CN104502581B - 一种猪传染性胸膜肺炎抗体检测用抗原及制备方法 - Google Patents

一种猪传染性胸膜肺炎抗体检测用抗原及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明的目的是为猪群的猪传染性胸膜肺炎抗体检测提供一种检测用抗原及制备方法。本发明中抗原是从猪传染性胸膜肺炎放线杆菌1～15型菌株培养物中提取的多糖抗原，为菌体分泌多糖，具有很强的特异性和敏感性，能真实的检测出猪传染性胸膜肺炎抗体；本发明中抗原标准浓度临界值的确定，为酶联免疫吸附试验检测和间接血凝试验检测提供了保障；操作简单、方便快速，无需特殊设备和仪器，适合在基层推广应用。

Description

一种猪传染性胸膜肺炎抗体检测用抗原及制备方法
技术领域
本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种猪传染性胸膜肺炎抗体检测用抗原及制备方法。
背景技术
猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌(Actionobacilluspleuropneumoniae，APP)引起猪的一种呼吸系统重要传染病。本病主要是引起猪的一种伴有胸膜炎的纤维素性、出血性、坏死性肺炎，多呈最急性或急性病程而迅速致死，发病率和死亡率均在50％以上，它可发生于任何年龄的猪只，猪传染性胸膜肺炎在世界各国均有发生，阳性率逐年在上升，近年来几乎全国各国各省均有本病发生的报道。尤其在集约化养猪场，一旦发生会造成重大经济损失。(进口猪嗜血杆菌胸膜肺炎血清学检查中国畜禽传染病1988(1)31～32；陈小玲,杨旭夫,朱士盛.猪传染性胸膜肺炎的流行现状和措施.中国兽医杂志,2001,37:33-35；NicoletJ.TaxonomyandserologicalidentificationofActionobacilluspleuropneumoniae.CanVet,1988,29:578-580)。根据细菌荚膜多糖和脂多糖(LPS)抗原对血清的反应，可将生物Ⅰ型分为12个血清型；生物Ⅱ型至少有3个血清型(本病至今已有15个血清型)，现有的而各型毒力有所差异，型间交叉保护性极差或缺少。由于本病病原的血清型众多，给本病的预防和控制带来了一定的难度，这就要求加强口岸检疫和猪群抗体的检测；因此血清学抗体检测是最重要的诊断方法之一。但由于APP各型之间缺少交叉保护，如果将每个样本都进行15个血清型的检测，操作繁琐，工作量大，难以实施，不能满足临床检测需求。
发明内容
本发明的目的是为猪群的猪传染性胸膜肺炎抗体检测提供一种检测用抗原及制备方法，从而克服现有检测抗原的不足。
本发明所提供的猪传染性胸膜肺炎抗体检测用抗原，为猪传染性胸膜肺炎1～15型的混合抗原；
本发明的抗原优选为从猪胸膜肺炎放线杆菌1～15型菌株培养物中提取的多糖抗原；采用以下步骤制备：
1)生产抗原用种子制备
将APP1～15型冻干菌种分别划线接种于S琼脂平板上，置5％～10％CO2条件下，37℃培养16～18小时，分别挑选菌落接种5～6日龄SPF鸡胚卵黄囊内，在37℃继续孵育，收集30小时内死亡的鸡胚卵黄液作为一级种子；再分别取各型菌株一级种子划线接种S琼脂平板，在含5％～10％CO2条件下37℃培养16～18小时后，挑选菌落或菌苔接种于S肉汤培养基中，置37℃振荡培养10～12小时制成二级种子；
2)菌液的培养
将各型菌株的二级种子按3％接种到S肉汤中进行扩大培养，37℃振荡培养10～12小时，收获菌液；将各型菌液按终浓度为0.5％加入甲醛溶液，37℃振荡灭活24小时，灭活，将菌液5000r/min离心20min去上清，将沉淀的菌体用pH6.4PBS洗涤2次，将沉淀的菌体用pH6.4PBS稀释，稀释后将各型菌液置于-20℃以下反复冻融3～5次，然后进行冰浴超声裂解，间歇破碎5min，以8000r/min离心30min，各型上清液分别用0.22μm滤膜无菌抽滤，收集于无菌瓶内，其滤液即为猪传染性胸膜肺炎1～15型单型诊断用抗原液；将APP1～15型标准浓度抗原等量混合，即成为1个光吸收单位的标准浓度多型混合抗原。
所述的S琼脂，其制备方法如下：取鸡肉汁100ml,胰蛋白胨血琼脂基质3g，多聚蛋白胨0.5g，加热溶解后调pH值至7.2～7.4，115℃灭菌30分钟，待冷至55℃左右，加入灭活鸡血清5ml，1％辅酶Ⅰ1ml。
所述的S肉汤，其制备方法如下：取鸡肉汁100ml，多聚蛋白胨0.5g，胰蛋白胨0.5g，氯化钠0.5g，加热溶解后调pH值至7.2～7.4，115℃灭菌30分钟，待冷至55℃左右，加入灭活的鸡血清5ml，1％辅酶Ⅰ1ml。
本发明中抗原是从猪传染性胸膜肺炎放线杆菌1～15型菌株培养物中提取的多糖抗原，为菌体分泌多糖，具有很强的特异性和敏感性，能真实的检测出猪传染性胸膜肺炎抗体；本发明中抗原标准浓度临界值的确定，为酶联免疫吸附试验检测和间接血凝试验检测提供了保障；操作简单、方便快速，无需特殊设备和仪器，适合在基层推广应用；本发明是目前国内唯一可以用于酶联免疫吸附试验和间接血凝试验检测的诊断抗原。而本发明基于稳定性好、特异强、敏感性高等突出优点的同时，还能用于酶联免疫吸附试验和间接血凝试验检测方法中，且检测效果均良好，能够在临床检测上得到更好的应用。
具体实施方式
本发明提供一种可同时应用猪传染性胸膜肺炎酶联免疫吸附试验和间接血凝试验应用免疫原性良好的APP1～15型菌株制备，按本发明能制备出稳定性好、特异强、敏感性高的APP1～15型混合抗原，本发明抗原主要优点还可同时进行猪传染性胸膜肺炎酶联免疫吸附试验和间接血凝试验，本发明要解决的技术问题在于克服现有检测抗原的不足，现有的检测用抗原仅能应用一种检测方法，而本发明抗原可同时用于猪传染性胸膜肺炎酶联免疫吸附试验和间接血凝试验检测，无论应用哪一种检测方法进行检测，本发明抗原检测效果均良好。该方法的建立还可满足抗体检测快速、准确，为进出口种猪抗体检测提供保障。
本发明的抗原的制备方法如下：
1生产抗原用种子制备
1.1鸡肉汤琼脂(简称S琼脂)制备取鸡肉汁100ml,胰蛋白胨血琼脂基质3g，多聚蛋白胨0.5g，加热溶解后调pH值至7.2～7.4，115℃灭菌30分钟，待冷至55℃左右，按无菌要求加入灭活鸡血清5ml，1％辅酶Ⅰ(NADH)1ml。
1.2一级种子繁殖与鉴定将APP1～15型冻干菌种划线接种于S琼脂平板上，置5％～10％CO2条件下，37℃培养16～18小时，挑选5个以上具有虹彩光泽的典型菌落(或菌苔)，接种5～6日龄SPF鸡胚卵黄囊内，在37℃继续孵育，收集30小时内死亡的鸡胚卵黄液，经纯粹检验合格后，作为一级种子。-20℃保存，使用期应不超过1个月；-70℃以下保存，使用期应不超过3个月，在培养基上继代应不超过6代。
1.3二级种子繁殖取各型菌株一级种子，划线接种S琼脂平板，在含5％～10％CO2条件下，37℃培养16～18小时，挑选具有虹彩光泽的典型菌落或菌苔，接种于S肉汤培养基中，置37℃振荡培养10～12小时，经纯检合格后，即为二级种子。2～8℃保存，应不超过24小时。
2菌液的培养
2.1鸡肉汤培养基(简称S肉汤)制备取鸡肉汁100ml，多聚蛋白胨0.5g，胰蛋白胨0.5g，氯化钠0.5g，加热溶解后调pH值至7.2～7.4，115℃灭菌30分钟，待冷至55℃左右，按无菌要求加入灭活的鸡血清5ml，1％辅酶Ⅰ(NADH)1ml。
2.2培养方法将纯检合格的各型菌株的二级种子按3％接种到S肉汤中进行扩大培养，37℃振荡培养10～12小时，收获菌液进行纯粹检验。
2.3纯粹检验将培养物涂片进行革兰氏染色镜检，应纯粹。
3菌液处理将各型菌液按终浓度为0.5％加入甲醛溶液，37℃振荡灭活24小时，灭活检验合格后，将菌液5000r/min离心20min去上清，将沉淀的菌体用pH6.4PBS洗涤2次，将沉淀的菌体用pH6.4PBS稀释，按比浊法测定，每毫升含菌量约为90亿。稀释后将各型菌液置于-20℃以下反复冻融3～5次，然后进行冰浴超声裂解，间歇破碎5min，以8000r/min离心30min，各型上清液分别用0.22μm滤膜无菌抽滤，收集于无菌瓶内，其滤液即为猪传染性胸膜肺炎1～15型单型诊断用抗原液。
4各型抗原最佳浓度标定将APP1～15型抗原液分别按适宜比例稀释，在紫外分光光度计波长260nm处测定其浓度(以光吸收单位表示)，然后将各单型抗原用pH6.4PBS稀释成1个光吸收单位，作为各型抗原的标准浓度。
5APP1～15型混合抗原的配制将APP1～15型标准浓度抗原等量混合，即成为1个光吸收单位的标准浓度多型混合抗原。
6成品检验
【性状】对制备的3批猪传染性胸膜肺炎诊断抗原进行了性状检测，结果均为无色透明液体。
【无菌检验】对本发明所制备的3批猪传染性胸膜肺炎诊断抗原按2010年版《中国兽药典》附录进行检验，均无菌生长。
【效价测定】我们对所抽取的诊断用抗原，进行了ELISA、间接血凝(IHA)效价的测定，达不到要求全部报废。对制备的3批猪传染性胸膜肺炎诊断抗原进行了检测，结果均符合要求。详见表1。
表1：3批诊断抗原效价测定结果
批号 ELISA效价 IHA效价 结果
2012001 S/N≥4.0 ≥1:32 合格
2012002 S/N≥4.0 ≥1:32 合格
2012003 S/N≥4.0 ≥1:32 合格
【特异性检验】对本发明所制备的3批猪传染性胸膜肺炎1～15型混合型诊断抗原，将各型抗原分别与APP1～15型阳性血清进行ELISA试验，均应得到阳性结果；分别与阴性对照血清、猪瘟、猪喘气病、猪萎缩性鼻炎及猪细小病毒的单因子血清进行ELISA试验，均应为阴性。详见表2。
表2：3批诊断抗原特异性检验结果
血清种类 ELISA效价 IHA效价 结果
AP1～15型阳性血清 S/N≥4.0 ≥1:32 阳性
APP阴性血清 S/N≤4.0 ≤1:2 阴性
猪瘟阳性血清 S/N≤4.0 ≤1:2 阴性
猪喘气病阳性血清 S/N≤4.0 ≤1:2 阴性
猪萎缩性鼻炎阳性血清 S/N≤4.0 ≤1:2 阴性
猪细小病毒阳性血清 S/N≤4.0 ≤1:32 阴性
实施例1
1生产抗原用种子制备
1.1一级种子繁殖与鉴定将APP1～15型冻干菌种划线接种于S琼脂平板上，置5％～10％CO2条件下，37℃培养16～18小时，挑选5个以上具有虹彩光泽的典型菌落(或菌苔)，接种5～6日龄SPF鸡胚卵黄囊内，在37℃继续孵育，收集30小时内死亡的鸡胚卵黄液，经纯粹检验合格后，作为一级种子。-20℃保存，使用期应不超过1个月；-70℃以下保存，使用期应不超过3个月，在培养基上继代应不超过6代。
1.2二级种子繁殖取各型菌株一级种子，划线接种S琼脂平板，在含5％～10％CO2条件下，37℃培养16～18小时，挑选具有虹彩光泽的典型菌落或菌苔，接种于S肉汤培养基中，置37℃振荡培养10～12小时，经纯检合格后，即为二级种子。2～8℃保存，应不超过24小时。
2菌液的培养
2.1培养方法将纯检合格的各型菌株的二级种子按3％接种到S肉汤中进行扩大培养，37℃振荡培养10～12小时，收获菌液进行纯粹检验。
2.2纯粹检验将培养物涂片进行革兰氏染色镜检，应纯粹。
3菌液处理将各型菌液按终浓度为0.5％加入甲醛溶液，37℃振荡灭活24小时，灭活检验合格后，将菌液5000r/min离心20min去上清，将沉淀的菌体用pH6.4PBS洗涤2次，将沉淀的菌体用pH6.4PBS稀释，按比浊法测定，每毫升含菌量约为90亿。稀释后将各型菌液置于-20℃以下反复冻融3～5次，然后进行冰浴超声裂解，间歇破碎4min，以8000r/min离心30min，各型上清液分别用0.22μm滤膜无菌抽滤，收集于无菌瓶内，其滤液即为猪传染性胸膜肺炎1～15型单型诊断用抗原液。
4各型抗原浓度标定将APP1～15型抗原液分别按适宜比例稀释，在紫外分光光度计波长260nm处测定其浓度(以光吸收单位表示)，然后将各单型抗原用pH6.4PBS稀释成1个光吸收单位，作为各型抗原的标准浓度。
5APP1～15型混合抗原的配制将APP1～15型标准浓度抗原等量混合，即成为1个光吸收单位的标准浓度多型混合抗原。
6田间血清样品检测
表3：APP血清学样品ELISA抗体检测结果
省市 送检头数 阳性头数 阳性率(％)
山东省 1262 221 17.5
安徽省 858 163 19
广东省 560 103 18.4
广西省 768 84 11
总计 3448 571 16.5
实施例2
1生产抗原用种子制备
1.1一级种子繁殖与鉴定将APP1～15型冻干菌种划线接种于S琼脂平板上，置5％～10％CO2条件下，37℃培养16～18小时，挑选5个以上具有虹彩光泽的典型菌落(或菌苔)，接种5～6日龄SPF鸡胚卵黄囊内，在37℃继续孵育，收集30小时内死亡的鸡胚卵黄液，经纯粹检验合格后，作为一级种子。-20℃保存，使用期应不超过1个月；-70℃以下保存，使用期应不超过3个月，在培养基上继代应不超过6代。
1.2二级种子繁殖取各型菌株一级种子，划线接种S琼脂平板，在含5％～10％CO2条件下，37℃培养16～18小时，挑选具有虹彩光泽的典型菌落或菌苔，接种于S肉汤培养基中，置37℃振荡培养10～12小时，经纯检合格后，即为二级种子。2～8℃保存，应不超过24小时。
2菌液的培养
2.1培养方法将纯检合格的各型菌株的二级种子按3％接种到S肉汤中进行扩大培养，37℃振荡培养10～12小时，收获菌液进行纯粹检验。
2.2纯粹检验将培养物涂片进行革兰氏染色镜检，应纯粹。
3菌液处理将各型菌液按终浓度为0.5％加入甲醛溶液，37℃振荡灭活24小时，灭活检验合格后，将菌液5000r/min离心20min去上清，将沉淀的菌体用pH6.4PBS洗涤2次，将沉淀的菌体用pH6.4PBS稀释，按比浊法测定，每毫升含菌量约为90亿。稀释后将各型菌液置于-20℃反复冻融3～5次，然后进行冰浴超声裂解，间歇破碎4min，以8000r/min离心30min，各型上清液分别用0.22μm滤膜无菌抽滤，收集于无菌瓶内，其滤液即为猪传染性胸膜肺炎1～15型单型诊断用抗原液。
4各型抗原浓度标定将APP1～15型抗原液分别按适宜比例稀释，在紫外分光光度计波长260nm处测定其浓度(以光吸收单位表示)，然后将各单型抗原用pH6.4PBS稀释成1个光吸收单位，作为各型抗原的标准浓度。
5APP1～15型混合抗原的配制将APP1～15型标准浓度抗原等量混合，即成为1个光吸收单位的标准浓度多型混合抗原。
6田间血清样品检测
表4：APP血清样品IHA抗体检测结果
省市 送检头数 阳性头数 阳性率(％)
北京市 1083 152 14
四川省 972 96 9.85 -->
福建省 1366 175 12.8
宁夏 791 85 10.7
总计 4212 508 12.1

Claims (1)

1.一种猪传染性胸膜肺炎抗体检测用抗原的制备方法，其特征在于，所述的抗原为猪传染性胸膜肺炎1～15型的混合抗原，其方法包括如下的步骤：
1)生产抗原用种子制备
将APP1～15型冻干菌种分别划线接种于S琼脂平板上，置5％～10％CO2条件下，37℃培养16～18小时，分别挑选菌落接种5～6日龄SPF鸡胚卵黄囊内，在37℃继续孵育，收集30小时内死亡的鸡胚卵黄液作为一级种子；再分别取各型菌株一级种子划线接种S琼脂平板，在含5％～10％CO2条件下37℃培养16～18小时后，挑选菌落或菌苔接种于S肉汤培养基中，置37℃振荡培养10～12小时制成二级种子；
2)菌液的培养
将各型菌株的二级种子按3％接种到S肉汤中进行扩大培养，37℃振荡培养10～12小时，收获菌液；将各型菌液按终浓度为0.5％加入甲醛溶液，37℃振荡灭活24小时，灭活，将菌液5000r/min离心20min去上清，将沉淀的菌体用pH6.4PBS洗涤2次，将沉淀的菌体用pH6.4PBS稀释，稀释后将各型菌液置于-20℃以下反复冻融3～5次，然后进行冰浴超声裂解，间歇破碎5min，以8000r/min离心30min，各型上清液分别用0.22μm滤膜无菌抽滤，收集于无菌瓶内，其滤液即为猪传染性胸膜肺炎1～15型单型诊断用抗原液；将APP1～15型标准浓度抗原等量混合完成制备；
所述的S琼脂，其制备方法如下：取鸡肉汁100ml,胰蛋白胨血琼脂基质3g，多聚蛋白胨0.5g，加热溶解后调pH值至7.2～7.4，115℃灭菌30分钟，待冷至55℃左右，加入灭活鸡血清5ml，1％辅酶Ⅰ1ml；
所述的S肉汤，其制备方法如下：取鸡肉汁100ml，多聚蛋白胨0.5g，胰蛋白胨0.5g，氯化钠0.5g，加热溶解后调pH值至7.2～7.4，115℃灭菌30分钟，待冷至55℃左右，加入灭活的鸡血清5ml，1％辅酶Ⅰ1ml。
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