CN104498391A - 一种大肠杆菌及其培养基的培养方法 - Google Patents

一种大肠杆菌及其培养基的培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种大肠杆菌培养基及其培养方法，该培养基由下列物质组成：葡萄糖0.1g、蛋白胨0.5g、KH2PO4·3H2O0.1g、MgSO4·7H2O0.05g、孟加拉红溶液0.33ml、琼脂1.5～2g、蒸馏水100ml、自然pH2％去氧胆酸钠溶液2ml、链霉素溶液0.33ml。本发明提供一种大肠杆菌的培养基，通过本培养基，能快速对大肠杆菌进行培养，同时优化了微生物发酵培养菌条件，培养工艺简单，能够获得理想的高活菌浓度。

Description

一种大肠杆菌及其培养基的培养方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体是指一种大肠杆菌的培养基及培养方法、大肠杆菌种子液的制备方法。
背景技术
大肠杆菌是与我们日常生活关系非常密切的一类细菌，学名称作“大肠埃希菌”，属于肠道杆菌大类中的一种。它是寄生在人体大肠里对人体无害的一种单细胞生物，结构简单，繁殖迅速，培养容易，它是生物学上重要的实验材料。
正常情况下，大多数大肠杆菌是非常安分守己的，不但不会给我们的身体健康带来任何危害，反而还能竞争性抵御致病菌的进攻，同时还能帮助合成维生素K2，与人体是互利共生的关系。只有在机体免疫力降低、肠道长期缺乏刺激等特殊情况下，才会兴风作浪，移居到肠道以外的地方，例如胆囊、尿道、膀胱、阑尾等地，造成相应部位的感染或全身播散性感染。因此，大部分大肠杆菌通常被看作机会致病菌。
各种动物大肠杆菌灭活疫苗的制备中，首要环节就是大肠杆菌的培养。为了获得理想的活菌浓度，业界对大肠杆菌培养工艺进行了大量研究。影响大肠杆菌培养菌浓度的因素有很多，如培养基组成、培养时间、菌种接种量以及细菌生长环境等。
发明内容
本发明的目的在于：提供一种大肠杆菌的培养基及其培养方法、大肠杆菌种子液制备方法，培养工艺简单，获得理想的高活菌浓度。
本发明通过下述技术方案实现如下：一种大肠杆菌的培养基及其培养方法，由下列物质组成：蛋白胨15.0g、酵母膏粉3.0g、氯化钠5.0g、葡萄糖0.2g、十二烷基硫酸钠0.1g、琼脂12.0g、混合显色底物6.77g、蒸馏水100ml、自然pH 2％去氧胆酸钠溶液4ml、链霉素溶液0.66ml、孟加拉红溶液0.33ml、KH2PO4·3H2O 0.1g、MgSO4·7H2O0.05g。。
进一步地，为更好的实现本发明，所述链霉素溶液浓度为10000u/ml。
进一步地，为更好的实现本发明，所述培养基pH为7.2～7.4。
一种大肠杆菌种子液的制备方法，包括以下步骤：
(1)称量，按培养基的配方比例依次准确称取蛋白胨、酵母膏粉、氯化钠、葡萄糖、十二烷基硫酸钠、混合显色底物、自然pH 2％去氧胆酸钠溶液、链霉素溶液、孟加拉红溶液、KH2PO4·3H2O、MgSO4·7H2O放入烧杯中；
(2)溶化，在上述烧杯中加入适量蒸馏水、搅拌，加热溶解，按配方比例称取琼脂，加热溶化；
(3)调节PH；
(4)分装将培养基分装入三个试管和三角烧瓶中，试管装量不超过管高的1/5，三角烧瓶的量不超过1/2，分装完后，加塞；
(5)包扎加塞后，用麻绳将试管捆绑，在棉塞外包一层牛皮纸，作好记录；
(6)灭菌将上述培养基以0.1MPa，121℃，25min高压蒸汽灭菌；
(7)倒平板取已消毒的培养皿，在无菌操作台上用三角烧瓶中的培养基倒置三个平板培养基，冷却；
(8)搁置斜面，取灭菌的试管培养基冷却至50℃，将试管口端搁在玻璃棒上，搁置斜面长度不超过试管总长的一半；
(9)取制备的大肠杆菌种子，用接种环在已制备的的斜面上接种大肠杆菌；
(10)所述步骤(9)接种好的斜面放入37℃的恒温箱培养箱子中培养24小时；
(11)在无菌条件下，取一支保存的大肠杆菌斜面，用无菌生理盐水将菌种进行冲洗，再用无菌生理盐水将其按梯度进行稀释，分别吸取溶液土布平板，然后再37℃培养箱中过夜；
(12)选择生长状态好、特征明显的单个菌落，接种于新鲜灭菌的大肠杆菌培养基中37℃170r/min恒温培养18小时作大肠杆菌种子培养液。
一种培养大肠杆菌的方法，包括以下步骤：
(1)一级种子的制备，大肠杆菌菌种分别接种于含0.1％微量盐溶液的培养基中，37℃条件下培养24小时，划线接种琼脂平板上培养，再接种马丁琼脂斜面，37℃条件下培养20～24小时，作为一级种子；
(2)二级种子的制备，将大肠杆菌菌株的一级种子液接种到培养基中，37℃条件下培养24小时，经纯粹检验合格后，作为二级种子，置3～7℃条件下保存；
(3)将大肠杆菌菌株的二级种子液接种到含0.1％微量盐溶液的培养基，二级种子液接种量为培养基体积总量的2～3％，菌株种子在37℃条件下于微生物摇床内培养11～13小时。
进一步地，为更好的实现本发明，所述摇床转速为120～160转/分钟。
进一步地，为更好的实现本发明，所述摇床转速为150转/分钟。
进一步地，为了更好的实现本发明，菌株种子在37℃条件下雨微生物摇床内培养12小时。
本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：
本发明提供一种大肠杆菌的培养基及培养方法，通过本培养基，能快速对大肠杆菌进行培养，同时优化了微生物发酵培养菌条件，培养工艺简单，能够获得理想的高活菌浓度。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此。
实施例一：
1、准备兔大肠杆菌菌种：大肠杆菌EC45菌株；菌株向农业部下属中国兽医药品监察所建立的中国兽医微生物菌种保藏管理中心(CVCC)购买。
菌种标准：
①形态和生化特性：培养物涂片为革兰氏阴性杆菌。生化特性应符合细菌分类学中本菌的特性。
②培养特征：接种麦康凯式培养基平板上，37℃培养24小时，肉眼观察呈粉红色，菌落隆起，表面光滑。低倍显微镜下45度折光观察，边缘整齐，呈鲜艳的金光。
③血清学特性：EC45为02。
④毒力：大肠杆菌EC45毒力测定。取2月龄兔3只，胸部肌肉注射大肠杆菌EC24菌株的普通肉汤菌液0.5ml(含活菌2～5×108CFU)，观察10日，应全部发病。
⑤免疫原性：各菌株按本发明分别制备单价蜂胶灭活疫苗进行免疫原性鉴定。取2月龄兔3只，经颈部皮下注射0.5ml，21日后连同条件相同的对照兔3只，分别经胸部肌肉注射一个最小感染剂量(1MID)的对应制苗用强毒菌液0.5ml(含活菌3～4×108CFU)，观察7日。
纯粹：按照《中国兽药典》检验，应纯粹。
2、制备兔大肠杆菌菌株的一级种子液：将兔大肠杆菌菌种分别接种于含0.1％微量盐溶液的培养基(蛋白胨15.0g、酵母膏粉3.0g、氯化钠5.0g、葡萄糖0.2g、十二烷基硫酸钠0.1g、琼脂12.0g、混合显色底物6.77g、蒸馏水100ml、自然pH 2％去氧胆酸钠溶液4ml、链霉素溶液0.66ml、孟加拉红溶液0.33ml、KH2PO4·3H2O 0.1g、MgSO4·7H2O 0.05g，PH7.2)中，37℃条件下培养24小时，划线接种麦康凯氏琼脂平板上培养，各菌株选取符合上述“培养特征”标准的典型菌落8个，再分别接种马丁琼脂斜面若干支，37℃条件下培养20小时，作为一级种子，置8℃条件下保存备用，且20内用完。
3、制备兔大肠杆菌菌株的二级种子液：将兔大肠杆菌菌株的一级种子液接种到上述培养基中，37℃条件下培养24小时，经纯粹检验合格后，作为二级种子，置3℃条件下保存，且3日内用完。
4、将兔大肠杆菌菌株的二级种子液接种到含0.1％微量盐溶液的上述培养基，其pH值范围为7.4；二级种子液接种量为培养基体积总量的3％，菌株种子在37℃条件下于微生物发酵罐内通入新鲜氧气，通气量为3升/分钟，搅拌速度控制为160转/分钟，培养11小时。所得菌液活菌数较高，活菌浓度为4.8×109CFU/ml。
实施例二：
1、准备兔大肠杆菌菌种：兔大肠杆菌EC24菌株；菌株向农业部下属中国兽医药品监察所建立的中国兽医微生物菌种保藏管理中心(CVCC)购买。
菌种标准：
①形态和生化特性：培养物涂片为革兰氏阴性杆菌。生化特性应符合细菌分类学中本菌的特性。
②培养特征：接种麦康凯式培养基平板上，37℃培养24小时，肉眼观察呈粉红色，菌落隆起，表面光滑；低倍显微镜下45度折光观察，边缘整齐，呈鲜艳的金光。
③血清学特性：EC24为078。
④毒力：兔大肠杆菌EC24毒力测定。取1月龄兔3只，胸部肌肉注射大肠杆菌EC24菌株的普通肉汤菌液0.5ml(含活菌2～5×108CFU)，观察10日，应全部发病。
⑤免疫原性：各菌株按本发明分别制备单价蜂胶灭活疫苗进行免疫原性鉴定。取1月龄兔3只，经颈部皮下注射0.5ml，21日后连同条件相同的对照兔3只，分别经胸部肌肉注射一个最小感染剂量1MID的对应制苗用强毒菌液0.5ml，含活菌3～4×108CFU，观察7日。
纯粹：按照《中国兽药典》检验，应纯粹。
2、制备兔大肠杆菌菌株的一级种子液：将兔大肠杆菌菌种分别接种于含0.1％微量盐溶液的培养基(蛋白胨15.0g、酵母膏粉3.0g、氯化钠5.0g、葡萄糖0.2g、十二烷基硫酸钠0.1g、琼脂12.0g、混合显色底物6.77g、蒸馏水100ml、自然pH 2％去氧胆酸钠溶液4ml、链霉素溶液0.66ml、孟加拉红溶液0.33ml、KH2PO4·3H2O 0.1g、MgSO4·7H2O 0.05g，PH7.4)中，37℃条件下培养24小时，划线接种麦康凯氏琼脂平板上培养，各菌株选取符合上述“培养特征”标准的典型菌落8个，再分别接种马丁琼脂斜面若干支，37℃条件下培养20小时，作为一级种子；置2℃条件下保存备用，20内用完。
3、制备兔大肠杆菌菌株的二级种子液：将兔大肠杆菌菌株的一级种子液接种到上述培养基中，37℃条件下培养24小时，经纯粹检验合格后，作为二级种子，置7℃条件下保存(3日内用完)。
4、将兔大肠杆菌菌株的二级种子液接种到含0.1％微量盐溶液的上述培养基，其pH值范围为7.2；二级种子液接种量为培养基体积总量的2％，菌株种子在37℃条件下于微生物发酵罐内通入新鲜氧气，通气量为3升/分钟，搅拌速度控制为180转/分钟，培养12小时。所得菌液活菌数较高，活菌浓度为4.6×109CFU/ml。
实施例三：
一种大肠杆菌种子液的制备方法，包括以下步骤，
(1)称量，按培养基的配方比例依次准确称取蛋白胨、酵母膏粉、氯化钠、葡萄糖、十二烷基硫酸钠、混合显色底物、自然pH 2％去氧胆酸钠溶液、链霉素溶液、孟加拉红溶液、KH2PO4·3H2O、MgSO4·7H2O放入烧杯中；
(2)溶化，在上述烧杯中加入适量蒸馏水、搅拌，加热溶解，按配方比例称取琼脂，加热溶化；
(3)调PH，在未调PH前，可用精密PH试纸测量培养的的原始PH，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/l NaOH，边加边搅拌，并随时用PH试纸测定PH直到PH达到7.4—7.6，反之用1mol/l盐酸调节；
(4)分装将培养基分装入三个试管和三角烧瓶中，试管装量不超过管高的1/5，三角烧瓶的量不超过1/2，分装完后，加塞；
(5)包扎加塞后，用麻绳将试管捆绑，在棉塞外包一层牛皮纸，作好记录；
(6)灭菌将上述培养基以0.1MPa,121℃，25min高压蒸汽灭菌；
(7)倒平板取已消毒的培养皿，在无菌操作台上用三角烧瓶中的培养基倒置三个平板培养基，冷却；
(8)搁置斜面，取灭菌的试管培养基冷却至50℃，将试管口端搁在玻璃棒上，搁置斜面长度不超过试管总长的一半；
(9)取制备的大肠杆菌种子，用接种环在已制备的的斜面上接种大肠杆菌；
(10)所述步骤(9)接种好的斜面放入37℃的恒温箱培养箱子中培养24小时；
(11)在无菌条件下，取一支保存的大肠杆菌斜面，用无菌生理盐水将菌种进行冲洗，再用无菌生理盐水将其按梯度进行稀释，分别吸取溶液土布平板，然后再37℃培养箱中过夜；
(12)选择生长状态好、特征明显的单个菌落，接种于新鲜灭菌的大肠杆菌培养基中37℃170r/min恒温培养18小时作大肠杆菌种子培养液。
每次试验培养大肠杆菌前从大肠杆菌种子培养液中吸取2ml菌液接种于新鲜灭菌的培养基中，37℃，170rpm恒温振荡培养。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化，均落入本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种大肠杆菌的培养基，其特征在于，由下列物质组成：蛋白胨15.0g、酵母膏粉3.0g、氯化钠5.0g、葡萄糖0.2g、十二烷基硫酸钠0.1g、琼脂12.0g、混合显色底物6.77g、蒸馏水100ml、自然pH 2％去氧胆酸钠溶液4ml、链霉素溶液0.66ml、孟加拉红溶液0.33ml、KH2PO4·3H2O 0.1g、MgSO4·7H2O 0.05g。
2.根据权利要求1所述的一种大肠杆菌的培养基，其特征在于：所述链霉素溶液浓度为10000u/ml。
3.根据权利要求1所述的一种大肠杆菌的培养基，其特征在于：所述培养基pH为7.2～7.4。
4.一种大肠杆菌种子液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤(1)称量，按权利要求1所述的培养基的配方比例依次准确称取蛋白胨、酵母膏粉、氯化钠、葡萄糖、十二烷基硫酸钠、混合显色底物、自然pH 2％去氧胆酸钠溶液、链霉素溶液、孟加拉红溶液、KH2PO4·3H2O、MgSO4·7H2O放入烧杯中；
步骤(2)溶化，在上述烧杯中加入蒸馏水、搅拌，加热溶解，按权利要求1所述的培养基的配方比例称取琼脂，加热溶化；
步骤(3)调节PH，得到培养基；
步骤(4)分装，将步骤(3)得到的培养基分装入三个试管和三角烧瓶中，试管装量不超过管高的1/5，三角烧瓶的量不超过1/2，分装完后，加塞；
步骤(5)在步骤(4)的试管和烧瓶被包扎加塞后，用麻绳将试管捆绑，在棉塞外包一层牛皮纸，作好记录；
步骤(6)灭菌，将上步骤(5)得到的培养基以0.1MPa,121℃，25min高压蒸汽灭菌；
步骤(7)倒平板，取已消毒的培养皿，在无菌操作台上将三角烧瓶中的培养基倒置三个平板培养基，冷却；
步骤(8)搁置斜面，取灭菌的试管培养基冷却至50℃，将试管口端搁在玻璃棒上，搁置斜面长度不超过试管总长的一半；
步骤(9)取制备的大肠杆菌种子，用接种环在已制备的的斜面上接种大肠杆菌；
步骤(10)所述步骤(9)接种好的斜面放入37℃的恒温箱培养箱子中培养24小时；
步骤(11)在无菌条件下，取一支保存的大肠杆菌斜面，用无菌生理盐水将菌种进行冲洗，再用无菌生理盐水将其按梯度进行稀释，分别吸取溶液土布平板，然后再37℃培养箱中过夜；
步骤(12)选择步骤(11)中所形成菌落中生长状态好、特征明显的单个菌落，接种于新鲜灭菌的大肠杆菌培养基中37℃170r/min恒温培养18小时作大肠杆菌种子培养液。
5.一种使用权利要求1～3中任意一项所述的培养基的大肠杆菌的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)一级种子的制备，大肠杆菌菌种分别接种于含0.1％微量盐溶液的培养基中，37℃条件下培养24小时，划线接种琼脂平板上培养，再接种马丁琼脂斜面，37℃条件下培养20～24小时，作为一级种子；
(2)二级种子的制备，将大肠杆菌菌株的一级种子液接种到培养基中，37℃条件下培养24小时，经纯粹检验合格后，作为二级种子，置3～7℃条件下保存；
(3)将大肠杆菌菌株的二级种子液接种到含0.1％微量盐溶液的培养基，二级种子液接种量为培养基体积总量的2～3％，菌株种子在37℃条件下于微生物摇床内培养11～13小时。
6.根据权利要求5所述的大肠杆菌的培养方法，其特征在于：所述摇床转速为160～180转/分钟。
7.根据权利要求5所述的大肠杆菌的培养方法，其特征在于：菌株种子在37℃条件下于微生物摇床内培养12小时。
8.根据权利要求6所述的大肠杆菌的培养方法，其特征在于：所述摇床转速为170转/分钟。
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