CN105462884B

CN105462884B - 鸭支原体培养基及鸭支原体的分离纯化方法

Info

Publication number: CN105462884B
Application number: CN201510950317.6A
Authority: CN
Inventors: 宫晓炜; 刘永生; 陈启伟; 郑福英; 储岳峰
Original assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2015-12-18
Filing date: 2015-12-18
Publication date: 2018-12-04
Anticipated expiration: 2035-12-18
Also published as: CN105462884A

Abstract

本发明提供鸭支原体培养基，由液体培养基和固体培养基组成，液体培养基由以下组分组成：去离子水，10%的醋酸铊溶液，PPLO肉汤，葡萄糖，蛋白胨，胰蛋白胨，1%的酚红，含L‑谷氨酰胺的CMRL‑1066培养基，灭活的马血清，酵母浸出液，青霉素，L‑半胱氨酸盐酸盐和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；除添加琼脂粉，去掉酚红外，固体培养基其余组分与液体培养基相同。利用上述培养基对鸭支原体分离纯化：在固体培养基上分离菌落，将分离的菌落置于液体培养基中生长，然后进行液体培养物的过滤、稀释、涂板和挑单菌落增殖的纯化步骤，重复上述步骤直至得到纯化的鸭支原体。本发明的培养基可促进鸭支原体的生长，且分离纯化鸭支原体的成功率高。

Description

鸭支原体培养基及鸭支原体的分离纯化方法

技术领域

本发明涉及细菌培养基及分离纯化的方法，具体涉及鸭支原体培养基及鸭支原体的分离纯化方法。

背景技术

鸭支原体（Mycoplasma anatis）主要引起鸭的传染性窦炎，临床上易感染雏鸭，导致眶下窦、鼻腔、气管及气囊的炎症，其中眶下窦肿胀最为典型。当鸭支原体与其他病原（如流感病毒、大肠细菌）混合感染时，可引起鸭呼吸困难、软脚、腹泻、共济失调、斜颈、转圈或倒退运动等一系列神经系统症状，严重影响鸭的生长和发育；组织学病变表现为淋巴细胞性脑膜炎、纤维蛋白渗出性的气囊炎、间质性肺炎和淋巴滤泡性气管炎（Stipkovits，2012）。

1964年Robert首次报道从患有窦炎的小鸭中分离出鸭支原体，之后西班牙、美国等国家相继分离到鸭支原体，karpas、Amin等从北京鸭、短颈小野鸭和斑背浅鸭中分离出鸭支原体（Ivanics et al，1988；Poveda et al，1990；Goldberg et al，1995）。我国是世界上主要的鸭养殖基地，鸭肉产量占全球总量的66%；国内学者于1989年和1991年就证实了鸭支原体在我国的存在，而近两年国内有关鸭支原体合并病毒、细菌感染的病例屡见不鲜，给养鸭业造成了重大危害和经济损失，表明鸭支原体感染在我国持续时间已经很久。

鸭支原体是一类特殊的微生物，无细胞壁，由于其基因组较小，造成基因组中编码氨基酸和辅助因子合成的基因就少，导致支原体生物合成和代谢的能力相当有限；由于支原体属于氨基酸、脂类和某些辅助因子营养缺陷型，很难对环境变化做出调整，仅在特定的环境下生存，因此鸭支原体对体外培养基的选择相当苛刻，需要从中摄取脂肪酸、胆固醇、核酸前体和能量来源等营养成分促进自身繁殖。鸭支原体（Mycoplasma anatis）不同于其他禽类支原体，如鸡毒支原体（Mycoplasma gallispeticum）、滑液支原体（Mycoplasma symoviae）、泄殖腔支原体（Mycoplasma cloaclae）、莱氏无胆甾支原体（Acolaplasma laidlawii）等感染多种宿主，鸭支原体只寄生于鸭体内。关于鸭支原体的诊断，主要为聚合酶链反应（PCR）和直接免疫荧光实验（FA），二者均涉及支原体纯培养物即单个菌落的分离和培养；而目前分离鸭支原体使用的人工培养基一般均由Frey或PPLO培养基改良而来，仍存在活菌滴度低、繁殖能力差等问题，易产生漏诊；因此，本领域亟需高效稳定、快速分离诊断鸭支原体的培养基以及分离纯化鸭支原体的方法，进而开展鸭支原体感染的治疗与防控研究。

发明内容

本发明提供了鸭支原体培养基，该培养基能够用来分离纯化鸭支原体，活菌滴度高，繁殖能力强；本发明还提供应用该培养基分离纯化鸭支原体的方法。

本发明为解决以上技术问题所采用的方案为：

鸭支原体培养基，包括液体培养基和固体培养基，所述液体培养基由以下组分组成：去离子水，10%的醋酸铊溶液，PPLO肉汤，葡萄糖，蛋白胨，胰蛋白胨，1%的酚红，含L-谷氨酰胺的CMRL-1066培养基，灭活的马血清，酵母浸出液，青霉素，L-半胱氨酸盐酸盐和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；

所述固体培养基由以下组分组成：去离子水，10%的醋酸铊溶液，PPLO肉汤，葡萄糖，蛋白胨，胰蛋白胨，琼脂粉，含L-谷氨酰胺的CMRL-1066培养基，灭活的马血清，酵母浸出液，青霉素，L-半胱氨酸盐酸盐和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。

作为优选，所述液体培养基由以下组分组成：10%的醋酸铊溶液4.5-6mL/L，PPLO肉汤3-5g/L，葡萄糖4-6g/L，蛋白胨4-6g/L，胰蛋白胨8-10g/L，1%的酚红2-3mL/L，含L-谷氨酰胺的CMRL-1066培养基450-500mL/L，灭活的马血清150-180mL/L，酵母浸出液45-55mL/L，青霉素200-300万单位/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.1-0.2g/L，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸0.1-0.2g/L，余量为去离子水。

最优选地，所述液体培养基由以下组分组成：10%的醋酸铊溶液4.8mL/L，PPLO肉汤3g/L，葡萄糖5g/L，蛋白胨4.8g/L，胰蛋白胨10g/L，1%的酚红2mL/L，含L-谷氨酸的CMRL-1066培养基450mL/L，灭活的马血清180mL/L，酵母浸出液45mL/L，青霉素300万单位/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.2g/L，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸0.2g/L，余量为去离子水。

作为优选，所述固体培养基由以下组分组成：10%的醋酸铊溶液4.5-6mL/L，PPLO肉汤3-5g/L，葡萄糖4-6g/L，蛋白胨4-6g/L，胰蛋白胨8-10g/L，琼脂粉10-12g/L，含L-谷氨酰胺的CMRL-1066培养基450-500 mL/L，灭活的马血清150-180mL/L，酵母浸出液45-55mL/L，青霉素200-300万单位/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.1-0.2g/L，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸0.1-0.2g/L，余量为去离子水。

最优选地，所述固体培养基由以下组分组成：10%的醋酸铊溶液4.8mL/L，PPLO肉汤3g/L，葡萄糖5g/L，蛋白胨4.8g/L，胰蛋白胨10g/L，琼脂粉12g/L，含L-谷氨酸的CMRL-1066培养基450mL/L，灭活的马血清180mL/L，酵母浸出液45mL/L，青霉素300万单位/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.2g/L，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸0.2g/L，余量为去离子水。

作为优选，所述酵母浸出液的制备方法为：将酵母溶于5倍去离子水中，在30℃下磁力搅拌1小时；10-15分钟内逐渐增加温度到40℃；之后每分钟增加5℃至沸点，煮沸3-5分钟，冷却至室温，离心，取上清，依次经0.8 μm、0.45 μm、0.22 μm的滤器过滤后收集滤液即得。

采用上述方法制备得到的酵母浸出液具备以下优点：不断搅拌可使酵母的溶解性增加，浸出液色泽为淡黄色至黄色；缓慢升高温度可减少浸出液营养成份的破坏；整个制备过程的总时间控制在2小时左右，减少了污染杂菌的概率。

作为优选，除添加琼脂粉，去掉酚红指示剂外，所述固体培养基其余组分和各组分含量均与液体培养基相同。通常情况之下，固体培养基与液体培养基成分应该保持一致的，这样能够确保支原体生长状态的稳定；另外在大批量配置液体及固体培养基时可同时进行，节省人力和时间。

本发明还提供上述培养基的制备方法，所述液体培养基的制备方法为：将配方量的去离子水，10%的醋酸铊溶液，PPLO肉汤，葡萄糖，蛋白胨，胰蛋白胨，1%的酚红充分混匀，调pH值为7.8，121℃高压灭菌15分钟，冷却至50-55℃，加入配方量的无菌的CMRL-1066培养基（含L-谷氨酰胺），灭活的马血清，酵母浸出液，无菌的青霉素水溶液，无菌的L-半胱氨酸盐酸盐水溶液以及无菌的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水溶液，添加时无先后顺序，最后微调pH值至7.7-7.8。

作为优选，所述固体培养基的制备方法为：将配方量的去离子水，10%的醋酸铊溶液，PPLO肉汤，葡萄糖，蛋白胨，胰蛋白胨，琼脂粉充分混匀，调pH值为7.8，121℃高压灭菌15分钟，放入50-55℃的水浴锅中冷却，加入配方量的无菌的CMRL-1066培养基（含L-谷氨酰胺），灭活的马血清，酵母浸出液，无菌的青霉素水溶液，无菌的L-半胱氨酸盐酸盐水溶液以及无菌的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水溶液，添加时无先后顺序，混匀后倒平板，得固体培养基。

本发明的第三个目的是提供鸭支原体分离纯化的方法，包括以下步骤：

1. 用无菌棉签在鸭的鼻后孔、气管、泄殖腔或气囊采样、或挑取大约0.1mL的卵黄液（含部分卵黄膜）、或无菌条件下剪切小块病样组织接种到4.5mL的液体培养基中（棉签需弃掉），置于37℃、5% CO₂培养箱中培养，24小时后，进行第一代盲传，无论液体培养基颜色是否改变，将上述液体培养物划线接种到固体培养基进行菌落生长；若此时，上述液体培养基pH下降，颜色由红色变为黄色，可按1:10的比例转接到新的液体培养基中传代增殖；若未发生pH值下降，继续放置培养箱中培养，待颜色变黄立即转接新的液体培养基和固体培养基。

2. 上述固体培养基培养5-7天，低倍镜下观察菌落的生长情况，用接种环无菌刮取平板上的菌落接种到新的液体培养基中培养生长，再将变黄的培养物接种到固体培养基上；重复该步骤，确保分离到支原体特征菌落。

步骤1和2表明，由于初步分离支原体时，病料本身和其他杂菌污染可能会抑制鸭支原体的生长，影响支原体的分离，因此，在首次接种液体培养基24小时后，无论液体培养基是否发生颜色改变，需在固体培养基中进行盲传；同时，根据液体培养基颜色的变化，考虑是否转接新液体培养基进行增殖。若24小时内液体培养基未发生颜色的改变，需继续放置在培养箱中培养，每日观察，待pH下降、液体变黄时转接新的液体培养基和固体培养基进行增殖和分离。由于病料的来源、类型不同，支原体在分离初期生长的速度也不尽相同，因此需多次重复步骤2，确保分离到支原体特征性菌落。

3. 用0.45μm-0.22μm的滤器过滤上述培养支原体特征菌落生长变黄的液体培养物，然后取200μL过滤的培养物（原液）加到1.8 mL液体培养基中做连续10倍稀释（10^-1-10^-7）；将平皿划为8等分，依次取5μL原液和不同浓度的稀释液分别涂布到固体培养基上，37℃、5%CO₂培养箱培养5-7天，用低倍显微镜观察，可见分布均匀，边缘整齐，中间较厚，周边透明的“油煎蛋”样圆形菌落。

4. 在显微镜下选取单个的特征菌落，并在平板底部做好标记；用一次性巴氏吸管吸取单一菌落并接种到4.5mL液体培养基中培养，当pH下降，液体由红色变为黄色时，重复步骤3和4；如此重复3次，得到纯化的鸭支原体，加甘油-80℃保存。

本发明对培养基进行了营养成分的筛选，通过添加CMRL-1066和马血清，增加了鸭支原体培养基的营养成分，使其富含核苷酸、维生素、胆固醇及蛋白质；通过添加酵母浸出液，提供了鸭支原体生长所需的氮源和微量元素；经反复实验表明，本发明的培养基能有效促进鸭支原体的繁殖，仅24小时即可生长，生长滴度可达10^2-3 CCU/mL，而在未添加上述成分之前，生长48小时生长滴度才能达到10³ CCU/mL；通过添加醋酸铊、提高青霉素的浓度，可阻止环境中其他杂菌的生长，使培养基在2-8℃存储时间从之前的1-2月延长到半年。

利用上述培养基对鸭支原体分离纯化，是在固体培养基上分离菌落，将分离的菌落置于液体培养基中生长，然后进行液体培养物的过滤、稀释、涂板和挑单菌落增殖的纯化步骤，重复上述步骤直至得到纯化的鸭支原体。利用本发明的培养基进行鸭支原体分离纯化的成功率高，在正确采样的前提下，通过最初病料接种、盲传培养和分离，到后来液体培养物的过滤、稀释、涂板、挑取单菌落增殖的纯化步骤，均能从临床病样中成功分离纯化出鸭支原体。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。

实施例1

本发明的鸭支原体培养基由液体培养基和固体培养基组成，具体为：

液体培养基配方为：10%的醋酸铊溶液4.8mL/L，PPLO肉汤3 g/L，葡萄糖5g/L，蛋白胨4.8g/L，胰蛋白胨10g/L，1%的酚红2mL/L，含L-谷氨酰胺的CMRL-1066培养基450mL/L，灭活的马血清180mL/L，酵母浸出液45mL/L，青霉素300万单位/L，L-半胱氨酸盐酸盐水溶液0.2g/L，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水溶液0.2g/L，余量为去离子水。

配制500ml本发明的液体培养基的方法如下：将1L的三角瓶置于磁力搅拌机上，先量取100 mL的去离子水，缓慢滴加10%的醋酸铊溶液2.4mL，然后依次称取并加入PPLO肉汤1.5g，葡萄糖2.5g，蛋白胨2.4g，胰蛋白胨5g，1%的酚红2mL，充分混匀后用质量百分浓度为20%的NaOH调pH值为7.8，121℃高压灭菌15分钟；冷却至50-55℃，加入无菌的CMRL-1066培养基（含L-谷氨酰胺）225mL，灭活的马血清90mL，酵母浸出液22.5mL，无菌的青霉素150万单位（溶于20mL去离子水），无菌的L-半胱氨酸盐酸盐水溶液（0.1g溶于10mL去离子水），无菌的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水溶液（0.1g溶于10mL去离子水），用去离子水调至500ml，无菌条件下调pH值至7.8，置4℃冰箱备用。

固体培养基配方为：10%的醋酸铊溶液4.8mL/L，PPLO肉汤3g/L，葡萄糖5g/L，蛋白胨4.8g/L，胰蛋白胨10g/L，琼脂粉12g/L，含L-谷氨酰胺的CMRL-1066培养基450mL/L，灭活的马血清180mL/L，酵母浸出液45mL/L，青霉素300万单位/L，L-半胱氨酸盐酸盐水溶液0.2g/L，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水溶液0.2g/L，余量为去离子水。

配制500mL本发明的固体培养基：将1L的三角瓶置于磁力搅机上，先量取100 mL的去离子水，缓慢滴加10%的醋酸铊溶液2.4mL，然后依次称取PPLO肉汤1.5g，葡萄糖2.5g，蛋白胨2.4g，胰蛋白胨5g，琼脂粉6g，充分混匀后用质量百分浓度为20%的NaOH调pH值为7.8，121℃高压灭菌15分钟；放入50-55℃的水浴锅中冷却（此温度下可防止琼脂凝集及对后续添加物营养成分的破坏）；加入无菌的CMRL-1066培养基（含L-谷氨酰胺）225mL，灭活的马血清90mL，酵母浸出液22.5mL，无菌的青霉素150万单位（溶于20 mL去离子水），无菌的L-半胱氨酸盐酸盐水溶液（0.1g溶于10mL去离子水），无菌的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水溶液（0.1 g溶于10mL去离子水），用去离子水调至500ml，混匀后倒平板，放置4℃冰箱的平皿罐内备用。

上述培养基中酵母浸出液的制备方法为：称取酵母粉200g，加入1000mL去离子水，在30℃下磁力搅拌1小时；10-15分钟内逐渐增加温度到40℃；之后每分钟增加5℃至沸点，煮沸3-5分钟，冷却至室温，离心，取上清，依次经0.8 μm、0.45 μm、0.22 μm的滤器过滤后收集滤液，50mL分装后放入-20℃备用。

本发明的鸭支原体培养基的活菌滴度（CCU）测定：

取11支试管，加液体培养基4.5mL /管，在第1管中加入0.5mL 生长良好的培养液（鸭支原体模式株1340株：购自美国菌种保藏中心ATCC），振荡器混匀，换新的移液管，从第1管吸取0.5mL加入到第2管中，依次进行10倍稀释至第10管，最后一管中的0.5mL弃去；第11管为阴性对照。将试管放置37℃恒温箱中静置培养，每日观察颜色变化，连续观察10-12天，最后发生颜色变化的那管稀释度就是该培养物的CCU滴度。第10天读值，结果显示培养液的含菌量为1×10⁹ CCU/mL。

应用实施例1制备的培养基分离纯化鸭支原体的方法如下：

1）用无菌棉签，从活体病鸭的气管中取样，立即将棉签放入含有4.5 mL培养基的试管中用力搅拌挤压，弃棉签，并尽快放入37℃、5% CO₂的培养箱中培养。

2) 24小时后，进行第一代盲传，将上述液体培养物划线接种到固体培养基进行菌落生长；若此时，上述液体培养基PH下降，颜色由红色变为黄色，可按1:10的比例转接新的液体培养基，若未发生PH值下降，继续放置培养箱中培养，待颜色变黄转接新的液体培养基和固体培养基。

3) 固体培养基培养5-7天，低倍镜下观察菌落的生长情况，用接种环无菌刮取平板上的菌落接种到液体培养基中培养生长，再将变黄的培养物接种到固体培养基上；重复该步骤，直至得到支原体特征菌落。

4）将特征菌落接种到液体培养基中生长，颜色变黄后，用0.22μm滤器过滤液体培养物；转接200μL滤液到1.8mL液体培养基中做连续10倍稀释（10^-1-10^-7）；将原液和稀释液各5μL涂布固体培养基，37℃、5%CO₂培养箱培养5天，可在低倍显微镜下观察到分布均匀的支原体菌落，选取单个菌落接种于液体培养基中培养，当液体由红色变为黄色后，重复该步骤；如此重复3次，即可得到纯化的鸭支原体，加甘油于-80℃保存。

实施例2

本实施例与实施例1的不同之处在于：

液体培养基配方为：10%的醋酸铊溶液4.5mL/L，PPLO肉汤5g/L，葡萄糖4g/L，蛋白胨4g/L，胰蛋白胨9g/L，1%的酚红2.5mL/L，含L-谷氨酰胺的CMRL-1066培养基500mL/L，灭活的马血清150mL/L，酵母浸出液55mL/L，青霉素250万单位/L，L-半胱氨酸盐酸盐水溶液0.1g/L，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水溶液0.1g/L，余量为去离子水。

固体培养基配方为：10%的醋酸铊溶液4.5mL/L，PPLO肉汤5g/L，葡萄糖4g/L，蛋白胨4g/L，胰蛋白胨9g/L，琼脂粉10g/L，含L-谷氨酰胺的CMRL-1066培养基500mL/L，灭活的马血清150mL/L，酵母浸出液55mL/L，青霉素250万单位/L，L-半胱氨酸盐酸盐水溶液0.1g/L，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水溶液0.1g/L，余量为去离子水。

其余部分均相同。

实施例3

本实施例与实施例1的不同之处在于：

液体培养基配方为：10%的醋酸铊溶液6.0mL/L，PPLO肉汤4g/L，葡萄糖6g/L，蛋白胨6g/L，胰蛋白胨8g/L，1%的酚红3mL/L，含L-谷氨酰胺的CMRL-1066培养基480mL/L，灭活的马血清170mL/L，酵母浸出液50mL/L，青霉素280万单位/L，L-半胱氨酸盐酸盐水溶液0.1g/L，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水溶液0.2g/L，余量为去离子水。

固体培养基配方为：10%的醋酸铊溶液6.0mL/L，PPLO肉汤4g/L，葡萄糖6g/L，蛋白胨6g/L，胰蛋白胨8g/L，琼脂粉11g/L，含L-谷氨酰胺的CMRL-1066培养基480mL/L，灭活的马血清170mL/L，酵母浸出液50mL/L，青霉素280万单位/L，L-半胱氨酸盐酸盐水溶液0.1g/L，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水溶液0.2g/L，余量为去离子水。

其余部分均相同。

实施例4

本实施例与实施例1的不同之处在于：

液体培养基配方为：10%的醋酸铊溶液5.0mL/L，PPLO肉汤4.5g/L，葡萄糖5.5g/L，蛋白胨4.5g/L，胰蛋白胨8.5g/L，1%的酚红3mL/L，含L-谷氨酰胺的CMRL-1066培养基470mL/L，灭活的马血清160mL/L，酵母浸出液52mL/L，青霉素230万单位/L，L-半胱氨酸盐酸盐水溶液0.2g/L，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水溶液0.1g/L，余量为去离子水。

固体培养基配方为：10%的醋酸铊溶液5.0mL/L，PPLO肉汤4.5g/L，葡萄糖5.5g/L，蛋白胨4.5g/L，胰蛋白胨8.5g/L，琼脂粉10.5g/L，含L-谷氨酰胺的CMRL-1066培养基470mL/L，灭活的马血清160mL/L，酵母浸出液52mL/L，青霉素230万单位/L，L-半胱氨酸盐酸盐水溶液0.2g/L，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水溶液0.1g/L，余量为去离子水。

其余部分均相同。

实施例5

本实施例与实施例1的不同之处在于：

液体培养基配方为：10%的醋酸铊溶液5.5mL/L，PPLO肉汤3.5g/L，葡萄糖4.5g/L，蛋白胨5.5g/L，胰蛋白胨9.5g/L，1%的酚红2.5mL/L，含L-谷氨酰胺的CMRL-1066培养基490mL/L，灭活的马血清165mL/L，酵母浸出液52mL/L，青霉素260万单位/L，L-半胱氨酸盐酸盐水溶液0.15g/L，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水溶液0.15g/L，余量为去离子水。

固体培养基配方为：10%的醋酸铊溶液5.5mL/L，PPLO肉汤3.5g/L，葡萄糖4.5g/L，蛋白胨5.5g/L，胰蛋白胨9.5g/L，琼脂粉11.5g/L，含L-谷氨酰胺的CMRL-1066培养基490mL/L，灭活的马血清165mL/L，酵母浸出液52mL/L，青霉素260万单位/L，L-半胱氨酸盐酸盐水溶液0.15g/L，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水溶液0.15g/L，余量为去离子水。

其余部分均相同。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.鸭支原体培养基，其特征在于：由液体培养基和固体培养基组成，

所述液体培养基配方为：10%的醋酸铊溶液4.5-6mL/L，PPLO肉汤3-5g/L，葡萄糖4-6g/L，蛋白胨4-6g/L，胰蛋白胨8-10g/L，1%的酚红2-3mL/L，含L-谷氨酰胺的CMRL-1066培养基450-500 mL/L，灭活的马血清150-180mL/L，酵母浸出液45-55mL/L，青霉素200-300万单位/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.1-0.2g/L，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸0.1-0.2g/L，余量为去离子水；

所述固体培养基配方为：10%的醋酸铊溶液4.5-6mL/L，PPLO肉汤3-5g/L，葡萄糖4-6g/L，蛋白胨4-6g/L，胰蛋白胨8-10g/L，琼脂粉10-12g/L，含L-谷氨酰胺的CMRL-1066培养基450-500 mL/L，灭活的马血清150-180mL/L，酵母浸出液45-55mL/L，青霉素200-300万单位/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.1-0.2g/L，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸0.1-0.2g/L，余量为去离子水。

2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于：所述液体培养基由以下组分组成：10%的醋酸铊溶液4.8mL/L，PPLO肉汤3g/L，葡萄糖5g/L，蛋白胨4.8g/L，胰蛋白胨10g/L，1%的酚红2mL/L，含L-谷氨酸的CMRL-1066培养基450mL/L，灭活的马血清180mL/L，酵母浸出液45mL/L，青霉素300万单位/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.2g/L，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸0.2g/L，余量为去离子水。

3.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于：所述固体培养基由以下组分组成：10%的醋酸铊溶液4.8mL/L，PPLO肉汤3g/L，葡萄糖5g/L，蛋白胨4.8g/L，胰蛋白胨10g/L，琼脂粉12g/L，含L-谷氨酸的CMRL-1066培养基450mL/L，灭活的马血清180mL/L，酵母浸出液45mL/L，青霉素300万单位/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.2g/L，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸0.2g/L，余量为去离子水。

4.根据权利要求2所述的培养基，其特征在于：所述固体培养基由以下组分组成：10%的醋酸铊溶液4.8mL/L，PPLO肉汤3g/L，葡萄糖5g/L，蛋白胨4.8g/L，胰蛋白胨10g/L，琼脂粉12g/L，含L-谷氨酸的CMRL-1066培养基450mL/L，灭活的马血清180mL/L，酵母浸出液45mL/L，青霉素300万单位/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.2g/L，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸0.2g/L，余量为去离子水。

5.根据权利要求1-4任一所述的培养基，其特征在于：所述酵母浸出液的制备方法为：将酵母溶于5倍去离子水中，在30℃下磁力搅拌1小时；10-15分钟内逐渐增加温度到40℃；之后每分钟增加5℃至沸点，煮沸3-5分钟，冷却至室温，离心，取上清，依次经0.8 μm、0.45μm、0.22 μm的滤器过滤后收集滤液即得。

6.根据权利要求1-3任一所述的培养基，其特征在于：除添加琼脂粉，去掉酚红指示剂外，所述固体培养基其余组分和各组分含量均与液体培养基相同。

7.根据权利要求5所述的培养基，其特征在于：除添加琼脂粉，去掉酚红指示剂外，所述固体培养基其余组分和各组分含量均与液体培养基相同。

8.权利要求1-7任一所述的培养基的制备方法，其特征在于：所述液体培养基的制备方法为：将配方量的去离子水，10%的醋酸铊溶液，PPLO肉汤，葡萄糖，蛋白胨，胰蛋白胨，1%的酚红充分混匀，调pH值为7.8，121℃高压灭菌15分钟，冷却至50-55℃，加入配方量的无菌的含L-谷氨酰胺的CMRL-1066培养基，灭活的马血清，酵母浸出液，无菌的青霉素水溶液，无菌的L-半胱氨酸盐酸盐水溶液以及无菌的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水溶液；最后微调pH值至7.7-7.8。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述固体培养基的制备方法为：将配方量的去离子水，10%的醋酸铊溶液，PPLO肉汤，葡萄糖，蛋白胨，胰蛋白胨，琼脂粉充分混匀，调pH值为7.8，121℃高压灭菌15分钟，放入50-55℃的水浴锅中冷却，加入配方量的无菌的含L-谷氨酰胺的CMRL-1066培养基，灭活的马血清，酵母浸出液，无菌的青霉素水溶液，无菌的L-半胱氨酸盐酸盐水溶液以及无菌的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水溶液；混匀后倒平板，得固体培养基。

10.应用权利要求1-7任一所述的鸭支原体培养基对鸭支原体分离纯化的方法，其特征在于：步骤如下：

1）无菌采集组织病料接种到液体培养基中进行培养，一定时间后，进行第一代盲传，将液体培养物接种到固体培养基中进行菌落生长；若此时，液体培养物pH下降，颜色由红色变为黄色，将培养物转接到新的液体培养基中生长；若未发生pH值下降，继续放置于培养箱中培养，待颜色变黄立即转接新的液体培养基和固体培养基；

2）在固体培养基上培养5-7天后，将菌落接种到新的液体培养基中培养生长；待液体培养基变黄时再将培养物接种到固体培养基中，重复该步骤，直到分离到支原体特征菌落；

3）将分离到的支原体特征菌落转接液体培养基，待培养基变黄时，过滤液体培养物，并将过滤的培养物加入到液体培养基中做连续10倍稀释，将原液和不同浓度的稀释液分别涂布到固体培养基上培养5-7天；

4）选取单个的特征菌落，接种到液体培养基中培养，当液体培养基由红色变为黄色时，重复步骤3）和4），如此重复3次，得到纯化的鸭支原体。