CN104531600A - 一种vbnc联苯降解菌的分离筛选方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种VBNC联苯降解菌的分离筛选方法及应用，该方法将促进剂SRpf添加至处理组的富集培养中，对照组不添加促进剂SRpf，通过分离纯化处理组特有的菌株，以筛选VBNC状态菌。本发明分离筛选出的菌株TG9，其特征在于，它的16S rRNA是SEQ ID No.1所示的基因序列；它能在较广的温度、pH和盐度范围内生长，且能利用联苯为唯一碳源生长；同时，其耐受联苯浓度高达3000mg/L，亦可降解低氯代多氯联苯及低氯代苯甲酸。因此，该VBNC状态菌的分离筛选方法不仅可以用于筛选高效联苯降解菌群，亦可用于筛选其它有机污染物降解菌群，为探索新的菌种资源及环境功能菌，提供一种安全、廉价、高效的方法。

Description

一种VBNC联苯降解菌的分离筛选方法及应用
技术领域
本发明属于污染物微生物降解领域，尤其涉及一种VBNC联苯降解菌的分离筛选方法及应用。
背景技术
自然环境中存在大量的微生物，利用纯培养技术仅能对自然界中0.01％-10％的微生物进行分离鉴定，尚有90％以上的微生物因处于活的但非可培养(“viable but non-culturable”，简称VBNC)状态而未被认知。VBNC状态菌作为自然界中未能开发利用的绝大部分微生物资源，虽然基于非培养手段可以获取其多样性及菌群结构信息，但对于菌株相关生态功能及基因型的阐述，分离纯培养是不可或缺的。对VBNC状态菌可培养化的研究，将为重新认识和评价微生物在食品发酵、农业、环保等领域的作用提供新的科学依据。
藤黄球菌(Micrococcus luteus)复苏促进因子(resuscitation-promoting factor，简称Rpf)的发现是VBNC状态菌复苏的主要突破。藤黄球菌Rpf具有胞壁溶解酶活性，其活性中心非常保守，预测该位点在细胞壁溶解过程中起到重要作用。另外，由藤黄球菌分泌的Rpf蛋白的活性要高于合成的Rpf蛋白，且纯Rpf蛋白易失活。同时，在藤黄球菌上清液中分离出至少具有两种Rpf功能(溶解酶活性)的蛋白，其分子量大于Rpf蛋白。因此，藤黄球菌胞外分泌物(“Extracellular organic matter”，简称EOM或促进剂SRpf)中含有至少3种具有溶解酶活性的蛋白，除此之外，促进剂SRpf中还含有多糖、脂类和多肽等多种大分子物质，可为微生物的生长提供碳源及氮源。由此可知，基于环境功能与微生物资源角度，利用促进剂SRpf探索环境中的VBNC状态菌群，更为经济方便。
联苯(Biphenyl)是一种有两个苯环组成的芳香族化合物，天然存在于煤焦油、原油、天然气中，通过化石燃料的燃烧进入环境中。在工业生产中，联苯中的氢原子被氯原子不同程度取代所形成209种同系物，这一类化合物称为多氯联苯(Polychlorinated biphenyls,简称PCBs)。PCBs因具有较好的阻燃性、高绝缘性及热稳定性，曾被广泛应用于变压器、电容器绝缘油、燃料分散剂、润滑剂、增塑剂和涂料等。PCBs属于难降解有机污染物，由于环境持久性及“三致”效应而成为目前广泛关注的典型有机污染物，虽然PCBs已禁用多年，但它所造成的环境污染问题随着研究的深入而日益突出。传统的物理和化学方法因存在 低效、二次污染等问题而成为应用瓶颈，微生物作为大量存在的自然资源，且微生物降解治理技术具有安全、高效、经济等特点，因此，筛选和构建高效PCBs降解菌成为修复PCBs污染环境的研究热点。
自1973年Ahmed首次证明联苯降解微生物具有降解PCBs同系物的功能。从此，更多的研究工作开始关注联苯降解菌对PCBs同系物转化能力这一方面。PCBs好氧降解菌株研究主要是以联苯作为生长底物进行驯化筛选，再测试其降解PCBs的能力。另外，在好氧条件下，某些联苯降解菌通过bph途径共代谢PCB同系物。现今已有较多PCBs降解菌的报道，包括革兰氏阴性菌：Alcaligenes、Janibacter、Acinetobacter、Acidovorax、Cupriavidus、Comamonas、Enterobacter、Sphingomonas、Ralstonia、Burkholderia、Paenibacillus、Pseudomonas、Achromobacter和革兰氏阳性菌：Rhodococcus、Arthrobacter、Nocardia、Bacillus、Micrococcus、Corynebacterium等。虽然关于PCBs的微生物降解已投入大量的研究工作，但大多仍限于实验室研究阶段，PCBs高效降解功能菌种资源匮乏成为其推广应用的最大瓶颈。因此，如何从作为自然环境中绝大部分微生物资源的VBNC菌群中，寻找潜在联苯和PCBs降解菌群，提高菌株的降解效能成为打破微生物修复技术在PCBs污染环境中应用瓶颈的关键所在。
综上所述，利用促进剂SRpf分离筛选PCBs污染环境中的非可培养状态菌群，可为寻找高效PCBs降解菌及新的菌种资源提供新的途径。另外，该VBNC状态菌的筛选方法亦可用于筛选其它有机污染物降解菌群，为探索新的菌种资源及环境功能菌，提供一种安全、廉价、高效的方法。
发明内容
本发明的目的是针对现有PCBs污染环境的微生物修复技术中存在的菌种分离难、降解效能低、高效降解菌匮乏的不足，提供一种VBNC联苯降解菌的筛选方法及其应用。菌株TG9是依据本发明所述筛选方法获得的多氯联苯降解菌之一，该菌能降解高浓度的联苯，亦可降解低氯代多氯联苯及低氯代苯甲酸。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种VBNC联苯降解菌的分离筛选方法，包括以下步骤：
(1)将藤黄球菌接种于LMM液体培养基，使其培养液OD600nm为0.05-0.2；LMM液体培养基组成是：2.5-4.5g/L的NH4Cl，1.0-2.0g/L的KH2PO4，0.005g/L的生物素，0.02g/L的L-蛋氨酸，0.04g/L的维生素B1，0.5-1.5g/L的肌苷，0.03g/L的MgSO4，8.0-10.0g/L的L-乳酸锂盐，1.5-3.0ml/L的矿质盐溶液，pH为6.5-8.0；培养24-36h，获得种子培养液；
(2)将步骤(1)获得的种子培养液按3-5％(v/v)的接种量接种至LMM 液体培养基中，160r/min，培养48-60h，将发酵液离心(8000-10000r/min)10-15min去除菌体，经0.22μm过滤膜进行无菌过滤，所获得的上清液即为促进剂SRpf，其蛋白含量为23.96-25.34mg/L，保存于-20℃条件下备用；
(3)制备处理组和对照组的筛选培养基；将步骤(2)得到的促进剂SRpf按体积分数为5-10％添加至无机盐培养基中获得处理组培养基；对照组培养基为不添加促进剂SRpf的无机盐培养基；其中无机盐培养基的组成是：1-2g/L的KH2PO4，2.5-3.5g/L的K2HPO4·3H2O，0.2g/L的MgSO4，0.02g/L的FeSO4·7H2O，1g/L的NaCl，2-4g/L的(NH4)2SO4，0.01g/L的CaCl2，2mL/L的微量盐溶液，无机盐培养基的pH为7.3-7.5；所述微量盐溶液的组成为：4mg/L的MoO3，28mg/L的ZnSO4·5H2O，0.02mg/L的CuSO4·5H2O，4mg/L的H3BO3，4mg/L的MnSO4·5H2O，4mg/L的CoCl2·6H2O，溶剂为水；
(4)从受PCBs长期污染的区域采集污染底泥样，取底泥样分别接种至步骤(3)中配制的两种刷选培养基中，得到两个培养体系；其中，PCBs污染底泥与筛选培养基的质量体积比为46-72g/L；
(5)将联苯分别加入步骤(4)中所述的培养体系中进行连续传代富集驯化，联苯在培养体系中的溶度为500-2000mg/L；180-200r/min摇床培养，每代培养时间为3-5d，传代培养3-4次，得到两组富集培养液；
(6)将步骤(5)中所得的两组富集培养液分别稀释，涂布于琼脂平板，并喷洒联苯，挑取能使琼脂平板上出现透明圈的菌落划线纯化，得到纯菌株，经形态特征及16S rRNA基因序列比对分析，获得处理组特有的菌株，即为处于VBNC状态的联苯降解菌；
(7)将步骤(6)获得的处理组特有的菌株进行16S rRNA基因序列及表型、化学特征比对分析，获得新种菌株TG9；所述菌株TG9保存在中国专利局指定的保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC 1.12975，分类命名为：红球菌(Rhodococcus sp.)；菌株TG9的16S rRNA是SEQ ID No.1所示的基因序列。
进一步地，所述步骤(2)得到的促进剂SRpf为藤黄球菌的胞外分泌物，其多糖的含量为401.16-405.74mg/L，蛋白质含量为23.96-25.34mg/L。
进一步地，所述步骤(7)得到的菌株TG9在LB培养基上菌落呈淡粉黄色，表面光滑，凸起，不透明，粘稠，边缘整齐，呈现棒状-球状的生长周期；菌株TG9生长的温度范围为10-45℃，最适值为28-32℃；生长范围pH为5.0-11.0，最适值为7.0-8.0；TG9生长的NaCl浓度范围为：0-9g/L，最适NaCl浓度为0-3g/L；菌株TG9全细胞水解液中主要糖组分为阿拉伯糖和半乳糖，细胞壁中主要氨基酸 组分为meso-DAP、丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸；甲基萘醌MK-8(H2)是其唯一的醌种类。
一种VBNC联苯降解菌的应用，该应用为：将VBNC联苯降解菌株TG9应用于降解联苯、低氯代多氯联苯及低氯代苯甲酸。根据文献Adaptive responses and cellular behaviour of biphenyl-degrading bacteria toward polychlorinated biphenyls.Biotechnology Advances,2006,24(3):309-320和Study for Microbial Biodegradation:Anaerobic Bacterial Reductive Dechlorination of Polychlorinated Biphenyls-From Sediment to Defined Medium.Annual Review of Microbiology,2008,62:253-270可知，低氯代表示氯原子的取代数＜5。
进一步地，将VBNC联苯降解菌株TG9应用于降解联苯，具体为：将菌株TG9按体积分数为4-6％的接种量接种至含500-3000mg/L联苯的无机盐培养基中，30℃、160-180r/min，培养24-64h。
进一步地，将VBNC联苯降解菌株TG9应用于降解低氯代多氯联苯，具体为：将菌株TG9按体积分数为5-8％的接种量分别接种至含6～12mg/L的低氯代多氯联苯的无机盐培养基中，30℃、160-180r/min，培养48-72h。
进一步地，将VBNC联苯降解菌株TG9应用于降解低氯代苯甲酸，具体为：将菌株TG9按体积分数为5-8％的接种量分别接种至含20-40mg/L的低氯代苯甲酸的无机盐培养基中，30℃、160-180r/min，培养48-72h。
进一步地，所述低氯代多氯联苯选自2-氯联苯、3-氯联苯、2,4′-二氯联苯、3,3′-二氯联苯、2,4,4′-三氯联苯和2,4′,5-三氯联苯。
进一步地，所述低氯代苯甲酸选自苯甲酸、2-氯苯甲酸、3-氯苯甲酸和4-氯苯甲酸。
本发明与现有的联苯降解菌富集方法相比，其有益效果是：
1、本发明所用促进剂SRpf由藤黄球菌分泌，其中至少含有3种具有溶解酶活性的蛋白，除此之外，EOM中还含有多糖、脂类和多肽等多种大分子物质，可为微生物的生长提供碳源及氮源。具有成本低廉、原料易得、安全无毒、操作简便等特点。
2、本发明利用促进剂SRpf的复苏促进作用，可以分离筛选作为绝大部分微生物资源的处于难培养或非可培养状态VBNC菌群，可为联苯和PCBs降解菌种资源的获得提供新的方法途径。
3、本发明中所获得的菌株TG9为红球菌属的新种，其呈现典型的棒状-球状的生长周期，它能在较广的温度、pH和盐度范围内生长，表明菌株TG9对不良环境有较好的适应能力。
4、本发明所获得的菌株TG9对联苯的耐受浓度高达3000mg/L，同时在64h内，对2-氯联苯、3-氯联苯、2,4′-二氯联苯的降解率可达99％以上，表明菌株TG9可以较快速的降解低氯代多氯联苯。
5、本发明所获得的菌株TG9亦可降解苯甲酸、2-氯苯甲酸、3-氯苯甲酸和4-氯苯甲酸，因此，可避免多氯联苯降解过程中氯代苯甲酸的积累，从而促进多氯联苯更加完全、快速的降解。
6、本发明所述的VBNC状态菌的筛选方法不仅可以用于筛选高效联苯降解菌群，亦可用于筛选其它有机污染物降解菌群，为探索新的菌种资源及环境功能菌，提供一种安全、廉价、高效的方法。
综上所述，本发明符合绿色安全的环保理念，实现了微生物资源最大利用化，能有效筛选使用常规方法不可获得的VBNC状态菌群，复苏促进VBNC状态菌群降解性能，为促进微生物修复技术的推广应用提供一种安全无毒、成本低廉的方法。
所述菌株TG9保存于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为：CGMCC 1.12975，分类命名为：红球菌(Rhodococcus sp.)，保藏时间为2014年10月8日。
附图说明
图1是菌株TG9在不同时间的扫描电镜图：24h(A)、48h(B)、60h(C)和72h(D)；
图2是菌株TG9在不同时间的透射电镜图：36h(A)和72h(B)；
图3是菌株TG9在不同联苯浓度下培养60h的耐受联苯浓度图；
具体实施方式
以下结合实施例进一步说明本发明，本发明的目的和效果将变得更加明显。
实施例1：促进剂SRpf的制备
1.菌种来源：藤黄球菌(Micrococcus Luteus IAM14879)可购于日本理化学研究所微生物菌种保藏中心。
2.LMM培养基：4.0g/L NH4Cl，1.4g/L KH2PO4，0.005g/L生物素，0.02g/L L-蛋氨酸，0.04g/L维生素B1，1.0g/L肌苷，0.03g/L MgSO4，8.75g/L L-乳酸锂盐，1.5ml/L矿质盐溶液(0.375g/L CuSO4·5H2O，0.785g/L MnCl2·4H2O，0.18g/L FeSO4·7H2O，0.029g/L Na2MoO4·2H2O，0.089g/L ZnSO4·7H2O)，pH为7.5。
3.预发酵：从斜面试管将M.luteus接种于LMM平板，30℃培养3d。挑取3环M.luteus菌苔至装有50mL LMM液体培养基的250mL三角瓶中，30℃，160r/min，培养36h。
4.发酵培养：取种子培养液按4％(v/v)的接种量接入装有15mL LMM培养液的50mL三角瓶中，30℃，160r/min培养48-72h。
5.离心与保存：将发酵液离心(8000-10000r/min)10-15min去除菌体，经0.22μm过滤膜进行无菌过滤，所获得的上清液即为促进剂SRpf，其蛋白含量为25.34mg/L，保存于-20℃条件下备用；
实施例2：VBNC联苯降解菌的富集筛选与分离纯化
1.底泥来源：用于分离VBNC联苯降解菌的底泥取自浙江台州市路桥区某多氯联苯污染区域。
2.筛选培养基：筛选培养基有两种分别为处理组和对照组培养基，将促进剂SRpf按体积分数为10％添加至无机盐培养基中获得处理组培养基。对照组培养基为不添加促进剂SRpf的无机盐培养基。其中无机盐培养基的组成是：1-2g/L的KH2PO4，2.5-3.5g/L的K2HPO4·3H2O，0.2g/L的MgSO4，0.02g/L的FeSO4·7H2O，1g/L的NaCl，2-4g/L的(NH4)2SO4，0.01g/L的CaCl2，2mL/L的微量盐溶液(4mg/L的MoO3，28mg/L的ZnSO4·5H2O，0.02mg/L的CuSO4·5H2O，4mg/L的H3BO3，4mg/L的MnSO4·5H2O，4mg/L的CoCl2·6H2O)，pH为7.3-7.5；
3.富集培养：取8-10g底泥分别加到装有100mL含500mg/L联苯的处理组与对照组的筛选培养基中，30℃，180r/min培养5d后，将第一代的富集液按4-6％接种量接种至装有50mL含1000mg/L联苯的富集培养基的150mL三角烧瓶中，30℃，180r/min摇床培养5-6d后，将第二代的富集液按4-6％接种量接种至装有50mL含1500mg/L联苯的富集培养基的150mL三角烧瓶中，30℃，180r/min摇床培养3-4d后，将第三代的富集液按4-6％接种量接种至装有50mL含2000mg/L联苯的富集培养基的150mL三角烧瓶中，30℃，180r/min摇床培养2-3d，经3代富集培养后，富集液最终联苯浓度达到2000mg/L，分别获得对照组与处理组富集培养液。
4.菌株的分离纯化：两组富集培养液分别用无菌生理盐水(0.9％)进行梯度稀释，然后将稀释液涂布于琼脂平板。然后在平板表面喷洒0.5-1mL联苯溶液(联苯溶解于丙酮，浓度8-10g/L)，30℃恒温培养，观察4d，挑取能使琼脂平板上出现透明圈的菌落划线分离，连续在LB平板上划线纯化3-5次，得到纯菌株，经16S rRNA基因序列及表型特征、化学特征比对分析，获得处理组特有的菌株，即为处于VBNC状态的联苯降解菌，共11个菌株。
实施例3：VBNC联苯降解菌株中，菌株TG9的筛选与分子鉴定及命名保藏
1.菌株TG9的筛选：将处理组特有的11个菌株与现有的菌种进行16S rRNA基因序列及表型、化学特征比对分析，筛选出不同于现有菌种的新种菌株 TG9。
2.菌株TG916S rRNA基因序列：(1)利用DNA抽提试剂盒(UNIQ-10柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒)提取细菌DNA，进行菌株16S rDNA的扩增，PCR反应体系50μL包括：EasyTaq SuperMix：25μL，引物8F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1541R(5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’)各1μL，模板DNA 2μL，去离子水：21μL。PCR反应条件为：95℃预变性4min，95℃变性3min，53℃退火30s，72℃延伸1min，进行30个循环，72℃终延伸5min，16℃保持。(2)取5μL PCR扩增产物与缓冲液混合后进行1％琼脂糖凝胶电泳(1×TAE电泳缓冲液，100V电泳30min)，EB(0.5μl/ml)染色后，拍摄观察，PCR产物为约1.5Kb大小的电泳条带。(3)采用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒进行PCR扩增产物回收与纯化。(4)采用pMD 18-T vector(Takara)进行割胶回收产物与T载体的连接。然后取一定量的连接液加入大肠杆菌DH5α感受态细胞进行质粒重组子的转化。在氨苄平板中挑取白色单菌落，进行质粒的抽取，再提取质粒DNA。(5)将质粒重组子转化大肠杆菌DH5α涂布平板后，挑选单菌落，液体培养后送至华大基因进行测序。正向测序引物为M13F或T7，反向测序引物为M13R或T3。(6)所得16S rRNA基因序列如SEQ ID NO.1所示，16S rRNA基因全长为1515bp，GenBank登陆号为KJ546454。
3.菌株TG9的保藏与命名：将新种菌株TG9保存在中国专利局指定的保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC1.12975，分类命名为：红球菌(Rhodococcus sp.)。
实施例4：VBNC联苯降解菌株TG9的表型与化学分类特征
1.表型特征：将菌株TG9接种至LB固体培养基，30℃，培养2-3d，观察菌落的大小、形状、色泽、透明度、边缘和表面突起等。
将培养至对数生长中期的新鲜菌液，在普通光学显微镜(100倍)下观察细胞的形态和运动性。同时，进行革兰氏染色观察。
将新鲜生长的平板菌体，用无菌水悬浮。用已处理后的铜网吸附菌悬液体，醋酸双氧铀复染，透射电镜下观察细胞的大小、形态及是否有鞭毛。
将新鲜菌体离心(1,000r/min,5min)去除上清液后，加入2.5％戊二醛固定液1mL，过夜静置。磷酸缓冲液清洗3次，每次静置30min，然后用1％锇酸，静置2h以上，磷酸盐缓冲液清洗3次，每次静置30min，再用丙酮梯度(30％、50％、70％、80％、90％、95％和100％丙酮各1次，10～15min/次)脱水，再用乙酸异戊酯置换30min。CO2临界点干燥1h以上，粘台，喷金后进行扫描电镜 观察。
2.化学分类特征：NaCl生长浓度：为确定菌株生长所需NaCl的上下限和最适生长浓度，将菌株接种至含有0％、1％、3％、5％、6％、7％、9％、10％、12％、15％、20％(w/v)NaCl的固体培养基，30℃，培养8-15d。
pH生长浓度：为确定菌株生长所需pH的上下限和最适生长浓度，将菌株接种至不同pH梯度(4、5、6、7、8、9、10、11、12)的培养液中，30℃，培养8-15d。
生长温度：为确定菌株生长所需温度的上下限和最适生长浓度，将菌株接种至LB平板，4℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、28℃、30℃、32℃、37℃、45℃、50℃和55℃培养8-15d。
结果表明，将菌株TG9在LB培养基上培养3d后，得到菌落形态见。菌株TG9的细胞为杆状，多数呈链状排列，少数单个排列或两连杆排列，0.4-0.6×1.0～1.7μm，革兰氏阳性，不生芽孢。在LB培养基上菌落呈淡粉黄色，表面光滑，凸起，不透明，粘稠，边缘整齐。由扫描电镜图(附图1)和透视电镜图(附图2)可知，菌株TG9呈现红球菌属典型的棒状-球状生长周期。在最初培养的24h内为分支短杆状，48-60后呈现短棒状或球状，在72后大部分为球状。菌株TG9生长的温度范围为10-45℃，最适值为28-32℃。生长pH和NaCl浓度分别为5.0-11.0和0-9％(w/v)，最适分别为7.0-8.0和0-3％。
实施例5：VBNC联苯降解菌株TG9的降解特性
1.种子液的制备：将菌株TG9接种至LB培养液中，30℃、180r/min培养18-24h，8000r/min离心10min，收集菌体，用0.05mol/L的磷酸盐缓冲液漂洗后，将菌体重悬于无机盐培养基中，调节OD600为1.0-1.5作为种子液，4℃保存备用。
2.联苯降解特性：所获得的菌株TG9种子液按4％的接种量接种至装有20mL含0.5％，1.0％，1.5％，2.0％，2.25％，2.5％，2.75％，3.0％联苯的无机盐培养液中，30℃、180r/min培养60h，测定菌体生长量(OD600)和联苯降解率。每个时间均做三组平行实验。结果如附图3所示，菌株TG9的耐受联苯浓度高达3000mg/L。
联苯含量的测定：取上层有机相测定残留的联苯浓度。GC-MS测定的条件：GC条件：GC(Agilent 7890)进行测定，DB-5石英毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)；检测器放射源为63Ni；进样口温度：270℃；检测器温度：280℃；载气：高纯氮气，恒流1.0mL/min；无分流进样1μL。升温程序为：始温70℃，保持1min，30℃/min升至280℃，保持7min，总运行时间8min。MS条件： MS(5975C inter MSD)EI离子源温度为200℃，四级杆温度150℃，检测模式为选择离子扫描，溶剂延迟3min。联苯有三种选择离子，m/z分别为152、153、154。TMX有四种选择离子，m/z分别为207、209、242、244。
菌体生长量(OD600)的测定：菌体生长是通过测定600nm下的光密度值(OD600)进行表示。取无机相发酵液，10000r/min离心10min，收集菌体，蒸馏水洗涤3次后稀释至原体积，用UV-5500(PC)型分光光度计在波长600nm处测定光密度值，以OD600来表示菌体生长量。
3.低氯代联苯及低氯代苯甲酸降解特性：所获得的菌株TG9种子液按5-8％(v/v)的接种量分别接种至含6～12mg/L的2-氯联苯、3-氯联苯、2,4′-二氯联苯、3,3′-二氯联苯、2,4,4′-三氯联苯和2,4′,5-三氯联苯的无机盐培养基中，30℃、160-180r/min，培养48-72h。另外，将菌株TG9种子液按5-8％(v/v)的接种量分别接种至含20-40mg/L的苯甲酸、2-氯苯甲酸、3-氯苯甲酸和4-氯苯甲酸的无机盐培养基中，30℃、160-180r/min，培养48-72h。
结果表明，菌株TG9对2-氯联苯、3-氯联苯、2,4′-二氯联苯的降解率为99.27-100％，对3,3′-二氯联苯、2,4,4′-三氯联苯和2,4′,5-三氯联苯的降解率为31.64-50.27％，对苯甲酸、2-氯苯甲酸、3-氯苯甲酸和4-氯苯甲酸降解率为6.79-16.85％。
                         SEQUENCE LISTING
 
<110>  浙江大学
 
<120>  一种VBNC联苯降解菌的分离筛选方法及应用
 
 
<160>  1    
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  1515
<212>  DNA
<213>  Rhodococcus biphenylivorans Strain TG9
 
<400>  1
agagtttgat cctggctcag gccgaacgct ggcggcgtgc ttaacacatg caagtcgaac     60
 
gatgaagccc agcttgctgg gtggattagt ggcgaacggg tgagtaacac gtgggtgatc    120
 
tgccctgcac tctgggataa gcctgggaaa ctgggtctaa taccggatat gacctcttgc    180
 
tgcatggcga ggggtggaaa gtttttcggt gcaggatgag cccgcggcct atcagcttgt    240
 
tggtggggta atggcctacc aaggcgacga cgggtagccg gcctgagagg gcgaccggcc    300
 
acactgggac tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc agcagtgggg aatattgcac    360
 
aatgggcgca agcctgatgc agcgacgccg cgtgagggat gacggccttc gggttgtaaa    420
 
cctctttcac ccatgacgaa gcgcaagtga cggtagtggg agaagaagca ccggccaact    480
 
acgtgccagc agccgcggta atacgtaggg tgcgagcgtt gtccggaatt actgggcgta    540
 
aagagctcgt aggcggtttg tcgcgtcgtc tgtgaaatcc cgcagctcaa ctgcgggctt    600
 
gcaggcgata cgggcagact cgagtactgc aggggagact ggaattcctg gtgtagcggt    660
 
gaaatgcgca gatatcagga ggaacaccgg tggcgaaggc gggtctctgg gcagtaactg    720
 
acgctgagga gcgaaagcgt gggtagcgaa caggattaga taccctggta gtccacgccg    780
 
taaacggtgg gcgctaggtg tgggtttcct tccacgggat ccgtgccgta gccaacgcat    840
 
taagcgcccc gcctggggag tacggccgca aggctaaaac tcaaaggaat tgacgggggc    900
 
ccgcacaagc ggcggagcat gtggattaat tcgatgcaac gcgaagaacc ttacctgggt    960
 
ttgacatgta ccggacgact gcagagatgt ggtttccctt gtggccggta gacaggtggt   1020
 
gcatggctgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac   1080
 
ccttgtcctg tgttgccagc acgtgatggt ggggactcgc aggagactgc cggggtcaac   1140
 
tcggaggaag gtggggacga cgtcaagtca tcatgcccct tatgtccagg gcttcacaca   1200
 
tgctacaatg gtcggtacag agggctgcga taccgtgagg tggagcgaat cccttaaagc   1260
 
cggtctcagt tcggatcggg gtctgcaact cgaccccgtg aagtcggagt cgctagtaat   1320
 
cgcagatcag caacgctgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcacg   1380
 
tcatgaaagt cggtaacacc cgaagccggt ggcctaaccc cttgtgggag ggagccgtcg   1440
 
aaggtgggat cggcgattgg gacgaagtcg taacaaggta gccgtaccgg aaggtgcggc   1500
 
tggatcacct cctta                                                    1515

Claims (9)

1.一种VBNC联苯降解菌的分离筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将藤黄球菌接种于LMM液体培养基，使其培养液OD600nm为0.05-0.2；LMM液体培养基组成是：2.5-4.5g/L的NH4Cl，1.0-2.0g/L的KH2PO4，0.005g/L的生物素，0.02g/L的L-蛋氨酸，0.04g/L的维生素B1，0.5-1.5g/L的肌苷，0.03g/L的MgSO4，8.0-10.0g/L的L-乳酸锂盐，1.5-3.0ml/L的矿质盐溶液，pH为6.5-8.0；培养24-36h，获得种子培养液；
(2)将步骤(1)获得的种子培养液按3-5％(v/v)的接种量接种至LMM液体培养基中，160r/min，培养48-60h，将发酵液离心(8000-10000r/min)10-15min去除菌体，经0.22μm过滤膜进行无菌过滤，所获得的上清液即为促进剂SRpf，其蛋白含量为23.96-25.34mg/L，保存于-20℃条件下备用；
(3)制备处理组和对照组的筛选培养基；将步骤(2)得到的促进剂SRpf按体积分数为5-10％添加至无机盐培养基中获得处理组培养基；对照组培养基为不添加促进剂SRpf的无机盐培养基；其中无机盐培养基的组成是：1-2g/L的KH2PO4，2.5-3.5g/L的K2HPO4·3H2O，0.2g/L的MgSO4，0.02g/L的FeSO4·7H2O，1g/L的NaCl，2-4g/L的(NH4)2SO4，0.01g/L的CaCl2，2mL/L的微量盐溶液，无机盐培养基的pH为7.3-7.5；所述微量盐溶液的组成为：4mg/L的MoO3，28mg/L的ZnSO4·5H2O，0.02mg/L的CuSO4·5H2O，4mg/L的H3BO3，4mg/L的MnSO4·5H2O，4mg/L的CoCl2·6H2O，溶剂为水；
(4)从受PCBs长期污染的区域采集污染底泥样，取底泥样分别接种至步骤(3)中配制的两种刷选培养基中，得到两个培养体系；其中，PCBs污染底泥与筛选培养基的质量体积比为46-72g/L；
(5)将联苯分别加入步骤(4)中所述的培养体系中进行连续传代富集驯化，联苯在培养体系中的溶度为500-2000mg/L；180-200r/min摇床培养，每代培养时间为3-5d，传代培养3-4次，得到两组富集培养液；
(6)将步骤(5)中所得的两组富集培养液分别稀释并涂布于琼脂平板，并喷洒联苯，挑取能使琼脂平板上出现透明圈的菌落划线纯化，得到纯菌株，经形态特征及16S rRNA基因序列比对分析，获得处理组特有的菌株，即为处于VBNC状态的联苯降解菌；
(7)将步骤(6)获得的处理组特有的菌株进行16S rRNA基因序列及表型、化学特征比对分析，获得新种菌株TG9；所述菌株TG9保存在中国专利局指定的保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为： CGMCC 1.12975，分类命名为：红球菌(Rhodococcus sp.)；菌株TG9的16S rRNA是SEQ ID No.1所示的基因序列。
2.根据权利要求1所述一种VBNC联苯降解菌的分离筛选方法，其特征在于，所述步骤(2)得到的促进剂SRpf为藤黄球菌的胞外分泌物，其多糖的含量为401.16-405.74mg/L，蛋白质含量为23.96-25.34mg/L。
3.根据权利要求1所述一种VBNC联苯降解菌的分离筛选方法，其特征在于，所述步骤(7)得到的菌株TG9在LB培养基上菌落呈淡粉黄色，表面光滑，凸起，不透明，粘稠，边缘整齐，呈现棒状-球状的生长周期；菌株TG9生长的温度范围为10-45℃，最适值为28-32℃；生长范围pH为5.0-11.0，最适值为7.0-8.0；TG9生长的NaCl浓度范围为：0-9g/L，最适NaCl浓度为0-3g/L；菌株TG9全细胞水解液中主要糖组分为阿拉伯糖和半乳糖，细胞壁中主要氨基酸组分为meso-DAP、丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸；甲基萘醌MK-8(H2)是其唯一的醌种类。
4.一种权利要求1所述的VBNC联苯降解菌的应用，其特征在于，该应用为：将VBNC联苯降解菌株TG9应用于降解联苯、低氯代多氯联苯及低氯代苯甲酸。
5.根据权利要求4所述的VBNC联苯降解菌的应用，其特征在于，将VBNC联苯降解菌株TG9应用于降解联苯，具体为：将菌株TG9按体积分数为4-6％的接种量接种至含500-3000mg/L联苯的无机盐培养基中，30℃、160-180r/min，培养24-64h。
6.根据权利要求4所述的VBNC联苯降解菌的应用，其特征在于，将VBNC联苯降解菌株TG9应用于降解低氯代多氯联苯，具体为：将菌株TG9按体积分数为5-8％的接种量分别接种至含6～12mg/L的低氯代多氯联苯的无机盐培养基中，30℃、160-180r/min，培养48-72h。
7.根据权利要求4所述的VBNC联苯降解菌的应用，其特征在于，将VBNC联苯降解菌株TG9应用于降解低氯代苯甲酸，具体为：将菌株TG9按体积分数为5-8％的接种量分别接种至含20-40mg/L的低氯代苯甲酸的无机盐培养基中，30℃、160-180r/min，培养48-72h。
8.根据权利要求4所述的VBNC联苯降解菌的应用，其特征在于，所述低氯代多氯联苯选自2-氯联苯、3-氯联苯、2,4′-二氯联苯、3,3′-二氯联苯、2,4,4′-三氯联苯和2,4′,5-三氯联苯。
9.根据权利要求4所述的VBNC联苯降解菌的应用，其特征在于，所述低氯代苯甲酸选自苯甲酸、2-氯苯甲酸、3-氯苯甲酸和4-氯苯甲酸。
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