CN110484465B - 一种vbnc细菌的复苏培养基及其制备方法与应用 - Google Patents

一种vbnc细菌的复苏培养基及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种VBNC细菌的复苏培养基及其制备方法与应用，所述VBNC细菌的复苏培养基包括基础培养基和藤黄微球菌菌液，其中，所述基础培养基按重量份数计包括，葡萄糖1‑5份，酵母抽提物1‑5份，蛋白胨1‑10份，磷酸氢二钾0.2‑0.5份，硫酸镁0.02‑0.1份，硫酸亚铁0.005‑0.1份，氯化钠0.02‑0.1份，麦芽糖2‑10份，蒸馏水1000份；所述藤黄微球菌菌液含有复苏促进因子；所述藤黄微球菌菌液与所述基础培养基的体积比为10‑20：100。本发明还提供了相应的制备方法和应用。该复苏培养基能够有效促进VBNC细菌的复苏，且具有制备方法简单，成本低廉的优点。

Description

一种VBNC细菌的复苏培养基及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及微生物筛选和培养领域，具体涉及一种VBNC细菌的复苏培养基及其制备方法与应用。
背景技术
利用传统的常规培养方法从自然界中只能分离到0.01-10％的可培养微生物，绝大部分微生物都处在活的但非可培养(viable but non-culturable，VBNC)状态，这种微生物的细胞仍具有代谢活性，在一定条件的刺激诱导下，能恢复活性进行代谢繁殖，近年来，对于VBNC菌的研究逐渐受到越来越多的重视。
VBNC菌指在环境胁迫下失去在培养基上形成菌落能力但保留一定生理活性的细菌，这一定义的前提是该细菌本来具有在某种培养基上生长的能力，由此与不可培养(Non-culturable bacteria)区分开。同时，与其他失活状态(Non-growing)如饥饿、芽孢、休眠、耐受态细胞相比，VBNC状态的细菌保留了细胞的完整形态，并有呼吸、蛋白质合成、基因转录等生理过程，在适宜条件下，VBNC菌液可恢复在平板上生长的能力，这一过程称为复苏(resuscitation)。
1998年Mukamolova等在培养藤黄微球菌(Micrococcus luteus)的过程中发现了复苏促进因子(resuscitation promoting factor，Rpf)，后续研究发现，Rpf蛋白对土壤中的多种VBNC状态的细菌有复苏活化作用，其不仅对高GC的革兰氏阳性菌起效果，同时对低GC的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌也有较好的效果。
中国专利文献CN109536431A公开了一种复合生化复苏因子组合物及其应用，所述组合物包括两种Rpf蛋白和丙酮酸钠，所述两种Rpf蛋白分别为来自藤黄微球菌的重组蛋白MLUT_RS18675和来源于哈氏噬纤维菌的重组蛋白CHU_0099。这两种生物复苏因子分别作用于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，同时采用化学复苏因子从增强能量供给、DNA和蛋白质合成的角度以提高环境微生物的可培养性。
尽管Rpf已被应用于VBNC细菌的复苏，并可刺激正常细菌的生长，但促进效果仍较为有限，在此基础上，本领域技术人员一直致力于开发可显著促进VBNC复苏的培养基。
发明内容
本发明的目的在于提供一种VBNC细菌的复苏培养基及其制备方法与应用。
为此，本发明的第一方面，提供了一种VBNC细菌的复苏培养基，所述培养基包括基础培养基和藤黄微球菌菌液，
其中，所述基础培养基按重量份数计包括，
葡萄糖1-5份，酵母抽提物1-5份，蛋白胨1-10份，磷酸氢二钾0.2-0.5份，硫酸镁0.02-0.1份，硫酸亚铁0.005-0.1份，氯化钠0.02-0.1份，麦芽糖2-10份，蒸馏水1000份；
所述藤黄微球菌菌液含有复苏促进因子(resuscitation promoting factor，Rpf)；
所述藤黄微球菌菌液与所述基础培养基的体积比为10-20：100，优选为15-20：100。
进一步，所述基础培养基按重量份数计包括，
葡萄糖2-5份，酵母抽提物3-5份，蛋白胨1-5份，磷酸氢二钾0.2-0.5份，硫酸镁0.02-0.1份，硫酸亚铁0.005-0.05份，氯化钠0.02-0.1份，麦芽糖2-10份，蒸馏水1000份。
进一步，所述藤黄球菌菌液的制备方法如下，
取藤黄微球菌接种于菌种液体培养基，25-37℃，100-150rpm培养；细菌生长至对数期后期，培养液用3000-8000rpm，10-30min离心抽提去除菌体；经0.20-0.25μm膜过滤灭菌后，-30～-10℃保存备用。
进一步，所述离心抽提去除菌体的条件为5000-8000rpm，20-30min离心抽提；优选的条件为6000rpm，30min离心抽提。
进一步，所述菌种液体培养基为乳酸盐基本培养基(Lactate Minimal Medium，LMM)。
LMM培养基的配方为：4.0g NH4Cl、1.4g KH2PO4、0.005g生物素(Biotin)、0.02g L-蛋氨酸、0.04g微生物B1、1.0g肌苷(Inosine)、0.03g MgSO4、10.0g L-乳酸锂盐、1.0ml矿物质盐溶液(0.375g CuSO4·5H2O、0.785g MnCl2·4H2O、0.183g FeSO4·7H2O、0.029gNa2MoO4·2H2O和0.089g ZnSO4·7H2O)，蒸馏水1000ml，pH7.0-7.5。
进一步，所述基础培养基还包括谷氨酸钠和D-半乳糖，所述谷氨酸钠和D-半乳糖的重量份数比为1-2：2-5，优选为1-2：3-5。
在一个优选的实施方式中，所述基础培养基按重量份数计包括，葡萄糖2-5份，酵母抽提物3-5份，蛋白胨1-5份，磷酸氢二钾0.2-0.5份，硫酸镁0.02-0.1份，硫酸亚铁0.005-0.05份，氯化钠0.02-0.1份，麦芽糖2-10份，谷氨酸钠1-2份，D-半乳糖2-5份，蒸馏水1000份。
本发明的第二方面，提供了上述VBNC细菌的复苏培养基的制备方法，包括，
(1)准确称取基础培养基的各组分，pH调至7.0-7.5，优选为7.0，110-130℃，10-30min高压灭菌锅灭菌，制备得到基础培养基；
(2)取藤黄微球菌接种于菌种液体培养基，25-37℃，100-150rpm培养；细菌生长至对数期后期，培养液用3000-8000rpm，10-30min离心抽提去除菌体；经0.20-0.25μm膜过滤灭菌，制备得到藤黄微球菌菌液；
(3)将步骤(2)制备得到的藤黄微球菌菌液和步骤(1)制备得到的基础培养基按照所述体积比混合，搅拌均匀，即制备得到所述VBNC细菌的复苏培养基。
进一步，步骤(2)中去除菌体的条件为5000-8000rpm，15-30min离心抽提。
本发明的第三方面，提供了所述VBNC细菌的复苏培养基在复苏和/或分离环境样品中活的但非可培养状态微生物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明提供的培养基能够有效促进VBNC细菌的复苏；
(2)本发明无需异源表达复苏促进因子(Rpf)，通过培养藤黄微球菌并对培养产物进行提取，即可有效利用培养基中的Rpf，操作简便，成本低廉；
(3)本发明提供的培养基有利于VBNC细菌的复苏和生长，从而有利于进一步对VBNC细菌进行分离；通过在培养基中同时添加谷氨酸钠和D-半乳糖，意料不到地显著提升了培养基对VBNC细菌的复苏效果。
附图说明
通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。在附图中：
图1为土壤样品经培养72h后菌密度对比图。
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。
LMM培养基配方：4.0g NH4Cl、1.4g KH2PO4、0.005g生物素(Biotin)、0.02g L-蛋氨酸、0.04g微生物B1、1.0g肌苷(Inosine)、0.03g MgSO4、10.0g L-乳酸锂盐、1.0ml矿物质盐溶液(0.375g CuSO4·5H2O、0.785g MnCl2·4H2O、0.183g FeSO4·7H2O、0.029g Na2MoO4·2H2O和0.089g ZnSO4·7H2O)，加入蒸馏水1000ml溶解，调节pH至7.5，高温高压灭菌。
藤黄微球菌购自美国ATCC(菌种编号ATCC4698)，。
以下实施例中所用的试剂和方法，如无特殊说明，均为可通过常规商业途径获得的试剂和本领域常规的方法。
实施例1
(1)称取葡萄糖2g，酵母抽提物5g，蛋白胨2g，磷酸氢二钾0.2g，硫酸镁0.05g，硫酸亚铁0.01g，氯化钠0.05g，麦芽糖8g，蒸馏水1000ml，pH调至7.0，110℃，30min高压灭菌锅灭菌，制备得到基础培养基；
(2)取藤黄微球菌接种于LMM液体培养基，35℃，120rpm培养；细菌生长至对数期后期，培养液用5000rpm，30min离心抽提去除菌体；经0.22μm膜过滤灭菌，制备得到藤黄微球菌菌液；
(3)将步骤(2)制备得到的藤黄微球菌菌液和步骤(1)制备得到的基础培养基按照体积比15：100混合，搅拌均匀，即制备得到所述VBNC细菌的复苏培养基。
实施例2
(1)称取葡萄糖5g，酵母抽提物3g，蛋白胨3g，磷酸氢二钾0.3g，硫酸镁0.04g，硫酸亚铁0.02g，氯化钠0.02g，麦芽糖5g，谷氨酸钠2g，蒸馏水1000ml，pH调至7.0，110℃，30min高压灭菌锅灭菌，制备得到基础培养基；
(2)取藤黄微球菌接种于LMM液体培养基，35℃，120rpm培养；细菌生长至对数期后期，培养液用8000rpm，20min离心抽提去除菌体；经0.22μm膜过滤灭菌，制备得到藤黄微球菌菌液；
(3)将步骤(2)制备得到的藤黄微球菌菌液和步骤(1)制备得到的基础培养基按照体积比20：100混合，搅拌均匀，即制备得到所述VBNC细菌的复苏培养基。
实施例3
(1)称取葡萄糖2g，酵母抽提物5g，蛋白胨5g，磷酸氢二钾0.3g，硫酸镁0.05g，硫酸亚铁0.01g，氯化钠0.05g，麦芽糖10g，D-半乳糖5g，蒸馏水1000ml，pH调至7.0，110℃，30min高压灭菌锅灭菌，制备得到基础培养基；
(2)取藤黄微球菌接种于LMM液体培养基，35℃，150rpm培养；细菌生长至对数期后期，培养液用4000rpm，30min离心抽提去除菌体；经0.22μm膜过滤灭菌，制备得到藤黄微球菌菌液；
(3)将步骤(2)制备得到的藤黄微球菌菌液和步骤(1)制备得到的基础培养基按照体积比15：100混合，搅拌均匀，即制备得到所述VBNC细菌的复苏培养基。
实施例4
(1)称取葡萄糖2g，酵母抽提物5g，蛋白胨5g，磷酸氢二钾0.3g，硫酸镁0.05g，硫酸亚铁0.01g，氯化钠0.05g，麦芽糖8g，谷氨酸钠2g，D-半乳糖5g，蒸馏水1000ml，pH调至7.0，110℃，30min高压灭菌锅灭菌，制备得到基础培养基；
(2)取藤黄微球菌接种于LMM液体培养基，35℃，120rpm培养；细菌生长至对数期后期，培养液用5000rpm，30min离心抽提去除菌体；经0.22μm膜过滤灭菌，制备得到藤黄微球菌菌液；
(3)将步骤(2)制备得到的藤黄微球菌菌液和步骤(1)制备得到的基础培养基按照体积比15：100混合，搅拌均匀，即制备得到所述VBNC细菌的复苏培养基。
对比例1
称取葡萄糖2g，酵母抽提物5g，蛋白胨5g，磷酸氢二钾0.2g，硫酸镁0.05g，硫酸亚铁0.02g，氯化钠0.05g，麦芽糖8g，蒸馏水1000ml，pH调至7.0，110℃，30min高压灭菌锅灭菌，制备得到培养基。
对比例2
(1)称取葡萄糖2g，酵母抽提物5g，蛋白胨5g，磷酸氢二钾0.2g，氯化钠0.05g，麦芽糖8g，蒸馏水1000ml，pH调至7.0，110℃，30min高压灭菌锅灭菌，制备得到基础培养基；
(2)取藤黄微球菌接种于LMM液体培养基，35℃，120rpm培养；细菌生长至对数期后期，培养液用5000rpm，30min离心抽提去除菌体；经0.22μm膜过滤灭菌，制备得到藤黄微球菌菌液；
(3)将步骤(2)制备得到的藤黄微球菌菌液和步骤(1)制备得到的基础培养基按照体积比15：100混合，搅拌均匀，即制备得到复苏培养基。
对比例3
(1)称取葡萄糖10g，酵母抽提物1g，蛋白胨2g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁0.5g，硫酸亚铁0.002g，氯化钠0.01g，麦芽糖1g，谷氨酸钠5g，D-半乳糖1g，蒸馏水1000ml，pH调至7.0，110℃，30min高压灭菌锅灭菌，制备得到基础培养基；
(2)取藤黄微球菌接种于LMM液体培养基，35℃，120rpm培养；细菌生长至对数期后期，培养液用8000rpm，20min离心抽提去除菌体；经0.22μm膜过滤灭菌，制备得到藤黄微球菌菌液；
(3)将步骤(2)制备得到的藤黄微球菌菌液和步骤(1)制备得到的基础培养基按照体积比15：100混合，搅拌均匀，即制备得到复苏培养基。
实验例
(1)土壤样品来源：采取自金华市湖海塘周围土壤样品。在超净工作台中，取100mg土壤样品置于灭菌1.5ml离心管中，添加1ml灭菌去离子水，充分振荡均匀，离心收集上清。
(2)MPN(Most probable number)计数法培养：实验共分为七组(分别应用实施例1-4和对比例1-3制备得到的培养基进行培养)，每组三个平行。移取100μl步骤(1)得到的土壤上清液接种于装有900μl培养基的微量培养瓶中，记为10-1(对土壤上清液的稀释倍数为10-1)，摇匀后从10-1瓶移取100μl混合液到下一个培养瓶中，记为10-2，以此类推至10-6瓶。
(3)将微量培养瓶瓶盖拧紧后置于培养箱中，30℃振荡培养72h，测定培养液的菌液密度(OD600)值，测定结果如图1所示；通过菌密度对比，随着稀释倍数越来越大时，实施例1-4的培养基所培养的菌密度显著高于对比例1-3的培养基，且实施例4的培养基的菌密度较实施例1-3的显著更高。与应用对比例1-3的培养基相比，应用实施例4的培养基额外分离到三株菌，经鉴定为Microbacterium sp.、Bacillus sp.和Rhodococcus sp.；应用实施例1-3的培养基也分离得到了Microbacterium sp.和Bacillus sp.(并未分离得到Rhodococcus sp.)。上述结果表明这三种细菌在实验所选的环境样品中处于休眠状态，经本发明提供的培养基复苏后，变为可培养状态，进而可得到分离。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (6)

1.一种VBNC细菌的复苏培养基，其特征在于，由基础培养基和藤黄微球菌( Micrococcus luteus )菌液组成，
其中，所述基础培养基按重量份数计由以下成分组成，
葡萄糖2-5份，酵母抽提物3-5份，蛋白胨2-5份，磷酸氢二钾0.2-0.3份，硫酸镁0.04-0.05份，硫酸亚铁0.01-0.02份，氯化钠0.02-0.05份，麦芽糖5-10份，谷氨酸钠2份，D-半乳糖5份，蒸馏水1000份；
所述藤黄微球菌菌液含有复苏促进因子(resuscitation promoting factor，Rpf)；
所述藤黄微球菌菌液与所述基础培养基的体积比为10-20：100。
2.如权利要求1所述的VBNC细菌的复苏培养基，其特征在于，所述藤黄球菌菌液的制备方法包括，
取藤黄微球菌接种于菌种液体培养基，25-37℃，100-150rpm培养；细菌生长至对数期后期，培养液用3000-8000rpm，10-30min离心抽提去除菌体；经0.20-0.25μm膜过滤灭菌。
3.如权利要求2所述的VBNC细菌的复苏培养基，其特征在于，所述菌种液体培养基为乳酸盐基本培养基。
4.如权利要求1-3任一项所述的VBNC细菌的复苏培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤，
(1)准确称取基础培养基的各组分，pH调至7.0-7.5，110-130℃，10-30min高压灭菌锅灭菌，制备得到基础培养基；
(2)取藤黄微球菌接种于菌种液体培养基，25-37℃，100-150rpm培养；细菌生长至对数期后期，培养液用3000-8000rpm，10-30min离心抽提去除菌体；经0.20-0.25μm膜过滤灭菌，制备得到藤黄微球菌菌液；
(3)将步骤(2)制备得到的藤黄微球菌菌液和步骤(1)制备得到的基础培养基按照体积比10-20：100混合，搅拌均匀，即制备得到所述VBNC细菌的复苏培养基。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)抽提去除菌体的条件为5000-8000rpm，15-30min离心抽提。
6.如权利要求1-3任一项所述VBNC细菌的复苏培养基在复苏和/或分离环境样品中活的但非可培养状态微生物中的应用。
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