿色荧光分布，比LY294002组的绿色荧光增多，但比替唑尼特组和雷帕霉素(rapamycin)组明显减少(图8)。以上结果说明LC3II型蛋白在自噬抑制剂的作用下含量减少，而在替唑尼特等诱导剂的作用下浓度显著升高，进一步说明替唑尼特能有效诱导细胞自噬。

Claims (9)

1.替唑尼特和/或硝唑尼特及其药学上可接受的盐在制备自噬诱导剂药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，替唑尼特和/或硝唑尼特及其药学上可接受的盐可以抑制mTOR蛋白。

3.根据权利要求2所述的用途，所述药学上可接受的盐，包括无机酸盐、有机酸盐，例如苹果酸盐等。

4.根据权利要求1所述的用途，细胞自噬过程中的诱导因素为抑制细胞中的PI3K、AKT、ERK蛋白的磷酸化，从而抑制mTOR蛋白的磷酸化激活。

5.一种药物组合物在制备抗炎药物中的用途，所述药物组合物包含替唑尼特和/或硝唑尼特或其药学上可接受的盐及药学上可接受的辅料。

6.一种药物组合物在制备抑制mTOR蛋白的药物中的用途，所述药物组合物包含替唑尼特和/或硝唑尼特或其药学上可接受的盐及药学上可接受的辅料。

7.根据权利要求5或6所述的用途，所述药物组合物可以经多种途径施用，例如口服片剂，胶囊，粉剂，口服液，注射剂和透皮制剂。

8.根据权利要求5或6所述的用途，所述药物组合物为固体制剂、注射剂、外用制剂、喷剂、液体制剂、或复方制剂。

9.根据权利要求1、5、6所述的用途，其特征在于：所述替唑尼特和/或硝唑尼特在诱导细胞自噬的药物中的有效浓度为25μmol/L～150μmol/L。