CN107164453A - 一种仔猪大肠杆菌血清型鉴定及其毒力因子检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种仔猪大肠杆菌血清型鉴定及其毒力因子检测方法，属于仔猪养殖防病技术领域。所述的方法包括细菌分离及纯化、待检菌株生化鉴定、大肠杆菌O血清型鉴定；大肠杆菌O抗原定型血清型鉴定、和大肠杆菌毒力因子检测的步骤。本发明对分离的64株仔猪源致病性大肠杆菌血清型进行鉴定和毒力因子基因PCR检测，结果显示仔猪源大肠杆菌的血清型复杂，地区分布广泛，且差异较大，为本地区筛选优势血清型且具有良好免疫原性的菌株制备多价苗提供数据参考。

Description

一种仔猪大肠杆菌血清型鉴定及其毒力因子检测方法

技术领域

本发明属于仔猪养殖防病技术领域，具体涉及一种仔猪大肠杆菌血清型鉴定及其毒力因子检测方法。

背景技术

仔猪腹泻病是目前猪养殖过程中最为常见的疾病之一，常常导致仔猪生长缓慢、停滞甚至死亡，给养猪业造成极大的经济损失。中国仔猪腹泻病其原因复杂，主要为传染性腹泻，其中病毒性病原有传染性胃肠炎病毒、流行性腹泻病毒及轮状病毒等；细菌性病原主要有大肠杆菌、沙门氏菌和魏氏梭菌等。

仔猪大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌引起的一类传染病，造成仔猪黄痢、白痢和水肿病。仔猪黄痢是初生仔猪的急性、致死性传染病，主要发生于1周龄内仔猪，以1～3日龄最为常见，发病率和死亡率均很高。仔猪白痢主要发生于10～30日龄仔猪，发病率高，死亡率低。目前大肠杆菌血清型繁多，抗原成分复杂，完整的血清分型包括菌体抗原(O抗原)、荚膜抗原(K抗原)、鞭毛抗原(H抗原)及菌毛抗原(F抗原)。到目前为止，已有175个O抗原，80个K抗原，56个H抗原及20多个F抗原被正式鉴定。因大肠杆菌抗原血清型的多样性给大肠杆菌病的防治造成了极大的困难，目前虽有部分疫苗对其进行预防注射，但效果并不理想。

目前，常规检测猪源大肠杆菌毒素的方法费时耗钱，操作复杂，不适合大批量临床分离株的检测。

发明内容

本发明提供一种仔猪大肠杆菌血清型鉴定及其毒力因子检测方法。

PCR(聚合酶链式反应)方法的建立为临床实验室提供了一个更为快速、简便、灵敏的测定毒素的方法。与传统血清学方法相比，PCR方法准确性高，检出时间短，是目前推广使用的方法。

所述的方法包括如下步骤：

步骤1：细菌分离及纯化。

取病料样品于含2％(体积百分数)血清的TSA琼脂培养基上划线培养，37℃培养18～24h；然后挑取单菌落继续在麦康凯培养基上传代培养，稳定纯化3代后，单菌落再接种于LB培养基中，进行纯菌增殖，得到分离菌，-80℃甘油冻存，备用。

步骤2：待检菌株生化鉴定；

将步骤1得到的分离菌分别作吲哚试验、甲基红试验、VP试验、构椽酸盐利用试验和三糖铁琼脂试验，逐一鉴定筛选，大肠杆菌参考菌株ATCC 25922作对照，筛选出的菌株，再做葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、尿素发酵试验；确定分离菌为大肠杆菌。

步骤3：大肠杆菌O血清型鉴定；

抗原的制备：取分离菌光滑菌落接种于普通琼脂斜面小管，置于37℃培养箱中培养24h，用2mL0.5％石炭酸生理盐水洗下普通琼脂斜面小管培养物，置于小圆底试管，用塞子塞住，制成浓稠菌悬液，121℃高压2h，破坏其K抗原，制成高压抗原。

步骤4：大肠杆菌O抗原定型血清型鉴定。

先进行玻片凝集试验初步筛选O血清型，然后通过试管凝集试验确定其O血清型。定型标准为血清的试管凝集价≥640。

玻片凝集反应：将单因子血清进行玻片凝集反应。取高压抗原10μL于玻片上，再取10μL单因子血清与之混合，使之充分混匀，30s内出现明显凝集者为阳性反应。同时以高压抗原与0.5％石炭酸生理盐水混合物作对照，观察有无自凝集现象。

试管凝集反应：在l排小圆底试管中先加0.5％石炭酸生理盐水稀释液，第1管加1.5mL，从第2管起各管加0.5mL，然后在第1管加入大肠杆菌单因子血清0.5mL，混合后，从第1管吸0.5mL，加入第2管，依次作1∶2、1∶4、1∶8……1∶1 024系列倍比浓度稀释，然后各管加0.5mL普通肉汤高压抗原，振荡使血清和抗原充分混匀，放入37℃培养箱18～20h，取出后在室温静置2h，记录结果。每个试验设有以下各组：①标准抗原+阳性血清对照；②标准抗原+阴性血清对照；③标准抗原+生理盐水对照。

步骤5：大肠杆菌主要毒力因子检测；

大肠杆菌DNA模板制备：按照细菌DNA基因组提取试剂盒方法进行操作，提取大肠杆菌DNA，-20℃保存备用。

引物设计与合成：根据GenBank上已公布的序列(登录号：CP009072.1)设计引物，用于毒力因子的扩增，引物由北京诺赛生物技术公司合成，浓度均为50mmol/L，引物信息见表1。

PCR扩增；

以提取的DNA基因组作为模板，进行PCR扩增，检测64株分离菌对6个毒力因子的携带情况。PCR反应体系20μL:2×EasyTaq PCR SuperMix 10mL，上、下游引物各0.5μL，DNA模板1μL，双蒸水8μL。PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸2min，共35个循环；72℃再延伸10min。反应结束，取10μL PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳。

本发明的优点在于：

(1)；对分离的64株仔猪源致病性大肠杆菌血清型进行鉴定，主要有8种，分别为O101(18.8％)、O8(11.0％)、O20(11.0％)、O64(12.5％)、O45(4.6％)、O149(4.6％)、O2(1.5％)、O89(1.5％)。其中，O101(18.8％)、O8(11.0％)、O20(11.0％)、O64(12.5％)是4种主要流行血清型。

(2)；本发明实施例中对64株仔猪源致病性大肠杆菌毒力因子基因进行PCR检测，携带毒力因子astA和eaeA的菌株超过50％，而30％以上的菌株分别拥有sta和Stx2e。另外，80％细菌至少拥有2个毒力因子，其中毒力因子组合Stx2e+astA和Stx2e+eaeA较为流行，分别为20株和25株，而毒力因子组合sta+stb和stb+Stx2e较为少见，仅分别检测到3株和2株。

附图说明

图1A～1F分别为实施例中仔猪源致病性大肠杆菌毒力因子基因PCR检测结果电泳图，图1A，stb基因；图1B，astA基因；图1C，eaeA基因；图1D，SepA基因；图1E，sta基因；图1F，Stx2e基因。标号1～9表示待检菌株。

具体实施方式

下面将结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。

本发明提供一种仔猪大肠杆菌血清型鉴定及其毒力因子检测方法，所述的检测方法中涉及到的蛋白胨购自Oxoid公司；氯化钠、乳糖、蔗糖、牛肉膏、甘油等均购自国药集团化学试剂有限公司。超净工作台购自苏州净化设备厂；隔水式恒温培养箱、生化培养箱、电热鼓风干燥箱均购自上海一恒科学仪器有限公司；PCR仪购自Bio-Rad公司；电泳仪(DYY-6C型)购自北京六一仪器厂；紫外透射分析仪购自北京智源通技术研究所；瞬时离心机购自江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司。

所述的仔猪大肠杆菌血清型鉴定及其毒力因子检测方法包括如下步骤：

第一步，细菌分离及纯化。

取病料样品于含2％(体积分数)血清的TSA琼脂培养基上划线培养，37℃培养18～24h后，见到有白色、隆起、光滑的黏稠菌落后，用接种环勾取菌落涂片后采用革兰氏染色镜检，可见两端钝圆，散在的红色小杆菌，如图1。

然后从每个TSA琼脂平板上挑取单菌落继续在麦康凯培养基上传代培养，置于37℃培养箱中，培养24～48h，稳定纯化3代后，单菌落再接种于LB培养基中，进行纯菌增殖，可见呈红色、隆起、光滑湿润型菌落，为典型大肠杆菌培养特性和形态特征。以上结果可初步判定分离菌为大肠杆菌。将分离菌-80℃甘油冻存，备用。

所述的病料样品来自2010～2015年，在北京周边规模化猪场收集400份仔猪腹泻样品中分离得到的64株大肠杆菌。大肠杆菌参考菌株ATCC 25922、C83907(K88+)、C83529(K99 +)和C83710(987+)购自中国兽医药品监察所。

所述的血清为胎牛血清，购自Gibco公司。所述的TSA、TSB培养基均购自BD公司。

第二步，待检菌株生化鉴定；

将第一步中得到的64种大肠杆菌分离菌样品分别作吲哚试验、甲基红试验、VP试验、构椽酸盐利用试验和三糖铁琼脂试验，逐一鉴定筛选，大肠杆菌参考菌株ATCC 25922作对照，筛选出的菌株，这64株细菌均符合大肠杆菌特征。再做葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、尿素发酵试验，观察记录结果。

将64株大肠杆菌分别进行生化试验，VP和枸橼酸盐利用试验均为阴性，全部毒株甲基红和吲哚试验为阳性，56株能发酵葡萄糖、麦芽糖、乳糖，33株能发酵蔗糖，不产生硫化氢，不分解尿素。上述结果进一步表明64株分离菌为大肠杆菌。

第三步，大肠杆菌O血清型鉴定；

抗原的制备：取分离菌光滑菌落接种于普通琼脂斜面小管，置于37℃培养箱中培养24h，用2mL0.5％石炭酸生理盐水洗下普通琼脂斜面小管培养物，置于小圆底试管，用塞子塞住，制成浓稠菌悬液，121℃高压(当加热至开锅，加上高压阀后，汽体喷出，此时的温度已达121℃左右)2h，破坏其K抗原，制成高压抗原。

第四步，大肠杆菌O抗原定型血清型鉴定；

按中国兽药监察所提供的大肠杆菌O抗原定型血清使用说明书的方法进行O血清型鉴定。先进行玻片凝集试验初步筛选可能的O血清型，然后通过试管凝集试验确定其O血清型。定型标准为血清的试管凝集价≥640。

所述的玻片凝集试验：将单因子血清进行玻片凝集反应，具体为：

取第三步制备得到的高压抗原10μL于玻片上，再取10μL单因子血清与之混合，使二者充分混匀，30s内出现明显凝集者为阳性反应。同时以高压抗原与0.5％(质量百分比)石炭酸生理盐水混合物作对照，观察有无自凝集现象。

所述的试管凝集试验：在一排小圆底试管中先加0.5％(质量百分比)石炭酸生理盐水稀释液，第1管加1.5mL，从第2管起各管加0.5mL，然后在第1管加入大肠杆菌单因子血清0.5mL，混合后，从第1管吸0.5mL，加入第2管，依次作1∶2、1∶4、1∶8……1∶1 024系列倍比稀释，然后各管加0.5mL普通肉汤高压抗原，振荡使血清和抗原充分混匀，放入37℃培养箱18～20h，取出后在室温静置2h，记录结果。每个试验设有以下各组：①标准抗原+阳性血清对照；②标准抗原+阴性血清对照；③标准抗原+生理盐水对照。

第五步，大肠杆菌主要毒力因子检测；

(5.1)大肠杆菌DNA模板制备：按照细菌DNA基因组提取试剂盒方法进行操作，提取大肠杆菌DNA，-20℃保存备用。

(5.2)引物设计与合成：根据GenBank上已公布的序列(登录号：CP009072.1)设计引物，用于毒力因子的扩增，引物由北京诺赛生物技术公司合成，浓度均为50mmol/L，引物信息见表1。

表1引物信息

(5.3)PCR扩增：以提取的DNA基因组作为模板，进行PCR扩增，检测64株分离菌对6个毒力因子的携带情况。PCR反应体系20μL:2×EasyTaq PCR SuperMix 10mL，上、下游引物各0.5μL，DNA模板1μL，双蒸水8μL。PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸2min，共35个循环；72℃再延伸10min。反应结束，取10μL PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳。

实现结果如下：

血清型鉴定：64株仔猪源致病性大肠杆菌血清型分布见表3。由表3可知，对4株仔猪源致病性大肠杆菌鉴定出血清型的有42株，占鉴定菌株的65.5％，22株未能定型，占鉴定菌株的34.5％。流行的主要血清型主要有8种，分别为O101(18.8％)、O8(11.0％)、O20(11.0％)、O64(12.5％)、O45(4.6％)、O149(4.6％)、O2(1.5％)、O89(1.5％)。其中，O101(18.8％)、O8(11.0％)、O20(11.0％)、O64(12.5％)是4种主要流行血清型，其余各血清型较为分散，相同来源的菌株有相同血清型分布，也有不同血清型分布，而不同来源的菌株也有部分具有相同血清型。

表3 64株仔猪源致病性大肠杆菌血清型分布表

毒力因子检测：

本试验对64株仔猪源致病性大肠杆菌毒力因子基因进行PCR检测，部分检测结果见图1，(图1中，)其携带毒力因子基因情况见表4。携带毒力因子astA和eaeA的菌株超过50％，而30％以上的菌株分别拥有sta和Stx2e。另外，80％细菌至少拥有2个毒力因子，其中毒力因子组合Stx2e+astA和Stx2e+eaeA较为流行，分别为20株和25株，而毒力因子组合sta+stb和stb+Stx2e较为少见，仅分别检测到3株和2株。5株细菌中没有检测到所调查的任何一个毒力因子。

表4 64株仔猪源致病性大肠杆菌毒力因子分布表

最后应当说明的是:以上实施例仅用以解释说明本发明的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换；而不脱离本发明技术方案的精神，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。

本发明实施例的试验是对北京周边规模化猪场分离出64株仔猪源致病性大肠杆菌进行O 血清型鉴定，结果显示仔猪源大肠杆菌的血清型复杂，地区分布广泛，且差异较大。在定型42株菌中主要包括了8种血清型，分别为O101(18.8％)、O8(11.0％)、O20(11.0％)、O64(12.5％)、O45(4.6％)、O149(4.6％)、O2(1.5％)和O89(1.5％)，占分离菌株的65.5％。从鉴定比例中看出北京市的优势血清型为O101(18.8％)、O8(11.0％)、O20(11.0％)、O64(12.5％)，与山西省优势血清型基本一致，与河南省优势血清型O8，广东省优势血清型O107等不完全符合，证实了不同地区仔猪致病性大肠杆菌流行的主要血清型不同，可能是由于养猪业的发展，各地品种频繁的流通，导致了血清型的不断变化，为本地区筛选优势血清型且具有良好免疫原性的菌株制备多价苗提供数据参考。

本研究从北京周边分离到的仔猪大肠杆菌携带的毒力因子主要有sta、Stx2e、astA和eaeA等，拥有astA和eaeA的菌株超过50％，拥有sta和Stx2e的菌株占30％以上。80％的细菌至少拥有2个毒力因子，这些毒力因子在疾病发生过程中有着非常重要的作用。

目前，常规检测猪源大肠杆菌毒素的方法费时耗钱，操作复杂，不适合大批量临床分离株的检测。PCR方法的建立为临床实验室提供了一个更为快速、简便、灵敏的测定毒素的方法。与传统血清学方法相比，PCR方法准确性高，检出时间短，是目前推广使用的方法。

Claims (4)

1.一种仔猪大肠杆菌血清型鉴定及其毒力因子检测方法，其特征在于：所述的方法包括如下步骤，

步骤1：细菌分离及纯化；

取病料样品于含体积百分数2％血清的TSA琼脂培养基上划线培养，37℃培养18～24h；然后挑取单菌落继续在麦康凯培养基上传代培养，稳定纯化3代后，单菌落再接种于LB培养基中，进行纯菌增殖，得到分离菌，-80℃甘油冻存，备用；

步骤2：待检菌株生化鉴定；

将步骤1得到的分离菌分别作吲哚试验、甲基红试验、VP试验、构椽酸盐利用试验和三糖铁琼脂试验，逐一鉴定筛选，大肠杆菌参考菌株ATCC 25922作对照，筛选出的菌株，再做葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、尿素发酵试验；确定分离菌为大肠杆菌；

步骤3：大肠杆菌O血清型鉴定；

抗原的制备：取分离菌光滑菌落接种于普通琼脂斜面小管，置于37℃培养箱中培养24h，用2mL0.5％石炭酸生理盐水洗下普通琼脂斜面小管培养物，置于小圆底试管，用塞子塞住，制成浓稠菌悬液，121℃高压2h，破坏其K抗原，制成高压抗原；

步骤4：大肠杆菌O抗原定型血清型鉴定；

先进行玻片凝集试验初步筛选O血清型，然后通过试管凝集试验确定其O血清型；定型标准为血清的试管凝集价≥640；

步骤5：大肠杆菌毒力因子检测；

大肠杆菌DNA模板制备：按照细菌DNA基因组提取试剂盒方法进行操作，提取大肠杆菌DNA，-20℃保存备用；

引物设计与合成；

PCR扩增：

以提取的DNA基因组作为模板，进行PCR扩增，检测分离菌对毒力因子的携带情况。

2.根据权利要求1所述的一种仔猪大肠杆菌血清型鉴定及其毒力因子检测方法，其特征在于：所述的玻片凝集反应是指：将单因子血清进行玻片凝集反应，取高压抗原10μL于玻片上，再取10μL单因子血清与之混合，使之充分混匀，30s内出现明显凝集者为阳性反应；同时以高压抗原与0.5％石炭酸生理盐水混合物作对照，观察有无自凝集现象。

3.根据权利要求1所述的一种仔猪大肠杆菌血清型鉴定及其毒力因子检测方法，其特征在于：所述的试管凝集反应是指：在一排小圆底试管中先加0.5％石炭酸生理盐水稀释液，第1管加1.5mL，从第2管起各管加0.5mL，然后在第1管加入大肠杆菌单因子血清0.5mL，混合后，从第1管吸0.5mL，加入第2管，依次作1:2、1:4、1:8……1:1 024系列倍比浓度稀释，然后各管加0.5mL普通肉汤高压抗原，振荡使血清和抗原充分混匀，放入37℃培养箱18～20h，取出后在室温静置2h。

4.根据权利要求1所述的一种仔猪大肠杆菌血清型鉴定及其毒力因子检测方法，其特征在于：步骤5中所述的PCR扩增，PCR反应体系20μL:2×EasyTaq PCR SuperMix 10mL，上、下游引物各0.5μL，DNA模板1μL，双蒸水8μL；

PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸2min，共35个循环；72℃再延伸10min。