CN102499982B

CN102499982B - 副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗的生产方法

Info

Publication number: CN102499982B
Application number: CN 201110431884
Authority: CN
Inventors: 郭莉莉; 程增青; 马爽; 周旭斌; 申洪银; 冯阳; 李金积; 王福军; 刘晓东; 王宗升
Original assignee: Qingdao Yebio Bioengineering Co Ltd
Current assignee: Qingdao Yebio Bioengineering Co Ltd
Priority date: 2011-12-21
Filing date: 2011-12-21
Publication date: 2013-07-17
Anticipated expiration: 2031-12-21
Also published as: CN102499982A

Abstract

本发明涉及副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗的生产方法。本发明从优势流行菌株中筛选出免疫原性良好的副猪嗜血杆菌4型YBH04株、5型YBH05株和13型YBH13株作为疫苗制备菌株，分别接种于适宜培养基培养，收获菌液，经甲醛溶液灭活后，加入矿物油佐剂混合乳化制成；用于预防由4、5和13型副猪嗜血杆菌引起的猪副嗜血杆菌病；此疫苗具有安全性好、免疫效力高且免疫期长等优点。

Description

副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗的生产方法

技术领域

本发明涉及一种副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗的生产方法，属于兽用生物制品领域。

背景技术

猪副嗜血杆菌病，又称革拉泽氏病(Glasser′s disease)，是由副猪嗜血杆菌引起的一种以呼吸道症状、跛行、胸膜炎、心包炎、腹膜炎、关节炎和脑膜炎等为特征的猪呼吸道传染病。随着养猪业的发展，猪副嗜血杆菌病已成为近年来严重危害养猪业的新发细菌性传染病，呈世界性分布，并已证实在我国绝大多数猪场存在和流行，可影响2周龄到4月龄的猪，但主要在断奶前后和仔猪阶段发病，常见于5-8周龄的猪，发病率一般为10-15％，严重时死亡率可达50％以上，给我养猪业造成巨大的损失。(蔡旭旺，陈焕春，刘正飞，吴斌，金梅林，Blackall P J.副猪嗜血杆菌的分离培养和血清型鉴定.华中农业大学学报，2005，24：55-58；Oliveira S&Pijoan(2004)Haemophilus parasuis：new trends on diagnosis，epidemiology andcontrol.Vet Microbiol 99：1-12.)

传统的血清分型方法是根据热稳定性可溶性抗原和琼脂扩散试验(AGPT)，已有15种血清型得到证实，而且还有一定数量不能分型的副猪嗜血杆菌(Kielstein P&Rapp-GabrielsonVJ.Designation of 15serovars of Haemophilus parasuis on the basis of immunodiffusion usingheat-stable antigen extracts.J Clin Microbiol.1992，30：862～865)。目前已经发现并证实的副猪嗜血杆菌的毒力因子及其潜在的毒力因子有：荚膜、菌毛、外膜蛋白、脂多糖、转铁蛋白、神经氨酸酶等(李静怡，张建民，徐成刚，郭莉莉，陈济铛，廖明.副猪嗜血杆菌主要毒力因子及致病机理研究进展冲国畜牧兽医，2010年第37卷第12期)。副猪嗜血杆菌血清型众多以及很大比例的不能分型的菌株，具有明显的地方性特征，菌株毒力及致病性之间具有明显的差异性，血清型间交叉保护性极差或缺少，因此研制与当地相关型的、具有高效交叉保护力的疫苗是预防和控制副猪嗜血杆菌病的必然要求(Baumann G，Bilkei G.Effect of vaccinatingsows and their piglets on the development ofdisease induced by a virulent strain ofHaemophilus parasuis serovar 5.Vet.Rec.2002，151：18-21)。

发明内容

本发明的目的是采用免疫原性良好的副猪嗜血杆菌4型YBH04株、5型YBH05株和13型YBH13株分别接种于适宜培养基培养，收获培养物，经甲醛溶液灭活，加入矿物油佐剂混合乳化制成。用于预防由4、5和13型副猪嗜血杆菌引起的猪副嗜血杆菌病。

一、生产用毒株

1.菌株来源

用于制造疫苗的副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)菌株为YBH04、YBH05和YBH13株，由青岛易邦生物工程有限公司分离、鉴定。国内分离株4型YBH04株(2009年从山东省某猪场病死猪的关节液中分离)和5型YBH05株(2008年从山东省平度某猪场病死猪的关节液中分离)，13型YBH13株(2009年从山东省济南某猪场病死猪的心脏中分离)。以上3个菌株已于2011年11月23日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号：YBH04株为CGMCC No.5479、YBH05为CGMCC No.5480和YBH13株为CGMCC No.5501。

2.菌株特点

(1)形态及生化特性副猪嗜血杆菌菌株YBH04、YBH05和YBH13株菌均为革兰氏阴性，细小杆菌，具有多种不同的形态，从单个的球杆菌到长的、细长的、以致丝状的菌体。

无溶血现象、脲酶试验阴性，氧化酶试验阴性，接触酶试验阳性，硝酸盐还原试验阳性，吲哚试验阴性并发酵葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、核糖和麦芽糖等碳水化合物。

(2)培养特性副猪嗜血杆菌YBH04、YBH05和YBH13株菌生长均需要V因子，不需要X因子，在普通培养基上不生长。接种在胰蛋白胨大豆琼脂(Tryptic Soy Agar，TSA)培养基上培养(其配制方法为：取胰蛋白大豆琼脂40g，加入去离子水，定容至1000mL，充分摇匀溶解，121℃高压蒸汽灭菌15min，加入50ml过滤除菌的牛血清、10ml过滤除菌的0.01％NAD。)；并将培养基置于5％～10％CO₂条件下37℃培养24～48h，可形成直径为1～2mm的圆形、光滑湿润、无色透明菌落。

(3)血清型应用琼脂扩散试验进行血清型鉴定，副猪嗜血杆菌YBH04、YBH05和YBH13株菌分别为HPS4、5和13型。

(4)菌株毒力用副猪嗜血杆菌8～10h TSB肉汤培养物腹腔注射9～10周龄健康易感仔猪，能使攻毒仔猪死亡的各菌株的最小攻毒量分别是YBH04株约为7×10⁹CFU/头，YBH05株约为9×10⁹CFU/头和YBH13株约为7×10⁹CFU/头。

(5)免疫原性用副猪嗜血杆菌YBH04、YBH05和YBH13株菌制备的不同含菌量的单价油乳剂灭活疫苗，分别颈部肌肉注射4～5周龄健康仔猪，2ml/头，免疫后4周连同对照组一起进行攻毒保护试验。结果表明，副猪嗜血杆菌YBH04、YBH05和YBH13株菌制备的含菌量为2×10⁹CFU/ml单价灭活疫苗免疫的仔猪攻毒保护率均达4/5～5/5。

二、副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗的生产方法，主要是：

1.采用发酵罐分别培养副猪嗜血杆菌4、5和13型菌液。按发酵罐容积的70％加入生产用的半合成培养基(其配制方法为：取胰蛋白大豆肉汤(Tryptic Soy Broth，TSB)30g溶于去离子水，定容至1000mL，充分摇匀溶解后121℃高压蒸汽灭菌15min，加入50ml过滤除菌的牛血清、10ml过滤除菌的0.01％NAD)，同时加入消泡剂(泡敌)进行消毒，待其温度降至37～38℃时，将2～8℃保存的二级种子液(单型)分别按2％～2.5％加入到发酵罐内。调节培养温度37～38℃、搅拌转速200r/min、pH7.2、罐压0.03～0.05Mpa之间、溶氧量40％，培养时间9～10小时收获各型菌液，按菌液体积的0.3％加入甲醛溶液，37℃搅拌灭活24h，取样进行灭活检验后，置2～8℃保存。

2.根据活菌计数结果，将灭活的副猪嗜血杆菌4、5、13型菌液均稀释成≥12×10⁹CFU/ml后等量混合。

3.按常规方法制备成油乳剂灭活疫苗。

本发明的详细描述

一、疫苗制备

1.生产用种子制备

(1)一级种子繁殖与鉴定将YBH04、YBH05、YBH13株冻干菌种划线接种于TSA琼脂平板上，在5％～10％CO₂条件下，37℃培养24～48h，挑取典型菌落，接种于TSB肉汤培养基上，置37℃振荡培养24～48h，经纯粹检验合格后，作为一级种子。在-20℃下保存，不超过1个月；-70℃下保存，不超过3个月。

(2)二级种子繁殖取一级种子，划线接种于TSA琼脂平板，在含5％～10％CO₂条件下，37℃培养24～48h，挑选典型菌落或菌苔，接种于TSB肉汤培养基上，置37℃振荡培养24～48h，经纯粹检验合格后，即为二级种子。在2～8℃保存，应不超过24h。

2.菌液培养采用发酵罐分别培养副猪嗜血杆菌4、5、13型菌液。按发酵罐容积的60％～70％加入生产用的半合成培养基，同时加入消泡剂(泡敌)进行消毒，待其温度降至37～38℃时，将2～8℃保存的二级种子液(单型)按2％～2.5％加入到发酵罐内。培养温度控制在37～38℃、搅拌转速100～200r/min、pH7.2、罐压0.03～0.05Pa、溶氧量40％，培养9～10h，收获菌液，按菌液体积的0.3％加入甲醛溶液，37℃搅拌灭活24h，取样进行灭活检验后，置2～8℃保存。

3.活菌计数取培养9～10h的菌液1ml，按(中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二五年版(三部).中国农业出版社，2006，本发明简称《中国兽药典》)附录方法进行活菌计数，根据计数结果将各型活菌含量浓缩成均应不低于12×10⁹CFU/ml。

4.灭活按菌液体积的0.3％加入甲醛溶液，37℃搅拌灭活24h，取样进行灭活检验，灭活后的菌液置2～8℃保存，应不超过7日。

5.疫苗制备

(1)水相配制取灭菌的吐温-80 4份、无菌检验合格的菌液96份，导入配液罐中，开启搅拌电机，匀速搅拌至吐温-80完全溶解。

(2)油相制备取注射用白油94份、司本-80 6份和硬脂酸铝1份加入油相制备罐中，开启搅拌电机，匀速搅拌，同时开启导热油开关，125℃加热30min，冷却后，导入贮油罐中备用。

(3)乳化取油相2份置于乳化罐内，开动电机低速搅拌，同时缓缓加入水相1份，再以4000r/min乳化30min。乳化后，取样10ml，以3000r/min离心15min，应不分层；若有分层现象，应重新乳化1次。

(4)分装定量分装，加盖密封。

二、疫苗的安全试验

1.副猪嗜血杆菌疫苗对靶动物和非使用日龄动物的一次单剂量接种的安全性试验

用本发明人按本法试制的副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗01批分别对4～5周龄仔猪、产前15天怀孕母猪(均购自山东青岛平度市某良种猪场)各5头进行颈部肌肉注射，2ml/头，另设生理盐水免疫对照组。以观察试验猪接种疫苗后2周内，试验猪有无过敏，精神、饮食有无异常，注射部位有无红肿现象，仔猪增重或母猪产子情况是否正常。结果仔猪精神良好，产前15天怀孕母猪接种后注射部位均未出现红肿现象，精神、采食均正常，所产仔猪均正常；对照试验猪均正常。

表1对非使用日龄靶动物的一次接种安全性试验结果

2.副猪嗜血杆菌疫苗对靶动物一次超剂量接种的安全性试验

用本发明人试制的3批(01、02和03)副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗分别对4～5周龄健康易感仔猪，产前1个月怀孕母猪以及种公猪各5头分别颈部肌肉注射，4ml/头，观察试验猪接种疫苗后的安全性。结果表明，4～5周龄仔猪和种公猪接种后注射部位均未出现红肿反应，精神、采食以及种公猪配种性能均正常；产前1个月怀孕母猪接种后均未出现任何不良反应，所产仔猪均正常，与对照猪无明显差异。说明我们试制的疫苗一次超剂量接种怀孕母猪是安全的。详见表2。

表2副猪嗜血杆菌疫苗超剂量接种的安全性试验

3.单剂量重复接种安全试验

用本发明人试制的01批副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗对4～5周龄健康易感仔猪、产前1个月的怀孕母猪及种公猪进行疫苗接种，14天后重复接种一次，观察疫苗单剂量重复接种对接种猪的安全性。结果表明，该疫苗对接种猪无不良影响，无过敏现象，接种部位无红肿等不良反应，接种猪的精神、采食量均正常，仔猪增重、母猪及种公猪的生产性能与对照猪无明显差异。证明我们试制的疫苗单剂量重复接种是安全的。详见表3、表4、表5。

表3试验仔猪单剂量重复安全性试验结果

表4产前1个月怀孕母猪单剂量重复接种安全性试验结果

表5种公猪单剂量重复接种安全性试验结果

4.疫苗接种对靶动物免疫学功能的影响

用本发明人试制的01批猪副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗对4～5周龄健康易感仔猪进行接种，同时注射猪瘟活疫苗(兔源)、伪狂犬活疫苗，均由青岛易邦生物工程有限公司制备。接种4周后所有试验猪采血分离血清测定猪瘟间接血凝效价，HPS4、5、13型间接血凝抗体效价及伪狂犬的ELISA抗体效价，观察疫苗接种对接种仔猪免疫学功能的影响。结果表明，疫苗对靶动物免疫学功能无明显影响。试验结果表明该疫苗对靶动物的免疫学功能没有明显影响。详见表6。

表6疫苗接种对仔猪免疫学功能的影响结果记录表

注：-表示抗体为阴性 ^*表示伪狂犬病的ELISA检测结果S/N≤0.5者为阳性，S/N＞0.6者为阴性/表示未进行试验

三、疫苗间接血凝抗体效价和攻毒保护相关试验

用本发明人试制的01批副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗，按不同剂量(0.25ml/头、0.5ml/头、1.0ml/头)颈部肌肉注射4～5周龄健康易感仔猪。免疫后4周，采血并分离血清，用间接血凝试验方法检测4、5、13型抗体效价，根据间接血凝抗体效价重新编号分组，连同非免疫对照组用副猪嗜血杆菌4型(HS79)、5型(HS80)、13型(HS1079)国际参考株攻毒(攻毒菌株副猪嗜血杆菌HS79株(4型)、HS80株(5型)、HS1079株(13型)均购自中国兽医药品监察所)，每头腹腔注射3ml，攻毒菌液活菌含量分别为HPS5型约为9×10⁹CFU/头、HPS4型和HPS13型均约为7×10⁹CFU/头。观察14天，记录试验猪发病情况；观察不同免疫剂量的抗体水平与攻毒保护之间的关系。试验结果表明，间接血凝抗体效价与攻毒保护率呈正相关。间接血凝抗体效价≤1∶8时，攻毒保护率为≤2/5；间接血凝抗体效价≥1∶32时，攻毒保护率为4/5～5/5。详见表7、表8。

表7免疫猪的间接血凝抗体效价

注：“-”表示抗体为阴性

表8间接血凝抗体与攻毒保护关系试验结果

注：分子指保护仔猪数，分母指攻毒仔猪总数。“-”表示抗体为阴性。

四、抗体消长规律、免疫持续期及仔猪母源抗体持续期试验

用本发明人制备3批副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗(批号分别为01、02、03批)，分别免疫4～5周龄健康易感仔猪各15头、种公猪和产前1月龄怀孕母猪各15头，2ml/头，颈部肌肉注射。仔猪于免后第2、4、6、8周、4个月、6个月、7个月随机抽样5头；种公猪和母猪于免疫后1、3、6、7个月，分别采血用间接血凝试验测定其抗体效价，观察抗体水平的消长规律；免疫母猪产仔后，随机抽取1、3、5、6周龄仔猪各5头采血并分离血清，检测仔猪血清中4、5、13型抗体效价，同时分别用副猪嗜血杆菌4、5、13型攻毒菌株对1、3、4、5周龄仔猪进行攻毒试验，根据试验结果确定仔猪通过母源抗体获得的被动免疫持续时间。以≥1∶32抗体水平的持续时间为免疫持续期。结果表明对4～5周龄仔猪进行免疫，免疫持续期为6个月；怀孕母猪在产仔前1个月进行免疫，2ml/头，所产仔猪的免疫持续期维持至第5周，种公猪免疫持续期为6个月。详见表9、表10、表11、表12。

表9仔猪免疫后间接血凝抗体消长规律的测定

注：-表示抗体为阴性

表10种公猪、产前1个月怀孕母猪免疫后间接血凝抗体消长规律的测定

表11仔猪母源抗体消长规律测定结果

试验猪日龄	HPS 4犁	HPS 5犁	HPS 13犁
				1周龄仔猪	≥1∶32	≥1∶32	≥1∶32
3周龄仔猪	≥1∶32	≥1∶32	≥1∶32
				4周龄仔猪	≥1∶32	≥1∶32	≥1∶32
5周龄仔猪	≤1∶8	≤1∶8	≤1∶8
				非免疫对照组	-	-	-

注：-表示抗体为阴性

表12被动免疫仔猪攻毒保护试验结果

注：分子表示保护仔猪头数，分母表示攻毒仔猪总数。

五、疫苗成品检验

(1)性状

外观乳白色乳液。

剂型油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水表面，除第一滴外，均应呈油滴状不扩散。

稳定性吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15min，管底析出的水相应≤0.5ml。

粘度用1ml吸管(下口内径为1.2mm，上口内径为2.7mm)吸取25℃左右疫苗1.0ml，令其垂直自然流出，记录流出0.4ml所需的时间，应在6s以内。

(2)无菌检验按《中国兽药典》方法进行，应无菌生长。

(3)安全检验取4～5周龄健康易感仔猪5头，颈部肌肉注射疫苗，4ml/头，观察14日，应无异常反应。

(4)效力检验先采用血清学方法检验，当血清学方法检验不合格时，采用免疫攻毒法进行检验。

血清学方法取4～5周龄健康易感仔猪10头，其中5头颈部肌肉注射疫苗，2ml/头，剩余5头作非免疫对照。免后4周，所有试验猪采血分离血清，用间接血凝试验检测HPS4、5和13型抗体效价。免疫组试验猪血清中4、5和13型抗体均应为阳性，且至少有4头均不小于1∶32，对照组猪血清4、5和13型抗体均应为阴性。

免疫攻毒法取4～5周龄健康易感仔猪30头，随机分为A、B、C、D、E和F 6组，每组5头，其中A、B和C组为免疫组，均颈部肌肉注射疫苗，2ml/头，D、E、F组为非免疫对照组。免疫后4周进行攻毒，A和D组试验猪用副猪嗜血杆菌HS79株(4型)的8～10hTSB肉汤培养物腹腔注射攻毒，2ml/头(活菌含量约为7×10⁹CFU/头)；B和E组试验猪用副猪嗜血杆菌HS80株(5型)的TSB肉汤培养物腹腔注射攻毒，2ml/头(活菌含量约为9×10⁹CFU/头)；C和F组试验猪用副猪嗜血杆菌HS1079株(13型)8～10h TSB肉汤培养物腹腔注射攻毒，2ml/头(活菌含量约为7×10⁹CFU/头)，观察14日，各对照组仔猪应全部发病，各免疫组仔猪应至少保护4头。

(5)汞类防腐剂含量测定按《中国兽药典》方法进行，应符合兽用生物制品通则的规定。

六、疫苗的作用与用途

用于预防由4、5和13型副猪嗜血杆菌引起的副猪嗜血杆菌病。免疫期为6个月。

七、用法与用量

颈部肌肉注射，妊娠母猪产前一个月进行首免，3周后二免，2ml/头；仔猪2周龄首免，3周后二免，2ml/头；种公猪每6个月免疫一次，2ml/头/次。

本发明所涉及微生物：

本发明涉及副猪嗜血杆菌菌株YBH04、YBH05和YBH13株菌，以上3个菌株已于2011年11月23日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号分别为：CGMCC No.5479、CGMCC No.5480和CGMCC No.5501。

本发明的积极意义：

本发明从优势流行菌株中筛选出免疫原性良好的副猪嗜血杆菌4型YBH04株、5型YBH05株和13型YBH13株作为疫苗制备菌株，分别接种于TSB营养肉汤培养基上培养，收获培养物，经甲醛溶液灭活，加入矿物油佐剂混合乳化制成；用于预防由4、5和13型副猪嗜血杆菌引起的猪副嗜血杆菌病；此疫苗具有安全性好、免疫效力高且免疫期长等优点。

实施例

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的保护范围。

实施例1

1.生产用种子制备

(1)一级种子繁殖与鉴定将YBH04、YBH05、YBH13株冻干菌种划线接种于TSA琼脂平板上，在5％～10％CO₂条件下，37℃培养24～48h，各挑取典型菌落或菌苔，接种于100mlTSB肉汤，置37℃振荡培养24～48h。各取2ml菌液经纯粹检验合格后，作为一级种子。在-20℃下保存，不超过1个月；-70℃下保存，不超过3个月(参见表13)。

表13一级种子

菌株号	种子数量(ml)	使用培养基	菌落生长情况
				HPS YBH04株	100	TSA	圆形、光滑湿润、无色透明菌落
HPS YBH05株	100	TSA	圆形、光滑湿润、无色透明菌落
				HPS YBH13株	100	TSA	圆形、光滑湿润、无色透明菌落

(2)二级种子繁殖取YBH04、YBH05、YBH13菌株一级种子，划线接种TSA琼脂平板，在含5％～10％CO₂条件下，37℃培养24～48h；各挑选典型菌落或菌苔，接种于800mlTSB肉汤中，置37℃振荡培养24～48h，各取2ml菌液经纯粹检验合格后，即为二级种子。在2～8℃保存，应不超过24h(参见表14)。

表14二级种子

菌株号	种子数量(ml)	使用培养基	菌落生长情况
				HPS YBH04株	800	TSA	圆形、光滑湿润、无色透明菌落
HPS YBH05株	800	TSA	圆形、光滑湿润、无色透明菌落
				HPS YBH13株	800	TSA	圆形、光滑湿润、无色透明菌落

2.菌液培养采用发酵罐分别培养4、5、13型菌液。按发酵罐容积的60％～70％加入生产用的半合成培养基20000ml，同时加入消泡剂(泡敌)进行消毒，待其温度降至37～38℃时，将2～8℃保存的二级种子液(单型)按2％～2.5％各400ml加入到发酵罐内。培养温度控制在37～38℃、搅拌转速100～200r/min、pH7.2～7.4、罐压0.03～0.05Pa、溶氧量40％，培养9～10h，收获菌液22400，按菌液体积的0.3％加入甲醛溶液672ml，37℃搅拌灭活24h，取样进行灭活检验，灭活后的菌液置2～8℃保存。(参见表15)。

表15副猪嗜血杆菌YBH04、YBH05和YBH13株菌数测定结果

4.疫苗配制(参见表16)

(1)水相配制取灭菌的吐温-80 4份、无菌检验合格的菌液96份，导入配液罐中，开启搅拌电机，匀速搅拌至吐温-80完全溶解。水相总量为9000ml。

(2)油相制备取注射用白油94份、司本-80 6份和硬脂酸铝1份加入油相制备罐中，开启搅拌电机，匀速搅拌，同时开启导热油开关，125℃加热30min，冷却后，导入贮油罐中备用。油相总量为18000ml。

(3)乳化取18000ml油相份置于乳化罐内，开动电机低速搅拌，同时缓缓加入9000ml水相，再以4000r/min乳化30min。乳化完成后，取样20ml，以3000r/min离心15min，应不分层；若有分层现象，应重新乳化1次。

(4)分装定量分装，加盖密封。

表16疫苗乳化和分装

实施例2

疫苗成品检验

(1)性状

外观乳白色乳液。

剂型油包水型。取一清洁吸管，吸取2ml疫苗滴于冷水表面呈油滴状不扩散。

稳定性吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15min，不分层。

粘度用1ml吸管(下口内径为1.2mm，上口内径为2.7mm)吸取25℃左右疫苗1.0ml，令其垂直自然流出，记录流出0.4ml所需的时间为4.9秒。

(2)无菌检验按《中国兽药典》方法进行，无菌生长。

(3)安全检验取4～5周龄健康易感仔猪5头，颈部肌肉注射疫苗，4ml/头，观察14日，均无异常反应。

(4)效力检验

血清学方法取4～5周龄健康易感仔猪10头，其中5头颈部肌肉注射疫苗，2ml/头，剩余5头作非免疫对照。免后4周，所有试验猪采血分离血清，用间接血凝方法检测HPS4、5和13型抗体效价。免疫组试验猪血清中HPS4、5和13型抗体均为大于等于1∶32，对照组猪血清HPS4、5和13型抗体均为阴性(见表17)。

表17免疫猪的间接血凝抗体效价

注：“-”表示抗体为阴性。

免疫攻毒法取4～5周龄健康易感仔猪30头，随机分为A、B、C、D、E和F 6组，每组5头，其中A、B和C组为免疫组，均颈部肌肉注射疫苗，2ml/头，D、E和F组为非免疫对照组。免疫后4周进行攻毒，A和D组试验猪用副猪嗜血杆菌HS79株(4型)的8～10hTSB肉汤培养物腹腔注射攻毒，2ml/头(活菌含量约为7×10⁹CFU/头)；B和E组试验猪用副猪嗜血杆菌HS80株(5型)的TSB肉汤培养物腹腔注射攻毒，2ml/头(活菌含量约为9×10⁹CFU/头)；C和F组试验猪用副猪嗜血杆菌HS1079株(13型)8～10h TSB肉汤培养物腹腔注射攻毒，2ml/头(活菌含量约为7×10⁹CFU/头)。观察14日，各对照组仔猪均5/5发病，各免疫组仔猪保护率均为4/5。

表18免疫攻毒保护试验结果

注：分子指保护仔猪数，分母指攻毒仔猪总数。

(5)汞类防腐剂含量测定按《中国兽药典》方法进行，硫柳汞含量为0.009％，符合规定。

Claims

1.一种副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗的生产方法，其特征在于：

（1）菌液培养与灭活采用发酵罐分别培养4、5、13型副猪嗜血杆菌CGMCCNo.5479、CGMCCNo.5480和CGMCCNo.5501的菌液，以上3个菌株已于2011年11月23日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号分别为：CGMCCNo.5479、CGMCCNo.5480和CGMCCNo.5501：按发酵罐容积的70％加入生产用的半合成培养基，同时加入消泡剂进行消毒，待其温度降至37～38℃时，按培养基总量的2％～2.5％将种子液分别加到发酵罐内，培养温度37～38℃、搅拌转速200r/min、pH7.2、罐压0.03～0.05Mpa之间、溶氧量40％，培养时间9～10小时收获菌液，按菌液体积的0.3％加入甲醛溶液，37℃搅拌灭活24h，取样进行灭活检验后，置2～8℃保存；

（2）水相制备根据活菌计数结果，将灭活的4、5、13型副猪嗜血杆菌菌液均稀释成≥12×10⁹CFU/ml后等量混合；

（3）疫苗制备按常规方法制备成矿物油佐剂灭活疫苗。

2.按照权利要求1所述的一种副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗的生产方法，其特征是其中所使用半合成培养基是：胰蛋白胨大豆肉汤培养基30g，加入去离子水，定容至1000mL，充分摇匀溶解，调pH至7.2～7.4，121℃高压蒸汽灭菌15min，待冷至55℃左右，按无菌要求加入50mL过滤除菌的牛血清、10mL过滤除菌的0.02%NAD。