CN112870342A - 一种副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗的制备方法。本发明从优势流行菌株中筛选出免疫原性良好的副猪嗜血杆菌4型H25株、5型H45株、12型H31株作为疫苗制备菌株，分别划线接种于TSA固体培养基，TSB培养基上培养，再放大到改进后的发酵罐上培养，收获培养物，经甲醛溶液灭活后，离心浓缩，再加入佐剂混合乳化制成副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗，该疫苗用于预防由4、5、12型副猪嗜血杆菌引起的猪副嗜血杆菌病，具有安全性好、免疫效力高且免疫期长等优点。

Description

一种副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗的制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗的制备方法。
背景技术
副猪嗜血杆菌病是1906年德国科学家格拉泽发现的，故又称格拉泽氏病。副猪嗜血杆菌是猪上呼吸道的常在菌，在特定条件下如环境改变、其他细菌病毒感染的条件下能够侵入机体的多种组织系统中引起全身症状，临床上以“六炎四水”为病变特征，即胸膜炎、腹膜炎、关节炎、心包炎、肺炎、脑膜炎，胸腔、腹腔、关节、颅腔积液；临床表现为精神沉郁高热，食欲不振厌食消瘦，关节肿胀跛行，咳嗽呼吸困难，粘膜发绀等症状。该病呈世界性分布，已成为全球范围内危害养猪业的最主要细菌性传染病之一，并已证实在中国绝大多数猪场存在和流行。本病只感染猪，主要是断奶前后仔猪和保育猪，患猪或带菌猪通过空气、接触、消化道传播感染，可影响2周龄～4月龄猪，常见于5-8周龄猪，发病率一般为10％～15％，严重时死亡率可达50％以上。
目前国际认可的副嗜血杆菌有15个血清型，其中我国主要以4型和5型最为流行，其次流行血清型主要为12型、13型和14型。
目前我国副猪嗜血杆菌病商品化灭活疫苗是以血清型4型和5型制备的二价苗为主。虽然二价疫苗的应用对该病起到了一定的预防作用，但多种血清型感染已经使现有疫苗很难达到预期的免疫效果。
另一方面，现有疫苗制备方法中，存在以下问题：(1)在菌液发酵罐培养过程中，溶氧量需控制在50％～60％，在培养量为70％时，在生长高峰期耗氧量增大，容易导致溶氧量不足；(2)副猪嗜血杆菌抗原基本上是采用先浓缩再灭活的方式，浓缩过程容易散毒、菌液失活，且在生产过程中菌失活后容易裂解产生内毒素。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种发酵罐以及副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗的制备方法，该疫苗用于预防由4、5、12型副猪嗜血杆菌引起的猪副嗜血杆菌病，具有安全性好、免疫效力高且免疫期长的优点。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
本发明首先提供一种发酵罐，包括罐体，罐体的顶部设有罐口，罐体的顶部连接有进料管，罐体的底部连接有出料管，罐体的侧壁上设有加热夹套，加热夹套上设有进水口和出水口，所述的罐体顶部还设有补料口和进气口，罐体的下部设有取样口，所述罐体内设有搅拌轴和至少一个搅拌桨，所述搅拌轴一端与设置在罐体顶部的驱动电机连接，搅拌轴另一端与搅拌桨连接；所述发酵罐还包括环形通气装置和空气管道，所述空气管道通过从罐体顶部伸入罐体内的下部，空气管道的底部与环形通气装置一端连接，环形通气装置的环形面与罐体底部平行设置。
所述环形通气装置由不锈钢管成型。环形通气装置上间隔设有多个不同朝向的通气孔。
所述空气管道上设有流量控制器。所述搅拌桨的数量为四个，四个搅拌桨沿搅拌轴长度方向间隔设置。
所述罐体的下部还设有温度电极口、溶氧电极口和pH电极口。所述进料管、补料口和出料管上设有过滤网。
采用本发明发酵罐的副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：
S1：生产用种子的制备
分别将副猪嗜血杆菌4型H25株、5型H45株、12型H31株冻干菌种溶解，划线接种于TSA培养基，置37℃培养24～48小时，分别选取单个典型菌落划线接种于TSA培养基，37℃培养24～48小时；
用TSB培养基洗下固体培养基上的一级种子，接种于TSB液体培养基中，37℃振荡培养8～10小时，取样纯粹检验合格后，作为二级种子液；
S2：制苗用菌液的制备
S2-1：菌液培养
采用本发明发酵罐分别对4型H25株、5型H45株、12型H31株菌种的二级种子进行培养：按发酵罐容积的70～80％加入TSB培养基，同时加入0.01％～0.02％消泡剂，通入高压蒸汽进行灭菌，待温度降至37～38℃时，分别加入10％新生牛血清、10～20μg/mL NAD和2％～4％二级种子液进行发酵培养，培养温度为37℃、搅拌转速为100～150r/min，溶氧值控制在50％-60％，菌液培养8～10小时后，取样进行活菌计数和纯粹检验；
S2-2：活菌计数
4型H25株、5型H45株、12型H31株菌种的培养菌液活菌数均应大于等于6×109CFU/mL；
S2-3：灭活浓缩
在4型H25株、5型H45株、12型H31株菌种的培养菌液中分别计量加入终浓度为0.2～0.4％甲醛溶液，37℃搅拌灭活24～30小时，灭活结束后取样进行灭活检验，其余菌液置2～8℃保存；
分别将4型H25株、5型H45株、12型H31株灭活完成的菌液，导入柱式离心机离心，收获菌泥，将菌泥重悬于适量灭菌的生理盐水中，置于2～8℃保存，根据活菌计数结果，均稀释至1.8×1010CFU/mL，分别得到4型H25株、5型H45株、12型H31株灭活抗原；
S3半成品检验
S3-1纯粹检验
按现行《中国兽药典》附录进行检验；
S3-2灭活检验
灭活结束后，取2支10mL TSB液体培养基，各接种灭活菌液0.2毫升，37℃培养7天；其中，当培养液培养至24小时，分别取0.5ml培养液再移植接种于1支10mL TSB液体培养基，37℃培养24-48小时。观察结果，所有TSB培养基不变浑浊，则视为灭活检验合格。
S3-3毒素检验
各取4型H25株、5型H45株、12型H31株灭活菌液0.2ml，经静脉注射18～22g Balb/c小鼠5只，逐日观察3日，小鼠全部健活则视为毒素检验合格；
4)疫苗制备
将检验合格的4型H25株、5型H45株、12型H31株灭活抗原等比例混合后，在搅拌器中缓慢搅拌混匀，再缓慢加入GEL佐剂(9：1的比例)，搅拌5min～10min，直至完全混合均匀，再加入终浓度0.01％的硫柳汞钠溶液，乳化后即得到副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗，置于4℃保存；
此外，本发明乳化佐剂不限，可为油佐剂、铝胶佐剂、蜂胶佐剂、ISA201VG佐剂等，制备的疫苗可为油包水型疫苗、水包油型疫苗或水包油包水型疫苗；
5)分装
经无菌检验合格后，定量分装，加盖密封，并粘贴标签，置2～8℃保存。
本发明从优势流行菌株中筛选出免疫原性良好的副猪嗜血杆菌4型H25株、5型H45株、12型H31株作为疫苗制备菌株，分别划线接种于TSA固体培养基，TSB培养基上培养，再放大到改进后的发酵罐上培养，收获培养物，经甲醛溶液灭活后，离心浓缩，再加入GEL佐剂混合乳化制成三价疫苗，用于预防由4、5、12型副猪嗜血杆菌引起的猪副嗜血杆菌病，此疫苗具有安全性好、免疫效力高且免疫期长等优点。
本发明具有以下优点：
1、目前我国最为流行的副猪嗜血杆菌血清型是4型、5型、12型，但我国副猪嗜血杆菌病商品化疫苗是以血清型4型和5型制备的二价苗为主，本发明提供血清4型、5型、12型有较高的保护力，能够对仔猪产生较高的抗体，持续期长，能够抵抗同型野毒株的攻击，具有很好的免疫效力。
2、采用本发明的菌液发酵罐培养时，在发酵罐底部连接有通气装置，可以快速达到溶氧值。发酵罐设置深层通气装置，不仅降低了污染风险，提高了菌液活菌数，还缩短了培养时间，还可以适当增加培养量。
3、本发明采用先灭活后离心的方法，避免了在离心过程中菌液失活；培养后的三种菌液分别灭活，灭活后的菌液再进行离心，不仅减少散毒风险，还能去除灭活后抗原的甲醛。
4、本发明采用的是GEL佐剂，水包油剂型，更易注射，更易吸收，能够对仔猪产生较高的抗体，免疫保护力好。
附图说明
以下结合附图和具体实施方式对本发明做进一步详细说明；
图1为本发明发酵罐的结构示意图。
具体实施方式
如图1所示，本发明的发酵罐，包括罐体1，罐体1的顶部设有罐口2，罐体1的顶部连接有进料管3，罐体1的底部连接有出料管4，罐体1的侧壁上设有加热夹套5，加热夹套5上设有进水口6和出水口7，所述的罐体1顶部还设有补料口8和进气口20，罐体1的下部设有取样口10，所述罐体1内设有搅拌轴11和至少一个搅拌桨12，所述搅拌轴11一端与设置在罐体1顶部的驱动电机13连接，搅拌轴11另一端与搅拌桨12连接；所述发酵罐还包括环形通气装置14和空气管道15，所述空气管道15从罐体顶部伸入罐体1内的下部，空气管道15的底部与环形通气装置14一端连接，环形通气装置14的环形面与罐体1底部平行设置。
所述环形通气装置由不锈钢管成型，环形通气装置上间隔设有多个不同朝向的通气孔16。
所述空气管道上设有流量控制器17。
作为本发明的一种实施方式，搅拌桨12的数量为四个，四个搅拌桨12沿搅拌轴11长度方向间隔设置。
所述罐体1的下部还设有温度电极口18、溶氧电极口19和pH电极口9。
所述进料管3和出料管4上设有过滤网(图中未示出)。
本发明的发酵罐具有以下优点：1、罐体的补料口、取样口均为三通装置，一端进液，一端进气，端口处均有阀门，可独立灭菌，做到用后及时灭菌，降低污染风险。2、罐体搅拌桨设置多层搅拌叶，能做到搅拌更加均匀。3、在进料管、补料口和出料管增加不锈钢致密过滤网，过滤网镶嵌在管道内，可拆除清洗，以达到过滤杂质的目的。4、环形通气装置与洁净空气管道连接，悬空环绕在罐体内壁周围，环形通气装置上间隔设有多个不同朝向的通气孔，可以达到增加洁净空气的目的。5、罐体取样口旁边设置有温度电极口、溶氧电极口、pH电极口，温度通过水箱水注入夹套循环来控制，溶氧通过洁净空气流量控制器来控制。
表1发酵罐改进造前后的活菌量
Figure BDA0002915225010000041
Figure BDA0002915225010000051
采用上述发酵罐的副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：
S1：生产用种子的制备
分别将副猪嗜血杆菌4型H25株、5型H45株、12型H31株冻干菌种溶解，划线接种于TSA培养基，置37℃培养24～48小时，分别选取单个典型菌落划线接种于TSA培养基，37℃培养24～48小时；
用TSB培养基洗下固体培养基上的一级种子，接种于TSB液体培养基中，37℃振荡培养8～10小时，取样纯粹检验合格后，作为二级种子液；
S2：制苗用菌液的制备
S2-1：菌液培养
采用发酵罐分别对4型H25株、5型H45株、12型H31株菌种的二级种子进行培养：按发酵罐容积的70～80％加入TSB培养基，同时加入0.01％～0.02％消泡剂，通入高压蒸汽进行灭菌，待温度降至37～38℃时，分别加入10％新生牛血清、10～20μg/mL NAD和2％～4％二级种子液进行发酵培养，培养温度为37℃、搅拌转速为100～150r/min，溶氧值控制在50％-60％，菌液培养8～10小时后，取样进行活菌计数和纯粹检验；
S2-2：活菌计数
4型H25株、5型H45株、12型H31株菌种的培养菌液活菌数均应大于等于6×109CFU/mL；
S2-3：灭活浓缩
在4型H25株、5型H45株、12型H31株菌种的培养菌液中分别计量加入终浓度为0.2～0.4％甲醛溶液，37℃搅拌灭活24～30小时，灭活结束后取样进行灭活检验，其余菌液置2～8℃保存；
分别将4型H25株、5型H45株、12型H31株灭活完成的菌液，导入柱式离心机离心，收获菌泥，将菌泥重悬于适量灭菌的生理盐水中，置于2～8℃保存，根据活菌计数结果，均稀释至1.8×1010CFU/mL，分别得到4型H25株、5型H45株、12型H31株灭活抗原；
S3半成品检验
S3-1纯粹检验
按现行《中国兽药典》附录进行检验；
S3-2灭活检验
灭活结束后，取2支10mL TSB液体培养基，各接种灭活菌液0.2毫升，37℃培养7天；其中，当培养液培养至24小时，分别取0.5ml培养液再移植接种于1支10mL TSB液体培养基，37℃培养24-48小时。观察结果，所有TSB培养基应不变浑浊。
S3-3毒素检验
各取4型H25株、5型H45株、12型H31株灭活菌液0.2ml，经静脉注射18～22g Balb/c小鼠5只，逐日观察3日，小鼠全部健活则视为毒素检验合格；
4)疫苗制备
将检验合格的4型H25株、5型H45株、12型H31株灭活抗原等比例混合后，在搅拌器中缓慢搅拌混匀，再缓慢加入GEL佐剂(9：1的比例)，搅拌5min～10min，直至完全混合均匀，再加入终浓度0.01％的硫柳汞钠溶液，乳化后即得到副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗，置于4℃保存；
此外，本发明乳化佐剂不限，可为油佐剂、铝胶佐剂、蜂胶佐剂、ISA201VG佐剂等，制备的疫苗可为油包水型疫苗、水包油型疫苗或水包油包水型疫苗；
5)分装
经无菌检验合格后，定量分装，加盖密封，并粘贴标签，置2～8℃保存。
本发明采用先灭活再离心的方法制备疫苗，菌液损失小,不仅较少了离心过程菌液失活，还降低了散毒风险，还能去除代谢产物、甲醛、血清蛋白等，减小副反应。具体见表2：
表2安全性试验
Figure BDA0002915225010000061
本发明方法制备的疫苗，抗体效价更高，攻毒保护率更高。具体见表3
表3疫苗效力检验与毒力检验
Figure BDA0002915225010000062
实施例1
采用本发明发酵罐的副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：
S1：生产用种子的制备
分别将副猪嗜血杆菌4型H25株、5型H45株、12型H31株冻干菌种溶解，划线接种于TSA培养基，置37℃培养24小时，分别选取单个典型菌落划线接种于TSA培养基，37℃培养24小时；
用TSB培养基洗下固体培养基上的一级种子，接种于TSB液体培养基中，37℃振荡培养8小时，取样纯粹检验合格后，作为二级种子液；
S2：制苗用菌液的制备
S2-1：菌液培养
采用发酵罐分别对4型H25株、5型H45株、12型H31株菌种的二级种子进行培养：按发酵罐容积的70％加入TSB培养基，同时加入0.01％％消泡剂，通入高压蒸汽进行灭菌，待温度降至37℃时，分别加入10％新生牛血清、10μg/mL NAD和2％二级种子液进行发酵培养，培养温度为37℃、搅拌转速为100r/min，溶氧值控制在50％-，菌液培养8小时后，取样进行活菌计数和纯粹检验；
S2-2：活菌计数
4型H25株、5型H45株、12型H31株菌种的培养菌液活菌数均应大于等于6×109CFU/mL；
S2-3：灭活浓缩
在4型H25株、5型H45株、12型H31株菌种的培养菌液中分别计量加入终浓度为0.2％甲醛溶液，37℃搅拌灭活24小时，灭活结束后取样进行灭活检验，其余菌液置2℃保存；
分别将4型H25株、5型H45株、12型H31株灭活完成的菌液，导入柱式离心机离心，收获菌泥，将菌泥重悬于适量灭菌的生理盐水中，置于2℃保存，根据活菌计数结果，均稀释至1.8×1010CFU/mL，分别得到4型H25株、5型H45株、12型H31株灭活抗原；
S3半成品检验
S3-1纯粹检验
按现行《中国兽药典》附录进行检验；
S3-2灭活检验
灭活结束后，取2支10mL TSB液体培养基，各接种灭活菌液0.2毫升，37℃培养7天；其中，当培养液培养至24小时，分别取0.5ml培养液再移植接种于1支10mL TSB液体培养基，37℃培养24小时。观察结果，所有TSB培养基应不变浑浊。
S3-3毒素检验
各取4型H25株、5型H45株、12型H31株灭活菌液0.2ml，经静脉注射18g Balb/c小鼠5只，逐日观察3日，小鼠全部健活则视为毒素检验合格；
4)疫苗制备
将检验合格的4型H25株、5型H45株、12型H31株灭活抗原等比例混合后，在搅拌器中缓慢搅拌混匀，再缓慢加入GEL佐剂(9：1的比例)，搅拌5min，直至完全混合均匀，再加入终浓度0.01％的硫柳汞钠溶液，乳化后即得到副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗，置于4℃保存；
此外，本发明乳化佐剂不限，可为油佐剂、铝胶佐剂、蜂胶佐剂、ISA201VG佐剂等，制备的疫苗可为油包水型疫苗、水包油型疫苗或水包油包水型疫苗；
5)分装
经无菌检验合格后，定量分装，加盖密封，并粘贴标签，置2℃保存。
实施例2
采用上述发酵罐的副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：
S1：生产用种子的制备
分别将副猪嗜血杆菌4型H25株、5型H45株、12型H31株冻干菌种溶解，划线接种于TSA培养基，置37℃培养48小时，分别选取单个典型菌落划线接种于TSA培养基，37℃培养248小时；
用TSB培养基洗下固体培养基上的一级种子，接种于TSB液体培养基中，37℃振荡培养10小时，取样纯粹检验合格后，作为二级种子液；
S2：制苗用菌液的制备
S2-1：菌液培养
采用发酵罐分别对4型H25株、5型H45株、12型H31株菌种的二级种子进行培养：按发酵罐容积的80％加入TSB培养基，同时加入0.02％消泡剂，通入高压蒸汽进行灭菌，待温度降至38℃时，分别加入10％新生牛血清、20μg/mL NAD和4％二级种子液进行发酵培养，培养温度为37℃、搅拌转速为150r/min，溶氧值控制-60％，菌液培养8～10小时后，取样进行活菌计数和纯粹检验；
S2-2：活菌计数
4型H25株、5型H45株、12型H31株菌种的培养菌液活菌数均应大于等于6×109CFU/mL；
S2-3：灭活浓缩
在4型H25株、5型H45株、12型H31株菌种的培养菌液中分别计量加入终浓度为0.4％甲醛溶液，37℃搅拌灭活30小时，灭活结束后取样进行灭活检验，其余菌液置2～8℃保存；
分别将4型H25株、5型H45株、12型H31株灭活完成的菌液，导入柱式离心机离心，收获菌泥，将菌泥重悬于适量灭菌的生理盐水中，置于8℃保存，根据活菌计数结果，均稀释至1.8×1010CFU/mL，分别得到4型H25株、5型H45株、12型H31株灭活抗原；
S3半成品检验
S3-1纯粹检验
按现行《中国兽药典》附录进行检验；
S3-2灭活检验
灭活结束后，取2支10mL TSB液体培养基，各接种灭活菌液0.2毫升，37℃培养7天；其中，当培养液培养至24小时，分别取0.5ml培养液再移植接种于1支10mL TSB液体培养基，37℃培-48小时。观察结果，所有TSB培养基应不变浑浊。
S3-3毒素检验
各取4型H25株、5型H45株、12型H31株灭活菌液0.2ml，经静脉注射18～22g Balb/c小鼠5只，逐日观察3日，小鼠全部健活则视为毒素检验合格；
4)疫苗制备
将检验合格的4型H25株、5型H45株、12型H31株灭活抗原等比例混合后，在搅拌器中缓慢搅拌混匀，再缓慢加入GEL佐剂(9：1的比例)，搅拌10min，直至完全混合均匀，再加入终浓度0.01％的硫柳汞钠溶液，乳化后即得到副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗，置于4℃保存；
此外，本发明乳化佐剂不限，可为油佐剂、铝胶佐剂、蜂胶佐剂、ISA201VG佐剂等，制备的疫苗可为油包水型疫苗、水包油型疫苗或水包油包水型疫苗；
5)分装
经无菌检验合格后，定量分装，加盖密封，并粘贴标签，置8℃保存。
实施例3
采用上述发酵罐的副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：
S1：生产用种子的制备
分别将副猪嗜血杆菌4型H25株、5型H45株、12型H31株冻干菌种溶解，划线接种于TSA培养基，置37℃培养36小时，分别选取单个典型菌落划线接种于TSA培养基，37℃培养36小时；
用TSB培养基洗下固体培养基上的一级种子，接种于TSB液体培养基中，37℃振荡培养9小时，取样纯粹检验合格后，作为二级种子液；
S2：制苗用菌液的制备
S2-1：菌液培养
采用发酵罐分别对4型H25株、5型H45株、12型H31株菌种的二级种子进行培养：按发酵罐容积的75％加入TSB培养基，同时加入0.015％消泡剂，通入高压蒸汽进行灭菌，待温度降至37℃时，分别加入10％新生牛血清、15μg/mL NAD和3％二级种子液进行发酵培养，培养温度为37℃、搅拌转速为125r/min，溶氧值控制在55％，菌液培养9小时后，取样进行活菌计数和纯粹检验；
S2-2：活菌计数
4型H25株、5型H45株、12型H31株菌种的培养菌液活菌数均应大于等于6×109CFU/mL；
S2-3：灭活浓缩
在4型H25株、5型H45株、12型H31株菌种的培养菌液中分别计量加入终浓度为0.3％甲醛溶液，37℃搅拌灭活28小时，灭活结束后取样进行灭活检验，其余菌液置6℃保存；
分别将4型H25株、5型H45株、12型H31株灭活完成的菌液，导入柱式离心机离心，收获菌泥，将菌泥重悬于适量灭菌的生理盐水中，置于2～8℃保存，根据活菌计数结果，均稀释至1.8×1010CFU/mL，分别得到4型H25株、5型H45株、12型H31株灭活抗原；
S3半成品检验
S3-1纯粹检验
按现行《中国兽药典》附录进行检验；
S3-2灭活检验
灭活结束后，取2支10mL TSB液体培养基，各接种灭活菌液0.2毫升，37℃培养7天；其中，当培养液培养至24小时，分别取0.5ml培养液再移植接种于1支10mL TSB液体培养基，37℃培养36小时。观察结果，所有TSB培养基应不变浑浊。
S3-3毒素检验
各取4型H25株、5型H45株、12型H31株灭活菌液0.2ml，经静脉注射20g Balb/c小鼠5只，逐日观察3日，小鼠全部健活则视为毒素检验合格；
4)疫苗制备
将检验合格的4型H25株、5型H45株、12型H31株灭活抗原等比例混合后，在搅拌器中缓慢搅拌混匀，再缓慢加入GEL佐剂(9：1的比例)，搅拌8min，直至完全混合均匀，再加入终浓度0.01％的硫柳汞钠溶液，乳化后即得到副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗，置于4℃保存；
此外，本发明乳化佐剂不限，可为油佐剂、铝胶佐剂、蜂胶佐剂、ISA201VG佐剂等，制备的疫苗可为油包水型疫苗、水包油型疫苗或水包油包水型疫苗；
5)分装
经无菌检验合格后，定量分装，加盖密封，并粘贴标签，置2～8℃保存。

Claims (10)

1. 一种副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1：生产用种子的制备
分别将副猪嗜血杆菌4型H25株、5型H45株、12型H31株冻干菌种溶解，划线接种于TSA培养基，置37℃培养24～48小时，分别选取单个典型菌落划线接种于TSA培养基，37℃培养24～48小时；
用TSB培养基洗下固体培养基上的一级种子，接种于TSB液体培养基中，37℃ 振荡培养8～10小时，取样纯粹检验合格后，作为二级种子液；
S 2：制苗用菌液的制备
S 2-1：菌液培养
采用发酵罐分别对4型H25株、5型H45株、12型H31株菌种的二级种子进行培养：按发酵罐容积的70～80％加入TSB培养基，同时加入0.01%～0.02%消泡剂，通入高压蒸汽进行灭菌，待温度降至37～38℃时，分别加入10％新生牛血清、10～20μg/mL NAD和2％～4％二级种子液进行发酵培养，培养温度为37℃、搅拌转速为100～150 r/min，溶氧值控制在50%-60%，菌液培养8～10小时后，取样进行活菌计数和纯粹检验；
S 2-2：活菌计数
4型H25株、5型H45株、12型H31株菌种的培养菌液活菌数均应大于等于6×109CFU/mL；
S 2-3：灭活浓缩
在4型H25株、5型H45株、12型H31株的培养菌液中分别计量加入终浓度为0.2～0.4％甲醛溶液，37℃搅拌灭活24～30小时，灭活结束后取样进行灭活检验，其余菌液置2～8℃保存；
分别将4型H25株、5型H45株、12型H31株灭活完成的菌液，导入柱式离心机离心，收获菌泥，将菌泥重悬于适量灭菌的生理盐水中，置于2～8℃保存，根据活菌计数结果，均稀释至1.8×1010CFU/mL，分别得到4型H25株、5型H45株、12型H31株灭活抗原；
S 3：半成品检验
上述4型H25株、5型H45株、12型H31株灭活菌液分别经过纯粹检验、灭活检验、毒素检验，检验结果均合格；
S 4：疫苗制备
将检验合格的4型H25株、5型H45株、12型H31株灭活抗原等比例混合后，在搅拌器中缓慢搅拌混匀，再缓慢加入GEL佐剂，搅拌5min～10min，直至完全混合均匀，再加入终浓度0.01%的硫柳汞钠溶液，乳化后即得到副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗，置于4℃保存。
2. 根据权利要求1所述的一种副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗的制备方法，其特征在于：步骤S 2-1中，菌液培养条件为：培养温度为37℃，搅拌转速为100～150 r/min，溶氧值控制在50%-60%。
3. 根据权利要求1 所述的一种副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗的制备方法，其特征在于：步骤S 4中，4型H25株、5型H45株、12型H31株抗原的总量与佐剂的质量比为9：1。
4. 根据权利要求1 所述的一种副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗的制备方法，其特征在于：步骤S 4中，所述佐剂为GEL佐剂、油佐剂、铝胶佐剂、蜂胶佐剂、ISA201VG佐剂中的一种。
5. 根据权利要求1 所述的一种副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗的制备方法，其特征在于：步骤S 2-1中，所述发酵罐包括罐体，罐体的顶部设有罐口，罐体的顶部连接有进料管，罐体的底部连接有出料管，罐体的侧壁上设有加热夹套，加热夹套上设有进水口和出水口，所述的罐体顶部还设有补料口和进气口，罐体的下部设有取样口，所述罐体内设有搅拌轴和至少一个搅拌桨，所述搅拌轴一端与设置在罐体顶部的驱动电机连接，搅拌轴另一端与搅拌桨连接；所述发酵罐还包括环形通气装置和空气管道，所述空气管道从罐体顶部伸入罐体内的下部，空气管道的底部与环形通气装置一端连接，环形通气装置的环形面与罐体底部平行设置。
6.根据权利要求5所述的一种副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗的制备方法，其特征在于：所述环形通气装置由不锈钢管成型，所述环形通气装置上间隔设有多个不同朝向的通气孔。
7.根据权利要求5所述的一种副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗的制备方法，其特征在于：所述空气管道上设有流量控制器。
8.根据权利要求5所述的一种副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗的制备方法，其特征在于：所述搅拌桨的数量为四个，四个搅拌桨沿搅拌轴长度方向间隔设置。
9.根据权利要求5所述的一种副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗的制备方法，其特征在于：所述罐体的下部还设有温度电极口、溶氧电极口和pH电极口。
10.根据权利要求5所述的一种副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗的制备方法，其特征在于：所述进料管、补料口和出料管上设有过滤网。
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