CN102058880A

CN102058880A - 猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗的生产方法

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Publication number: CN102058880A
Application number: CN2010105043984A
Authority: CN
Inventors: 朱士盛; 马爽; 胡潇; 郭玉广; 程增清
Original assignee: Qingdao Yebio Bioengineering Co Ltd
Current assignee: Qingdao Yebio Bioengineering Co Ltd
Priority date: 2010-10-13
Filing date: 2010-10-13
Publication date: 2011-05-18
Anticipated expiration: 2030-10-13
Also published as: CN102058880B

Abstract

本发明涉及猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗的生产方法。本发明从优势流行菌株中筛选出免疫原性良好的胸膜肺炎放线杆菌1型HT株菌、5型SZ株菌和7型DY株菌作为疫苗制备菌株，分别接种于适宜培养基培养，收获培养物，经甲醛溶液灭活，加入矿物油佐剂混合乳化制成；用于预防由1、5和7型胸膜肺炎放线杆菌引起的猪传染性胸膜肺炎；此疫苗具有安全性好、免疫效力高且免疫期长等优点。

Description

猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗的生产方法

技术领域

本发明涉及一种用于预防由1、5和7型胸膜肺炎放线杆菌引起的猪传染性胸膜肺炎的油乳剂疫苗制备方法，属于兽用生物制品领域。

背景技术

猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌(Actionobacillus pleuropneumoniae，APP)引起猪的一种呼吸系统重要传染病。本病主要是引起猪的一种伴有胸膜炎的纤维素性、出血性、坏死性肺炎，多呈最急性或急性病程而迅速致死，发病率和死亡率均在50％以上，它可发生于任何年龄的猪只，尤其在集约化养猪场，一旦发生会造成重大经济损失。(进口猪嗜血杆菌胸膜肺炎血清学检查中国畜禽传染病1988(1)31～32；猪传染性胸膜肺炎HT株的分离、鉴定与定型试验中国动物检疫1999(2)7～9)；陈小玲，杨旭夫，朱士盛.猪传染性胸膜肺炎的流行现状和措施.中国兽医杂志，2001，37：33-35；Nicolet J.Taxonomy and serological identification of Actionobacillus pleuropneumoniae.Can Vet，1988，29：578-580)。

毒素是Actionobacillus pleuropneumoniae最重要的毒力因子，现已证明不同血清型的菌株可以产生四种细胞毒素，名为Apx(Apx I、Apx II、Apx III和Apx IV)具有细胞毒性或溶血性(陆承平主编.兽医微生物学第四版.中国农业出版社，2007，143)。根据细菌荚膜多糖和脂多糖(LPS)抗原对血清的反应，可将生物I型分为12个血清型；生物II型至少有3个血清型(本病至今已有15个血清型)，而各型毒力有所差异，型间交叉保护性极差或缺少，因此对某地区本病的预防，最好方法是制备与当地相关型疫苗，才能获得最佳的免疫效果(斯劳特，阿莱尔，蒙加林，等.赵德明，张中秋，沈建忠，主译.猪病学.第八版，北京：中国农业科技出版社，357-367，957-959；王春来，杨旭夫，刘杰.胸膜肺炎放线杆菌主要毒力因子的致病性及其免疫原性研究进展.预防兽医学进展，2001，3(1)：10212；Nielsen R.Serological and Immunological of pleuropneumonia of swine caused by Haemophilus parahaemolyticus.Acta VetScand，1974，5：80-89)。

发明内容

本发明的目的是采用免疫原性良好的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌1型HT株、5型SZ株和7型DY株分别接种于适宜培养基培养，收获培养物，经甲醛溶液灭活，加入矿物油佐剂混合乳化制成。用于预防由1、5和7型猪胸膜肺炎放线杆菌引起的猪传染性胸膜肺炎。

一、生产用毒株

1.菌株来源

用于制造疫苗的胸膜肺炎放线杆菌菌株为HT、SZ和DY株，由中国动物卫生与流行病学中心分离、鉴定。国内分离株1型HT株(1998年从山东河套分离，朱士盛，杜文金，王新等.猪传染性胸膜肺炎HT株的分离、鉴定与定型试验.中国动物检疫，1999，16(2)：7～9)和5型SZ株(1987年从深圳光明农场分离)、7型DY株(1993年从山东胜利油田分离)以上菌株已于2010年10月11日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号：胸膜肺炎放线杆菌SZ株为CGMCC No.4215，DY株株为CGMCC No.4216。

2.毒株特点

(1)形态及生化特性胸膜肺炎放线杆菌HT、SZ和DY株菌均为革兰氏阴性，染色镜检呈小杆菌，球杆菌、长杆菌、短链排列等多形态。溶血性试验、尿素酶试验和CAMP试验均为阳性、发酵葡萄糖、蔗糖、木糖、甘露醇、不发酵乳糖、阿拉伯胶糖、棉子糖。

(2)培养特性胸膜肺炎放线杆菌HT、SZ和DY株菌生长均需要V因子，不需要X因子，在普通培养基上不生长。在鸡肉汤培养基(简称“S肉汤”，其配方及配制方法为：取鸡肉汁100ml，多聚蛋白胨0.5g，胰蛋白胨0.5g，氯化钠0.5g，加热溶化后调pH至7.2，115℃灭菌30min，待冷至55℃左右，按无菌要求加入灭活的鸡血清5ml，1％辅酶I(NADH)1ml)中呈均匀一致混浊。接种于鸡肉汤琼脂培养基(简称“S琼脂”，其配方及配制方法为：取鸡肉汁100ml，胰蛋白胨血琼脂基质3g，多聚蛋白胨0.5g，溶化后调pH 7.2，115℃灭菌30min，待冷至55℃左右，按无菌要求加入灭活鸡血清5ml，1％辅酶I 1ml)上，于5％～10％CO₂条件下37℃培养16～18h，可形成直径1mm左右圆形、边缘整齐透明呈露滴状灰白色的菌落。于折光下观察具有虹彩光泽。

(3)血清型应用琼脂扩散试验进行血清型鉴定，胸膜肺炎放线杆菌HT、SZ和DY株菌分别为APP 1、5和7型。

(4)菌株毒力用胸膜肺炎放线杆菌6～8h S琼脂培养物采用滴鼻的方法对5～6周龄健康易感仔猪进行攻毒，能使攻毒仔猪全部发病的各菌株的最小攻毒量分别是HT株约为1×10⁷CFU/头，SZ株约为5×10⁷CFU/头和DY株约为5×10⁷CFU/头。

(5)免疫原性用胸膜肺炎放线杆菌HT、SZ和DY株菌制备的不同含菌量的单价油乳剂灭活疫苗，分别颈部肌肉注射5～6周龄健康仔猪，2ml/头，免疫后4周连同对照组一起进行攻毒保护试验。结果表明，胸膜肺炎放线杆菌HT、SZ和DY株菌制备的含菌量为7.5×10⁷CFU/ml单价灭活疫苗免疫的仔猪攻毒保护率均达3/4～4/4。

二、猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗的生产方法，主要是：

1.采用机械搅拌发酵罐分别培养胸膜肺炎放线杆菌1、5和7型菌液。按发酵罐容积的70％加入生产用的半合成培养基(其配方和配制方法为：取多聚蛋白胨5g，胰蛋白胨5g，酪蛋白胨5g，谷氨酸钠5g，酵母浸粉5g，D-葡萄糖1g，氯化钠5g溶于1000ml蒸馏水中，加热溶化后调pH至7.2～7.4，115℃灭菌30min，待冷至55℃左右，按无菌要求加入灭活鸡血清20ml，1％辅酶I 10ml)，同时按培养基量的0.01％～0.02％加入消泡剂(泡敌)进行消毒，待其温度降至37～38℃时，将2～8℃保存的二级种子液(单型)分别按2％～2.5％加入到发酵罐内。调节培养温度37～38℃、搅拌转速200r/min、pH 7.2、罐压0.03～0.05Mpa之间、溶氧量40％，培养时间9～10小时。收获的各型菌液置2～8℃保存。

2.根据活菌计数结果，将灭活的胸膜肺炎放线杆菌1、5、7型菌液均稀释成≥3×10⁹CFU/ml后等量混合。

3.按常规方法制备成油乳剂灭活疫苗。

本发明的详细描述

一、疫苗制备

1.生产用种子制备

(1)一级种子繁殖与鉴定将HT、SZ、DY株冻干菌种划线接种于鸡肉汤琼脂平板上，在5％～10％CO₂条件下，37℃培养16～18h，挑取具有虹彩光泽的典型菌落(菌苔)，接种于5～6日龄SPF鸡胚卵黄囊内，在37℃继续孵育，收集30h内死亡的鸡胚卵黄液，经纯粹检验合格后，作为一级种子。在-20℃下保存，不超过1个月；-70℃下保存，不超过3个月。

(2)二级种子繁殖取感染鸡胚卵黄液，划线接种鸡肉汤琼脂平板，在含5％～10％CO₂条件下，37℃培养16～18h，挑选具有虹彩光泽的典型菌落或菌苔，接种于鸡肉汤培养基中，置37℃振荡培养10～12h，经纯检合格后，即为二级种子。在2～8℃保存，应不超过24h。

2.菌液培养采用机械搅拌发酵罐分别培养1、5、7型菌液。按发酵罐容积的60％～70％加入生产用的半合成培养基，同时按培养基量的0.01％～0.02％加入消泡剂 (泡敌)进行消毒，待其温度降至37～38℃时，将2～8℃保存的二级种子液(单型)按2％～2.5％加入到发酵罐内。培养温度控制在37～38℃、搅拌转速100～200r/min、pH 7.2、罐压0.03～0.05Pa、溶氧量40％，培养9～10h，收获菌液，置2～8℃保存，同时取样进行检验。

3.活菌计数取培养9～10h的菌液1ml，按(中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二五年版(三部).中国农业出版社，2006，本发明简称《中国兽药典》)附录方法进行活菌计数，各型活菌含量均应不低于3×10⁹CFU/ml。

4.灭活按菌液体积的0.3％加入甲醛溶液，37℃搅拌灭活16h，取样进行灭活检验，灭活后的菌液置2～8℃保存，应不超过7日。

5.疫苗制备

(1)水相配制取灭菌的吐温-804份、无菌检验合格的菌液96份，导入配液罐中，开启搅拌电机，匀速搅拌至吐温-80完全溶解。

(2)油相制备取注射用白油94份、司本-806份和硬脂酸铝1份加入油相制备罐中，开启搅拌电机，匀速搅拌，同时开启导热油开关，125℃加热30min，冷却后，导入贮油罐中备用。

(3)乳化取油相2份置于乳化罐内，开动电机低速搅拌，同时缓缓加入水相1份，再以4000r/min乳化30min。乳化后，取样10ml，以3000r/min离心15min，应不分层；若有分层现象，应重新乳化1次。

(4)分装定量分装，加盖密封。

二、疫苗的安全试验

1.猪传染性胸膜肺炎疫苗对靶动物和非使用日龄动物的一次单剂量接种的安全性试验用本发明人按本法试制的猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗01批分别对15日龄以内哺乳仔猪、产前15天怀孕母猪(均购自山东青岛平度市某良种猪场)各4头进行颈部肌肉注射，2ml/头，另设生理盐水免疫对照组。以观察试验猪接种疫苗后2周内，试验猪有无过敏，精神、饮食有无异常，注射部位有无红肿现象，仔猪增重或母猪产子情况是否正常。结果除了15日龄以内哺乳仔猪个别出现一过性精神不振和吮奶次数减少外，产前15天怀孕母猪接种后注射部位均未出现红肿现象，精神、采食均正常，所产仔猪均正常；对照试验猪均正常。

表1对非使用日龄靶动物的一次接种安全性试验结果

2.对靶动物一次超剂量接种的安全性试验

用本发明人试制的3批(01、02和03)猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗分别对5～6周龄健康易感仔猪，产前1个月怀孕母猪以及种公猪各4头分别颈部肌肉注射，4ml/头，观察试验猪接种疫苗后的安全性。结果表明，5～6周龄仔猪和种公猪接种后注射部位均未出现红肿反应，精神、采食以及种公猪配种性能均正常；产前1个月怀孕母猪接种后均未出现任何不良反应，所产仔猪均正常，与对照猪无明显差异。说明我们试制的疫苗一次超剂量接种怀孕母猪是安全的。详见表2。

表24ml疫苗接种安全性试验结果

3.单剂量重复接种安全试验

用本发明人试制的01批猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗对5～6周龄健康易感仔猪、产前1个月的怀孕母猪及种公猪进行疫苗接种，14天后重复接种一次，观察疫苗单剂量重复接种对接种猪的安全性。结果表明，该疫苗对接种猪无不良影响，无过敏现象，接种部位无红肿等不良反应，接种猪的精神、采食量均正常，仔猪增重、母猪及种公猪的生产性能与对照猪无明显差异。证明我们试制的疫苗单剂量重复接种是安全的。详见表3、表4、表5。

表3试验仔猪单剂量重复安全性试验结果

表4产前1个月怀孕母猪单剂量重复接种安全性试验结果

表5种公猪单剂量重复接种安全性试验结果

4.疫苗接种对靶动物免疫学功能的影响

用本发明人试制的01批猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗对5～6周龄健康易感仔猪进行接种，同时注射猪瘟活疫苗(兔源)、伪狂犬活疫苗，均由青岛易邦生物工程有限公司制备。接种4周后所有试验猪采血分离血清测定猪瘟间接血凝效价、APP1、5、7型ELISA抗体效价及伪狂犬的ELISA抗体效价，观察疫苗接种对接种仔猪免疫学功能的影响。结果表明，疫苗对靶动物免疫学功能无明显影响。试验结果表明该疫苗对靶动物的免疫学功能没有明显影响。详见表6。

表6疫苗接种对仔猪免疫学功能的影响结果记录表

注：-表示抗体为阴性 *表示伪狂犬病的ELISA检测结果S/N≤0.5者为阳性，S/N＞0.6者为阴性/表示未进行试验

三、疫苗ELISA抗体效价和攻毒保护相关试验

用本发明人试制的01批猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗，按不同剂量(0.25ml/头、0.5ml/头、1.0ml/头)颈部肌肉注射5～6周龄健康易感仔猪。免疫后4周，采血并分离血清，用ELISA试验方法检测1、5、7型抗体效价，根据ELISA抗体效价重新编号分组，连同非免疫对照组用胸膜肺炎放线杆菌1型(Shope4074)、5型(K17)、7型(WF83)国际参考株攻毒(免疫攻毒菌株胸膜肺炎放线杆菌Shope4074株(1型)、K17株(5型)、WF83株(7型)由瑞士伯恩大学兽医细菌研究所J.Nicolet教授和丹麦兽医学血清实验室R.Nielsen博士共同惠赠)，每头滴鼻3ml，攻毒菌液活菌含量分别为APP 1型约为1×10⁸CFU/头、APP 5型和APP 7型均约为5×10⁸CFU/头。观察14天，记录试验猪发病情况；观察不同免疫剂量的抗体水平与攻毒保护之间的关系。试验结果表明，ELISA抗体效价与攻毒保护率呈正相关。ELISA抗体效价为1∶200时，攻毒保护率为≤2/4；ELISA抗体效价≥1∶400时，攻毒保护率为3/4～4/4。详见表7、表8。

表7免疫猪的ELISA抗体效价

注：“-”表示抗体为阴性

表8ELISA抗体与攻毒保护关系试验结果

注：分子指保护仔猪数，分母指攻毒仔猪总数。“-”表示抗体为阴性。

四、抗体消长规律与免疫持续期及仔猪母源抗体持续期试验

用本发明人制备3批猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗(批号分别为01、02、03批)，分别免疫5～6周龄健康易感仔猪各12头、种公猪和产前1月龄怀孕母猪各12头，2ml/头，颈部肌肉注射。仔猪于免后第2、4、6、8周、4个月、6个月、7个月随机抽样4头；种公猪和母猪于免疫后1、3、6、7个月，分别采血测定其ELISA抗体效价，观察抗体水平的消长规律；免疫母猪产仔后，随机抽取1、3、5、6周龄仔猪各4头采血并分离血清，检测仔猪血清中1、5、7型ELISA抗体效价，同时分别用胸膜肺炎放线杆菌1、5、7型攻毒菌株对1、3、5、6周龄仔猪进行攻毒试验，根据试验结果确定仔猪通过母源抗体获得的被动免疫持续时间。以≥1∶400抗体水平的持续时间为免疫持续期。结果表明对5～6周龄仔猪进行免疫，免疫持续期为6个月；怀孕母猪在产仔前1个月进行免疫，2ml/头，所产仔猪的免疫持续期维持至5周，种公猪免疫持续期为6个月。详见表9、表10、表11、表12。

表9仔猪免疫后ELISA抗体消长规律的测定

注：-表示抗体为阴性

表10种公猪、产前1个月怀孕母猪免疫后ELISA抗体消长规律的测定

表11仔猪母源抗体消长规律测定结果

注：-表示抗体为阴性

表12被动免疫仔猪攻毒保护试验结果

注：分子表示保护仔猪头数，分母表示攻毒仔猪总数。

五、疫苗成品检验

(1)性状

外观乳白色乳液。

剂型油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水表面，除第一滴外，均应呈油滴状不扩散。

稳定性吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15min，管底析出的水相应≤0.5ml。

粘度用1ml吸管(下口内径为1.2mm，上口内径为2.7mm)吸取25℃左右疫苗1.0ml，令其垂直自然流出，记录流出0.4ml所需的时间，应在6s以内。

(2)无菌检验按《中国兽药典》方法进行，应无菌生长。

安全检验取5～6周龄健康易感仔猪4头，颈部肌肉注射疫苗，4ml/头，观察14日，应无异常反应。

(3)效力检验先采用血清学方法检验，当血清学方法检验不合格时，采用免疫攻毒法进行检验。

血清学方法取5～6周龄健康易感仔猪8头，其中4头颈部肌肉注射疫苗，2ml/头，剩余4头作非免疫对照。免后4周，所有试验猪采血分离血清，按附注4的方法用ELISA检测APP1、5和7型抗体效价。免疫组试验猪血清中1、5和7型抗体均应为阳性，且至少有3头均不小于1∶400，对照组猪血清1、5和7型抗体均应为阴性。

免疫攻毒法取5～6周龄健康易感仔猪24头，随机分为A、B、C、D、E和F 6组，每组4头，其中A、B和C组为免疫组，均颈部肌肉注射疫苗，2ml/头，D、E、F组为非免疫对照组。免疫后4周进行攻毒，A和D组试验猪用胸膜肺炎放线杆菌Shope4074株(1型)的6～8h S琼脂培养物滴鼻攻毒，3ml/头(活菌含量约为1×10⁸CFU/头)；B和E组试验猪用胸膜肺炎放线杆菌K17株(5型)的6～8h S琼脂培养物滴鼻攻毒，3ml/头(活菌含量约为5×10⁸CFU/头)；C和F组试验猪用胸膜肺炎放线杆菌WF83株(7型)的6～8h S琼脂培养物滴鼻攻毒，3ml/头(活菌含量约为5×10⁸CFU/头)，观察14日，各对照组仔猪应全部发病，各免疫组仔猪应至少保护3头。

(4)汞类防腐剂含量测定按《中国兽药典》方法进行，应符合兽用生物制品通则的规定。

六、疫苗的作用与用途

用于预防由1、5和7型猪胸膜肺炎放线杆菌引起的猪传染性胸膜肺炎。免疫期为6个月。

七、用法与用量

颈部肌肉注射，妊娠母猪产前一个月免疫，2ml/头；仔猪5～6周龄免疫，2ml/头；种公猪每6个月免疫一次，2ml/头/次。

本发明的积极意义：

本发明从优势流行菌株中筛选出免疫原性良好的胸膜肺炎放线杆菌1型HT株、5型SZ株和7型DY株作为疫苗制备菌株，分别接种于适宜培养基培养，收获培养物，经甲醛溶液灭活，加入矿物油佐剂混合乳化制成；用于预防由1、5和7型胸膜肺炎放线杆菌引起的猪传染性胸膜肺炎；此疫苗具有安全性好、免疫效力高且免疫期长等优点。

实施例

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的保护范围。

实施例1

1.生产用种子制备

(1)一级种子繁殖与鉴定将HT、SZ、DY株冻干菌种划线接种于鸡肉汤琼脂平板上，在含5％～10％CO₂条件下，37℃培养16～18h，挑取具有虹彩光泽的典型菌落(菌苔)，接种于5～6日龄SPF鸡胚卵黄囊内，在37℃继续孵育，收集30h内死亡的鸡胚卵黄液，经纯粹检验合格后，作为一级种子。在-20℃下保存，不超过1个月；-70℃下保存，不超过3个月(参见表13)。

表13一级种子

菌株号	种子数量(ml)	使用培养基	菌落生长情况
				APP HT株	100	鸡肉汤琼脂	具有虹彩光泽的典型菌落
APP SZ株	100	鸡肉汤琼脂	具有虹彩光泽的典型菌落
				APP DY株	100	鸡肉汤琼脂	具有虹彩光泽的典型菌落

(2)二级种子繁殖取感染鸡胚卵黄液，划线接种鸡肉汤琼脂平板，在含5％～10％CO₂条件下，37℃培养16～18h，挑选具有虹彩光泽的典型菌落或菌苔，接种于鸡肉汤培养基中，置37℃振荡培养10～12h，经纯检合格后，即为二级种子。在2～8℃保存，应不超过24h。(参见表14)。

表14二级种子

菌株号	种子数量(ml)	使用培养基	菌落生长情况
				APP HT株	1200	鸡肉汤琼脂	具有虹彩光泽的典型菌落
APP SZ株	1200	鸡肉汤琼脂	具有虹彩光泽的典型菌落
				APP DY株	1200	鸡肉汤琼脂	具有虹彩光泽的典型菌落

2.菌液培养采用机械搅拌发酵罐分别培养1、5、7型菌液。按发酵罐容积的60％～70％加入生产用的半合成培养基，同时按培养基量的0.01％～0.02％加入消泡剂(泡敌)进行消毒，待其温度降至37～38℃时，将2～8℃保存的二级种子液(单型)按2％～2.5％加入到发酵罐内。培养温度控制在37～38℃、搅拌转速100～200r/min、pH 7.2～7.4、罐压0.03～0.05Pa、溶氧量40％，培养9～10h，收获菌液，置2～8℃保存，同时取样进行检验。(参见表15)。

表15胸膜肺炎放线杆菌HT、SZ和DY株菌数测定结果

4.疫苗配制(参见表16)

(1)水相配制取灭菌的吐温-80 4份、无菌检验合格的菌液96份，导入配液罐中，开启搅拌电机，匀速搅拌至吐温-80完全溶解。

(2)油相制备取注射用白油94份、司本-80 6份和硬脂酸铝1份加入油相制备罐中，开启搅拌电机，匀速搅拌，同时开启导热油开关，125℃加热30min，冷却后，导入贮油罐中备用。

(4)分装定量分装，加盖密封。

表16疫苗乳化和分装

实施例2

疫苗成品检验

(1)性状

外观乳白色乳液。

剂型油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水表面呈油滴状不扩散。

稳定性吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15min，不分层。

粘度用1ml吸管(下口内径为1.2mm，上口内径为2.7mm)吸取25℃左右疫苗1.0ml，令其垂直自然流出，记录流出0.4ml所需的时间为4.9秒。

(2)无菌检验按《中国兽药典》方法进行，无菌生长。

安全检验取5～6周龄健康易感仔猪4头，颈部肌肉注射疫苗，4ml/头，观察14日，均无异常反应。

(3)效力检验

血清学方法取5～6周龄健康易感仔猪8头，其中4头颈部肌肉注射疫苗，2ml/头，剩余4头作非免疫对照。免后4周，所有试验猪采血分离血清，按附注4的方法用ELISA检测APP 1、5和7型抗体效价。免疫组试验猪血清中APP 1、5和7型抗体≥1∶400，对照组猪血清APP 1、5和7型抗体均为阴性。

免疫攻毒法取5～6周龄健康易感仔猪24头，随机分为A、B、C、D、E和F 6组，每组4头，其中A、B和C组为免疫组，均颈部肌肉注射疫苗，2ml/头，D、E和F组为非免疫对照组。免疫后4周进行攻毒，A和D组试验猪用胸膜肺炎放线杆菌Shope4074株(1型)的6～8h S琼脂培养物滴鼻攻毒，3ml/头(活菌含量约为1×10⁸CFU/头)；B、E组试验猪用胸膜肺炎放线杆菌K17株(5型)的6～8h S琼脂培养物滴鼻攻毒，3ml/头(活菌含量约为5×10⁸CFU/头)；C、F组试验猪用胸膜肺炎放线杆菌WF83株(7型)的6～8h S琼脂培养物滴鼻攻毒，3ml/头(活菌含量约为5×10⁸CFU/头)。观察14日，各对照组仔猪均4/4发病，各免疫组仔猪保护率均≥3/4。

(4)汞类防腐剂含量测定按《中国兽药典》方法进行，硫柳汞含量为0.009％，符合规定。

Claims

1.一种猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗，其特征是该疫苗含有经甲醛溶液灭活的胸膜肺炎放线杆菌1型HT株菌、5型SZ株菌和7型DY株菌及常规的矿物油佐剂，以上菌株已于2010年10月11日送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号：胸膜肺炎放线杆菌SZ株为CGMCC No.4215，DY株株为CGMCCNo.4216。

2.一种猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗的生产方法，其特征在于：

(1)采用机械搅拌发酵罐分别培养1、5、7型胸膜肺炎放线杆菌菌液：按发酵罐容积的70％加入生产用的半合成培养基，同时按培养基量的0.01％～0.02％加入消泡剂进行消毒，待其温度降至37～38℃时，按培养基总量的2％～2.5％将各型种子液分别加到发酵罐内，培养温度37～38℃、搅拌转速200r/min、pH 7.2、罐压0.03～0.05Mpa之间、溶氧量40％，培养时间9～10小时收获菌液置2～8℃保存；

(2)根据活菌计数结果，将灭活的1、5、7型胸膜肺炎放线杆菌菌液均稀释成≥3×10⁹CFU/ml后等量混合；

(3)按常规方法制备成矿物油佐剂灭活疫苗。

3.按照权利要求1和2所述的一种猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗及其生产方法，其特征是其中所使用半合成培养基是：取多聚蛋白胨5g，胰蛋白胨5g，酪蛋白胨5g，谷氨酸钠5g，酵母浸粉5g，D-葡萄糖1g，氯化钠5g溶于1000ml蒸馏水中，加热溶化后调pH至7.2～7.4，115℃灭菌30min，待冷至55℃左右，按无菌要求加入灭活鸡血清20ml，1％辅酶I 10ml。