CN101991845B

CN101991845B - 一种鸭传染性浆膜炎灭活疫苗乳化方法

Info

Publication number: CN101991845B
Application number: CN2010105432338A
Authority: CN
Inventors: 程安春; 汪铭书; 朱德康; 陈孝跃
Original assignee: ENGINEERING AND TECHONLOGY CENTER FOR LABORATORY ANIMALS OF SICHUAN AGRICULTURAL UNIVERSITY
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2010-11-15
Filing date: 2010-11-15
Publication date: 2012-11-21
Anticipated expiration: 2030-11-15
Also published as: CN101991845A

Abstract

本发明公开了一种鸭传染性浆膜炎灭活疫苗乳化方法，包括以下步骤：水相制备：4份吐温-80装入瓶中灭菌，冷却后加入96份菌液，充分振摇，至吐温-80完全溶解为止；油相制备：93份注射用白油、5份司本-80、2份硬脂酸铝，配油相时，先取少量注射用白油与硬脂酸铝混合，加热溶化，再与全量司本-80及注射用白油混合均匀，搅拌至透明为止，116℃灭菌30分钟，备用；将水相和油相按1∶1.5-1∶3的比例进行乳化，以3200-4800r/min的转速进行乳化，乳化时间8-12分钟。

Description

一种鸭传染性浆膜炎灭活疫苗乳化方法

技术领域

本发明涉及兽用生物制剂技术领域，特别涉及一种鸭传染性浆膜炎灭活疫苗乳化方法。

背景技术

鸭传染性浆膜炎又称为新鸭病、鸭败血症、鸭疫综合症、鸭疫巴氏杆菌病等，是由鸭疫里默氏菌(Riemerella anatipestifer，RA)引起的一种接触性传染性疾病，多见于1～8周龄的小鸭，尤以2～5周龄的雏鸭最为易感。潜伏期一般为2～5天，呈急性或慢性败血症，临床上主要表现为眼、鼻分泌物增多、喘气、咳嗽、下痢、共济失调和头颈震颤，少数慢性病例出现头颈歪斜等症状。病变以纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、脑膜炎及部分病例出现关节炎为特征，常引起小鸭的大批发病和死亡。是目前对养鸭业危害最为严重的细菌性传染病之一。

在自然条件下，本病一年四季都有发生。主要通过污染的饲料、饮水、尘埃、飞沫等，经呼吸道、消化道或皮肤的伤口(尤其是足蹼部皮肤)而感染。不同品种鸭如番鸭、半番鸭、北京鸭、樱桃谷鸭、狄高鸭、金定鸭、麻鸭等均易感。它的发生与鸭龄的大小、感染菌株的毒力强弱、饲养管理条件的好坏、各种不良应激因素或其它病原感染有一定的关系，死亡率一般在5％～75％，在有其它疾病混合感染时，死亡率可高达90％以上。耐过鸭常生长不良，增重缓慢，失去饲养价值，而且该病在发病鸭场能持续存在，引起不同批次鸭的感染发病，给养鸭业造成严重的经济损失。

由于RA病给养鸭业带来严重的经济损失，有关其免疫预防研究引起了越来越多的关注。尽管RA血清型较多，各型之间基本无交叉保护作用，给疫苗的研制带来了较大的困难，但关于RA疫苗的研究，还是引起了兽用生物制品领域科研人员的广泛关注并认为鸭疫里默氏菌预防的根本措施还是接种疫苗。目前研究报道的RA疫苗主要有RA灭活疫苗(只有一种血清型的单价灭活疫苗、含多种血清型的多价灭活疫苗)、RA和E.coli二联灭活疫苗、RA弱毒活疫苗、提取获得RA亚单位成分的亚单位疫苗。其中灭活疫苗效果确实，就目前研究进展来说是鸭疫里默氏菌预防最好的选择，但目前国内多是自家场疫苗(即自己小量生产，自己使用)，鸭疫里默氏菌灭活苗的配方和乳化生产工艺没有正规的程序，但灭活疫苗的配方和乳化过程对疫苗质量十分重要，它不仅对接种动物的安全有影响，对疫苗的质量也有直接的影响，是鸭疫里氏杆菌灭活疫苗生产的基础和关键之一，目前未有用于工厂化大规模发酵生产鸭疫里氏杆菌灭活疫苗的配方和乳化工艺的效果报道。。

发明内容

本发明目的在于提供一种鸭传染性浆膜炎灭活疫苗乳化方法。

本发明采用如下技术方案：

一种鸭传染性浆膜炎灭活疫苗乳化方法，包括以下步骤：水相制备：4份吐温-80装入瓶中灭菌，冷却后加入96份菌液，充分振摇，至吐温-80完全溶解为止；

油相制备：93份注射用白油、5份司本-80、2份硬脂酸铝，配油相时，先取少量注射用白油与硬脂酸铝混合，加热溶化，再与全量司本-80及注射用白油混合均匀，搅拌至透明为止，116℃灭菌30分钟，备用；

将水相和油相按1∶1.5-1∶3的比例进行乳化，乳化转速3200-4800r/min，乳化时间8-12分钟。

所述的鸭传染性浆膜炎灭活疫苗乳化方法，乳化时间为9～10分钟。

所述的鸭传染性浆膜炎灭活疫苗乳化方法，水相和油相混合比例为1∶2。

所述的鸭传染性浆膜炎灭活疫苗乳化方法，乳化转速为4000r/min。

采用本发明的乳化方法制备鸭传染性浆膜炎灭活疫苗为油包水型(W/O)，用清洁吸管吸取少量疫苗滴于冷水中，呈油滴状不扩散，剂型合格率提高；疫苗在37℃左右条件下放置21日，或取疫苗10ml装于离心管中以3000rpm/min离心15分钟，均不出现分层，稳定性好；用1.00ml吸管(出口内径1.2mm)，吸取25℃左右的疫苗1.00ml，令其垂直自然流出，流出0.4ml所需的时间均在8秒之内，粘度合格率高；外观为白色乳状液，色泽均匀，符合要求。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

实施例1

1％裂解血球全血N-J合成培养基制备：

配置100ml的1％裂解血球全血N-J合成培养基：胰蛋白胨：1.9g；酵母提取物：0.7g；牛肉浸膏：0.7g；水解乳蛋白：0.7g；葡萄糖：0.4g；NaCl：0.5g；磷酸二氢钾：0.3g；磷酸氢二钾：0.3g；Na₂HPO₄·12H₂O：0.9g；(NH₄)₂SO₄：0.2g；NH₄Cl：0.03g；水加至100mL；将上述各组分121℃灭菌15分钟，待灭菌成分冷却至低于40℃时，然后向上述基础培养基中加入添加物裂解血球全血1ml；摇匀后即得成品N-J合成培养基。

所述添加物裂解血球全血为采用颈静脉采血或颈动脉放血的方法无菌采取非疫区健壮牛血并无菌脱纤，于-20℃和室温冻融，反复冻融3次后，保存于-20℃备用或采血并无菌脱纤后直接保存于-20℃，使用前取出反复冻融3次制得。

实施例2

鸭传染性浆膜炎灭活疫苗制苗菌液的制备：

1菌种血清I型鸭疫里默氏杆菌RA-CH-I株。

2培养基 1％裂解血球全血N-J合成培养基、10％血清营养琼脂平板、裂解全血及检验用培养基均严格按《中国兽药典》附录进行生产和检验合格后备用。

3方法

3.1一级种子的繁殖与鉴定

将冻干的血清I型鸭疫里默氏杆菌RA-CH-I株基础菌种接入5ml含10％犊牛血清的营养肉汤中，37℃培养24小时；然后划线接种在2个含10％犊牛血清营养琼脂平板上，按标准【表面光滑、稍突起、圆形、呈奶油状的菌落，菌落直径1.2～1.7mm；菌涂片可见到菌体呈单个(偶见成对或呈丝状)，大小为0.2～0.4×15μm。】选典型菌落接种含10％犊牛血清营养琼脂斜面5支，置37℃，5-10％CO₂(或者烛缸)环境下培养24小时，保存于4℃冰箱中(不超过7日)作为一级种子。

3.2二级种子繁殖

取一级种子3支，每支用2-3ml营养肉汤洗下，合并接种于350ml含10％犊牛血清的营养肉汤，置37℃培养24小时，取样作纯粹检验合格后，保存于4℃冰箱中(不超过5日)作为一级种子。

3.3制苗用菌液培养

采用培养罐培养，在20L发酵罐中装入15L的N-J合成培养基及适量消沫剂，灭菌后按培养基量的2％接种二级种子液300ml，同时按1％比例加入裂解血球全血150ml，于37℃培养24小时。

3.4纯粹检验

菌液培养完成后，取样用10％犊牛血清营养琼脂平板作纯粹检验，应纯粹。

3.5菌数测定

将菌液定量取样离心后，用生理盐水连续离心洗涤3次并作适当稀释，于紫外分光光度计下测定560nm处OD值，根据公式：含菌总数(CFU/ml)＝OD_560nm值×稀释倍数×2×10⁹CFU/ml计算出菌液含菌量，每1.00ml含活菌不低于3.00×10¹⁰CFU，计数结果作为配苗时参考。

4结果

取发酵菌液1ml，以3000～5000转/分钟离心5-10分钟后，用生理盐水连续离心(3000～5000转/分钟，5-10分钟)洗涤3次；用生理盐水50ml溶解和稀释沉淀(即50倍稀释)；于紫外分光光度计下测定560nm处OD值(用生理盐水调0)，测得OD_560nm为0.589；根据公式：含菌总数(CFU/ml)＝OD_560nm值×稀释倍数×2×10⁹CFU/ml＝0.589×50×2×10⁹CFU/ml＝5.89×10¹⁰CFU/ml。

即每毫升该发酵液中鸭疫里默氏杆菌的含菌数为589亿个。

根据该计数结果，发酵液即可用于鸭传染性浆膜炎灭活疫苗制苗用的菌液，经灭活、乳化等最后制成鸭传染性浆膜炎灭活疫苗。

实施例3

最佳乳化条件的筛选：

材料：

1.1菌液鸭疫里默氏杆菌RA-CH-I株制苗用菌液。

1.2注射用白油购自杭州炼油厂。

1.3司本-80 购自成都东金化学试剂厂。

1.4硬脂酸铝购自上海远航化学试剂厂。

1.5吐温-80 购自成都东金化学试剂厂。

1.5甲醛溶液 AR、购自于成都鸿鹤试剂厂。

2试验方法：

2.1水相制备 4份吐温-80装入瓶中灭菌，冷却后加入96份菌液，充分振摇，至吐温-80完全溶解为止。

2.2油相制备 93份注射用白油、5份司本-80、2份硬脂酸铝，配油相时，先取少量注射用白油与硬脂酸铝混合，加热溶化，再与全量司本-80及注射用白油混合均匀，搅拌至透明为止，116℃灭菌30分钟，备用。

2.3将培养的菌液分成4组，水相和油相比例分别按1∶1.5、1∶2、1∶3的比例进行乳化，在8分钟、9分钟、10分钟、11分钟、12分钟进行抽样检验乳化效果。同时对3批次实验室培养菌液进行乳化试验。

2.4对3批实验室培养菌液乳化时间按9～10分钟，乳化水油相比例设定为1∶2，分别按3200r/min、3600r/min、4000r/min、4400r/min、4800r/min的转速进行乳化，并抽样作检验。

3结果评估

3.1结果判定结合各条件下乳化效果进行判定。

①外观：应为均匀的白色乳状液。

②剂型：为油包水型(W/O)。用清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，应呈油滴状不扩散。

③稳定性：疫苗在37℃左右条件下放置21日，或取疫苗10ml装于离心管中以3000rpm/min离心15分钟，应不出现分层。

④粘度：用1.00ml吸管(出口内径1.2mm)，吸取25℃左右的疫苗1.00ml，令其垂直自然流出，记录流出0.4ml所需的时间。应在8秒之内为合格。

3.2试验的有效性本实验使用的理论和技术成熟，结果判定指标客观，整个实验的各个环节严格操作、正确评估实验结果，结果如有疑议至少重复操作2次。每次试验培养规模及条件设置稳定，由此认为本实验结果有效。

4结果

4.1乳化时间和乳化水油相比例结果见表1

表1乳化时间和乳化水油相比例优化结果

注：第一个“+”表示外观合格，“-”表示不合格；第二个“+”表示剂型合格，“-”表示不合格；第三个“+”表示稳定性合格，“-”表示不合格；第四个“+”表示粘度合格，“-”表示不合格。

根据上表结果可以看出，不同乳化时间、不同水油相比例对疫苗的乳化效果影响较大。

4.2乳化转速结果见表2

表2不同转速下乳化效果结果

由上表可看出，不同转速对疫苗乳化效果影响较大。

5结论

5.1根据本试验研究结果表明：鸭传染性浆膜炎灭活疫苗的乳化时间为9～10分钟，水相和油相混合比例为1∶2。

5.2鸭传染性浆膜炎灭活疫苗的乳化转速为4000r/min。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims

1.一种鸭传染性浆膜炎灭活疫苗乳化方法，其特征在于，包括以下步骤：水相制备：4份吐温-80装入瓶中灭菌，冷却后加入96份菌液，充分振摇，至吐温-80完全溶解为止；

油相制备：93份注射用白油，5份司本-80，2份硬脂酸铝，配油相时，先取少量注射用白油与硬脂酸铝混合，加热溶化，再与全量司本-80及注射用白油混合均匀，搅拌至透明为止，116℃灭菌30分钟，备用；

将水相和油相按1∶2的比例进行乳化，乳化转速3200-4800r/min，乳化时间8-12分钟。

2.根据权利要求1所述的鸭传染性浆膜炎灭活疫苗乳化方法，其特征在于，乳化时间为9～10分钟。

3.根据权利要求1所述的鸭传染性浆膜炎灭活疫苗乳化方法，其特征在于，乳化转速为4000r/min。