CN108441446A - 一种副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗及其生产方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗及其生产方法和应用，本发明的副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗，含有经甲醛溶液灭活的副猪嗜血杆菌4型H4L1株、5型H5L3株和12型H12L3株及水基免疫佐剂，其中，所述副猪嗜血杆菌4型H4L1株、5型H5L3株和12型H12L3株均于2018年01月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号分别为：CCTCC M 2018019，CCTCC M 2018020，CCTCC M 2018021。本发明的三价灭活疫苗用于预防4、5和12型副猪嗜血杆菌引起的副猪嗜血杆菌病，并且此疫苗具有安全性好、免疫效力高且免疫期长等优点。

Description

一种副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗及其生产方法和应用
技术领域
本发明涉及兽用生物制品技术领域，具体涉及一种副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗及其生产方法和应用。
背景技术
副猪嗜血杆菌病，又称革拉泽氏病(Glaesser’s disease)，是由副猪嗜血杆菌引起的一种以呼吸道症状、跛行、胸膜炎、心包炎、腹膜炎、关节炎和脑膜炎等为特征的猪呼吸道传染病。随着养猪业的发展，猪副嗜血杆菌病已成为近年来严重危害养猪业的新发细菌性传染病，呈世界性分布，并已证实在我国绝大多数猪场存在和流行，可影响2周龄到4月龄的猪，但主要在断奶前后和仔猪阶段发病，常见于5～8周龄的猪，发病率一般为10～15％，严重时死亡率可达50％以上，给我国养猪业造成巨大的损失(蔡旭旺，陈焕春，刘正飞，吴斌，金梅林，Blacka11P J.副猪嗜血杆菌的分离培养和血清型鉴定.华中农业大学学报，2005,24:55-58；Oliveira S&Pijoan(2004)Haemophilus parasuis：new trends ondiagnosis，epidemiology and control.Vet microbiol 99:1-12.)。
传统的血清分型方法是根据热稳定性可溶性抗原和琼脂扩散试验(AGPT)，已有15种血清型得到证实，而且还有一定数量不能分型的副猪嗜血杆菌(Kielstein P&Rapp-Gabrielson VJ.Desigantion of 15serovars of Haemophilus parasuis on the basisof immunodiffusion using heat-stable antigen extracts.J Clinmicrobiol.1992，30：862～865)。目前已经发现并证实的副猪嗜血杆菌的毒力因子及其潜在的毒力因子有：荚膜、菌毛、外膜蛋白、脂多糖、转铁蛋白、神经氨酸酶等(李静怡，张建民，徐成刚，郭莉莉，陈济铛，廖明.副猪嗜血杆菌主要毒力因子及致病机理研究进展中国畜牧兽医，2010年第37卷第12期)。副猪嗜血杆菌血清型众多以及很大比例的不能分型的菌株，具有明显的地方性特征，菌株毒力及致病性之间具有明显的差异性，血清型间交叉保护性极差或缺少，因此研制与当地相关型的、具有高效交叉保护力的疫苗是预防和控制副猪嗜血杆菌病的必然要求(Baumann G，Bilkei G.Effect of vaccianting sows and their piglets on thedevelopment of Glaesser’s disease induced by a virulent strain of Haemophilusparasuis serovar 5.Vet.Rec.2002，151:18-21)。
目前防治副猪嗜血杆菌病的主要方法是抗生素的应用及灭活疫苗的使用。但随着抗生素的长期使用，HPS的耐药性越来越强，药物治疗对副猪嗜血杆菌的防治无有效作用，使用疫苗来预防才是最佳方案。目前国内副猪嗜血杆菌的疫苗只有副猪嗜血杆菌二价(血清4型和5型)灭活疫苗，但各研究表明副猪嗜血杆菌各型之间的交叉保护率较低。副猪嗜血杆菌灭活疫苗只对同一血清型的菌株具有保护作用。在发病猪群中副猪菌血清型与所注射疫苗血清型相符合时，对猪群有良好的保护作用，一旦猪体携带副猪菌血清型与注射疫苗不一致，则对猪无免疫保护效果。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提出一种副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗及其生产方法和应用，本发明首先分离得到免疫原性良好的副猪嗜血杆菌4型H4L1、5型H5L3和12型H12L3株，然后将其制成副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗，本发明研制的三价灭活疫苗可以有效地抵抗副猪嗜血杆菌血清4型、5型及12型的感染。
基于上述目的，本发明提供的一种副猪嗜血杆菌，所述的副猪嗜血杆菌为血清型4型H4L1株，于2018年01月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M2018019。
本发明还提供了一种副猪嗜血杆菌，所述的副猪嗜血杆菌为血清型5型H5L3株，于2018年01月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 2018020。
本发明还提供了一种副猪嗜血杆菌，所述的副猪嗜血杆菌为血清型12型H12L3株，于2018年01月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 2018021。
本发明的副猪嗜血杆菌的菌株保藏说明如下：
副猪嗜血杆菌血清型4型H4L1株：
分类命名：副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)H4L1，保藏编号为：CCTCC M2018019；
副猪嗜血杆菌血清型5型H5L3株：
分类命名：副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)H5L3，保藏编号：CCTCC M2018020；
副猪嗜血杆菌12型H12L3株：
分类命名：副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)H12L3，保藏编号：CCTCC M2018021；
以上三个菌株的保藏日期均为2018年01月11日，保藏地址均为中国武汉，武汉大学，中国典型培养物保藏中心，保藏单位均为：中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)。
本发明还提供了所述的副猪嗜血杆菌在制备副猪嗜血杆菌灭活疫苗中的应用。
本发明孩提供了一种副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗，含有经甲醛溶液灭活的副猪嗜血杆菌4型H4L1株、5型H5L3株和12型H12L3株及水基免疫佐剂，其中，所述副猪嗜血杆菌4型H4L1株、5型H5L3株和12型H12L3株均于2018年01月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号分别为：CCTCC M 2018019，CCTCC M 2018020，CCTCC M2018021。
本发明的副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗用于预防4、5和12型副猪嗜血杆菌引起的副猪嗜血杆菌病，免疫期为6个月。
本发明的副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗的用法与用量：颈部肌肉注射，按瓶签注明头份，不论猪只大小，每次均注射1头份(2mL)。母猪在产前8～9周首免，3周后二免，以后每胎产前5～6周免疫一次；仔猪在3～4周龄首免，3周后再次免疫。
目前国内副猪嗜血杆菌主要流行血清型为血清4型、血清5型及血清12型，而多价疫苗常常由于抗原的相互影响而导致免疫失败，特别是对于多血清型的副猪嗜血杆菌引起的疾病，由于血清型众多，选择抗原的种类和比例更加困难，而且对于大动物(猪)的免疫学实验往往时间漫长、费用昂贵，这也是一直以来市场上未出现有效的副猪嗜血杆菌多价疫苗的原因。而本发明在获得了三株新的副猪嗜血杆菌基础上，通过对这三种毒株制备的抗原的浓度含量及其相互比例进行了大量工作和实践，得到了一种抗原间配比及浓度适宜的三价疫苗，疫苗的免疫效果良好，可以有效治疗和预防副猪嗜血杆菌相关疾病，解决了长期以来的多血清型副猪嗜血杆菌相关疾病的多价疫苗制备困难的问题。本发明研制的三价灭活疫苗可以有效地抵抗副猪嗜血杆菌血清4型、5型及12型的感染。
在本发明的一些实施例中，在1mL副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗中，副猪嗜血杆菌4型H4L1株、5型H5L3株和12型H12L3株三种抗原分别含2.0×l09、1.0×109和1.0×109CFU菌体。
另外，本发明还提供了一种所述的副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗的生产方法，包括如下步骤：
a.分别将副猪嗜血杆菌H4L1株、副猪嗜血杆菌H5L3株和副猪嗜血杆菌H12L3株菌种增殖培养，得到副猪嗜血杆菌H4L1株菌液、副猪嗜血杆菌H5L3株菌液和副猪嗜血杆菌H12L3株菌液，并对其进行活菌计数，副猪嗜血杆菌4型H4L1株、5型H5L3株和12型H12L3株的活菌含量分别不少于2.0×109、1.5×109和1.0×109CFU/mL；
b.将副猪嗜血杆菌H4L1株、H5L3株和H12L3株的菌液分别单独灭活，按菌液总量的0.3％(体积分数)加入甲醛溶液，在37℃灭活48小时；
c.用中空纤维超滤器将灭活检验合格的菌液浓缩去除上清，根据灭活前活菌计数结果，使用无菌PBS(0.0lmol/L、pH值7.2)将H4L1株、H5L3株和H12L3株菌体抗原稀释并调节浓度至7.2×109、3.6×109和3.6×109CFU/mL，并将三种抗原液按1:1:1(体积比)的比例混合均匀；
d.将抗原液与GEL佐剂混合，搅拌均匀，在终止搅拌前加入硫柳汞溶液充分混匀，最终使疫苗中含灭活前H4L1株活菌数至少为2.0×109CFU/mL，含灭活前H5L3株和H12L3株活菌数均至少为1.0×109CFU/mL。
在本发明的一些实施例中，在步骤d中，将抗原液与GEL佐剂按照(80％～90％)：(20％～10％)的体积比混合，室温下500～800r/min搅拌0.5～1h，至其混合均匀；按照疫苗总体积的0.01％加入硫柳汞。
本发明还提供了所述的副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗在临床上防治副猪嗜血杆菌疾病的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明从优势流行菌株中筛选出免疫原性良好的副猪嗜血杆菌4型H4L1株、5型H5L3株和12型H12L3株作为疫苗制备菌株，分别接种于TSB营养肉汤培养基上培养，收获培养物，经甲醛溶液灭活后，加入水基免疫佐剂混合乳化制成副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗；本发明的三价灭活疫苗用于预防4、5和12型副猪嗜血杆菌引起的副猪嗜血杆菌病，并且此疫苗具有安全性好、免疫效力高且免疫期长等优点。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进一步详细说明。
实施例1副猪嗜血杆菌的筛选和鉴定
1.材料与方法
1.1病料来源
2008年10月到2010年3月间，共采集了137个来自河南、山东、湖北、安徽、江苏、河北等省具有疑似副猪嗜血杆菌病临床症状猪的病例。发病猪多表现为发热、呼吸困难、关节肿胀、跛行、皮肤及黏膜发绀、站立困难甚至瘫痪、僵猪或死亡。在采集肺脏的同时，部分猪采集心血、淋巴结、脾脏、脑、关节液等病料组织进行细菌的分离鉴定。
1.2培养基
胰蛋白胨大豆琼脂(Tryptic Soy Agar，TSA)培养基的配制方法为：取胰蛋白大豆琼脂40g，加入去离子水，定容至1000mL，充分摇匀溶解，121℃高压蒸汽灭菌15min，加入50mL过滤除菌的牛血清、1mL过滤除菌的0.1％NAD。
胰蛋白胨大豆肉汤培养基(Tryptic Soy Broth，TSB)培养基的配制方法为：取胰蛋白胨大豆肉汤培养基30g，加入去离子水，定容至1000mL，充分摇匀溶解，121℃高压蒸汽灭菌15min，加入50mL过滤除菌的牛血清、1mL过滤除菌的0.1％NAD。
1.3方法
1.3.1病原菌分离培养
将采集的肺脏等病料组织划线接种于含新生牛血清(终浓度10％)和NAD(终浓度100μg/mL)的TSA平板上，37℃培养24～48小时后挑取疑似菌落进行传代纯化，再培养24～48小时后观察副猪嗜血杆菌的菌落形态。同时，挑取3～5个单菌落进行革兰氏染色镜检，观察菌体形态特征。如果从同一病例不同病料组织中均分离到副猪嗜血杆菌，则只选择其中一个病料组织的分离菌株进行保存，其优先次序为脑、心血、肺脏、淋巴结、脾脏、关节液。
1.3.2涂片镜检
挑取上述纯培养菌落抹片，革兰氏染色后观察细菌形态。
1.3.3生化鉴定
在无菌操作台上，用接种环分别挑取上述可疑菌的单菌落，水平划线于无NAD的TSA平皿上，再挑取金黄色葡萄球菌垂直于水平线划线，37℃培养24～48h，看是否有“卫星生长现象”(即在葡萄球菌菌苔附近待测菌菌落生长较大，而远侧菌落生长较小甚至没有菌落生长)，同时观察是否具有溶血现象。取具有“卫星生长现象”且不溶血的单菌落纯培养后接种于葡萄糖、木糖、果糖、阿拉伯糖、山梨糖、山梨醇、甘露糖、甘露醇、D-核糖、蔗糖、乳糖、蜜三糖、H2S、麦芽糖、半乳糖、尿素酶、鸟氨酸脱羧酶、精氨酸水解酶、硝酸盐还原反应和ONPG(β-半乳糖苷)等微型生化鉴定管，同时进行氧化酶试验和接触酶试验，按厂家说明书方法操作并观察结果。
1.3.4分离菌血清型鉴定方法
用标准分型血清按Kieletein-Rapp-Gabriedson(KRG)琼脂扩散血清分型方法对分离的57株副猪嗜血杆菌菌株进行鉴定。
1.3.5小鼠毒力试验
将副猪嗜血杆菌4型H4L1株接种于含新生牛血清(终浓度10％)和NAD(终浓度100μg/mL)的TSA平板上，37℃复苏培养24～48小时后挑取单菌落再进行传代纯化培养24～48小时，取无菌PBS(0.0lmol/L、pH值7.2)5～8mL到培养皿中，用移液器反复吹打洗脱菌落并充分混匀，将制备的菌液进行2倍比稀释3个梯度。将16只BALB/c小鼠均分为4组(4只/组)，取上述原菌液及每个梯度稀释菌液分别对一组BALB/c小鼠进行腹腔接种(0.2mL/只)。同时对原菌液进行活菌计数，确定接种的实际菌量。按同样的方法对其他副猪嗜血杆菌菌株进行培养并接种小鼠。每批次试验设立1组4只小鼠接种无菌PBS为空白对照。观察、记录发病及死亡情况15日，死亡者立即剖检，取其内脏和脑组织进行细菌分离鉴定，并根据Reed-Muench法计算LD50。
1.3.6副猪嗜血杆菌原始种子批的建立
本研究将筛选的副猪嗜血杆菌5种血清型中毒力最强的菌株，包括4型4株、5型4株、12型3株、13型2株和14型3株，共16株细菌作为开发副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗的候选疫苗菌株。对这16株细菌分别保存30～35瓶作为原始种子批。
2实验结果
2.1菌株的形态及生化特性
革兰氏染色后在显微镜下观察，细菌为革兰氏阴性细小杆菌，呈单个球杆菌、细长或细丝状的多形态菌体。
生化试验结果表明，副猪嗜血杆菌分离株的触酶试验、精氨酸脱羧酶试验和硝酸盐(还原)试验均呈阳性，均能发酵葡萄糖、蔗糖和尿素，但均不能发酵山梨糖、木糖、棉子糖、阿拉伯糖、核糖、山梨醇、甘露醇、硫化氢、ONPG、蛋白胨水。对果糖、半乳糖、麦芽糖、乳糖、甘露糖、鸟氨酸的鉴定结果存在差异。这些生化试验结果符合细菌分类学中副猪嗜血杆菌的特性。
2.2菌株的培养特性
副猪嗜血杆菌分离株在含新生牛血清(终浓度10％)和NAD(终浓度100μg/mL)的TSA平板上，37℃培养24～48小时，可形成圆形、光滑、湿润、无色透明、边缘整齐、直径1～2mm的菌落。该类细菌仅在含有NAD的TSA培养基中生长繁殖，在无NAD的TSA培养基上不能生长。对纯化的细菌在含有15％绵羊血的TSA平板上与葡萄球菌交叉划线，37℃培养24～48小时后，呈现典型的“卫星生长”现象。即越靠近葡萄球菌的周围其生长越好，远离葡萄球菌的地方不生长。但所有副猪嗜血杆菌在含有绵羊血(终浓度15％)和NAD(终浓度100μg/mL)的琼脂平板上生长均不产生溶血现象。
2.3副猪嗜血杆菌的血清型鉴定结果
用标准分型血清按Kieletein-Rapp-Gabriedson(KRG)琼脂扩散血清分型方法对分离的57株副猪嗜血杆菌菌株进行鉴定，其中中间孔加入标准阳性血清，周围孔分别加入鉴定菌株热稳定抗原，出现沉淀线判为阳性。通过此方法从57株分离菌中共鉴定出了47株分离细菌的血清型，其中副猪嗜血杆菌4型菌株最多，共13株，占所有分离菌株的22.8％(13/57)、其次是5型12株(21.1％)、12型6株(10.5％)、13型6株(10.5％)、14型5株(8.8％)、1型2株(3.5％)，2型、6型和10型各1株(分别占1.8％)。血清学分型结果表明在我国目前以4型(22.8％)和5型(21.1％)最为流行，其次为12型(10.5％)、13型(10.5％)和14型(8.8％)，而其他血清型分别只有少数菌株为代表。
2.4菌株毒力
本研究对分离率最高的5种血清型副猪嗜血杆菌的部分菌株进行小鼠半数致死剂量(LD50)的测定，包括4型12株、5型10株、12型5株、13型5株和14型5株，共37株。试验结果表明副猪嗜血杆菌12型和14型菌株表现毒力最强。5株12型和5株14型副猪嗜血杆菌的LD50分别介于2.3～6.5×108CFU、3.0～8.0×108CFU之间。其次是5型和4型菌株。综合毒力试验结果，确定将副猪嗜血杆菌5种血清型中表现毒力最强的菌株，包括4型H4L1株，5型H5L3株，12型H12L3株，作为本研究中副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗的候选疫苗菌株。
2.5副猪嗜血杆菌原始种子的保存
对这3株细菌分别保存30～35瓶作为原始种子批。以脱脂牛奶为保护剂，真空冷冻干燥后的副猪嗜血杆菌呈固体但蓬松的蜂窝状结构，加水立即溶解。将原始种子批，贴上含有菌种名称、保存时间、保存人等信息的标签，置-80℃冰箱保存。三日后对保存菌种进行复苏检验，其纯粹性检和活性均良好，表明原始种子批达到要求。
本发明的副猪嗜血杆菌的菌株保藏说明如下：
副猪嗜血杆菌血清型4型H4L1株：
分类命名：副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)H4L1，保藏编号为：CCTCC M2018019；
副猪嗜血杆菌血清型5型H5L3株：
分类命名：副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)H5L3，保藏编号：CCTCC M2018020；
副猪嗜血杆菌12型H12L3株：
分类命名：副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)H12L3，保藏编号：CCTCC M2018021；
以上三个菌株的保藏日期均为2018年01月11日，保藏地址均为中国武汉，武汉大学，中国典型培养物保藏中心，保藏单位均为：中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)。
实施例2副猪嗜血杆菌4、5和12型三价灭活疫苗的生产方法
1.生产用种子制备
(1)一级种子繁殖与鉴定
将副猪嗜血杆菌4型H4L1株、5型H5L3株和12型H12L3株生产菌种分别接种于含新生牛血清(终浓度10％)和NAD(终浓度100μg/mL)的TSA平板上，37℃培养24～48小时，每株挑选5个以上典型菌落，分别接种含新生牛血清(终浓度10％)和NAD(终浓度100μg/mL)的TSA斜面若干支，37℃培养24～48小时，进行纯粹检验合格后，作为一级种子。在2～8℃保存，应不超过7日，继代不得超过5代。
(2)二级种子繁殖
将各株一级种子分别接种于含新生牛血清(终浓度10％)和NAD(终浓度100μg/mL)的TSB液体培养基中，在37℃、200r/min摇床上振荡培养12～16小时，进行纯粹检验合格后，作为二级种子。在2～8℃保存，使用期不超过7日。
2.菌液培养
三种菌液分别单独培养。按玻璃瓶容积装入适量培养基，然后按培养基总量的1％接入二级种子液，经37℃、200r/min摇床培养18～22小时后收获菌液。
3.活菌计数
按现行《中国兽药典》附录方法使用适宜于本菌生长的含新生牛血清(终浓度10％)和NAD(终浓度100μg/mL)的TSA培养基进行活菌计数。使用摇瓶培养，副猪嗜血杆菌4型H4L1株、5型H5L3株和12型H12L3株的活菌含量分别不少于2.0×109、1.5×109和1.0×109CFU/mL。
4.菌液灭活
将副猪嗜血杆菌H4L1株、H5L3株和H12L3株的培养液分别单独灭活。按菌液总量的0.3％(体积比)加入甲醛溶液，在37℃灭活48小时。
5.灭活检验
取灭活菌液0.2mL接种适宜于本菌生长的TSA平板(含10％新生牛血清和0.01％NAD)，同时取灭活菌液0.2ml按1:100的比例接种适宜于本菌生长的TSB液体培养基(含10％新生牛血清和0.01％NAD)，置37℃培养7日，均应无菌生长。
6.配苗
(1)佐剂准备
按照产品说明书，将GEL佐剂经121℃高压灭菌30分钟，并冷却至室温备用。
(2)抗原的准备
用中空纤维超滤器将灭活检验合格的菌液浓缩去除上清。根据灭活前活菌计数结果，使用无菌PBS(0.0lmol/L、pH值7.2)将H4L1株、H5L3株和H12L3株菌体抗原稀释并调节浓度至7.2×109、3.6×109和3.6×109CFU/mL，并将三种抗原液按1:1:1(体积比)的比例混合均匀。
(3)配苗
将抗原液与GEL佐剂按85:15的体积比混合，室温下以500～800r/min的转速下搅拌30～40分钟。在终止搅拌前加入1％硫柳汞溶液(终浓度为0.01％)，充分混匀。最终使疫苗中含灭活前H4L1株活菌数至少为2.0×109CFU/mL，含灭活前H5L3株和H12L3株活菌数均至少为1.0×109CFU/mL。
(4)半成品检验
按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。
(5)分装
定量分装，加盖密封，2～8℃保存。
实施例3副猪嗜血杆菌4、5和12型三价灭活疫苗成品检验
(1)性状
本品为灰白色混悬液，久置底部有少量沉淀，振荡后呈均匀混悬液。
(2)装量检查
按现行《中国兽药典》附录进行检验，应符合规定。
(3)无菌检验
按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。
(4)安全检验
用3～4周龄健康易感仔猪(见附注4)5头，各颈部肌肉注射疫苗4mL，观察14日，应无由疫苗引起的局部或全身不良反应。
(5)效力检验下列方法任择其一。
①豚鼠免疫抗体测定法
用250～300g豚鼠(副猪嗜血杆菌微量凝集抗体效价不高于1：4，操作方法见附注6)20只，采血，用其中10只各皮下注射疫苗0.4mL，3周后，再按相同方法各接种疫苗0.4mL。其余10只豚鼠，不接种作为对照。第2次接种后14日，采集所有豚鼠的血清，按微量平板凝集试验(MAT)方法(见附注6)分别用副猪嗜血杆菌H4L1株、H5L3株和H12L3株抗原检测血清抗体效价。对照组豚鼠4型、5型、12型血清抗体的效价均应不高于1：4，免疫组豚鼠4型、5型、12型血清抗体的几何平均效价均应不低于1：16。
②仔猪免疫攻毒法
用3～4周龄健康易感仔猪(见附注4)30头，随机均分为6组(5头/组)。用其中3组各颈部肌肉注射疫苗2mL，3周后，再按相同方法接种疫苗2mL。其余3组不接种作为对照。在第2次接种后14日，各取1组接种猪和1组对照猪分别腹腔内注射H4L1株菌液3mL(含活菌数约为6.8×109CFU)、H5L3株菌液3mL(含活菌数约为3.7×109CFU)、H12L3株菌液3mL(含活菌数约为3.0×109CFU)，逐日连续观察14日。每组免疫猪应至少保护4头，每组对照猪应至少4头发病(见附注5)。
(6)甲醛、硫柳汞残留量测定按现行《中国兽药典》附录进行测定，应符合规定。
实施例4副猪嗜血杆菌4、5和12型三价灭活疫苗的安全试验
4.1仔猪一次单剂量接种的安全性试验结果
用本发明人按照实施例2方法试制的3批副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗(批号：201201、201202、201203)分别对20～22日龄仔猪进行颈部肌肉接种(2mL/头)，观察其临床症状和病理变化。结果表明，3批疫苗接种仔猪的精神状态和食欲情况均正常，均没有发生腹泻、呕吐和死亡现象。接种前和接种后1～7日的体温测定结果表明，疫苗接种组仔猪出现了暂时的体温升高，但在接种后24小时体温平均升高不超过1℃，且在48小时内恢复正常。观察期结束后，解剖观察各组试验仔猪注射部位，3批疫苗组仔猪的接种部位均无明显的局部炎症、组织病变和疫苗残留现象，也无肉芽肿的形成，与对照组相比没有肉眼可见的差异。上述试验结果表明，该副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗对仔猪通过颈部肌肉进行一次单剂量接种是安全的。
4.2仔猪单剂量重复接种的安全性试验结果
用本发明人按照实施例2方法试制的3批副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗(批号：201201、201202、201203)对20～22日龄仔猪接种3次(2mL/头/次)，观察其临床症状和病理变化。结果表明，仔猪每次接种疫苗后的精神状态和食欲情况均正常，均没有发生腹泻、呕吐和死亡现象。每次接种前和接种后1～7日的体温测定结果表明，疫苗接种组仔猪出现了暂时的体温升高，但在接种后24小时体温平均升高不超过1℃，且在48小时内恢复正常。观察期结束后，解剖观察各组试验仔猪注射部位，3批疫苗组仔猪的接种部位均无明显的局部炎症、组织病变和疫苗残留现象，也无肉芽肿的形成，与对照组相比没有肉眼可见的差异。上述试验结果表明，该副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗对使用最小日龄靶动物(20～22日龄仔猪)进行单剂量重复接种3次是安全的。
4.3仔猪一次超剂量接种的安全性试验结果
用本发明人按照实施例2方法试制的3批副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗(批号：201201、201202、201203)分别对20～22日龄仔猪通过颈部肌肉途径进行一次超剂量接种(4mL/头)，观察其临床症状和病理变化。结果表明，3批疫苗接种仔猪的精神状态和食欲情况均正常，均没有发生腹泻、呕吐和死亡现象。接种前和接种后1～7日的体温测定结果表明，疫苗接种组仔猪出现了暂时的体温升高，但在接种后24小时体温平均升高不超过1℃，且在48小时内恢复正常。观察期结束后，解剖观察各组试验仔猪注射部位，3批疫苗组仔猪的接种部位均无明显的局部炎症、组织病变和疫苗残留现象，也无肉芽肿的形成，与对照组相比没有肉眼可见的差异。上述试验结果表明，该副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗对使用最小日龄靶动物(20～22日龄仔猪)进行一次超剂量接种是安全的。
4.4妊娠母猪一次单剂量接种的安全性试验结果
用本发明人按照实施例2方法试制的3批副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗(批号：201201、201202、201203)对产前8～9周的妊娠母猪进行颈部肌肉接种(2mL/头)，观察其临床症状和分娩情况。结果表明，疫苗接种母猪和对照组母猪的精神状态和食欲情况均正常，均没有发生腹泻、呕吐和死亡现象。接种前和接种后1～7日的体温测定结果表明，疫苗接种组母猪出现了暂时的体温升高，但在接种后24小时体温平均升高不超过1℃，且在48小时内恢复正常。母猪妊娠期满，分娩正常，没有流产和早产情况发生。与对照组相比，免疫组母猪产仔数没有显著差异(χ2检验，P>0.05)。死胎和弱仔数与对照组相似。同时也未发现疫苗所致的其他不良反应。上述试验结果表明，该副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗对妊娠母猪进行一次单剂量接种是安全的。
4.5妊娠母猪单剂量重复接种的安全性试验结果
用本发明人按照实施例2方法试制的3批副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗(批号：201201、201202、201203)对产前8～9周的妊娠母猪进行颈部肌肉接种3次(间隔3周，2mL/头/次)，观察其临床症状和分娩情况。结果表明，疫苗接种母猪和对照组母猪的精神状态和食欲情况均正常，均没有发生腹泻、呕吐和死亡现象。接种前和接种后1～7日的体温测定结果表明，疫苗接种组母猪出现了暂时的体温升高，但在接种后24小时体温平均升高不超过1℃，且在48小时内恢复正常。母猪妊娠期满，分娩正常，没有流产和早产情况发生。与对照组相比，免疫组母猪产仔数没有显著差异(χ2检验，P>0.05)。死胎和弱仔数与对照组相似。同时也未发现疫苗所致的其他不良反应。上述试验结果表明，该副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗对妊娠母猪进行单剂量2次接种是安全的。
4.6妊娠母猪一次超剂量接种的安全性试验结果
用本发明人按照实施例2方法试制的3批副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗(批号：201201、201202、201203)对产前8～9周的妊娠母猪通过颈部肌肉途径进行一次超剂量接种(4mL/头)，观察其临床症状和分娩情况。结果表明疫苗，接种母猪和对照组母猪的精神状态和食欲情况均正常，均没有发生腹泻、呕吐和死亡现象。接种前和接种后1～7日的体温测定结果表明，疫苗接种组母猪出现了暂时的体温升高，但在接种后24小时体温平均升高不超过1℃，且在48小时内恢复正常。母猪妊娠期满，分娩正常，没有流产和早产情况发生。与对照组相比，免疫组母猪产仔数没有显著差异(χ2检验，P>0.05)。死胎和弱仔数与对照组相似。同时也未发现疫苗所致的其他不良反应。上述试验结果表明，该副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗对妊娠母猪进行一次超剂量接种仍然是安全的。
4.7疫苗接种对仔猪生产性能的影响试验结果
仔猪接种疫苗(批号：201201、201202、201203)后的精神状态和食欲情况均正常，均没有发生腹泻、呕吐和死亡现象。首免后50日，201201、201202、201203批疫苗组和对照组的总体重分别为87.8、87.1、87.9和87.6kg；计算后获得每头平均增重介于14.45～15.74kg之间，料肉比介于1.78:1～1.94:1之间。经过χ2检验分析，三个疫苗接种组与对照组在平均增重和料肉比方面均无显著差异(P>0.05)。这表明，该副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗对靶动物猪的生长发育、增重、饲料报酬等均没有影响。
4.8小鼠一次超剂量接种的安全性试验结果
用本发明人按照实施例2方法试制的3批副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗(批号：201201、201202、201203)分别对6～8周龄BALB/c小鼠通过皮下注射途径进行一次超剂量接种(0.4mL/只)，观察其临床症状和病理变化。结果表明，接种PBS的空白对照组小鼠的各项指标均正常。3批疫苗接种小鼠出现了暂时的精神沉郁，食欲减退等现象，但24小时内均恢复正常。所有疫苗接种组小鼠均没有出现呕吐、腹泻和死亡，接种部位均无明显的肿胀现象。接种后14日对所有小鼠进行剖检，发现疫苗组小鼠注射部位均没有发生疫苗残留现象，但是均出现了轻微的肉芽组织增生，而一定程度肉芽组织的产生可能是动物机体发生良好炎症(免疫)反应的表现。上述试验结果表明，该副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗对非靶动物小鼠进行一次超剂量接种是安全的。
4.9豚鼠一次超剂量接种的安全性试验结果
用本发明人按照实施例2方法试制的3批副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗(批号：201201、201202、201203)分别对豚鼠通过皮下注射途径进行一次超剂量接种(0.8mL/只)，观察其临床症状和病理变化。结果表明，接种PBS的空白对照组豚鼠的各项指标均正常。3批疫苗接种豚鼠出现了暂时的精神沉郁，食欲减退等表现，但24小时内均恢复正常。所有疫苗接种组豚鼠均没有出现呕吐、腹泻和死亡，接种部位均无明显的肿胀现象。接种后14日对所有豚鼠进行剖检，注射部位均没有发生疫苗残留现象；但是均出现了轻微的肉芽组织增生，而一定程度肉芽组织的产生可能是动物机体发生良好炎症(免疫)反应的表现。上述试验结果表明，该副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗对非靶动物豚鼠进行一次超剂量接种是安全的。
实施例5疫苗的抗原含量及豚鼠免疫抗体效价与猪免疫攻毒保护的平行相关性研究
5.1不同抗原含量的副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗的配制
用本发明人按照实施例2方法制备了4种不同抗原含量的灭活疫苗，分别命名为①号、②号、③号和④号疫苗。其中①号疫苗中4型H4L1株、5型H5L3株和12型H12L3株的灭活前抗原含量分别为2.0×109、1.0×109和1.0×109CFU/ml，②号疫苗中4型H4L1株、5型H5L3株和12型H12L3株的灭活前抗原含量分别为1.0×109、5.0×108和5.0×108CFU/ml，③号疫苗中4型H4L1株、5型H5L3株和12型H12L3株的灭活前抗原含量分别为5.0×108、2.5×108和2.5×108CFU/ml，④号疫苗中4型H4L1株、5型H5L3株和12型H12L3株的灭活前抗原含量分别为2.5×108、1.3×108和1.3×108CFU/ml。将4种不同抗原含量的疫苗经检验合格后置4℃保存备用。
5.2不同抗原含量疫苗的豚鼠免疫保护试验结果
将不同抗原含量的副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗分别免疫豚鼠，二次免疫后通过微量平板凝集试验分别检测副猪嗜血杆菌4、5和12型的抗体水平。检测结果表明(见表1)，豚鼠的抗体水平与保护率均与其接种疫苗的抗原含量存在明显的相关性(χ2检验，P<0.01)。接种含有最高浓度抗原的①号疫苗的豚鼠在二免后2周，针对三种血清型抗原的凝集抗体效价均达到了1：21以上的水平。接种②号疫苗的豚鼠抗体水平较①号稍低，分别为1：16、1：15和1：18。但是，接种③号和④号疫苗的豚鼠抗体水平较②号进一步降低，其针对三种血清型抗原的抗体水平均低于1：16。所有PBS对照组豚鼠的血清抗体均为阴性(≤1：4)。攻毒试验结果表明，四种不同抗原含量疫苗(①号、②号、③号和④号)免疫的豚鼠中，①号疫苗组豚鼠全部存活，虽然部分豚鼠攻毒后出现了暂时的精神沉郁、扎堆和食欲减退的状况，但24小时内均逐渐恢复正常。②号疫苗组豚鼠得到了8/10以上的保护率。③号疫苗组豚鼠针对三种副猪嗜血杆菌4型H4L1株、5型H5L3株和12型H12L3株的攻击，分别获得了3/10、6/10和5/10的保护率。但是，④号疫苗不能提供接种豚鼠任何有意义的保护，死亡率均为100％(10/10)。PBS对照组豚鼠全部死亡。
5.3不同抗原含量疫苗的仔猪免疫保护试验结果
将不同抗原含量的四种副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗分别免疫仔猪，二次免疫后通过微量平板凝集试验方法分别检测副猪嗜血杆菌4型、5型和12型的抗体水平。检测结果表明(见表2)，免疫仔猪的抗体水平随疫苗中抗原含量的减少而降低(χ2检验，P<0.01)，且整体降低速度与免疫豚鼠相似。接种①号疫苗的仔猪在二免后2周(首免后5周)，针对三种血清型抗原的凝集抗体效价分别为1：28、1：28、1：37。接种②号疫苗的仔猪血清抗体效价达到了1：16、1：16、1：18的水平。所有PBS对照组仔猪血清抗体的副猪嗜血杆菌凝集效价均为阴性(≤1:4)。攻毒试验结果表明，四种不同抗原含量副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗(①号、②号、③号和④号)的免疫仔猪中，①号疫苗组仔猪得到完全保护；②号疫苗组中除4型H4L1株攻毒仔猪有1头发病外，其他仔猪全部得到保护(见表2)；虽然得到保护的仔猪在最初攻毒后也出现了暂时的体温升高、精神沉郁和食欲减退的状况，但48小时内均逐渐恢复正常。③号疫苗组仔猪针对副猪嗜血杆菌4型H4L1株、5型H5L3株和12型H12L3株的攻击，分别获得了1/5、3/5和3/5的保护率，其对应的血清抗体水平分别为1：12、1：11、1：12。但是，④号疫苗组仔猪没有得到有意义的保护，其保护率均不高于1/5。PBS对照组仔猪全部发病，并且仅有H5L3株攻毒组2头存活，其余全部死亡。这些试验结果表明，仔猪的抗体水平及其保护率均与其接种疫苗的抗原含量存在明显的相关性(χ2检验，P<0.01)。
5.4疫苗抗原含量及其豚鼠免疫抗体效价与猪免疫攻毒保护的平行相关性分析
制备四种抗原含量的副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗，分别命名为①号、②号、③号和④号疫苗。其中①号疫苗中4型H4L1株、5型H5L3株和12型H12L3株的灭活前抗原含量分别为2.0×109、1.0×109和1.0×109CFU/mL，②号疫苗中4型H4L1株、5型H5L3株和12型H12L3株的灭活前抗原含量分别为1.0×109、5.0×108和5.0×108CFU/mL，③号疫苗中4型H4L1株、5型H5L3株和12型H12L3株的灭活前抗原含量分别为5.0×108、2.5×108和2.5×108CFU/mL，④号疫苗中4型H4L1株、5型H5L3株和12型H12L3株的灭活前抗原含量分别为2.5×108、1.3×108和1.3×108CFU/mL。从其豚鼠和仔猪的免疫保护试验结果可以看出，仔猪通过肌肉途径2次(2mL/次)接种②号疫苗后，其针对三种抗原的抗体水平分别为1：16、1：16和1：18，针对副猪嗜血杆菌4型H4L1株、5型H5L3株和12型H12L3株攻击的保护率达到4/5以上。而对照猪至少4头发病(见表2)。此时，②号疫苗免疫豚鼠后的抗4型H4L1株、5型H5L3株和12型H12L3株的几何平均抗体效价分别为1：16、1：15和1：18(见表1)，与对应疫苗免疫仔猪的抗体水平一致。
综上所述，疫苗的抗原含量及其豚鼠免疫抗体效价与猪免疫攻毒保护平行相关性为，当副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗含灭活前4型H4L1株、5型H5L3株和12型H12L3株的抗原含量不少于1.0×109、5.0×108和5.0×108CFU/mL，按照免疫程序免疫豚鼠，免疫豚鼠的几何平均抗体效价分别不低于1：16、1：15和1：18；相应疫苗2次免疫仔猪(2mL/次)后，针对三种血清型毒株攻击的保护率均能达到80％(4/5)以上，而对照组5头仔猪至少4/5发病。由于豚鼠针对三种抗原的抗体效价(1：16、1：15和1：18)比较接近，我们统一将猪免疫攻毒保护平行相关的豚鼠免疫抗体效价确定为不低于1：16。由于仔猪针对三种抗原的抗体效价(1：16、1：16和1：18)也非常接近，我们统一将猪免疫攻毒保护平行相关的仔猪免疫抗体效价也确定为不低于1：16。
在实际生产和应用中，考虑到田间流行毒株的毒力强，疫苗需要足够长的保护期以及实际使用过程中的保存、运输等问题，现将副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗的使用剂量确定为2mL，其中1mL疫苗中副猪嗜血杆菌4型H4L1株、5型H5L3株和12型H12L3株抗原的灭活前活菌数分别不少于2.0×109、1.0×109和1.0×109CFU。
实施例6抗体消长规律、免疫持续期及仔猪母源抗体持续期试验
6.1妊娠母猪的抗体消长规律测定结果
使用3批副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗(批号：201201、201202、201203)分别免疫妊娠母猪，然后通过微量凝集试验检测妊娠母猪及其所产仔猪不同时间点针对副猪嗜血杆菌4型H4L1株、5型H5L3株和12型H12L3株抗原的平均抗体水平，统计分析其抗体消长规律。结果表明，妊娠母猪经过副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗免疫后，其针对副猪嗜血杆菌三种血清型抗原的抗体消长规律基本一致。在免疫前，所有母猪的血清抗体检测结果均为阴性；在首免后21日(即二免时间)，其抗体效价有所升高，但仅达到1:4的水平。在二免后7日，其抗体效价进一步升高，但仍然不高于1:16。在二免后14日(首免后35日)，针对三种血清型抗原的抗体效价均达到1:16及其以上，在二免后28日或60日继续升高并达到峰值(≥1:64)。然后缓慢下降，但是直至二免后180日，针对三种血清型抗原的抗体效价均在1:16以上。至210日后抗体效价进一步降低到1:16以下，不足以给新生仔猪提供足够的母源抗体保护。
6.2妊娠母猪所产仔猪的抗体消长规律测定结果
使用3批副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗(批号：201201、201202、201203)分别免疫妊娠母猪，生产后通过微量平板凝集试验检测出生仔猪不同时间针对副猪嗜血杆菌4型H4L1株、5型H5L3株和12型H12L3株抗原的抗体水平，统计分析其抗体消长规律。结果表明，妊娠母猪经过副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗两次免疫后，所产仔猪针对三种血清型抗原的母源抗体均较高且维持时间较长。在出生后母源抗体水平有一个逐渐升高的过程，到20日龄左右时达到顶峰，然后逐渐下降，但至30日龄时仍能达到1：16，然后快速下降，至40～50日龄时快速下降并消失。3批副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗(批号：201201、201202、201203)所产生各型的母源抗体水平及其消长规律没有明显差别。
6.3副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗免疫仔猪的抗体消长规律
使用3批副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗(批号：201201、201202、201203)分别免疫仔猪，然后通过微量平板凝集试验检测不同时间点针对副猪嗜血杆菌4型H4L1株、5型H5L3株和12型H12L3株抗原的抗体水平，统计分析其抗体消长规律。结果表明，仔猪经过副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗免疫后的抗体消长规律与母猪基本一致。从首免到二免后14日(首免后35日)，其抗体效价缓慢升高至1：16以上；在二免后28～60日达到峰值(1：64～1：111)，然后缓慢下降，但在二免后90～180日仍能维持在1：16以上的水平。然后继续下降，至二免后210日，大部分免疫组针对4型H4L1株、5型H5L3株和12型H12L3株的几何平均抗体效价已降到1：16以下。这些试验结果表明，该疫苗接种仔猪后的免疫产生期，即最早出现良好免疫力的时间为二免后14日，接种后保持良好免疫力的最长时间，即免疫持续期为二免后180日。
由上述内容可知，本发明从优势流行菌株中筛选出免疫原性良好的副猪嗜血杆菌4型H4L1株、5型H5L3株和12型H12L3株作为疫苗制备菌株，分别接种于TSB营养肉汤培养基上培养，收获培养物，经甲醛溶液灭活后，加入水基免疫佐剂混合乳化制成；用于预防4、5和12型副猪嗜血杆菌引起的副猪嗜血杆菌病；此疫苗具有安全性好、免疫效力高且免疫期长等优点。
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种副猪嗜血杆菌，其特征在于，所述的副猪嗜血杆菌为血清型4型H4L1株，于2018年01月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 2018019。
2.一种副猪嗜血杆菌，其特征在于，所述的副猪嗜血杆菌为血清型5型H5L3株，于2018年01月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 2018020。
3.一种副猪嗜血杆菌，其特征在于，所述的副猪嗜血杆菌为血清型12型H12L3株，于2018年01月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 2018021。
4.权利要求1-3任一项所述的副猪嗜血杆菌在制备副猪嗜血杆菌灭活疫苗中的应用。
5.一种副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗，其特征在于，含有经甲醛溶液灭活的副猪嗜血杆菌4型H4L1株、5型H5L3株和12型H12L3株及水基免疫佐剂，其中，所述副猪嗜血杆菌4型H4L1株、5型H5L3株和12型H12L3株均于2018年01月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号分别为：CCTCC M 2018019，CCTCC M 2018020，CCTCC M 2018021。
6.一种如权利要求5所述的副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗，其特征在于，在1mL副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗中，副猪嗜血杆菌4型H4L1株、5型H5L3株和12型H12L3株三种抗原分别含2.0×l09、1.0×109和1.0×109CFU菌体。
7.一种如权利要求5所述的副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗的生产方法，其特征在于，包括如下步骤：
a.分别将副猪嗜血杆菌H4L1株、副猪嗜血杆菌H5L3株和副猪嗜血杆菌H12L3株菌种增殖培养，得到副猪嗜血杆菌H4L1株菌液、副猪嗜血杆菌H5L3株菌液和副猪嗜血杆菌H12L3株菌液，并对其进行活菌计数，副猪嗜血杆菌4型H4L1株、5型H5L3株和12型H12L3株的活菌含量分别不少于2.0×109、1.5×109和1.0×109CFU/mL；
b.将副猪嗜血杆菌H4L1株、H5L3株和H12L3株的菌液分别单独灭活，按菌液总量的0.3％加入甲醛溶液，在37℃灭活48小时；
c.用中空纤维超滤器将灭活检验合格的菌液浓缩去除上清，根据灭活前活菌计数结果，使用无菌PBS将H4L1株、H5L3株和H12L3株菌体抗原稀释并调节浓度至7.2×109、3.6×109和3.6×109CFU/mL，并将三种抗原液按1:1:1的比例混合均匀；
d.将抗原液与GEL佐剂混合，搅拌均匀，在终止搅拌前加入硫柳汞溶液充分混匀，最终使疫苗中含灭活前H4L1株活菌数至少为2.0×109CFU/mL，含灭活前H5L3株和H12L3株活菌数均至少为1.0×109CFU/mL。
8.一种如权利要求5所述的副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗的生产方法，其特征在于，在步骤d中，将抗原液与GEL佐剂按照(80％～90％)：(20％～10％)的体积比混合，室温下500～800r/min搅拌0.5～1h，至其混合均匀；按照疫苗总体积的0.01％加入硫柳汞。
9.权利要求5所述的副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗在临床上防治副猪嗜血杆菌疾病的应用。
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