CN110540953A - 一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌培养基、分离鉴定方法及培养方法 - Google Patents

一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌培养基、分离鉴定方法及培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌培养基、分离鉴定方法及培养方法，属于微生物分离培养技术领域。本发明以鸡血清替代传统所用的牛、羊、马血清，制备猪传染性胸膜肺炎放线杆菌培养基，其中以5%左右的鸡血清的加入比例效果良好，该培养基价格便宜，来源广泛。用其分离鉴定猪传染性胸膜肺炎放线杆菌，从56份病料中分离鉴定出猪传染性胸膜肺炎放线杆菌51株，其分离率为97%；而传统的牛血清培养基仅从56份病料中分离鉴定出42株猪传染性胸膜肺炎放线杆菌，其分离率为75%；本发明的分离鉴定方法具有更高的分离效率。

Description

一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌培养基、分离鉴定方法及培 养方法
技术领域
本发明涉及一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌培养基、分离鉴定方法及培养方法，属于微生物分离培养技术领域。
背景技术
猪传染性胸膜肺炎(Infectious Pleuropneumonia of Swine，IPPS)是由胸膜肺炎放线杆菌(APP)引起的猪的呼吸道疾病，各种年龄猪均可感染。该病是世界范围内的多发病、常见病。我国于1990年首次确认有该病存在，近几年发病率呈上升趋势。该病引起猪只大批量的死亡、生长发育不良，给我过养猪业带来了很大的阻碍，随着养猪业的规模化、集约化发展，该病已经成为严重危害我国养猪业发展的主要呼吸道疾病之一，给我国养猪业带来了严重的经济损失。
猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)属于巴氏杆菌科、放线杆菌属，是一种革兰氏阴性小球杆菌。根据生长时是否依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD，又称V因子)可将APP分为两个生物型，生物I型(依赖NAD)和生物II型(不依赖NAD)。根据荚膜多糖(CPS)和细菌脂多糖(LPS)，猪传染性胸膜肺炎放线杆菌被分为15种血清型，且1型和5型分别又分为la、lb亚型和5a、5b亚型，其中1～12型和15型归为生物I型，13型和14型归为生物II型。不同血清型的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌毒力有明显差异，所引起的病程也有明显差异。由于猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清型多达15种，不同血清型菌株之间交叉免疫性又不强，因此灭活苗主要从当地分离的菌株制备而成，且在对疑似猪传染性胸膜肺炎病例的诊治中，细菌分离鉴定也是一种常规有效方法，对猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定是确诊猪传染性胸膜肺炎感染的重要依据。
传统方法中对该菌的分离鉴定过程中大多数采用在培养平皿中加入牛、马、羊的血清以满足该菌所需要的营养物质，然而这种方法在批量大规模分离鉴定或培养该菌时，成本较高，使用繁琐；并且猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的分离过程复杂，分离率低。
发明内容
本发明的目的是提供一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌培养基，以解决现有培养基成本较高，取材不便的问题。
本发明的目的还在于提供一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定方法，以解决现有分离鉴定的方法过程复杂，应用不便，成本高的问题。
本发明的目的还在于提供一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的培养方法，以解决现有培养方法应用不便，成本高的问题。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌培养基，包括：体积百分数为3-7％的鸡血清，余量为TSA培养基。
本发明以鸡血清替代传统所用的牛、羊、马血清，制备猪传染性胸膜肺炎放线杆菌培养基，其中以3-7％左右的鸡血清的加入比例效果良好，该培养基价格便宜，来源广泛。
进一步的，上述的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌培养基，还包括质量百分数为0.005-0.015％的烟碱腺嘌呤二核苷酸。
由于生物I型猪传染性胸膜肺炎放线杆菌为NAD依赖型，因此以3-7％左右鸡血清和0.005-0.015％NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)左右的比例分离鉴定或培养生物I型猪传染性胸膜肺炎放线杆菌效果良好。在培养猪传染性胸膜肺炎放线杆菌生物II型时，则无需添加烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。
具体的，所述TSA培养基可以为常规的配方，也可以为：每升加入胰蛋白胨13-17g，植物蛋白胨4-6g，氯化钠25-35g，琼脂13-17g，余量为水。
优选的，所述猪传染性胸膜肺炎放线杆菌培养基包括：体积百分数为5％的鸡血清，余量为TSA培养基。
一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定方法，包括以下步骤：
1)病料的采取：取临床症状表现为传染性胸膜肺炎的病猪的肺脏，作为病料；
分离培养基制备：所述分离培养基包括：体积百分数为3-7％的鸡血清，余量为TSA培养基；
2)细菌的分离鉴定：将病料接种于分离培养基上，培养至出现单菌落；
3)挑选菌形态与猪传染性胸膜肺炎放线杆菌相符的单菌落，然后进行尿素酶试验、CAMP试验和β溶血试验；若单菌落尿酶试验阳性、CAMP试验阳性并且β溶血，则判定为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌；若其中任一项不符，则判定为非猪传染性胸膜肺炎放线杆菌，弃之不用。
猪传染性胸膜肺炎放线杆菌在生长过程中对营养及环境要求较高，TSA培养基营养丰富，对于嗜血菌的培养率非常高，将其引入到猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的分离培养中，效果较好。同时，本发明中在TSA培养基中加入了3-7％的鸡血清对于猪传染性胸膜肺炎放线杆菌进行分离，分离效率增高，并且鸡血清价格便宜、来源广泛，分离鉴定成本低。
优选的，所述患有传染性胸膜肺炎的病猪为未经用药的患有传染性胸膜肺炎病猪。因该菌与其他杂菌混合感染的时候，细菌的分离更加困难；本发明在细菌分离选取未经用药的病猪或濒死猪进行分离，在分离时进行无菌操作，分离率较高，也防止了杂菌的污染。猪传染性胸膜肺炎放线杆菌分离鉴定传统方法中，一般先根据菌落形态、革兰染色和培养及营养要求进行几个方面进行初步鉴定，然后再根据尿素酶试验阳性，CAMP试验阳性，β溶血，NAD生长依赖，基本鉴定为APP；本发明中改良了分离鉴定传统方法中的营养要求部分。
优选的，步骤2)中所述培养为在厌氧条件下培养。猪传染性胸膜肺炎放线杆菌为兼性厌氧型菌株，因此，在厌氧条件下进行培养，能够排除好氧的杂菌，具体是在5％CO2厌氧培养容器中进行。
具体的，所述TSA培养基可以为常规的配方，也可以为：每升加入胰蛋白胨13-17.0g，植物蛋白胨4-6g，氯化钠25-35g，琼脂13-17g，余量为水。
进一步的，将挑选出的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌进行NAD生长依赖试验，若选出菌落NAD生长依赖，判定为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌生物I型；否则判定为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌生物II型。
进一步的，还可以对将挑选出的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌进行卫星生长试验，若选出菌落卫星生长试验阳性，判定为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌生物I型；否则判定为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌生物II型。
优选的，步骤3)中在挑选菌形态与猪传染性胸膜肺炎放线杆菌相符的单菌落时，从形态学特征进行判断。具体是从菌落形态和菌微观形态同时进行判断；所述菌落的形态应为：圆形、隆起、表面光滑、边缘整齐，并且为透明小菌落或为边缘整齐、灰白色带金黄色、不透明的大菌落。具体的，所述菌微观形态应为：革兰阴性短杆菌，两端钝圆，具有典型的多形性，菌体较小，多为球杆菌，有的成双排列。与猪传染性胸膜肺炎放线杆菌相符的单菌落应符合前述的菌落的形态和菌微观形态。
一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的的培养方法，使用含有质量百分数为0.005-0.015％烟碱腺嘌呤二核苷酸的分离培养基培养猪传染性胸膜肺炎放线杆菌生物I型菌株；所述分离培养基包括：体积百分数为3-7％的鸡血清，余量为TSA培养基。
一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的的培养方法，使用分离培养基培养猪传染性胸膜肺炎放线杆菌生物II型菌株；所述分离培养基包括：体积百分数为3-7％的鸡血清，余量为TSA培养基。
本发明中为实验室提供了一种方法简单，成本低廉，猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的培养方法。
具体的，所述TSA培养基可以为常规的配方，也可以为：每升加入胰蛋白胨13-17.0g，植物蛋白胨4-6g，氯化钠25-35g，琼脂13-17g，余量为水。
附图说明
图1为本发明中的培养基用来培养生物I型猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的效果图；
图2为本发明中所分离到的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的菌落形态展示图；
图3为本发明中所分离到的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的β溶血试验结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。除特殊说明的之外，各实施例及试验例中所用的设备和试剂均可从商业途径得到。
猪传染性胸膜肺炎放线杆菌培养基的实施例1
本实施例的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌培养基，制备包括：胰蛋白胨15.0g、植物蛋白胨5.0，氯化钠30.0g、琼脂15.0g，加蒸馏水至1000mL。将各成分加入水中，要不断搅拌，加热至煮沸1min。121℃高压灭菌15min，最终pH7.3±0.2。待其冷却至60℃时在无菌环境下无菌操作加入52mL鸡血清。
该培养基适合于猪传染性胸膜肺炎放线杆菌生物II型的分离鉴定及培养。
猪传染性胸膜肺炎放线杆菌培养基的实施例2
本实施例的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌培养基，制备包括：胰蛋白胨15.0g、植物蛋白胨5.0，氯化钠30.0g、琼脂15.0g，加蒸馏水至1000mL。将各成分加入水中，要不断搅拌，加热至煮沸1min。121℃高压灭菌15min，最终pH7.3±0.2。待其冷却至60℃时在无菌环境下无菌操作加入52mL鸡血清和0.1mgNAD。
该培养基适合于猪传染性胸膜肺炎放线杆菌生物I型的分离鉴定及培养。
猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定方法的实施例1
本实施例的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定方法，包括如下步骤：
(1)病料的采取；在选择病料时，应选择未进行药物治疗的猪只。临床症状主要表现为突然死亡，以剖检肺脏病变为主要判断标准，肺脏表面有纤维素性渗出，气管及支气管内充满泡沫状、血性黏液及黏膜渗出物，肺炎病变多是双侧型的，常发生于心叶和尖叶，取样时以肺脏为样品。
(2)培养基制备；具体培养基的制备为，5％鸡血清的TSA培养基。TSA配制为：胰蛋白胨15.0g、植物蛋白胨5.0，氯化钠30.0g、琼脂15.0g，加蒸馏水至1000mL。将各成分加入水中，要不断搅拌，加热至煮沸1min。121℃高压灭菌15min，最终pH7.3±0.2。待其冷却至60℃时在无菌环境下无菌操作加入52mL鸡血清；也可以选择加入1mL浓度为10％的NAD溶液。
(3)细菌的分离鉴定；用灼烧过的手术刀烫烙剖面(肺脏尖叶或心叶病变部位)，用无菌的剪刀剪开一新鲜切面并用镊子采集少许深层组织，将该组织在培养基上触抹划线接种于加0.01％NAD和5％鸡血清的TSA琼脂培养基上，同时划线于血平板、不加NAD的5％鸡血清的TSA琼脂培养基，5％CO2厌氧容器中37℃培养24～48h，如生长缓慢，可延长至72h后观察，挑选菌落形态疑似猪传染性胸膜肺炎的菌株，然后做尿素酶试验，CAMP试验，β溶血试验，NAD生长依赖试验，若分离菌尿酶试验阳性，CAMP试验阳性，β溶血，NAD生长依赖，则判为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌生物I型；仅符合前3项判为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌生物II型；前3项中有l项不符合者则弃之不用。
猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的培养方法的实施例1
本实施例的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的培养方法中：用含5％鸡血清和0.01％NAD的TSA培养基来培养生物I型猪传染性胸膜肺炎放线杆菌。TSA培养基中每升加入胰蛋白胨15g，植物蛋白胨5g，氯化钠30g，琼脂15g，余量为水。
选用4株洛阳中科基因技术有限公司已经通过传统常规方法分离鉴定的生物I型猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)，其血清型分别为5型、7型、3型、1型，用含5％鸡血清和0.01％NAD的TSA培养基来培养，培养后发现细菌生长状况良好；如图1所示，其中A为APP血清型7型；B为APP血清型5型；C为APP血清型3型；D为APP血清型1型。
猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的培养方法的实施例2
本实施例的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的培养方法中：用5％鸡血清的TSA培养基来培养生物II型猪传染性胸膜肺炎放线杆菌，TSA培养基中每升加入胰蛋白胨15g，植物蛋白胨5g，氯化钠30g，琼脂15g，余量为水。培养后发现细菌生长状况良好。
试验例1
2019年2月，某地某猪场4～5月龄的育肥猪发生大规模死亡，猪只发病峻急，出现体温升高、呼吸困难、死前口鼻有血色泡沫等症状，发病猪只症状疑似猪传染性胸膜肺炎，用灼烧过的手术刀烫烙肺脏尖叶剖面，用无菌的剪刀剪开一新鲜切面并用镊子采集少许深层组织，本次共收集56只猪的肺脏病料。
将病料同时触抹划线接种于加0.01％NAD的含5％鸡血清的TSA琼脂培养基(试验组)、加0.01％NAD的含5％犊牛血清的TSA琼脂培养基(对照组)上，于5％CO2厌氧容器中37℃下培养24h，观察菌落形态，挑取圆形、隆起、表面光滑、边缘整齐的透明小菌落进行纯化培养。纯化后菌株进行革兰染色镜检，挑选革兰阴性短杆菌，两端钝圆，具有典型的多形性，菌体较小，多为球杆菌，有的成双排列的菌落。
本次实验在使用加0.01％NAD和5％鸡血清的TSA琼脂培养基时，分别从56个肺脏病料中筛选出符合猪传染性胸膜肺炎放线杆菌菌落形态和菌微观形态的菌株55个。在使用加0.01％NAD和5％犊牛血清的TSA琼脂培养基时，分别从56个肺脏病料中筛选出符合猪传染性胸膜肺炎放线杆菌菌落形态和菌微观形态的菌株48个。
将这些菌株分别进行下一步的实验：
1、尿素酶试验：试验方法：应用Christenren氏培养基，即：蛋白胨1g，葡萄糖1g，氯化钠5g，KH2PO4 2g，0.2％酚红溶液6mL，琼脂20g，蒸馏水加至1000mL，调整pH至6.9。121℃高压灭菌15min，冷却至55℃时加入1/10的20％尿素液(经过滤法除菌)，使尿素含量为2％(即每1000mL中有20g)，制成短斜面。接种细菌时，同时做划线及穿刺，置37℃培养24h后观察，培养基从黄色变为红色时为阳性，阴性者继续观察4天。
本次试验5％鸡血清的TSA琼脂培养基上的55个菌株中53个为尿素酶阳性；而5％犊牛血清的TSA琼脂培养基上分离出的48个菌株中47个为尿素酶阳性。
2、CAMP试验：先用产溶血素的金黄色葡萄球菌在血琼脂平板上画一条横线；再挑取试验菌与前一画线垂直划线接种，两者相距0.5到1mm。至37℃培养18到24小时观察结果。结果判断：在两种细菌划线的交界处出现箭头形透明溶血区为阳性。
本次试验5％鸡血清的TSA琼脂培养基上的53个菌株中52个为CAMP阳性；而5％犊牛血清的TSA琼脂培养基上分离出的47个菌株中45个为CAMP阳性。
3、β溶血试验：结果如图2所示，图2表现为β溶血阳性。本次试验5％鸡血清的TSA琼脂培养基上的52个菌株中51个为β溶血阳性；而5％犊牛血清的TSA琼脂培养基上分离出的47个菌株中42个为β溶血阳性。
4、NAD生长依赖试验：将分离出的菌落分别涂覆于不加0.01％NAD的含5％鸡血清的TSA琼脂培养基和不加0.01％NAD的含5％犊牛血清的TSA琼脂培养基上进行培养。如菌落生长则为NAD生长不依赖，判定为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌生物II型；如菌落不生长，则为NAD生长依赖，判定为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌生物I型。
本次试验5％鸡血清的TSA琼脂培养基上的全部菌株为NAD生长依赖；而5％犊牛血清的TSA琼脂培养基上分离出的的全部菌株也为NAD生长依赖。
本试验例中对于鸡血清和犊牛血清的分离鉴定效果进行了比较，结果如表1所示。从临床上疑似猪传染性胸膜肺炎的病料56份病料中用鸡血清的方法分离鉴定出生物I型猪传染性胸膜肺炎放线杆菌51株，其分离率为97％，用牛血清的方法分离鉴定出42株生物I型猪传染性胸膜肺炎放线杆菌，其分离率为75％。从分离效果来看本发明中的方法优于传统方法(P＜0.05)。
表1两种方法的比较
分析产生这种结果的原因为：牛血清主要成分包括白蛋白、球蛋白、α-巨球蛋白、球蛋白、转铁蛋白、纤维粘连素，多肽类，激素类，以及其它如氨基酸、葡萄糖、微量元素等。鸡血清的主要成分：血清蛋白、非蛋白氮、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、乳酸脱氢酶、血糖、脂类、维生素、β胡萝卜素、血钙、血磷等组成。其中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等，这些物质对促进细胞生长或抑制生长活性是起达到生理平横的作用。因为存在生物的统一性，所以，自然界中大多数动物的血清成分大致一样，但在酶活力等个别因素上，还是存在差异，这也体现了生物界的个别差异性，这些个别差异性是导致两种方法效果不同的原因。而且胎牛血清供应往往不足，而鸡血清的供应量非常丰富，这也扩大了本发明培养基的来源，降低了分离鉴定、培养猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的成本。
对分离出的菌株进行常规培养试验和常规细菌生化试验。试验结果为：分离的菌落为圆形、隆起、表面光滑、边缘整齐的透明小菌落(如图3所示)，革兰氏染色为革兰阴性短杆菌，两端钝圆，具有典型的多形性，菌体较小，多为球杆菌，有的成双排列，符合生物I型APP的形态学特征。
将分离的菌株接种于不加NAD的5％鸡血清的TSA琼脂培养基、麦康凯培养基和普通平板，37℃培养24h。分离菌在不加NAD的5％血清的TSA琼脂培养基、麦康凯培养基和普通培养基不生长。
将分离的菌株进一步进行卫星生长试验和β溶血试验，卫星生长试验方法为：取一块没有添加NAD的TSA血清平皿，在平板中间沿直径线涂划接种金黄色葡萄球菌，然后将可以菌落垂直金黄色葡萄球菌线划线接种，37℃，培养24h后观察是否出现靠近金黄色葡萄球菌线的菌落长势较好，远离金黄色葡萄球菌线的地方无菌落生长的卫星现象。
结果为卫星生长试验阳性，血平板上产生β溶血(如图1所示)，符合生物I型APP特征。通过测序后同源性分析进行最终确定为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌。

Claims (10)

1.一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌培养基，其特征在于，包括：体积百分数为3-7%的鸡血清，余量为TSA培养基。
2.根据权利要求1所述的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌培养基，其特征在于，还包括质量百分数为0.005-0.015%的烟碱腺嘌呤二核苷酸。
3.根据权利要求1或2所述的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌培养基，其特征在于，所述TSA培养基为：每升加入胰蛋白胨13-17g，植物蛋白胨4-6g，氯化钠25-35g，琼脂13-17g，余量为水。
4.根据权利要求1所述的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌培养基，其特征在于，包括：体积百分数为5%的鸡血清，余量为TSA培养基。
5.一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）病料的采取：取临床症状表现为传染性胸膜肺炎的病猪的肺脏，作为病料；
分离培养基制备：所述分离培养基包括：体积百分数为3-7%的鸡血清，余量为TSA培养基；
2）细菌的分离鉴定：将病料接种于分离培养基上，培养至出现单菌落；
3）挑选菌形态与猪传染性胸膜肺炎放线杆菌相符的单菌落，然后进行尿素酶试验、CAMP试验和β溶血试验；若单菌落尿酶试验阳性、CAMP试验阳性并且β溶血，则判定为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌；若其中任一项不符，则判定为非猪传染性胸膜肺炎放线杆菌，弃之不用。
6.根据权利要求5所述的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定方法，其特征在于，步骤2）中所述培养为在厌氧条件下培养。
7.根据权利要求5所述的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定方法，其特征在于，将挑选出的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌进行NAD生长依赖试验，若选出菌落NAD生长依赖，判定为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌生物I型；否则判定为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌生物II型。
8.根据权利要求5所述的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定方法，其特征在于，步骤3）中在挑选菌形态与猪传染性胸膜肺炎放线杆菌相符的单菌落时，从形态学特征进行判断。
9.一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的的培养方法，其特征在于，使用分离培养基培养猪传染性胸膜肺炎放线杆菌生物II型菌株；所述分离培养基包括：体积百分数为3-7%的鸡血清，余量为TSA培养基。
10.一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的的培养方法，其特征在于，使用含有质量百分数为0.005-0.015%烟碱腺嘌呤二核苷酸的分离培养基培养猪传染性胸膜肺炎放线杆菌生物I型菌株；所述分离培养基包括：体积百分数为3-7%的鸡血清，余量为TSA培养基。
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