CN108018230A

CN108018230A - 一种血清7型副猪嗜血杆菌天然弱毒菌株及其应用

Info

Publication number: CN108018230A
Application number: CN201711237247.5A
Authority: CN
Inventors: 王湘如; 蔡旭旺; 张勤学; 陈焕春; 徐晓娟
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2017-11-30
Filing date: 2017-11-30
Publication date: 2018-05-11
Anticipated expiration: 2037-11-30
Also published as: CN108018230B

Abstract

本发明公开了一种血清7型副猪嗜血杆菌天然弱毒菌株及其应用，所述血清7型副猪嗜血杆菌天然弱毒菌株于2017年11月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2017706；本发明的血清7型副猪嗜血杆菌天然弱毒菌株致病力极低，适合用于制备治疗副猪嗜血杆菌病的药物；所述药物为疫苗；所述疫苗的制备方法包括如下步骤：S1.菌体培养；S2.菌体收集；S3.冻干。制备药物时无需灭活及灭活检验，制备方法简单，药物生产效率更高；所述疫苗对28‑35日龄仔猪，免疫剂量为2.0×10⁸CFU/mL时，免疫保护率即可达到100％。

Description

一种血清7型副猪嗜血杆菌天然弱毒菌株及其应用

技术领域

本发明属于副猪嗜血杆菌应用领域，更具体地，涉及一种血清7型副猪嗜血杆菌天然弱毒菌株及其应用。

背景技术

副猪嗜血杆菌病是近年来严重危害养猪业的新发细菌性传染病，引起猪的多发性浆膜炎、关节炎和脑膜脑炎等，发病率一般为10-15％，死亡率可达50％以上，给养猪业带来了巨大的经济损失，引起了人们的日益重视。该病的致病菌副猪嗜血杆菌(Hps)的血清型复杂多样，按Kieleetin.Rap-Gbarideosn(KRG)琼脂扩散血清分型方法，至少可将Hps分为 15个血清型，另有20％以上的分离株血清型不可定。已有的资料表明，Hps具有明显的地方性特征。

因副猪嗜血杆菌极易产生耐药性，所以控制该病的有效方式是疫苗接种。文献报道商业疫苗或自家苗的使用可以控制副猪嗜血杆菌的感染。但是也有使用灭活菌苗预防失败的实例，这可能是由于致病菌株与疫苗菌株血清型不同因而缺乏交叉保护。虽然交叉保护是对商品灭活疫苗的基本要求，但是菌株特异性灭活菌苗可能因为猪群中存在不止一种菌株或血清型而缺乏效力，也可能因为后来猪群中引入了新的菌株而失去效力。由于副猪嗜血杆菌血清型的多样性以及占很大比例的不能分型菌株，菌株毒力的差异，以及当前对保护性抗原和毒力因子缺乏深刻认识，还不可能有一种灭活菌苗同时对所有的致病菌株产生交叉保护力。研制具有交义保护的疫苗是预防和控制副猪嗜血杆菌病的必然要求和大势所趋。

疫苗产品的开发除高效的技术要求外，免疫成本必须低廉，不能超出养殖业的承受能力。减(弱)毒活疫苗因具有免疫效价高(可减少抗原剂量)、成本低廉、可开发广谱疫苗(活菌疫苗具有交叉保护性)的新技术优势，是当前多数传染病的研究热点。

发明内容

针对上述现有技术中的不足，本发明提供了一种血清7型副猪嗜血杆菌天然弱毒菌株，该弱毒菌株的致病力大大减弱，适合用于制备治疗副猪嗜血杆菌病的药物。

本发明的第二个目的在于提供一种上述血清7型副猪嗜血杆菌弱毒菌株的应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案予以实现的。

一种血清7型副猪嗜血杆菌天然弱毒菌株，所述血清7型副猪嗜血杆菌天然弱毒菌株于2017年11月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2017706；分类命名：副猪嗜血杆菌HPS1712，拉丁文学名：Haemophilus parasuis HPS1712，地址：中国武汉武汉大学。

所述的血清7型副猪嗜血杆菌天然弱毒菌株的应用，利用所述血清7型副猪嗜血杆菌天然弱毒菌株制备治疗副猪嗜血杆菌病的药物。

优选的，所述的血清7型副猪嗜血杆菌天然弱毒菌株的应用，所述药物为疫苗。

所述疫苗的制备方法，包括如下步骤：

S1.菌体培养：

将副猪嗜血杆菌HPS1712菌株的菌粉接种于TSA/V/S固体培养基分区划线，37℃培养 24h；挑取单菌落重新接种TSA/V/S固体培养基传3～5代，37℃培养12～16h然后挑取平板上单菌落接种于TSB/V/S液体培养基活化12h，进行纯粹检验合格后，转接到大瓶TSB/V/S 液体培养基，37℃，170rpm摇床振荡扩大培养12h；所述TSA/V/S及TSB/V/S培养基为含5％牛血清，0.2％NAD的培养基；

S2.菌体收集：

将步骤S1中液体培养的菌液移入无菌离心管中，离心，弃上清，得到菌体沉淀，用配得的保护剂重悬菌体沉淀；所述保护剂为含脱脂乳9.12％、海藻糖2.87％、甘油2.96％的悬液，经116℃高压蒸汽灭菌20分钟后使用；所述保护剂有利于在重悬阶段保护副猪嗜血杆菌HPS1712菌体活性；

S3.冻干

取混匀后的菌悬液分装入无菌带塞的青瓶中，-80℃超低温冰箱预冻8h，然后取出立即放入真空冻干机中开始冻干；冻干样品取出后放入-20℃冰箱保存备用；使用时恢复至室温后加入20％氢氧化铝胶生理盐水进行稀释。

优选的，所述步骤S1中，按菌液与培养基的体积比1:100，将单菌落接种到大瓶TSB/V/S 培养基扩大培养。

优选的，所述步骤S2中离心条件为6000rpm离心10min。

优选的，所述步骤S3中，冻干条件为真空度0.37mbar，冷凝器温度为-55℃，真空干燥时间为25h。

优选的，所述步骤S3制备的疫苗，使用时恢复至室温后加入20％氢氧化铝胶生理盐水稀释至含活菌2.0×10⁷～2.0×10¹⁰CFU/mL；对28-35日龄仔猪，当含活菌2.0×10⁸CFU/mL 时，免疫保护率即可达到100％。

与现有技术相比，本发明有益效果在于：本发明的血清7型副猪嗜血杆菌天然弱毒菌株的致病力大大减弱，制备药物时无需灭活及灭活检验，制备方法简单，药物生产效率更高，适合用于制备治疗副猪嗜血杆菌的疫苗。

附图说明

图1为实施例1菌落的革兰氏染色镜检图。

图2为实施例1菌落PCR鉴定的凝胶电泳图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

以下以具体实施条件为例对本发明方法进行进一步说明。

实施例1

副猪嗜血杆菌7型天然弱毒菌株的分离鉴定：

1)菌种

副猪嗜血杆菌7型天然弱毒菌株，分离编号HPS1712，于2007年2月6日分离自河南省舞阳县某猪场健康仔猪的鼻腔，由华中农业大学农业微生物学国家重点实验室分离、鉴定和保存。

副猪嗜血杆菌5型SH0165株、4型MD0322株、13型FX2002株，由华中农业大学农业微生物学国家重点实验室分离、鉴定和保存，作为检验用菌株。

2)实验动物

16～20g健康Balb/c小鼠；28～35日龄健康仔猪，购买自湖北武汉万年青畜牧有限公司，经副猪嗜血杆菌抗体ELISA检测试剂盒(实验室自建方法)检测，抗体为阴性。

3)菌种纯化与纯粹检验

3.1纯粹检验

对新鲜样本组织表面进行无菌处理，无菌条件下剪取内部组织在TSA琼脂培养皿划线分离培养细菌，将培养皿置于37℃恒温箱中培养24～48小时后观察，连续划线传代3次以纯化菌株后接种TSB培养基连续培养3代以适应体外培养，加保护剂冻干后对冻干菌进行纯粹检验，使用的适宜培养基为含5％新生牛血清、1％的0.1％NAD的TSA斜面，收获新鲜菌液进行革兰氏染色并镜检，如图1所示。结果如下表1，结果表明HPS1712原始冻存菌种纯粹检验合格，无杂菌。

表1HPS1712株纯粹检验结果

3.2形态学鉴别

将冻干菌种划线接种TSA固体培养基、巧克力琼脂平板、鲜血琼脂平板等培养基，置 37℃恒温箱中培养观察其生长表现。挑取生长的单菌落接种TSB培养基培养，8～12小时收获新鲜菌液进行革兰氏染色并镜检。副猪嗜血杆菌在几种代表性固体培养基上的生长情况如表2所示，在几种代表性液体培养基中的生长表现如表3所示。

结果表明：副猪嗜血杆菌在巧克力琼脂平板、TM/SN固体培养基、TSA固体培养基，以及BHI液体培养基、TSB液体培养基和TMB液体培养基中均生长良好。在其他培养基上不生长或生长较差。本菌有严格的NAD依赖性，在无NAD的培养基上不生长。HPS1712 株在TSA固体培养基上37℃培养生长良好，培养24小时之后，用肉眼观察可见针尖大小、无色透明、光滑湿润的菌落；接种于TSB液体培养基生长旺盛。纯培养物或菌落抹片革兰氏染色后在显微镜下观察，为革兰氏阴性细小杆菌，具有多种不同的形态，可见单个的球杆菌、杆菌或长的细长的以致丝状的菌体。

从表3可以看出，副猪嗜血杆菌在营养肉汤、马丁肉汤、胰眎胨液体培养基等液体培养基中均不能生长，在LB液体培养基中生长极差。在TSB液体培养基、TMB液体培养基和BHI液体培养基中生长良好，在前种培养基中接种8～12小时活菌数达最大值，在BHI 液体培养基中接种12～18小时活菌数达最大值。

表2副猪嗜血杆菌在几种固体培养基上培养不同时间后的菌落大小比较

培养时间

营养琼脂

鲜血琼脂

胰眎胨

LB固体

巧克力琼脂

TSA

TM/SN

24小时

—

≤1mm

48小时

—

针尖大小

≤2mm

72小时

—

针尖大小

≤1mm

≤3mm

96小时

—

针尖大小

≤2mm

≤4mm

“—”表示不生长或无肉眼可见菌落。

表3副猪嗜血杆菌在几种液体培养基上培养不同时间后的活菌数比较

培养时间

营养肉汤

马丁肉汤

胰眎胨

LB

TSB

TMB

BHI

6小时

—

10³

10⁹

10⁷

12小时

—

10⁴

10⁹

18小时

—

10³

10⁸

10⁹

24小时

—

10²

10⁷

10⁹

“—”表示培养基清亮不变浑浊，即不生长。

4)PCR鉴定

根据副猪嗜血杆菌16S rRNA序列设计引物，由上海生工公司合成：

上游引物：5'-GGC TTC GTC ACC CTC TGT-3'

下游引物：5'-GTG ATG AGG AAG GGT GGT GT-3'

反应体系(50ul)：10倍缓冲液5ul，25mmol/L MgCl₂ 1.5ul，dNTPs 1.0ul，1.5umol/L 上游引物1.5ul，1.5umol/L下游引物1.5ul，ExTapE 0.5ul，无菌水9ul，模板10ul。反应条件：94℃变性4分钟；94℃50秒，59℃50秒，72℃10分钟，72℃10分钟，PCR产物4℃保存。

序列测定：用DNA回收试剂盒回收PCR产物，将该PCR产物连接入pMD18-T载体中，送上海生工公司测序，测3个克隆。

如图2所示，根据副猪嗜血杆菌16S rRNA序列设计引物经PCR扩增的产物为822bp大小的片段，测序结果如序列表SEQ ID No.1所示，比对其序列与已知的副猪嗜血杆菌16SrRNA序列的同源性在98％-99％之间，因此确定所分离得到菌株为副猪嗜血杆菌，进一步用琼脂扩散试验进行血清分型，鉴定其为血清7型，最终将该菌株命名为HPS1712。

所述血清7型副猪嗜血杆菌天然弱毒菌株于2017年11月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为保藏编号为CCTCC M 2017706；分类命名：副猪嗜血杆菌HPS1712，地址：中国武汉武汉大学。

实施例2

将实施例1获得的副猪嗜血杆菌7型天然弱毒菌株HPS1712进行致病力检测：

1)对小鼠毒力测定

16～20g健康Balb/c小鼠130只，随机分成13组，每组10只。将副猪嗜血杆菌HPS1712 株及强毒菌株SH0165株按不同的剂量分成6个梯度，每株菌各注射6组小鼠，胸腔内注射菌液0.5ml/只，含活菌数分别为7.7×10⁷CFU，9.4×10⁸CFU，1.3×10⁹CFU，1.7×10¹⁰CFU， 2.1×10¹¹CFU，1.7×10¹²CFU，另1组注射0.5ml PBS作为对照，注射后观察14日，统计各组小鼠的死亡率，结果如下表4所示。

表4副猪嗜血杆菌7型HPS1712株及强毒菌株SH0165株对Balb/c小鼠的感染试验结果

2)对仔猪的毒力测定

用28～35日龄健康易感仔猪50头，随机分为10组，每组5头。1～5组分别用1.0×10¹⁰CFU， 1.0×10¹¹CFU，1.0×10¹²CFU,1.0×10¹³五个剂量的HPS1712株菌悬液颈部肌肉注射2ml接种仔猪，6～9组分别用1.0×10⁹CFU，1.0×10¹⁰CFU，1.0×10¹¹CFU，1.0×10¹²CFU四个剂量的 SH0165株菌悬液颈部肌肉注射2ml接种仔猪，剩下1组作为对照接种等量PBS。并对临床发病情况与体温结果进行统计，结果表明低、中、高剂量的菌悬液均不造成仔猪死亡，整个观察期内无明显临床症状出现(见表5)。

表5HPS1712株及SH0165株感染仔猪致病情况

对小鼠及仔猪的毒力测定结果表明，参考菌株SH0165在7.7×10⁷CFU便造成了10只小鼠全部死亡(死亡率100％)，而本发明的HPS1712菌株在最高攻毒剂量1.7×10¹²CFU下才发病1只，未发生死亡；参考菌株SH0165在1.0×10⁹CFU便造成了3头仔猪发病，而本发明的HPS1712菌株在最高攻毒剂量1.0×10¹³CFU才引起1只仔猪发病。说明本发明的副猪嗜血杆菌7型天然弱毒株HPS1712具有毒力弱，安全性高的特性，适合用于制备治疗副猪嗜血杆菌病的药物。

实施例3

副猪嗜血杆菌7型天然弱毒菌株HPS1712的免疫效力检测：

1)疫苗的制备：

S1.菌体培养：

将副猪嗜血杆菌HPS1712菌株的菌粉接种于TSA/V/S固体培养基分区划线，37℃培养 24h；挑取单菌落重新接种TSA/V/S固体培养基传3～5代，37℃培养12～16h然后挑取平板上单菌落接种于TSB/V/S液体培养基活化12h，进行纯粹检验合格后，按菌液与培养基的体积比1:100，将单菌落转接到大瓶TSB/V/S液体培养基，37℃，170rpm摇床振荡扩大培养12h，所述TSA/V/S及TSB/V/S培养基为含5％牛血清，0.2％NAD的培养基；

S2.菌体收集：

将步骤S1中液体培养的菌液移入50ml无菌离心管中，6000rpm离心10min，弃上清，得到菌体沉淀，用配得的保护剂重悬菌体沉淀，所述保护剂为含脱脂乳9.12％、海藻糖2.87％、甘油2.96％的悬液，经116℃高压蒸汽灭菌20分钟后使用；

S3.冻干

取2ml混匀后的菌悬液分装入无菌带塞的10ml青瓶中，-80℃超低温冰箱预冻8h，然后取出立即放入真空冻干机中开始冻干，冻干条件真空度设置为0.37mbar，冷凝器温度设置为-55℃，设置真空干燥时间为25h，冻干样品取出后放入-20℃冰箱保存备用；使用时恢复至室温后加入20％氢氧化铝胶生理盐水进行稀释。

将制备得到的治疗副猪嗜血杆菌病的疫苗进行免疫保护试验：

2)免疫原性试验

用28～35日龄健康易感仔猪10头，分为2组，每组5头，第1～4组每头颈部肌肉接种HPS1712株菌液1ml(分别含活菌2.0×10⁷CFU，2.0×10⁸CFU，2.0×10⁹CFU，2.0×10¹⁰CFU)，第5组每头颈部肌肉注射生理盐水1ml作为空白对照，一免14日后按同样方式和剂量二免。二免14日后，对免疫组和空白对照组用血清5型强毒株SH0165株进行攻毒，胸腔注射一个发病剂量的菌液(含活菌1.5×10¹⁰CFU/头)，攻毒后观察14日，统计发病、死亡情况与保护率，结果如表6所示。

表6疫苗免疫原性试验

表6结果表明，HPS1712菌株免疫组仔猪健康状况较好，具有很好的免疫源性， 2.0×10⁸CFU/mL的免疫剂量就能产生较好的保护性。

3)对不同血清型的交叉保护试验

用28～35日龄健康易感仔猪30头，分为6组，每组5头，其中第1、3和5组每头颈部肌肉接种HPS1712疫苗1ml(含活菌2.0×10⁸CFU)，一免14日后按同样方式和剂量二免，第2、4和6组作为空白对照组注射生理盐水。二免14日后，第1、2组各胸腔内注射1个发病剂量的MD0322株菌液3ml；第3、4组各胸腔内注射1个发病剂量的SH0165株菌液 3ml；第5、6组各胸腔内注射1个发病剂量的FX2002株菌液3ml；攻毒后观察14日，统计发病、死亡情况与保护率，结果如表7所示。

表7疫苗对不同血清型的免疫原性试验

交叉保护性实验结果表明，HPS1712疫苗对当前流行的4型、5型和13型副猪嗜血杆菌均有较好的交叉保护作用，对4型、5型和13型副猪嗜血杆菌的交叉保护率均为100％。

综上所述，本发明的血清7型副猪嗜血杆菌天然弱毒菌株致病力极低，适合用于制备治疗副猪嗜血杆菌病的药物，制备药物时无需灭活及灭活检验，制备方法简单，且药物生产效率更高，对28-35日龄仔猪，免疫剂量为2.0×10⁸CFU/mL时，免疫保护率即可达到100％。

以上所述，仅为本发明的说明实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，做出的若干改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明精神和范围的情况下，利用以上所揭示的技术内容做出的些许更改、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所做的任何等同变化的更改、修饰与演变，均仍属于本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 华中农业大学

<120> 一种血清7型副猪嗜血杆菌天然弱毒菌株及其应用

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 822

<212> DNA

<213> 副猪嗜血杆菌HPS1712

<400> 1

gtgatgagga agggtgatgt tttaatagag cattacattg acgttagtca cagaagaagc 60

accggctaac tccgtgccag cagccgcggt aatacggagg gtgcgagcgt taatcggaat 120

gactgggcgt aaagggcacg caggcggtga cttaagtgag atgtgaaagc cccgagctta 180

acttgggaat tgcatttcat actgggtggc tagagtattt tagggagggg tagaattcca 240

cgtgtagcgg tgaaatgcgt agagatgtgg aggaataccg aaggcgaagg cagccccttg 300

ggaaaatact gacgctcatg tgcgaaagcg tggggagcaa acaggattag ataccctggt 360

agtccacgct gtaaacgctg tcgatttgcg gattgggctt tatgtttggt gcccgtagct 420

aacgtgataa atcgaccgcc tggggagtac ggccgcaagg ttaaaactca aatgaattga 480

cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg atgcaacgcg aagaacctta 540

cctactcttg acatcctaag aagaactcag agatgagttt gtgccttcgg gaacttagag 600

acaggtgctg catggctgtc gtcagcacgt gttgtgaaat gttgggttaa gtcccgcaac 660

gagcgcaacc cttatccttt gttgccagcg atttggtcgg gatctcaaag gagactgcca 720

gtgattaact ggaggaaggt ggggatgacg tcaagtcatc atggccctta cgagtagggc 780

tacacacgtg ctacaatggt gcatacagag ggtgacgaag cc 822

Claims

1.一种血清7型副猪嗜血杆菌天然弱毒菌株，其特征在于，所述血清7型副猪嗜血杆菌天然弱毒菌株于2017年11月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC M2017706，分类命名：副猪嗜血杆菌HPS1712。

2.权利要求1所述的血清7型副猪嗜血杆菌天然弱毒菌株的应用，其特征在于，利用所述血清7型副猪嗜血杆菌天然弱毒菌株制备治疗副猪嗜血杆菌病的药物。

3.根据权利要求2所述的血清7型副猪嗜血杆菌天然弱毒菌株的应用，其特征在于，所述药物为疫苗。

4.根据权利要求3所述的血清7型副猪嗜血杆菌天然弱毒菌株的应用，其特征在于，所述疫苗的制备方法，包括如下步骤：

S1.菌体培养：

将副猪嗜血杆菌HPS1712菌株的菌粉接种于TSA/V/S固体培养基分区划线，37℃培养24h；挑取单菌落重新接种TSA/V/S固体培养基传3～5代，37℃培养12～16h然后挑取平板上单菌落接种于TSB/V/S液体培养基活化12h，进行纯粹检验合格后，转接到大瓶TSB/V/S液体培养基，37℃，170rpm摇床振荡扩大培养12h；所述TSA/V/S及TSB/V/S培养基为含5％牛血清，0.2％NAD的培养基；

S2.菌体收集：

将步骤S1中液体培养的菌液移入无菌离心管中，离心，弃上清，得到菌体沉淀，用配得的保护剂重悬菌体沉淀；所述保护剂为含脱脂乳9.12％、海藻糖2.87％、甘油2.96％的悬液，经116℃高压蒸汽灭菌20分钟后使用；

S3.冻干

取混匀后的菌悬液分装入无菌带塞的青瓶中，-80℃预冻8h，然后取出立即放入真空冻干机中开始冻干；冻干样品取出后放入-20℃冰箱保存备用；使用时恢复至室温后加入20％氢氧化铝胶生理盐水进行稀释。

5.根据权利要求4所述的血清7型副猪嗜血杆菌天然弱毒菌株的应用，其特征在于，所述步骤S1中，按菌液与培养基的体积比1:100，将单菌落接种到大瓶TSB/V/S培养基扩大培养。

6.根据权利要求4所述的血清7型副猪嗜血杆菌天然弱毒菌株的应用，其特征在于，所述步骤S2中离心条件为6000rpm离心10min。

7.根据权利要求4所述的血清7型副猪嗜血杆菌天然弱毒菌株的应用，其特征在于，所述步骤S3中冻干条件为真空度0.37mbar，冷凝器温度为-55℃，真空干燥时间为25h。

8.根据权利要求4所述的血清7型副猪嗜血杆菌天然弱毒菌株的应用，其特征在于，所述步骤S3制备的疫苗，使用时恢复至室温后加入20％氢氧化铝胶生理盐水稀释至含活菌2.0×10⁷～2.0×10¹⁰CFU/mL。