CN109536390B - 一种柑桔内生真菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种柑桔内生真菌，本发明从柑桔叶片中脉中分离到一株柑桔内生真菌，经微生物分类学鉴定、命名为Hypoxylon sp.nov，该菌株已保藏，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16095，保藏日期为2018年8月8日。本发明还提供了所述柑桔内生真菌抑制柑桔黑点病致病菌的应用。本发明提供的柑桔内生真菌，可用于防治柑桔黑点病，抑菌率可以达到68％以上，该方法绿色环保，同时避免了致病菌株产生抗药及耐药性。

Description

一种柑桔内生真菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种柑桔内生真菌及其应用。
背景技术
柑桔黑点病是目前我国柑桔上发生最普遍、危害比较严重的病害，对果实的外观品质影响非常大。柑桔黑点病是由柑桔间座壳菌 Dia-porthe citri 引起，目前的防治方法主要是化学农药代森锰锌，使用化学农药对环境不友好，对人的健康也有潜在危害，而且，大量及单一施用代森锰锌使有些菌株产生了抗药及耐药性。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种新的柑桔内生真菌，并用于抑制柑桔黑点病的致病菌，防治柑桔黑点病。
本发明从柑桔叶片中脉中分离到一株柑桔内生真菌，经微生物分类学鉴定、命名为Hypoxylon sp.nov，该菌株已保藏，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址 ：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编 ：100101；保藏编号为CGMCCNo.16095，保藏日期为2018年8月8日。
本发明所述的柑桔内生真菌的固体培养特征为：在马铃薯葡萄糖琼脂 (PDA) 培养基上28℃培养，一周可以长满整个培养皿（Φ90mm），初期菌落呈现白色，中期菌落呈现咖啡色，后期呈现深褐色，绒毛状平铺于培养基表面。
本发明所述的柑桔内生真菌的碱基系列如下所示：
ITS (internal transcribed spacer)序列5'-3'
GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTCTCCGTTGGTGAACCAGCGGAGGGATCATTACTGAGTTATTAAAACTCCAAACCCTTTGTGAACCTTACCGTCGTTGCCTCGGCGTGAGCTACGGCTACCCTGTAGTTACCCTATAGTTACCCTGTAGTTACCCTGTAGTTACCCTGCAGCTACCCTATAGTTACCCTGTAGTTACCCTGTAGTTACCCTGCAGCTACCCTATAGTTACCCTGTAGCTACCCTGTAGCCGGCTTATGGCCCGCCGAAGGACCGCCAAACTCTTGTTTTTTATTACTGTTTCTCTGAATTGTAAACCTAAATAAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCATTAGTATTCTAGTGGGCATGCCTATTCGAGCGTCATTTCGACCCTTAAGCCCTTGTTGCTTAGCGTTGGGAATCTACGGCGTAGTTCCTCAAAGTTAGTGGCGGAGTTAGGGTACACTCTCAGCGTAGTAATCTCTCTCGCTCGTGTGGTGGCCCTGGCTGCTAGCCGTTAAACCCCTATATTTTCTAGTGGTTGACCTCGGATTAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA
Act( actin gene)蛋白基因序列5'-3'
ATGTGCAAGGCCGGTTTCGCCGGTGATGATGCTCCCCGAGCTGTCTTCCG
TAAGTGCCATCCTCGCCCAACCGCCCCCGCTTGAGCCCCATCATGGTGGC
TTCAAACCTCAACCGCTTTCTAACATATAAACATAGCGTCCATTGTCGGC
CGACCCCGTCATCATGGGTAAGTAGTAACTCGCATCATAAACGAGTAGTA
ATTTGCGCGCAACGGTGTCTAACGATATGCTAGTATCATGATTGGTATGG
GCCAGAAGGACTCGTA
RPB2基因序列 (RNA polymerase II second largest subunit)5'-3'
GGGGTGACCAGAAGAAGGCGATGAGCTCGACTGCTGGTGTCTCTCAGGTC
CTGAACCGATATACTTTCGCCTCGACCCTCTCTCACTTGAGACGAACGAA
CACACCCATTGGAAGAGACGGGAAGCTCGCGAAGCCTCGACAGCTTCATA
ATACTCATTGGGGTCTTGTCTGTCCAGCTGAGACGCCCGAAGGCCAGGCC
TGCGGACTGGTGAAGAATTTATCGCTGATGTGCTCTATCAGCGTGGGTAC
ATCGACGGATCCTATCGTGGAGTATATGATTACTAGAAATATGGAAGTCC
TGGAGGAATACGAACCGATGCGATACCCTAACGCCACCAAGATCTTCCTT
AACGGTTCTTGGATTGGTGTACACCAGGATCCCAAGACTCTTGTCAAGGA
TATCCAGGCGCTTCGTCGGGCCAACCAAATTCCCTCCGAGGTTTCCTTGA
TCCGCGATATCCGTGATCGTGAGTTCAAGATATTCTCAGATGCAGGTCGT
GTCATGCGCCCCTTGTTTGTCGTGCAACAAGAAGATATCCCCGATGATGG
CATCAAAAAGGGTACATTGGCCCTTACCAAAGAGATGATCCAGCGACTAG
AGGCGGATGTTGAGCTAGACCCCGAAAGCGAGGAATACTTTGGCTGGCAA
GGTCTCGTTAACGAGGGTGTAATTGAGTTCCTCGACGCGGAGGAAGAGGA
AACGGCTATGATTTGCATGACACCGGAAGACCTAGAGAACTACCGATTGG
CCAAACTCGGGTACGAAGTGGTTCAGGATAACGGAGATGAGGTTAACAAA
CGACTCAAGACCAAGGTCAACCCGTCAACGCACATGTATACTCATTGCGA
AATCCATCCTAGCATGCTCTTGGGTATCTGCGCAAGCATTATTCCCTTCC
CTGATCACAACCAGTCACCTAGAAACACGTACCAGTCAGCCTAGGGCAAA
CAAGCCATGGG
本发明还提供了柑桔内生真菌的应用：通过与柑桔黑点病病原的平板对峙实验，发现该柑桔内生真菌对柑桔黑点病致病菌有一定抑制作用，抑菌率可以达到68%以上。
与现有技术相比，本发明的柑桔内生真菌可用于防治柑桔黑点病，相比较于现有技术中使用代森锰锌的防治方法，本发明更加绿色环保，同时避免了致病菌株产生抗药及耐药性。
附图说明
图1是本发明柑桔内生真菌在PDA平板培养基上的形态图。
图2是本发明柑桔内生真菌在显微镜下（40倍物镜）的菌丝及孢子形态图。
图3是本发明柑桔内生真菌基于ITS基因序列构建的炭团菌NJ系统进化树。
图4是本发明柑桔内生真菌基于ACT蛋白基因序列构建的炭团菌ML系统进化树。
图5是本发明柑桔内生真菌基于RPB2基因序列构建的炭团菌NJ系统进化树。
图6是本发明柑桔内生真菌与柑桔黑点病原平板对峙实验的结果图。
图7是柑桔黑点病病原菌单独生长结果对照图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或者改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
实施例1
柑桔内生真菌的分离纯化
从浙江省柑桔研究所品种园里采集温州蜜柑叶片，清水清洗后，撕取叶片中脉，依次在75%酒精中浸泡45秒，3%次氯酸钠中浸泡3-5分钟，75%酒精中浸泡45秒，之后用无菌水冲洗5-6次，在超净工作台上用无菌剪刀将叶片中脉剪成1厘米左右的小段，置于PDA培养基中，于28度培养箱中培养，培养一周后出现菌落，切取菌落边缘纯化，经过3次纯化后得到纯的菌落。
实施例2
柑桔内生真菌的培养
取本发明的柑桔内生真菌菌种，在无菌条件下，用接种针挑取少量菌落，接入已灭菌的固体PDA培养基平板，于28度培养箱中培养一周，一周后长满整个培养皿，初期菌落呈现白色，中期菌落呈现咖啡色，后期呈现深褐色，绒毛状平铺于培养基表面。
柑桔内生真菌在PDA培养基平板上的形态如图1所示，在40倍物镜的显微镜下菌丝及孢子的形态如图2所示。
实施例3
柑桔内生真菌的分子鉴定
（1）DNA提取：刮取菌落表面菌丝进行液氮研磨，研磨后取100毫克粉末装于1.5毫升离心管中，利用TAKARA公司TaKaRa MiniBEST Plant Genomic DNA Extraction Kit提取试剂盒（Protocol-II）提取真菌DNA。DNA的碱基系列为TCCGTAGGTGA。
（2）PCR扩增：引物采用ITS4/ITS5通用引物(引物序列为5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'/ 5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3')，ACT512F/ACT783R引物（序列为5'-ATGTGCAAGGCCGGTTTCGC-3'/5'-TACGAGTCCTTCTGGCCCAT-3'）；Frpb2-5F2/Frpb2-7cR引物:（序列为5'-GGGGWGAYCAGAAGAAGGC-3'/5'-CCCATRGCTTGTYYRCCCAT-3'）；扩增体系是50ul，包括PremixTaq(EX)酶，25 ul，10um引物3 ul，10um引物3 ul，灭菌水17 ul，真菌DNA 2 ul，设置阴性对照和阳性对照，阴性对照是清水做模板，阳性对照是已知真菌DNA，扩增程序依次是95℃ 3min，一个循环，95℃ 1min, 58℃ 1min 72℃ 2min，40个循环，72 ℃10min，1个循环，并进行三次重复。
（3）测序：将PCR产物直接送测序公司纯化测序。测序的公司分别是赛默飞苏州测序部和宝生物大连生物工程有限公司，测序的仪器是ABI3730，测序为双向测序，得到的序列利用DNASTAR7.1 Seqman拼接校对，得到柑桔内生真菌的基因序列。
（4）构建系统进化树：将得到的序列在NCBI上Blast比对，发现ITS序列相似性最高为95%，ACT序列相似度最高为96%，RPB2序列相似度最高为96% ，基于ITS基因序列、ACT蛋白基因序列和RPB2基因序列利用Mega7.0 软件做系统进化树，其结果如图3-5所示；根据系统进化树将柑桔内生真菌命名为Hypoxylon sp.nov。
实施例4
平板对峙实验
将本发明的柑桔内生真菌菌株与柑桔黑点病病原菌（Diaporthe citri）进行平板对峙筛选。柑桔内生真菌和柑桔黑点病病院菌分别在PDA平板上活化，28℃培养5d。活化好的菌株柑桔内生真菌和黑点病病原（Φ5mm）分别接种于直径90mm的PDA平板中，菌片距离皿的边缘20mm，两菌片相距40mm，同时分别单独接种作对照。重复3次，28℃培养20d，测量病原菌菌落和柑桔内生真菌菌落的直径，对照病原菌的菌落直径，计算抑菌率。抑制率的计算公式如下：抑制率／%＝［（对照病原菌菌落直径－处理病原菌菌落直径）／对照病原菌菌落直径］×100%，结果如表1和图6-7所示：表1是三组实验的抑菌率数据，图6是内生真菌对黑点病原菌对峙结果，图7是黑点病病原菌单独生长即对照。
上述柑桔内生真菌抑制柑桔黑点病病原的抑菌特点为：将病原菌边缘覆盖。
表1 柑桔内生真菌与柑桔黑点病病原的对峙实验
Figure DEST_PATH_IMAGE001

Claims (2)

1.一种柑桔内生真菌，其特征在于，分类名为炭团菌(Hypoxylon sp.)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16095，保藏日期为2018年8月8日。
2.根据权利要求1所述的柑桔内生真菌的应用，其特征在于，所述柑桔内生真菌用于抑制柑桔黑点病致病菌，所述柑桔黑点病致病菌为柑桔黑点病病原菌Diaporthe citri。
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