CN104450557A - 一种血清 5 型副猪嗜血杆菌疫苗株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种血清5型副猪嗜血杆菌疫苗株，其分类命名为副猪嗜血杆菌(Haemophi lus parasuis)，菌株名称为JSYZ10，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M 2014260，保藏日期：2014年6月15日；还涉及了所述的血清5型副猪嗜血杆菌疫苗株在制备副猪嗜血杆菌灭活疫苗中的应用。本发明的血清5型副猪嗜血杆菌JSYZ10株生物学稳定，对仔猪具有很强的致病性，灭活后接种仔猪，具有很好的免疫原性。将其作为疫苗候选株制成的单价疫苗安全性好，能够对仔猪产生较高的抗体，持续期长，具有很好的免疫效力，能够抵抗同型野毒株的攻击。免疫后猪群发病率和死亡率明显降低，减少猪场的经济损失，其免疫效果达到或优于市场上现有商品化疫苗。

Description

一种血清 5 型副猪嗜血杆菌疫苗株及其应用

技术领域

本发明涉及兽医生物制品中副猪嗜血杆菌灭活疫苗领域，特别是涉及一种血清5型副猪嗜血杆菌疫苗株，还涉及该疫苗株在制备灭活疫苗中的应用以及制备灭活疫苗的方法。

背景技术

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，HPS)是一种G-球杆菌，是猪的一种条件性病原菌，可引起副猪嗜血杆菌病。该病于1910年由德国学者Glasser首先报道，现已在全世界范围内广泛分布。目前，副猪嗜血杆菌感染是引起猪场仔猪高死亡率的主要病因之一。该病目前给中国猪群带来很大威胁，随着猪繁殖与呼吸综合征(PRRS，蓝耳病)的流行，副猪嗜血杆菌病给猪群造成的损失比以往更为严重。副猪嗜血杆菌只感染猪，具有很强的宿主特异性，可以影响2周龄～4月龄的猪，主要在断奶前后和保育舍阶段发病，发病率一般为10％～15％，严重时死亡率可达50％。

Hps是一种细小杆菌,在显微镜下呈多形态,非溶血性,不运动,无芽孢,无鞭毛，革兰氏阴性。新分离的菌株多呈球杆状或双球状,有时可呈短链状,在陈旧培养物中多呈多形态,有长杆状和丝状。Hps培养条件严格，生长依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD或V因子),不需要X因子。目前认为胰蛋白胨大豆琼脂(TSA培养基)和胰蛋白胨大豆(TSB)培养基是最适培养基。在添加了NAD和血清的TSA培养基上生长的菌落呈圆形,隆起,表面光滑,边缘整齐，灰白色半透明，针尖大小。

副猪嗜血杆菌至少有15种血清型,但临床分离菌中约20％无法定型。不同血清型的毒力不同，其中血清1、5、10、12、13、14型毒力最强,2、4、8、15型具有中等毒力,3、6、7、9、11型不能引起临床感染。从世界范围内看,血清4、5、12、13型最为流行,日本、德国、美国、西班牙、加拿大和中国以血清4型和5型最常见,澳大利亚和丹麦分离的菌株主要为血清5型和13型,但最新的研究结果表明,危害北美各猪场的Hps流行血清型发生了改变,在美国的猪场中血清型5不再广泛流行,而以血清4型(39％)和不能分型的分离株(27％)最为流行。HPS在我国普遍流行，目前，在河北、河南、湖北、安徽、上海、广东、江西、江苏等省市均有HPS病的发生报道。我国当前Hps流行的优势血清型主要为4、5、12、13型。

目前以副猪嗜血杆菌病为代表的细菌病对养猪业的危害正日益加重，从而导致大量使用抗生素进行治疗，结果导致细菌耐药性不断增强，耐药菌株不断出现，尤其是副猪嗜血杆菌，非常容易耐药，导致治疗效果不好，从而养殖户加大抗生素用量，造成恶性循环。研究表明，用同血清型的菌株制成的灭活疫苗能够有效抵抗野毒株的感染，是预防和控制副猪嗜血杆菌病最有效的措施。近年来，国内也开展了灭活疫苗的研究，显示了很好的防治效果。因此，在了解本我国主要流行菌的血清型的基础上，采用灭活疫苗进行接种，可以有效预防本病的发生。同一血清型的Hps毒力可能不同，免疫原性也不同，所以，筛选一株毒力强、免疫原性好的菌株是制备Hps灭活疫苗的关键，也是预防控制本病的重中之重。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种血清5型副猪嗜血杆菌疫苗株(JSYZ10)，该菌株是一株强毒株，具有很好的免疫原性，利用该菌株可以制备出效果良好的副猪嗜血杆菌灭活疫苗。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种血清5型副猪嗜血杆菌疫苗株，其分类命名为副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)，菌株名称为JSYZ10，已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉、武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M 2014260，保藏日期：2014年6月15日。

该菌株由2010年10月在江苏省扬州市一猪场发病猪分离获得的，具有较强的毒力和很好的免疫原性。经琼脂凝胶扩散试验证明，该菌株为血清5型。

利用该菌株通过常规方法制成不同佐剂的灭活疫苗，佐剂可以是白油佐剂、铝胶佐剂或206佐剂中的一种，分别得到的白油佐剂灭活疫苗含菌量为2.5×109CFU/mL、铝胶佐剂灭活疫苗含菌量为2.0×109CFU/mL、206佐剂灭活疫苗含菌量为2.5×109CFU/mL，可预防由血清5型副猪嗜血杆菌引起的副猪嗜血杆菌病。从而表明，该菌株是一株具有很好免疫原性。

本发明还提供了一种副猪嗜血杆菌灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：

(1)菌种选择血清5型副猪嗜血杆菌分离株JSYZ10，已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉、武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M2014260，保藏日期：2014年6月15日；

(2)生产种子的制备，取冻干的JSYZ10株，加无菌生理盐水溶解后，划线接种于TSA培养基上，37℃培养24h，挑取三个典型菌落，分别接种到3.0mLTSB液体培养基中，37℃振荡培养20～22h，收获培养物，进行纯粹性检验，合格后按1％比例接种到TSB液体培养基中(即加入TSB液体培养基体积1％的液体菌种)，37℃振荡培养20～22h，收获培养物，进行纯粹性检验，检验合格后，作为生产种子，置4℃，保存不超过1日；

(3)疫苗菌液的制备，取新鲜制备的生产种子，按1％比例接种到含有TSB培养基的发酵罐中，37℃振荡培养20～22h，收获并取样，进行纯粹性 检验，并测量菌液OD值，每批疫苗菌液应无杂菌生长，且活菌数达到2.0×10⁹CFU/mL；

(4)菌液的灭活，向检验合格的菌液中加入质量分数为10％的甲醛溶液，使甲醛最终的质量浓度百分比为0.2％，于37℃灭活18h，每3～4h摇动一次；

(5)灭活疫苗的制备，将灭活检验合格的菌液采用常规方法制备成白油佐剂灭活疫苗、铝胶佐剂灭活疫苗或206佐剂灭活疫苗。

上述步骤中的纯粹性检验按现行《中华人民共和国兽药典》附录进行。

本发明的有益效果是：本发明的血清5型副猪嗜血杆菌JSYZ10株生物学稳定，对仔猪具有很强的致病性，灭活后接种仔猪，具有很好的免疫原性。将其作为疫苗候选株制成的单价疫苗安全性好，能够对仔猪产生较高的抗体，持续期长，具有很好的免疫效力，能够抵抗同型野毒株的攻击。免疫后猪群发病率和死亡率明显降低，减少猪场的经济损失，其免疫效果达到或优于市场上现有商品化疫苗。

具体实施方式

以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1：血清5型副猪嗜血杆菌的分离、鉴定及生物学特性

一、副猪嗜血杆菌的分离

1、培养基的配制

(1)TSA的配制，向1000mL蒸馏水中加入TSA 40g，充分溶解后，经过121℃30min高压灭菌后，放置室温，待温度降至50℃左右，分别向TSA中添加灭活的犊牛血清和NAD(烟酰胺二嘌呤)，使血清和NAD最终的质量浓度百分比分别达到5％和0.01％，然后倒入一次性平皿中，待冷却凝固后，包装放置4℃备用。TSA平皿在4℃中保存最好不要超过30日，以免平皿中 的培养基干固，影响效果。

(2)TSB的配制，向1000mL蒸馏水中加入TSB 30g，充分溶解后，经过121℃30min高压灭菌后，放置室温，待温度降至50℃左右，分别向TSB中添加灭活的犊牛血清和NAD(烟酰胺二嘌呤)，使血清和NAD最终的质量浓度百分比分别达到5％和0.01％，放置4℃备用。TSB平皿在4℃中保存最好不要超过30日，以免影响培养效果。

2、病原菌的分离

2010年10月，在江苏省扬州市某大型养猪场出现临床疑似副猪嗜血杆菌污染的病猪，解剖后，表现出胸膜炎、心包炎、关节肿胀。用无菌接种环从疑似病猪新鲜的心包积液、关节液中取样，在TSA培养基(含质量浓度百分比5％血清和0.001％的NAD)上划线接种，37℃培养24h～48h。挑取单个半透明隆起的小菌落，在TSA固体培养基上采取分区划线法，进行2次单菌落纯化培养，直至无任何杂菌为止。

二、副猪嗜血杆菌的鉴定

1、镜检

挑取上述纯化培养的单菌落在事先滴有生理盐水的载玻片上涂菌，按照常规革兰氏染色法进行染色，在光学显微镜观察。在显微镜下可见，细菌为革兰氏阴性细小杆菌，具有多种不同的形态，从单个的球杆菌到长的、细长的、甚至有细丝状的菌体。

2、NAD依赖性试验

用接种环挑取上述纯化的单菌落，水平划线于无NAD的TSA平皿上，同时挑取金黄色葡萄球菌垂直于水平划线，37℃培养24h～48h，观察是否出现“卫星生长现象”，即在葡萄球菌苔附近的的菌落较大，远侧的菌落较小甚至没有菌落存在。如果为副猪嗜血杆菌应该出现“卫星生长现象”。

3、生化鉴定试验

挑取分离纯化的疑似副猪嗜血杆菌的单菌落，水平划线于TSA培养基上，于37℃培养14h～16h，然后分别接种含NAD的微量生化管，于37℃培养48h，结果为发酵半乳糖、葡萄糖、麦芽糖、果糖、和木糖，不发酵蔗糖和甘露醇。硝酸盐还原试验、接触酶试验阳性，吲哚试验、脲酶试验、氧化酶试验阴性。生化结果表明该菌符合副猪嗜血杆菌的生化特征。

4、16S rRNA基因序列测定与分析

(1)引物设计，参照Olveira S等发表的副猪嗜血杆菌16S rRNA基因序列设计引物。

上游引物：5′-GGC TTC GTC ACC CTC TGT-3′

下游引物：5′-GTG ATG AGG AAG GGT GGT GT-3′

PCR引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。

(2)细菌DNA模板的制备，将待检菌株菌液12000r/min离心3min，弃去上清液后，用无菌DEPC水悬浮，在振荡器上涡旋1min，于沸水中水浴20min，取出后置于-20℃冰箱中冻结。冻融后12000r/min离心1min，上清液即为模板DNA。

(3)PCR的扩增，以菌液DNA为模板，反应体系(50μl)如表1所示：

表1 PCR扩增反应体系 

rTaq-Mix	25μl
		DEPC水	22μl
上游引物	1.0μl
		下游引物	1.0μl
模板DNA	1.0μl
		总体积	50ul

反应条件：94℃预变性5min；94℃变性40S，60℃退火40S，72℃延伸1min，运行30个循环；72℃再延伸10min，PCR产物4℃保存。以DEPC水为 模板作阴性对照。

用1×TAE电泳缓冲液配制的终浓度1.2％琼脂糖制胶，取上述PCR产物5μl进行电泳，结果在预期位置出现822bp目的条带。

(4)16S rRNA PCR扩增产物测序

利用DNA凝胶回收试剂盒回收扩增的PCR产物(DNA片段)，然后与pMD18-T克隆载体连接，由生工生物工程(上海)股份有限公司进行DNA测序。将测得的序列与GenBank上的相应序列进行比较，核苷酸同源性99.2％以上。

5、血清学分型 

根据KeilSteia和Rapp-GabrielSon(1992)所建立的琼脂扩散试验(Gel diffusion，GD)血清学分型的方法对分离的副猪嗜血杆菌进行血清学分型。大致过程如下：将该菌株密集划线接种于TSA培养基，37℃培养24h后，用PBS洗下菌落，将菌液调整为5.0×10⁹CFU/mL，121℃高压2h，然后对菌液8000r/mim进行离心10min，取上清作为分型抗原。用生理盐水配制1％琼脂糖凝胶，置于微波炉10min融解，加入含量0.1g/100ml硫柳汞防腐，倒平板3mm～4mm厚，用打孔器在平板上打孔(孔径3mm，孔间距4mm)；然后在中央孔加分离菌沉淀抗原，周围孔加标准的阳性血清，放入湿盒中，于37℃24h～48h后观察结果。主要观察抗原与抗体孔之间的是否出现清晰的白色沉淀线，若有则判定为阳性，反之则判定为阴性。结果为抗原与5型阳性血清发生反应，出现白色沉淀，证明分离的菌株为血清5型副猪嗜血杆菌，并命名为JSYZ10。

三、副猪嗜血杆菌的生物学特性

1、副猪嗜血杆菌JSYZ10株外膜蛋白Oapm5序列测定

根据已发表的副猪嗜血杆菌Oamp5的序列，设计引物，扩增JSYZ10株Oapm5基因并进行核苷酸序列测定。通过在NCBI网站上的BLAST进行搜索， 结果显示该菌种的Oapm5的基因序列与GenBank登录号为CP009237副猪嗜血杆菌的相似性最高，达99％以上。与当前流行株具有很高的相似性。

2、副猪嗜血杆菌JSYZ10株保存时间的确定

将新鲜培养的副猪嗜血杆菌JSYZ10株分别保存于TSA、TSB、甘油+血清、卵黄液和卵黄液(冻干)，保存在4℃和-80℃。保存不同时间后取出进行复壮，以寻找合适的保存方法。结果见表1。结果表明，副猪嗜血杆菌在不同环境条件的生存时间差异很大，保存于TSA或TSB培养基中的菌在4℃保存时间很短，尤其是在TSB中。甘油+血清、卵黄液中的菌在-80℃可保1.5年，而冻干的菌保存于-70℃冻存，可以存活3年以上。结果如表2所示。

表2 JSYZ10株在不同条件下存活时间

3、动物致病性试验

副猪嗜血杆菌JSYZ10株接种到含质量浓度百分比5％血清和0.001％的NDA的TSB液体培养基，使活菌数达到1.0×10⁹CFU/mL，经腹腔注射45日龄健康易感猪，5mL/头，另设1组5头作对照，腹腔注射相同剂量的TSB培养液。攻菌后，连续观察14日，每日测体温，并观察临床症状，包括采食和饮水量的变化。14日后剖杀所有猪，根据临床症状和剖检病变计算发病数量。同时取肺组织和肿大的关节液做细菌分离和鉴定。

结果见表3，显示，在连续观察14天期间，攻击JSYZ10株的5头均先后发病，并死亡，对照猪表现正常。攻菌猪表现为体温升高1～2日，最高达41.5℃，体温逐渐下降，在猪死亡前，体温低于正常。攻菌后采食量降低，被毛粗乱，喜卧，到后期死亡前呼吸困难。剖检后表现出同样的症状，主要为胸腔积液，有大量纤维性渗出，导致胸膜粘连，肺部淋巴结肿大，肺有间 质水肿，心包积液增多，有大量纤维素性渗出。从发病猪的关节和肺部采样，分离到副猪嗜血杆菌，而对照5头猪全部没有分离到副猪嗜血杆菌。

表3 JSYZ10株攻击结果 

组别	动物数量	死亡数	细菌分离数
				攻击组	5	5/5	5/5
对照组	5	0/5	0/5

4、副猪嗜血杆菌JSYZ10株的免疫原性试验

(1)副猪嗜血杆菌不同佐剂单价灭活疫苗的制备

a、菌液的制备 

将副猪嗜血杆菌JSYZ10株接种在TSA固体培养基上复苏，然后接种于TSB液体培养基中，在摇床内37℃培养14h～16h，再将种子液按培养基总体积的3％接种于TSB液体培养基，37℃，170r/min振荡扩大培养20h～22h，测定菌液OD600值，根据活菌数与OD600值相关性，计算细菌总数。向菌液中加入最终的质量浓度百分比0.2％的甲醛灭活细菌，置于37℃恒温箱灭活18h，灭活期间，每5h摇动一次。到时间后，取灭活的菌液，在TSA固体培养基划线培养，置于37℃培养48h，观察是否有菌落长出以确定灭活效果。将完全灭活的菌液4500r/min离心20min，弃去上清，生理盐水悬浮沉淀，洗涤2次，最后一次加入适当体积的生理盐水，使菌液浓度为1.0×10¹⁰CFU/mL，向其中加入最终的质量浓度百分数为0.01％的硫柳汞溶液，置4℃保存备用。

b、不同佐剂疫苗的配制

白油佐剂灭活疫苗的配制：将灭活检验合格的菌液按体积加入最终的质量浓度百分数为4％的灭菌吐温-80，边加边搅拌，至完全溶解，制成灭活疫苗水相。向矿物油中加入质量浓度百分数为5％的span80制成油相。将白油佐剂加入到实验室高速分散机搅拌器中，开动分散器进行缓慢搅拌，按油相： 水相3：1的比例，向其中加入水相，再加入最终的质量浓度百分数为0.01％的硫柳汞溶液，水相完全加入后，开动电机乳化5min～10min，直至乳化完全。白油佐剂灭活疫苗成品中细菌的含量为2.5×10⁹CFU/mL，置于4℃保存。

铝胶佐剂灭活疫苗的配制：将灭活检验合格的菌液调整为2.5×10⁹CFU/mL，与等量的质量分数为20％的灭菌氢氧化铝盐水稀释液混合，室温下搅拌20min，在室温下静置24h，吸出总体积1/2的上清液，加入最终的质量浓度百分数为0.01％的硫柳汞溶液。铝胶佐剂灭活疫苗成品中细菌的含量为2.0×10⁹CFU/mL，置于4℃保存。

206佐剂灭活疫苗(w/o/w)的配制：将灭活检验合格的菌液调整为5.0×10⁹CFU/mL。将206佐剂加入到搅拌器中缓慢搅拌，向其中缓慢加入等体积灭菌菌液，再加入最终的质量浓度百分数为0.01％的硫柳汞溶液。按206佐剂的操作说明进行乳化。206佐剂灭活疫苗成品中细菌的含量为2.5×10⁹CFU/mL，置于4℃保存。

c、不同佐剂单价灭活疫苗的免疫原性

取40只5周龄豚鼠，平均分4组，每组10只，1～3组分别接种白油佐剂灭活疫苗、铝胶佐剂灭活疫苗和206佐剂灭活疫苗，每只颈部皮下注射0.5mL，第4组作对照。第一次接种后14天，重复接种一次，剂量同第一次。第二次接种21天后，采血分离血清。用微量板凝集试验检测各组每头豚鼠的抗体效价。结果见表4，从表中可见，副猪嗜血杆菌JSYZ10株与不同类型佐剂混合，匀可引起很高的抗体效价，抗体效价为微量板凝集试验抗体效价(xlog2)，其中铝胶组引起的效价最高，其次是矿物油佐剂组，最低的是206佐剂组。

表4二兔后21日各组抗体效价

实施例2：分离株JSYZ10株在副猪嗜血杆菌灭活疫苗中的应用

一、菌种选择 

选择血清5型副猪嗜血杆菌分离株JSYZ10，已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉、武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M 2014260，保藏日期：2014年6月15日；

二、生产种子的制备

取冻干的JSYZ10株，加无菌生理盐水溶解后，划线接种于TSA培养基上，37℃培养24h，挑取三个典型菌落，分别接种到3.0mLTSB液体培养基中，37℃振荡培养20～22h，收获培养物，进行纯粹性检验(按现行《中华人民共和国兽药典》附录进行，以下纯粹性检验也是如此)，合格后按1％比例接种到TSB液体培养基中(即加入TSB液体培养基体积1％的液体菌种)，37℃振荡培养20～22h，收获培养物，进行纯粹性检验，检验合格后，作为生产种子，置4℃，保存不超过1日；

三、疫苗菌液的制备

取新鲜制备的生产种子，按1％比例接种到含有TSB培养基的发酵罐中，37℃振荡培养20～22h，收获并取样，进行纯粹性检验，并测量菌液OD值，每批疫苗菌液应无杂菌生长，且活菌数达到2.0×109CFU/mL；

四、菌液的灭活

向检验合格的菌液中加入质量分数为10％的甲醛溶液，使甲醛最终的质量浓度百分比为0.2％，于37℃灭活18h，每3～4h摇动一次；

五、灭活疫苗的制备

将灭活检验合格的菌液采用实施例1中所述的方法制备成白油佐剂灭活疫苗、铝胶佐剂灭活疫苗或206佐剂灭活疫苗。

六、疫苗成品检验

1、外观：静置10h，分上下2层，上层为清澈无色，下层为乳白色；摇动疫苗，呈现乳白色均匀的混悬液。

2、无菌检验：按现行《中华人民共和国兽药典》附录进行，无杂菌生长。

3、甲醛含量测定：按现行《中华人民共和国兽药典》附录进行，甲醛含量(质量浓度百分数)为0.05％～0.10％，符合兽用生物制品通则的规定。

4:安全性检验：以实验室制备的灭活疫苗单剂量(2.0mL)、单剂量重复和超剂量(2倍单剂量)，分别经颈部肌肉注射2～3周龄健康易感仔猪，每组5头，另设5头注射相同剂量的PBS；同时，2倍单剂量注射妊娠90日的母猪5头，另设5头注射相同剂量的PBS。所有猪连续观察14日，每天在固定时间内测量每头猪的体温，观察注射部位和全身反应，包括采食和饮水量，重点检查注射部位的变化。结果在观察期内，仔猪没有出现任何由疫苗引起的局部和全身不良反应，母猪没有出现流产和死胎。说明制备的疫苗具有很好的安全性。

5、灭活疫苗的效力试验：用2周龄健康仔猪10头，其中5头猪颈部肌肉接种疫苗，剂量为2.0mL/头，14日后，以相同剂量再接种一次；另5头作对照组，接种相同剂量的PBS。二免后21日，用新鲜培养的副猪嗜血杆菌JSYZ10株腹腔注射，5.0×10⁹CFU/头，攻菌后连续观察14日，剖检，根据临床症状和剖检病变统计攻毒保护率。在观察期间，主要观察临床症状。动物的发病标准：发病猪出现发热(体温40.5℃以上，持续1～5天)、精神萎靡、咳嗽、呼吸困难、消瘦、跋行和被毛粗乱等临床症状。死亡的猪进行 解剖，可见胸膜炎、心包炎、腹膜炎、关节炎和脑膜炎等多发性浆膜和关节炎的病变，各浆膜面出现浆液性或纤维素性渗出物。结果显示，对照组全部发病和死亡，而免疫组全部保护，没有出现任何临床症状，保护率为100％(5/5)，说明疫苗对仔猪具有很好的免疫效力。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种血清5型副猪嗜血杆菌疫苗株，其特征在于，其分类命名为副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)，菌株名称为JSYZ10，已保藏于位于中国武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M 2014260，保藏日期：2014年6月15日。

2.一种如权利要求1所述血清5型副猪嗜血杆菌疫苗株在制备副猪嗜血杆菌灭活疫苗中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述副猪嗜血杆菌灭活疫苗为白油佐剂灭活疫苗、铝胶佐剂灭活疫苗或206佐剂灭活疫苗。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述白油佐剂灭活疫苗中含菌量为2.5×10⁹CFU/mL。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述铝胶佐剂灭活疫苗中含菌量为2.0×10⁹CFU/mL。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述206佐剂灭活疫苗中含菌量为2.5×10⁹CFU/mL。

7.一种副猪嗜血杆菌灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)菌种选择血清5型副猪嗜血杆菌分离株JSYZ10，已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉、武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M2014260，保藏日期：2014年6月15日；

(2)生产种子的制备，取冻干的JSYZ10株，加无菌生理盐水溶解后，划线接种于TSA培养基上，37℃培养24h，挑取三个典型菌落，分别接种到3.0mLTSB液体培养基中，37℃振荡培养20～22h，收获培养物，进行纯粹性检验，合格后按1％比例接种到TSB液体培养基中，37℃振荡培养20～22h，收获培养物，进行纯粹性检验，检验合格后，作为生产种子，置4℃，保存不超过1日；

(3)疫苗菌液的制备，取新鲜制备的生产种子，按1％比例接种到含有TSB培养基的发酵罐中，37℃振荡培养20～22h，收获并取样，进行纯粹性检验，并测量菌液OD值，每批疫苗菌液应无杂菌生长，且活菌数达到2.0×10⁹CFU/mL；

(4)菌液的灭活，向检验合格的菌液中加入质量分数为10％的甲醛溶液，使甲醛最终的质量浓度百分比为0.2％，于37℃灭活18h，每3～4h摇动一次；

(5)灭活疫苗的制备，将灭活检验合格的菌液采用常规方法制备成白油佐剂灭活疫苗、铝胶佐剂灭活疫苗或206佐剂灭活疫苗。