CN105296362A - 一种烟曲霉生物膜流动模型 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种烟曲霉生物膜流动模型，包括制备烟曲霉孢子悬液、建立生物膜流动模型和胞外基质染色及CLSM观察生物膜形成。将连接好的流动装置至于37℃恒温培养箱中，泵0.5%次氯酸钠的储液瓶消毒，随后高速流通无菌双蒸水清洗流动装置，灭菌清洗完毕后，连接泵入RPMI-1640培养基，将配制备好的孢子悬液以300μL/channel从chamber上游注入，夹闭两端，倒置2-4小时后开通，菌体表面流速为0.1-0.5mm/s；培养8h、16h、24h、48h、72h后，行胞外基质染色，CLSM观察生物被膜的形态。本发明烟曲霉生物膜流动模型具有无破坏性、实时观察等优点，可模拟植入导管相关感染的情况，是体外过渡到体内研究的研究模型。

Description

一种烟曲霉生物膜流动模型

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种烟曲霉生物膜流动模型及流动装置。

背景技术

烟曲霉是一种常见的条件致病性真菌，其孢子体积微小，直径2～3μm，漂浮于空气中，经呼吸道进入人体，肺部是曲霉感染主要发生部位。当宿主免疫力低下或者肺部的防御机制下降时，可引起过敏性支气管肺曲霉病（ABPA）、曲霉瘤或侵袭性曲霉病（IA）。而烟曲霉感染中90％为侵袭性感染，临床表现缺乏特异性，死亡率高。近年的研究表明烟曲霉菌可分泌大量胞外基质，在感染病灶中形成生物被膜，加重真菌的耐药性。烟曲霉感染已经受到众多临床工作者和科研者的关注。目前国外关于曲霉流动和静止模型下生物被膜成膜能力仍存在争议，曲霉的研究模型尚无定论。而国内研究人员大多研究的是静止模型的生物膜形态及结构，相关的药物干预亦是针对静止模型状态的生物膜形态和结构的研究，但静止模型的生物膜形态和生物体内的生物膜形态是存在差异的，生物体内由于血液的流动以及其他因素的影响，因此在静止模型下研究出的药物，具体实施到生物体内，却达不到预期的效果。这已成为了限制烟曲霉生物膜及其相关的药物干预研究的一大难题。

发明内容

本发明的目的是解决现有大多研究静止模型的烟曲霉生物结构及形态，提供一种更加接近于生命体内烟曲霉生物膜的形态和结构的研究模型，提供一种烟曲霉生物流动模型。为实现本发明目的所使用的技术方案为：

一种烟曲霉生物膜流动模型，包括制备烟曲霉孢子悬液、建立生物膜流动模型和胞外基质染色及CLSM观察生物膜形成；

（1）制备烟曲霉孢子悬液：将受试烟曲霉菌株在马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，35-37℃下活化3-5天，用含0.025%Tween20的PBS缓冲液冲洗斜面收集孢子，用MOPS缓冲后调pH值为6.9-7.1的RPMI-1640液体培养基重悬孢子，光学显微镜下用血细胞板计数悬液中的孢子量，用上述RPMI-1640液体培养基将计数好的孢子悬液稀释，调整孢子终浓度为1-3×10⁵孢子/ml；

（2）建立生物膜流动模型：连接流动装置，所述的流动装置包括蠕动泵，进液储液瓶，硅橡胶管，止水夹，单向排气装置，chamber，废液收集瓶；蠕动泵与进液储液瓶通过硅橡胶管连接，与进液储液瓶的硅橡胶管即进液端，蠕动泵与单向排气装置通过硅橡胶管连接，单向排气装置和chamber通过硅橡胶管连接，距chamber两端2-4cm处的硅橡胶管上各设置一个止水夹，chamber和废液收集瓶通过硅橡胶管，将连接好的流动装置至于35-37℃恒温培养箱中，泵0.5%次氯酸钠的储液瓶消毒，随后高速流通无菌双蒸水清洗流动装置，灭菌清洗完毕后，连接泵入RPMI-1640培养基，将配制备好的孢子悬液以300μL/channel从chamber上游注入，夹闭两端，倒置2-4小时后开通，菌体表面流速为0.1-0.5mm/s；培养8h、16h、24h、48h、72h后，行胞外基质染色，CLSM观察生物被膜的形态；

（3）胞外基质染色及CLSM观察生物膜形成：无菌生理盐水缓慢清洗chamber中的生物膜，无菌注射器注入300μL制备好的FITC-ConA染液，37℃避光染色90分钟，泵无菌去离子水洗去多余染液，然后置于CLSM下观察，激发光和滤过光的波长分别为488nm和BP515-530nm。

优选地，将所述的流动装置的置于35-37.0℃恒温生化培养箱中，流动装置进液端管道入口置于含有150-200ml0.5%次氯酸钠的储液瓶中，出液端硅橡胶管开口置入废液收集瓶中，启动蠕动泵，调节泵速为1.5-2.0rpm，持续4-5h泵入0.5%次氯酸钠消毒于整个流动装置；随后将进液端硅橡胶管入口置入含1.5-2L灭菌双蒸水的烧瓶中，以30-50rpm泵速高速流通无菌双蒸水3-4h清洗流动装置，同时开启恒温培养箱内的紫外射线消毒灯消毒整个装置外表面及其恒温培养箱内部，直至灭菌清洗完毕；

将流动装置进液端管硅橡胶管开口置入经MOPS缓冲后pH值为6.9-7.1的RPMI-1640液体培养基的储液瓶中，培养液温度为35-37℃，调节蠕动泵泵速为3-5rpm，持续泵入5-10min，使RPMI-1640液体培养基充满整个装置管道；暂时停止蠕动泵，于距chamber上游2-2.5cm处夹闭止水夹，用75%酒精消毒该段硅橡胶管，用1mL灭菌注射器将步骤（1）中配制备好的浓度为1-3×10⁵孢子/ml的孢子悬液以300μL/channel的接种量，从该段管道注入chamber，进液完毕后退出注射针头，将chambe下游的硅橡胶管用止水夹夹闭，将chamber倒置使其观察面朝下，静置2-4小时使孢子沉降并粘附于各chamber内各channel的观察面；孢子粘附完成后，将chamber转置使各channel的观察面朝上，再次开启蠕动泵，调节泵速为1.75rpm，菌体表面流速为0.2mm/s；于37.0℃恒温培养8h、16h、24h、48h、72h后，停止蠕动泵，对上述各个时点各个channel观察面上形成的烟曲霉生物膜进行胞外基质染色，激光共聚焦显微镜（CLSM）观察生物被膜的形态。

以上所述的流动装置还可以用75%乙醇进行消毒，消毒后，用转速为50-100rmp的无菌双蒸水清洗。

优选地，所述的步骤（2）孢子悬液在chamber倒置2小时后开通。

优选地，所述的步骤（2）泵流速为1.75rpm，菌体表面流速为0.2mm/s。

优选地，所述的步骤（3）胞外基质染色及CLSM观察生物膜形成：相应时间点培养结束后，以1.0-1.5rpm泵速缓慢泵入灭菌PBS水漂洗chamber各channel内的已形成的烟曲霉生物膜3-5min，于距chamber上游2-2.5cm处夹闭止水夹，1ml注射器缓慢注入300μL制备好的FITC-ConA染液，注入完毕后夹闭chamber下游止水夹，将chamber倒置，于37℃避光静止染色90min后，向chamber内注入无菌去离子水洗去多余染液，将其观察面朝上，置于CLSM下放大200倍观察各channel中烟曲霉生物被膜的生长情况，激发光和滤过光的波长分别为488nm和BP515-530nm。

以上所述的烟曲霉生物膜流动模型在烟曲霉生物膜研究中的应用。

本发明的有益效果为：流动模型在体外生物膜研究是在蠕动泵的帮助下将新鲜的培养液以恒定流速输送到微生物表面，维持稳定的pH、氧含量、液体剪切力，该模型具有无破坏性、实时观察等优点，可模拟植入导管相关感染的情况，是体外过渡到体内研究的研究模型。

流动模型的生物膜在发展过程中，烟曲霉粘附于载体并逐渐延长交叉缠绕成三维立体结构，生物量、基质覆盖率、平均厚度和平均扩散距离不断增加，BF表面逐渐趋于平坦，粗糙系数下降。而且本发明验证了流动和静止模型的区别对曲霉的粘附及萌芽时间并无影响，而是对菌丝密度和ECM分泌量的影响。

附图说明

图1流动和静止状态下烟曲霉生物膜的生长情况；其中A1-A3分别表示流动模型8h、24h、72h的生物被膜3D形态；B-B3分别表示静止模型8h、24h、72h的生物被膜3D形态。

具体实施方式

实施例1建立烟曲霉生物膜流动模型和静止模型

1、菌株

试验菌株为临床分离株，经本课题前期实验研究鉴定为成膜能力最强的4号烟曲霉菌。

2、载体

以直径为13mm的圆形细胞爬片作为静止模型的载体；以24×50mm材质相同的盖玻片作为流动模型的载体；高压灭菌后使用。

3、主要试剂

RPMI-1640粉（Gibco公司），MOPS（Sigma，USA），氢氧化钠（天津博迪化工股份有限公司），马铃薯葡萄糖琼脂（中国陆桥技术责任有限公司），FITC-ConA染液（vectorlaboratories，USA），磷酸盐缓冲液（Gibco公司），次氯酸钠溶液（天津大茂化学试剂厂）。

4、主要仪器

24孔细胞培养板（Corning，USA），蠕动泵（WatsonMarlow205S，USA），FlowCell（Stovall，USA），生物洁净安全柜（BHC-1300IIA/B2型，苏州净化设备有限公司净公司），智能生化培养箱（BS-2型，宁波江南仪器厂），漩涡混合仪（XW-80A型，海门市其林贝尔仪器制造有限公司），激光扫描共聚焦显微镜（NIikonA1，日本）。

5、方法

（1）烟曲霉孢子悬液的制备

所有受试曲霉在马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上活化3-5天，用含0.025%Tween20的PBS冲洗斜面收集孢子，用RPMI-1640培养基重悬孢子，血细胞板计数，并用在经MOPS缓冲后调pH值为7.0的RPMI-1640液体培养基稀释，孢子终浓度为1-3×10⁵孢子/ml。

（2）静止模型的制备

参照MowatE等，将圆形载体至于24孔板底部，加入1ml调整好的孢子悬液，37℃下分别培养8h、16h、24h、48h、72h，期间每24h更换培养液一次，用灭菌PBS轻柔漂洗载体3次，行胞外基质染色，CLSM观察生物被膜形态。

（3）流动模型的制备

连接流动装置，将流动装置至于37℃恒温培养箱中，泵0.5%次氯酸钠消毒，随后高速流通无菌双蒸水清洗流动装置。灭菌清洗完毕后，连接并泵入RPMI-1640培养基，将配制备好的孢子悬液从chamber上游注入，300μL/channel，夹闭两端，倒置2h后开通，菌体表面流速0.2mm/s。培养8h、16h、24h、48h、72h后，行胞外基质染色，CLSM观察生物被膜的形态。

（4）胞外基质染色及CLSM观察生物被膜形成的过程

静止模型以无菌生理盐水轻轻漂洗载体除去浮游菌，将载体移至新新孔板，每孔加入100μL200μg/ml的FITC-ConA染液；流动模型以无菌生理盐水缓慢清洗chamber中的生物膜，无菌注射器注入300μL制备好的FITC-ConA染液，37℃避光染色90分钟，泵无菌去离子水洗去多余染液，然后置于CLSM下观察，激发光和滤过光的波长分别为488nm和BP515-530nm。

（5）COMSTAT定量生物被膜结构

参照ArneHeydorn等的报道，将软件文件导入MATLAB路径，将CLSM拍摄好的三维图片转换为.GIF格式并导入相应的文件夹，启动METLAB7.0软件，运行CHECKALL程序检验图片的准确性和完整性，使用LOOK或LOOKTIF程序检测并设定灰度阈值，运行COMSTAT程序进行相关分析，计算图片的生物量、平均厚度、基质覆盖率、粗糙系数、平均扩散距离、表面积与生物量比等指标。每次每小组取3帧图定量分析取平均值，实验重复4次。

6、统计学方法

采用SPSS16.0统计软件，结果取（均数±标准差）表示，两组各测量指标的比较采用多变量重复测量方差分析方法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

实施例2CLSM观察烟曲霉生物被膜的生长情况

经过3天的培养，实施例1中烟曲霉生物被膜生长情况如图1所示。在静止和流态条件下，随着时间的进展，荧光染色提示烟曲霉生物被膜及其胞外基质均呈现明显增长趋势，相同时间点下静止模型的胞外基质荧光密度更大。

实施例3利用COMSTAT软件定量、比较烟曲霉两种形态下的生物被膜

本实验从粗糙系数方面评价烟曲霉生物被膜的生长情况，见表1。以培养方法（流动和静止）为组间处理因素，以各个时间点（8h、16h、24h、48h、72h）各指标的测量值为重复测量变量，进行多变量重复测量方差分析，见表2。粗糙系数、平均扩散距离及表面积与生物量比的处理因素的效应均有统计学意义（P值均<0.01），即不同培养方法对各指标的影响均有差异。时间因素的效应有统计学意义（P值均<0.001），即BF各个测量指标在不同时间点上的量化值不同。表中前5项指标的交互效应有统计学意义（P值均<0.01），即在对这些指标的影响上培养方法与时间有交互效应。粗糙系数随着培养时间的增加而降低；相同时间点下流动模型组高于静止模型组。表面积与生物量比的交互效应无统计学意义（F=1.236，P=0.322）。

表1烟曲霉生物被膜流动模型与静止模型不同时间点的粗糙系数、平均扩散距离、表面积与生物量比（ ,n=4）

表2烟曲霉生物被膜在两种培养方法下BF各指标的重复测量方差分析

Claims (7)

1.一种烟曲霉生物膜流动模型，其特征在于，包括制备烟曲霉孢子悬液、建立生物膜流动模型和胞外基质染色及CLSM观察生物膜形成；

（1）制备烟曲霉孢子悬液：将受试烟曲霉菌株在马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，35-37℃下活化3-5天，用含0.025%Tween20的PBS缓冲液冲洗斜面收集孢子，用MOPS缓冲后调pH值为6.9-7.1的RPMI-1640液体培养基重悬孢子，光学显微镜下用血细胞板计数悬液中的孢子量，用上述RPMI-1640液体培养基将计数好的孢子悬液稀释，调整孢子终浓度为1-3×10⁵孢子/ml；

（2）建立生物膜流动模型：连接流动装置，所述的流动装置包括蠕动泵，进液储液瓶，硅橡胶管，止水夹，单向排气装置，chamber，废液收集瓶；将连接好的流动装置至于35-37℃恒温培养箱中，泵0.5%次氯酸钠的储液瓶消毒，随后高速流通无菌双蒸水清洗流动装置，灭菌清洗完毕后，连接泵入RPMI-1640培养基，将配制备好的孢子悬液以300μL/channel从chamber上游注入，夹闭两端，倒置2-4小时后开通，菌体表面流速为0.1-0.5mm/s；培养8h、16h、24h、48h、72h后，行胞外基质染色，CLSM观察生物被膜的形态；

（3）胞外基质染色及CLSM观察生物膜形成：无菌生理盐水缓慢清洗chamber中的生物膜，无菌注射器注入300μL制备好的FITC-ConA染液，37℃避光染色90分钟，泵无菌去离子水洗去多余染液，然后置于CLSM下观察，激发光和滤过光的波长分别为488nm和BP515-530nm。

2.根据权利要求1所述的烟曲霉生物膜流动模型，其特征在于，所述的步骤（2）建立生物膜流动模型：将所述的流动装置的置于35-37.0℃恒温生化培养箱中，流动装置进液端管道入口置于含有150-200ml0.5%次氯酸钠的储液瓶中，出液端硅橡胶管开口置入废液收集瓶中，启动蠕动泵，调节泵速为1.5-2.0rpm，持续4-5h泵入0.5%次氯酸钠消毒于整个流动装置；随后将进液端硅橡胶管入口置入含1.5-2L灭菌双蒸水的烧瓶中，以30-50rpm泵速高速流通无菌双蒸水3-4h清洗流动装置，同时开启恒温培养箱内的紫外射线消毒灯消毒整个装置外表面及其恒温培养箱内部，直至灭菌清洗完毕；

将流动装置进液端管硅橡胶管开口置入经MOPS缓冲后pH值为6.9-7.1的RPMI-1640液体培养基的储液瓶中，培养液温度为35-37℃，调节蠕动泵泵速为3-5rpm，持续泵入5-10min，使RPMI-1640液体培养基充满整个装置管道；暂时停止蠕动泵，于距chamber上游2-2.5cm处夹闭止水夹，用75%酒精消毒该段硅橡胶管，用1mL灭菌注射器将步骤（1）中配制备好的浓度为1-3×10⁵孢子/ml的孢子悬液以300μL/channel的接种量，从该段管道注入chamber，进液完毕后退出注射针头，将chambe下游的硅橡胶管用止水夹夹闭，将chamber倒置使其观察面朝下，静置2-4小时使孢子沉降并粘附于各chamber内各channel的观察面；孢子粘附完成后，将chamber转置使各channel的观察面朝上，再次开启蠕动泵，调节泵速为1.75rpm，菌体表面流速为0.2mm/s；于37.0℃恒温培养8h、16h、24h、48h、72h后，停止蠕动泵，对上述各个时点各个channel观察面上形成的烟曲霉生物膜进行胞外基质染色，激光共聚焦显微镜（CLSM）观察生物被膜的形态。

3.根据权利要求1所述的烟曲霉生物膜流动模型，其特征在于，所述的流动装置还可以用75%乙醇进行消毒，消毒后，用转速为50-100rmp的无菌双蒸水清洗。

4.根据权利要求1所述的烟曲霉生物膜流动模型，其特征在于，所述的步骤（2）孢子悬液在chamber倒置2小时后开通。

5.根据权利要求1所述的烟曲霉生物膜流动模型，其特征在于，所述的步骤（2）泵流速为1.75rpm，菌体表面流速为0.2mm/s。

6.根据权利要求1所述的烟曲霉生物膜流动模型，其特征在于，所述的步骤（3）胞外基质染色及CLSM观察生物膜形成：相应时间点培养结束后，以1.0-1.5rpm泵速缓慢泵入灭菌PBS水漂洗chamber各channel内的已形成的烟曲霉生物膜3-5min，于距chamber上游2-2.5cm处夹闭止水夹，1ml注射器缓慢注入300μL制备好的FITC-ConA染液，注入完毕后夹闭chamber下游止水夹，将chamber倒置，于37℃避光静止染色90min后，向chamber内注入无菌去离子水洗去多余染液，将其观察面朝上，置于CLSM下放大200倍观察各channel中烟曲霉生物被膜的生长情况，激发光和滤过光的波长分别为488nm和BP515-530nm。

7.根据权利要求1-6任一项所述的烟曲霉生物膜流动模型在烟曲霉生物膜研究中的应用。