CN102399724B

CN102399724B - 一种副猪嗜血杆菌lc株及其应用

Info

Publication number: CN102399724B
Application number: CN 201110349964
Authority: CN
Inventors: 吴家强; 张玉玉; 于江; 杜以军; 丛晓燕; 王大鹏; 王金宝
Original assignee: Institute Animal Science and Veterinary Medicine of Shandong AAS
Current assignee: Institute Animal Science and Veterinary Medicine of Shandong AAS
Priority date: 2011-11-08
Filing date: 2011-11-08
Publication date: 2013-01-02
Anticipated expiration: 2031-11-08
Also published as: CN102399724A

Abstract

本发明涉及兽医生物制品中副猪嗜血杆菌疫苗领域，特别涉及一种副猪嗜血杆菌LC株，其保藏编号为CGMCC No.5257。副猪嗜血杆菌LC株在制备副猪嗜血杆菌灭活疫苗中的应用。副猪嗜血杆菌LC株对猪有较强的致病性，且具有良好的免疫原性，应用其制备的灭活铝胶疫苗安全可靠，不仅能提供同源攻毒保护，还可为血清4型、5型、10型、12型、14型和15型HPS异源攻毒提供较好的交叉保护，免疫后能够产生较强免疫力，接种猪群的发病率和死亡率均明显减少，其免疫效果达到或优于市场上现有的商品化疫苗，具备了与国内外同类产品竞争的优势，能够有效预防副猪嗜血杆菌病的流行和传播，降低本病造成的经济损失，有着广阔的应用前景。

Description

一种副猪嗜血杆菌LC株及其应用

技术领域

本发明涉及兽医生物制品中副猪嗜血杆菌疫苗领域，特别涉及一种副猪嗜血杆菌LC株，还涉及所述副猪嗜血杆菌LC株的应用。

背景技术

副猪嗜血杆菌（Haempohlius parasuis, HPS）是一种NAD（Nicotinamide adenine dinucleotide，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸即辅酶Ⅰ）依赖型、不运动的革兰氏阴性细小杆菌，属于巴斯德菌科（Pastteurellacea）嗜血杆菌属（Haemophilus）。HPS常引起猪的多发性浆膜炎、关节炎以及脑膜炎，由该菌引起的病又称为猪革拉斯氏病。该菌是在1922年由Schermer和Ehrlich首次分离出来的，但是直到1992才通过SPF（Specific Pathogen Free，无特定病原体）猪证实HPS的致病性以及不同血清型菌株之间的毒力差异。据调查，HPS可以影响从2周龄到4月龄的青年猪，主要在断奶前后和保育阶段发病，通常见于5周龄～8周龄的猪，发病率可达40%，严重时死亡率可达50%。HPS还可感染生产母猪，引起流产、产死胎或弱仔等。随着养猪业的不断发展，猪场规模化、集约化程度的不断提高，猪群饲养密度越来越大，副猪嗜血杆菌感染有明显增加趋势，已成为猪场保育猪发病和死亡的一个重要原因。另外，一些免疫抑制性疾病如猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒病等经常与HPS混合感染或继发感染，对全球的养猪业造成巨大的经济损失，也给副猪嗜血杆菌病的诊断和综合防治带来更多的难度。

近年来，副猪嗜血杆菌病已在我国普遍流行，在我国的主要养猪区域如广东、河南、湖北、湖南、山东、江西、河北、上海、吉林、四川、浙江、甘肃、江苏等省份都有副猪嗜血杆菌病发生以及HPS分离鉴定的报道。而HPS的真实发病率可能为实际确诊的10倍之多，给我国的养猪业带来了极大的威胁，已经引起了政府和社会上的高度重视。

由于HPS耐药性现象越来越常见，常用的抗生素对副猪嗜血杆菌病已无明显的疗效，而且随着人们对绿色食品需求的期望越来越高，抗生素在本病预防和控制等方面的应用必将受到严格限制和逐步禁止，疫苗免疫成为预防和控制副猪嗜血杆菌病的主要措施。由于HPS血清型较多，且不同血清型的菌株，其毒力与致病力差异较大，各个血清型之间免疫交叉保护力很低，不同地方分离的菌株具有较强的地方性特征，致使现有国内外的副猪嗜血杆菌商品化疫苗不能对该病提供完全有效的免疫保护。因此发掘更多的交叉保护性好且免疫原性强的HPS并利用其研制高效的副猪嗜血杆菌疫苗是该病防控的迫切需要。

Bak、Riising于2002年在《Veterinary record》上报道了一种血清5型副猪嗜血杆菌灭活疫苗，并评估了免疫猪群对同源和异源副猪嗜血杆菌（H. parasuis）进行实验感染后其保护性免疫的形成。5~7周龄的猪群免疫2周后，同源攻毒（血清5型非疫苗株）的保护率可达到80%（4/5）；血清1型副猪嗜血杆菌攻毒的保护率可达40%（2/5）；血清12型副猪嗜血杆菌攻毒的保护率可达100%（5/5）；血清13型副猪嗜血杆菌攻毒的保护率可达75%（3/4）；血清14型副猪嗜血杆菌攻毒的保护率可达100%（5/5）。可见，该血清5型副猪嗜血杆菌灭活疫苗不仅可保护同源攻毒，还可为异源攻毒（血清1、12、13和14）提供部分保护。

发明内容

为了解决以上现有国内外的副猪嗜血杆菌商品化疫苗各个血清型之间免疫交叉保护力低、免疫原性不强的问题，本发明提供了一种免疫原性强的副猪嗜血杆菌LC株。

本发明还提供了所述副猪嗜血杆菌LC株在制备各个血清型之间免疫交叉保护力强的灭活疫苗中的应用。

本发明是通过以下措施实现的：

一种副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis）LC株，其保藏编号为CGMCC No.5257。

所述的副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis）LC株在制备副猪嗜血杆菌灭活疫苗中的应用。

优选所述副猪嗜血杆菌灭活疫苗为油乳剂疫苗或铝胶疫苗。

优选所述副猪嗜血杆菌灭活疫苗为铝胶疫苗。

所述铝胶疫苗中含菌量≥2.5×10⁹ CFU/mL。

本发明的有益效果：副猪嗜血杆菌LC株对猪有较强的致病性，且具有良好的免疫原性，应用其制备的灭活铝胶疫苗安全可靠，不仅能提供同源攻毒保护，还可为血清4型、5型、10型、12型、14型和15型HPS等异源攻毒提供一定的交叉保护，免疫后能够产生较强免疫力，接种猪群的发病率和死亡率均明显减少，其免疫效果达到或优于市场上现有的商品化疫苗，具备了与国内外同类产品竞争的优势，能够有效预防副猪嗜血杆菌病的流行和传播，降低本病造成的经济损失，有着广阔的应用前景。

菌株保藏信息

保藏时间：2011年9月17日，

保藏单位：中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），

保藏编号：CGMCC No.5257，

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，

分类命名：副猪嗜血杆菌（Haempohlius parasuis）。

附图说明

附图1为攻毒试验中腹腔注射不同剂量LC株菌液后仔猪体温变化状况。

具体实施方式

为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例来进一步说明。

实施例1：

副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis）LC株，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No. 5257。

生产用培养基

TSA培养基配制：称取4 g TSA粉末加入100 mL蒸馏水中，充分混匀后，121℃灭菌15 min，冷却至50℃～60℃时，加入终浓度0.001% NAD和5%新生牛血清，混合均匀后倾倒平板备用。

TSB培养基配制：称取3 g TSB粉末加入100 mL蒸馏水中，121℃灭菌15 min。临用前加入终浓度0.001% NAD和5%新生牛血清，混合均匀后配制而成。

1.1 HPS菌株的分离纯化方法

从山东省聊城疑似副猪嗜血杆菌病的某大型养猪场选取病猪，无菌采集病猪的心包积液、胸腔积液、关节液和心血划线接种于含0.001% NAD（Nicotinamide adenine dinucleotide，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸即辅酶Ⅰ）和5%新生牛血清的TSA（Tryptic Soy Agar，胰蛋白胨大豆琼脂）培养基上，置于37℃培养箱培养36 h～72 h，挑取圆形、光滑湿润、无色透明的露珠状小菌落革兰氏染色镜检，选取革兰氏阴性细小杆菌进行划线纯培养。

将纯培养菌株分别划线接种于鲜血琼脂平板和普通琼脂平板，同时水平划线接种鲜血琼脂平板后，再挑取金黄色葡萄球菌垂直于水平线划线， 37℃培养24 h～48 h，选取在鲜血琼脂平板和普通琼脂平板上不生长，但与金黄色葡萄球菌在鲜血琼脂平板上共同培养时呈现明显的“卫星生长现象”且不溶血的微小菌落进行纯化培养。

将进一步纯化培养的两株菌株，分别接种于含NAD的微量生化反应管，37℃培养48 h，结果均为硝酸盐还原试验阳性，吲哚试验阴性，脲酶试验阴性，氧化酶试验阴性，接触酶试验阳性，发酵葡萄糖、蔗糖和果糖，不发酵麦芽糖、半乳糖、木糖和甘露醇。该菌株根据其病猪的来源地命名为LC株。

1.2 16S rRNA基因序列测定与分析

1.2.1 引物设计根据HPS 16S rRNA（GenBank No: M75065）序列设计引物，上游引物：5’-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3’，下游引物：5’-GGCTTCGTCACCCTCTGT-3’，该引物扩增编码16S rRNA长度约为822 bp的特异片段，引物由上海生物工程有限公司合成。

1.2.2细菌DNA模板的制备将被检菌株菌液5000 r/min离心5 min，弃上清液，用无菌水重悬后，于沸水中煮沸10 min，-20℃冻结、融化后，10000 r/min离心5 min，取上清液作模板进行PCR扩增。

1.2.3 PCR扩增将细菌DNA模板3 μL、10倍PCR缓冲液2.5 μL、dNTP（10 mmol/L）0.5 μL、引物各1 μL（10 μmol/L）和TaqDNA聚合酶0.25 μL（5 U/μL）混合，加水至25 μL，94℃预变性5 min，94℃变性30 s、58℃退火30 s、72℃延伸1 min，循环34次，最后72℃延伸10 min，PCR产物于1%琼脂糖凝胶电泳，可观察到822 bp大小的特异DNA条带。用DNA快速回收试剂盒回收PCR产物，-20℃保存备用。

1.2.4 16S rRNA扩增产物的克隆与测序将回收的PCR产物与pMD19-T在16℃连接30 min，转化DH5α感受态细菌，37℃过夜培养12 h～16 h。挑取平板上的单菌落于氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中37℃过夜振荡培养，次日应用菌液PCR的方法扩增16S rRNA基因筛选阳性克隆，鉴定为阳性的菌液提取质粒交由上海生工公司测序。LC株16S rRNA基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示，将序列在GenBank中进行BLAST比对，与已发布的副猪嗜血杆菌相应序列的同源性达到98.5%以上。

1.3 HPS LC株的血清学鉴定

将LC株分别密集划线接种于TSA培养基，37℃培养20 h～24 h后，用PBS（磷酸盐缓冲液）洗下菌落，将悬液稀释至含菌量为3.0×l0⁹ CFU/mL，121℃高压2 h，菌液7000 r/min离心10 min，取上清用于琼脂扩散试验的分型抗原。用生理盐水配制1%的琼脂糖凝胶，根据需要在相应的琼脂糖凝胶孔中加抗原和相应的抗血清，以刚加满孔为宜，湿盒内37℃下放置24 h～48 h，可见LC株于1型血清孔与抗原孔之间出现清晰的白色沉淀线，故判定副猪嗜血杆菌LC株为血清1型。

1.4 动物攻毒试验

1.4.1 攻毒菌液的制备分别挑取HPS LC株单菌落密集划线接种于TSA培养基，37℃培养12 h～16 h后，用PBS收获细菌。将菌液涂布于TSA培养基，37℃培养20 h后，用PBS收获细菌，并将菌液的活菌数调整为3.0×10⁹ CFU/mL。

1.4.2 动物攻毒试验结果取3周龄～4周龄健康易感仔猪40头，随机分成4组，每组10头，其中3组分别以1 mL、1.5 mL和2mL三个不同剂量进行腹腔注射LC株菌液（3.0×109 CFU/mL），另外1组注射灭菌生理盐水2 mL作为对照。攻毒组大部分仔猪的体温在攻毒第二天或第三天开始升高，持续三四天后，体温逐渐恢复正常，如图1所示；其还出现被毛粗乱、精神沉郁、食欲减退、呼吸困难、关节肿大、跛行、甚至死亡等临床症状；剖检可观察到：其胸腹腔积液增多、胸腹腔内粘连甚至出现纤维素性渗出物、心包积液增多甚至心包膜增厚有纤维素渗出物、全身淋巴结肿大、或后肢关节腔内关节液增多甚至有胶冻样渗出物。LC株的攻毒剂量越大，试验猪的最高体温越高，死亡越快，其发病率和死亡率越大。攻毒组仔猪的发病率和死亡率如表1所示。对照组仔猪的体温无明显变化，亦无发病和死亡。由于用1.5 mL菌液（3.0×10⁹ CFU/mL）攻毒可使仔猪发病率达到80%，所以后面的LC株攻毒试验选用1.5 mL剂量。

表1 LC株不同攻毒剂量仔猪的发病率和死亡率

攻毒剂量	发病数	发病率	死亡数	死亡率
					1 mL菌液	5/10	50%	0/10	0%
1.5 mL菌液	8/10	80%	4/10	40%
					2 mL菌液	9/10	90%	6/10	60%
2 mL生理盐水	0/10	0	0/10	0

1.5 免疫原性的测定

1.5.1取3周龄～4周龄健康易感仔猪40头，随机分成4组，每组10头。LC株菌种扩增培养物分别制成含菌量为2×10⁹CFU/mL、2.5×10⁹CFU/mL和3×10⁹ CFU/mL的灭活铝胶疫苗（疫苗的配制和成品检验方法参照实施例2）。其中3组仔猪分别颈部肌肉注射上述三种疫苗，2 mL/头，2周后按相同剂量进行二免，另外1组仔猪作为未免疫对照组。二免后2周采血通过玻片凝聚法检测仔猪的血清抗体效价，采血后4组仔猪均腹腔注射LC株菌液（3.0×10⁹ CFU/mL）1.5 mL/头。未免疫对照组仔猪的抗体为阴性，攻毒后有9头仔猪发病，其中3头死亡。而免疫组中，除最低剂量组（含菌量为2×10⁹ CFU/mL）免疫效果较差外，其余两组（含菌量为2.5×10⁹CFU/mL和3×10⁹ CFU/mL）均产生较好的免疫效果，仔猪抗体效价均在1:32以上，攻毒后仔猪均健活，剖检无明显病理变化，详细结果如表2所示。

表2 不同含菌量的灭活疫苗对仔猪的免疫效果

Figure 2011103499643100002DEST_PATH_IMAGE001

1.5.2含菌量为2×10⁹、2.5×10⁹、3×10⁹ CFU/mL的LC株灭活铝胶疫苗，分别颈部肌肉注射妊娠70天的健康母猪5头， 2 mL/头，2周后按相同剂量进行二免，同时设未免疫对照母猪5头。二免后2周采血通过玻片凝聚法检测母猪的血清抗体效价，采血后4组母猪均腹腔注射LC株菌液（3.0×10⁹ CFU/mL）1.5 mL/头，观察攻毒母猪的临床症状和产仔状况。不同含菌量的灭活铝胶疫苗对怀孕母猪的免疫效果如表3所示。未免疫对照组母猪的抗体为阴性，攻毒后则表现食欲减退和发热，有的母猪发生流产、早产或产死胎、木乃伊胎，部分死亡胎儿或弱仔的脐带出血。含菌量为2.5×10⁹ CFU/mL的疫苗免疫组中，有1头母猪攻毒后食欲下降、体温升高（约40.0～41.0℃），并发生早产，其他母猪产仔均正常，保护率可达到80%；含菌量为3×10⁹ CFU/mL的疫苗免疫组保护率达100%。

表3 不同含菌量的灭活疫苗对怀孕母猪的免疫效果

Figure 2011103499643100002DEST_PATH_IMAGE002

上述试验证明HPS LC株具有良好的免疫原性，其最低免疫剂量为2 mL含菌量为2.5×10⁹ CFU/mL的灭活疫苗。

实施例2、

副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis）LC株在制备的副猪嗜血杆菌灭活疫苗中的应用。

取菌种保藏编号为CGMCC No. 5257的副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis）LC株，活化后分别接种培养基，培养后收集菌液，经甲醛溶液灭活，与氢氧化铝胶佐剂混合配制成灭活铝胶疫苗。

优选操作步骤如下：

2.1 菌种选择

制苗用菌种为HPS LC株，其保藏编号为CGMCC No.5257，其菌落形态、菌体特征、生化特性、培养特性均稳定，对猪有较强的致病性，1.5 mL菌液（3.0×10⁹ CFU/mL）腹腔注射仔猪即可导致80%的仔猪发病。HPS LC株的免疫原性良好，最低免疫剂量应≥5.0×10⁹ CFU。

2.2 生产用菌种制备

2.2.1 一级生产种子繁殖取菌种保藏编号为CGMCC No.5257的HPS LC株，将其划线接种于TSA培养基，37℃培养24 h，取活化后的HPS LC株单菌落密集划线接种于TSA培养基，37℃培养16 h～20 h后，用PBS冲洗，收集菌液，并将菌液的活菌数调整为3.0×10⁹ CFU/mL。经纯粹检验合格后，作为一级生产种子。

2.2.2 二级生产种子繁殖取一级生产种子按1%剂量接种于TSB培养基中，37℃ 180 r/min振荡培养12 h～14 h，该菌液经纯粹检验合格后，作为二级生产种子。在2～8℃保存，不得超过6 h～8 h。

2.3 制苗菌液制备

将二级种子液按照培养基量的1%接种于盛有TSB培养基的玻璃瓶或培养罐中，小量通气，37℃培养20 h，收获并取样进行纯粹检验和活菌计数。纯粹检验和活菌计数均按现行《中华人民共和国兽药典》附录进行。每批制苗用菌液均纯粹，无杂菌生长，且其活菌数为2.5×10⁹ CFU/mL。

2.4 菌液的灭活

向菌液中分别加入终浓度为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%的甲醛溶液，将其置于37℃灭活，期间每隔4 h～6h振摇一次。灭活6 h、12 h、18 h、24 h、30 h、36 h、42 h和48 h时取样检测，观察是否灭活完全。三组平行试验的结果均显示0.3%和0.4%甲醛溶液灭活HPS菌液24 h时均未检出活菌，如表4所示。因此，菌液的灭活方法选用终浓度为0.3%甲醛溶液37℃灭活24 h，期间每隔4 h～6 h振摇一次。灭活菌液经检验无菌生长为合格，以该灭活菌液作为制苗用抗原。

表4 不同浓度甲醛灭活HPS LC株时细菌活性的检测

Figure 2011103499643100002DEST_PATH_IMAGE003

注：“＋”存在活菌；“－”无活菌。

2.5 免疫佐剂的筛选

2.5.1油苗的制备将灭活的菌液浓缩3倍，取浓缩菌液96份加入4份吐温混匀作为水相，取白油93份加入司本-80 6份，硬脂酸铝1份混合，121℃灭菌30 min后作为油相。按水相与油相1:2的比例进行乳化制备油乳剂灭活疫苗。成品疫苗中含菌量2.5×10⁹ CFU/mL。将疫苗取样进行无菌检验，按现行《中华人民共和国兽药典》方法进行，无细菌、霉菌生长。

2.5.2 铝胶疫苗的制备取20 g铝胶加入100 mL水中，搅拌至完全溶解，121℃高压灭菌1 h配制成20%的铝胶，按体积比1:2加入灭活菌液中，混匀后，2～8℃静置2天～3天，抽弃上清约浓缩成全量的三分之二，分装保存。成品疫苗中含菌量2.5×10⁹ CFU/mL。将疫苗取样进行无菌检验，按现行《中华人民共和国兽药典》方法进行，无细菌、霉菌生长。

2.5.3安全检验将15头3周龄～4周龄健康易感仔猪随机分成3组，5头/组。其中2组分别按2 mL/头接种铝胶佐剂灭活疫苗和油佐剂灭活疫苗，14天后二免，对照组仔猪不免疫。连续观察2周，结果免疫后绝大部分猪的精神、体温、食欲均正常，但油苗组注射部位到试验结束仍稍有肿胀，疫苗吸收不良，铝胶苗组无肿胀和坏死，无其他不良反应。

2.5.4 效力检验将21日龄健康易感仔猪15头分成3组，其中2组分别肌肉注射油苗和铝胶苗2 mL/头，间隔2周后以同样剂量加强免疫1次，另外1组仔猪不免疫作为对照。再间隔2周后，三组仔猪均腹腔注射1.5 mL LC株菌液（3.0×10⁹ CFU/mL），连续观察2周，记录体温变化和临床表现，剖检后观察病理变化。

油苗组：2头仔猪攻毒后食欲不振，精神沉郁，体温升高（>40.5℃），其中1头于攻毒后第7天死亡，剖解后发现腹膜炎，另外3头体温变化不大，食欲正常，剖检后无典型变化。该组疫苗的保护率为60%。

铝胶苗组：5头仔猪体温、食欲均无异常，剖检后仅有1头出现轻微腹膜炎，其他仔猪均无异常病变。该组疫苗的保护率为80%。

对照组：5头仔猪体温均升高（＞40.5℃），其中1头于攻毒后第10天死亡，解剖后仅见腹膜炎；另外3头于攻毒后精神沉郁、呼吸困难、卧地不起，于攻毒后第14天剖解后发现腹水增多且浑浊、胸腔内有粘连、严重者有纤维素性渗出，另外1头无明显异常病变。

综上所述，油苗和铝胶苗均能为仔猪提供保护，但铝胶苗的保护效果要强于油苗，因此，选用铝胶作为疫苗佐剂。

2.6 灭活铝胶疫苗的配制

2.6.1 20%铝胶的制备：取20 g铝胶加入100 mL水中，搅拌至完全溶解，121℃高压灭菌1 h后备用。

2.6.2 配苗与分装

抗原检验合格后，按菌液2份加20%铝胶1份进行配苗。同时，按疫苗总量的0.005%加入硫柳汞，充分振荡后2～8℃静置2天～3天，抽弃上清浓缩成全量的三分之二。混匀后定量分装，分装过程中要随时搅拌使其混合均匀。

2.7 灭活铝胶疫苗成品检验

2.7.1 物理性状测定本品静置后，上层为透明清亮液体，下层为灰白色沉淀，充分振摇后，呈均匀混悬液。

2.7.2 无菌检验按现行《中华人民共和国兽药典》附录进行检验，无菌生长。

2.7.3甲醛、硫柳汞含量测定分别按现行《中华人民共和国兽药典》附录进行测定，不同批次疫苗甲醛含量为0.09～0.14%，硫柳汞含量为0.003～0.004%，符合规定。

2.7.4 安全检验选取3周龄～4周龄健康易感仔猪5头，各颈部肌肉注射疫苗4 mL，观察2周，接种仔猪体温、精神和食欲均正常，全部健活，且注苗局部无肿胀和坏死。

2.7.5 效力检验取3周龄～4周龄健康易感仔猪10头，分为2组，5头/组。其中1组仔猪颈部肌肉注射2mL HPS灭活铝胶疫苗，间隔2周以相同剂量加强免疫一次，另外1组仔猪不免疫作为对照。2周后采血，分离血清，测定血清抗体效价。采血后用HPS LC株进行攻毒，每头仔猪腹腔注射1.5 mL菌液（细菌含量3.0×10⁹ CFU/mL），观察2周。免疫组仔猪抗体几何平均效价≥1:32，对照组仔猪的抗体几何平均效价≤1:4。攻毒后，对照仔猪至少4头发病或死亡，免疫仔猪至少保护4头。

2.7.6 交叉保护检验

选取HPS血清4、5、10、12、13、14和15型7个HPS分离株分别制备攻毒菌液，评估HPS LC株灭活铝胶疫苗对异源血清型的交叉保护作用。

每株HPS分离株的交叉保护检验方法：

随机选取3周龄～4周龄健康易感仔猪20头，分为2组，每组10头，1组颈部肌肉注射HPS LC株灭活疫苗2 mL/头，间隔2周后以同样剂量加强免疫1次，另一组仔猪不免疫作为对照组。2周后，腹腔注射HPS分离株菌液进行攻毒，每株HPS分离株的攻毒剂量见表5，连续观察2周。

HPS LC株灭活疫苗对异源血清型的交叉保护如表5所示。

表5 HPS LC株灭活疫苗对异源血清型的交叉保护

Figure 2011103499643100002DEST_PATH_IMAGE004

由上表可以看出，HPS LC株灭活铝胶疫苗对血清5型和10型HPS的交叉保护率可达到80%，对血清4型、12型和15型HPS的交叉保护率可达到70%，对血清14型HPS的交叉保护率可达到60%，交叉保护率比较高，是一种具有广阔市场应用前景的疫苗，值得推广。限于实验条件及原材料的限制，仅做了上述HPS血清4、5、10、12、13、14和15型7个HPS分离株的交叉保护实验，对HPS其它血清型的交叉保护性能的研究有待于以后的进一步研究。

<110> 山东省农业科学院畜牧兽医研究所

<120>一种副猪嗜血杆菌LC株及其应用

<160> 1

<210> 1

<211> 822

<212> DNA

<213> 副猪嗜血杆菌（Haemophilusparasuis）LC株

<400> 1

ggcttcgtca ccctctgtat gcaccattgt agcacgtgtg tagccctact cgtaagggcc 60

atgatgactt gacgtcatcc ccaccttcct ccagtttatc actggcagtc tcctttgagt 120

tcccgaccga atcgctggca acaaaggata agggttgcgc tcgttgcggg acttaaccca 180

acatttcaca acacgagctg acgacagcca tgcagcacct gtctctaagt tcccgaaggc 240

ataaactcat ctctgagttc ttcttaggat gtcaagagta ggtaaggttc ttcgcgttgc 300

atcgaattaa accacatgct ccaccgcttg tgcgggcccc cgtcaattca tttgagtttt 360

aaccttgcgg ccgtactccc caggcggtcg atttatcacg ttagctacgg gcaccaagct 420

ctaagcccaa tccccaaatc gacagcgttt acagcgtgga ctaccagggt atctaatcct 480

gtttgctccc cacgctttcg cacatgagcg tcagtatttt cccaaggggc tgccttcgcc 540

ttcggtattc ctccacatct ctacgcattt caccgctaca cgtggaattc tacccctccc 600

taaaatactc tagcaaccca gtatgaaatg caattcccaa gttaagctcg gggctttcac 660

atctcactta agtcaccgcc tgcgtgccct ttacgcccag tcattccgat taacgctcgc 720

accctccgta ttaccgcggc tgctggcacg gagttagccg gtgcttcttc tgtgactaac 780

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Claims

1.一种副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis）LC株，其特征在于其保藏编号为CGMCC No.5257。

2.权利要求1所述的副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis）LC株在制备副猪嗜血杆菌灭活疫苗中的应用，所述副猪嗜血杆菌灭活疫苗为铝胶疫苗。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述铝胶疫苗中含菌量≥2.5×10⁹ CFU/mL。