CN115216424A - 一株鸡滑液囊支原体的培养传代和保存方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株鸡滑液囊支原体的培养传代和保存方法，包括改良Frey氏培养基的配制，滑液囊支原体的分离，同时还包括滑液囊支原体的传代和保存方法；本检测方法优化了兽药典的支原体分离培养基的配方，与成品试剂相比价格低廉，分离率相当；并对滑液囊支原体分离的时机、方法进行了规范；同时对滑液囊支原体的培养传代方法进行了优化，对保存的方法进行了摸索，同时本方法操作简单，节省了成本，更规范化。

Description

一株鸡滑液囊支原体的培养传代和保存方法
技术领域
本发明涉及禽病诊断检测和治疗的技术领域，具体涉及一株鸡滑液囊支原体的培养传代和保存方法。
背景技术
目前支原体的分离在实践操作中非常的有难度，一是支原体培养基的选择使用局限，虽然拥有成品试剂的厂家很多，但是都不一定适用于所有类型的支原体分离，其中有一到两家培养基效果很好，但是价格昂贵，不适合日常检测批量分菌使用。二是分离的时机很重要，需要找准分菌的节点进行分离。三是分离后培养的方法，操作有难度。
发明内容
本发明的目的在于提供一株鸡滑液囊支原体的培养传代和保存方法，本检测方法优化了兽药典的支原体分离培养基的配方，与成品试剂相比价格低廉，分离率相当；并对滑液囊支原体分离的时机、方法进行了规范；同时对滑液囊支原体的培养传代方法进行了优化，对保存的方法进行了摸索，同时本方法操作简单，节省了成本，更规范化。
为达到上述技术目的，本发明采用了一株鸡滑液囊支原体的培养传代和保存方法，包括改良Frey氏培养基的配制，滑液囊支原体的分离，同时还包括滑液囊支原体的传代和保存方法；
所述改良Frey氏培养基的配制包括如下步骤：
（1）准备如下原料：氯化钠5.0g，氯化钾 0.4g，硫酸镁0.2g，磷酸氢二钠1.6g，磷酸二氢钾0.2g，葡萄糖10.0g，进口水解乳蛋白（BD）5.0g ，酵母浸出粉5.0g，以上成分按比例称重，加入注射用水逐一溶解；
（2）加入进口猪血清100.0ml，1%辅酶I10.0ml，1%L-半胱氨酸盐酸盐 10.0ml，2%精氨酸盐酸盐 20.0ml，8万IU/ml青霉素10.0ml，1%酚红 1.0ml，新制注射用水加至1000ml；
（3）将以上成分按比例称重，加入注射用水逐一溶解后，用1mol/L氢氧化钠调整PH7.6-8.0，用0.22um滤膜过滤除菌，定量分装，放4℃冷藏不超过7d，否则需放-20℃冻存；
所述滑液囊支原体的分离包括如下步骤：
（1）挑取发生滑液囊支原体疾病的鸡，取不同程度发病症状的鸡的病变关节，喉头拭子送检，并将脏器取样后切勿冷冻，以最快的速度低温送检实验室进行分离；
（2）将病鸡的关节部位，清洗外部，放置操作台进行无菌分离，剪开病变部位，用配制好的改良Frey氏的培养基对病变部位进行冲洗，冲洗液备用；
（3）取病变的筋腱、粘液放置到冲洗液中，进行震动混匀，放置冰箱浸内泡一段时间；
（4）取病料液8000r/min离心，5min，取上清，用0.22um的滤器进行过滤，得到过滤液，放置到玻璃试管中，用1mol/L氢氧化钠调节PH，并置于温箱培养；
所述滑液囊支原体的传代和保存方法包括如下步骤：
（1）取分离到滑液囊支原体，按照10%接种量接种到改良Fery氏培养基里，置于37℃温箱培养，待培养基的PH值下降至6.7-7.0时收获；
（2）得到菌株后将菌株进行纯化，将培养颜色变黄的滑液囊支原体菌液涂布支原体固体培养基上，倒置于培养箱内进行培养一段时间，挑取固体培养基上的单菌落至滑液囊支原体液体培养基中进行培养，重复以上操作3次即得纯化后的滑液囊支原体，继续传代。
优选的，所述滑液囊支原体的分离的步骤（3）中，取病变的筋腱、粘液放置到冲洗液中，进行震动混匀，放置4℃冰箱浸泡4小时。
进一步优选的，所述滑液囊支原体的分离的步骤（4）中，使培养基PH在7.6-8.0之间，并置于37℃温箱培养。
更进一步优选的，所述滑液囊支原体的传代和保存方法的步骤（2）中，将培养颜色变黄的滑液囊支原体菌液涂布支原体固体培养基上，倒置于5%CO2培养箱内37℃进行培养5～7ｄ。
本发明的检测方法具有如下优点：
（1）本发明的检测方法优化了兽药典的支原体分离培养基的配方，与成品试剂相比价格低廉，分离率相当；
（2）本发明的检测方法对滑液囊支原体分离的时机、方法进行了规范；
（3）本发明的检测方法对滑液囊支原体的培养传代方法进行了优化，对保存的方法进行了摸索，同时本方法操作简单，节省了成本，更规范化。
附图说明
图1所示为本发明中培养基培养时的状态图；
图2所示为本发明中培养基颜色变化的状态图；
图3所示为本发明中支原体纯化的状态图。
具体实施方式
下面采用具体实施方式对本发明作进一步的说明。
一株鸡滑液囊支原体的培养传代和保存方法，具体包括改良Frey氏培养基的配制，滑液囊支原体的分离，同时还包括滑液囊支原体的传代和保存方法；
在本发明中，改良Frey氏培养基的配制包括如下步骤：
（1）准备如下原料：氯化钠5.0g，氯化钾0.4g，硫酸镁0.2g，磷酸氢二钠1.6g，磷酸二氢钾0.2g，葡萄糖10.0g，进口水解乳蛋白（BD）5.0g ，酵母浸出粉5.0g，以上成分按比例称重，加入注射用水逐一溶解；
（2）加入进口猪血清100.0ml，1%辅酶I10.0ml，1%L-半胱氨酸盐酸盐 10.0ml，2%精氨酸盐酸盐 20.0ml，8万IU/ml青霉素10.0ml，1%酚红 1.0ml，新制注射用水加至1000ml；
（3）将以上成分按比例称重，加入注射用水逐一溶解后，用1mol/L氢氧化钠调整PH7.6-8.0，用0.22um滤膜过滤除菌，定量分装，放4℃冷藏不超过7d，否则需放-20℃冻存；
在上述步骤中，由于支原体对水的要求较高，配制培养基的水必须经过纯化，为注射用水或超纯水，不含杂质，注射用水储存不宜超过3天，现制现用为宜，以避免周围环境和空气可能造成的污染及水质的变化，同时配制培养基的试剂厂家最好是国药集团，培养基颜色为玫红色，澄清无沉淀（本步骤的培养基培养时的状态参考图1）。
在本发明中，滑液囊支原体的分离包括如下步骤：
（1）挑取发生滑液囊支原体疾病的鸡，取不同程度发病症状的鸡的病变关节，例如：严重肿胀的、轻微肿胀的、外观正常但是瘸腿的、精神不振的，喉头拭子送检，并将脏器取样后切勿冷冻，以最快的速度低温送检实验室进行分离；
（2）将病鸡的关节部位，清洗外部，放置操作台进行无菌分离，剪开病变部位，用配制好的改良Frey氏的培养基对病变部位进行冲洗，冲洗液备用；
（3）取病变的筋腱、粘液放置到冲洗液中，进行震动混匀，放置冰箱浸内泡一段时间；在该步骤中，取病变的筋腱、粘液放置到冲洗液中，进行震动混匀，放置4℃冰箱浸泡4小时；
（4）取病料液8000r/min离心，5min，取上清，用0.22um的滤器进行过滤，得到过滤液，放置到玻璃试管中，用1mol/L氢氧化钠调节PH，并置于温箱培养；在该步骤中，使培养基PH在7.6-8.0之间，并置于37℃温箱培养；
在上述步骤中，分离培养初期，需要在培养72小时之内，按照10%的接种比例进行传代一次，同时原液继续培养。待培养基的PH值下降至6.7-7.0时收获，此时眼观培养基的颜色由玫红色变为黄色（见图2）。收获支原体后，需要对获得的支原体进行鉴定，以及外源的其他病原进行检测。
在本发明中，滑液囊支原体的传代和保存方法包括如下步骤：
（1）取分离到滑液囊支原体，按照10%接种量接种到改良Fery氏培养基里，置于37℃温箱培养，待培养基的PH值下降至6.7-7.0时收获；
（2）得到菌株后将菌株进行纯化，将培养颜色变黄的滑液囊支原体菌液涂布支原体固体培养基上，倒置于培养箱内进行培养一段时间，挑取固体培养基上的单菌落至滑液囊支原体液体培养基中进行培养，重复以上操作3次即得纯化后的滑液囊支原体，继续传代。在该步骤中，将培养颜色变黄的滑液囊支原体菌液涂布支原体固体培养基上，倒置于5%CO2培养箱内37℃进行培养5～7ｄ（支原体纯化的状态请参考图3）。
需要强调的是，在传代的过程中，有的菌株活性较好，在培养时间上可能会不到24小时PH值就下降到0.5以上，也可以传代培养。支原体收获、传代、冻存都必须是要在活性最好的时间点进行，提前或者延后收获，都会影响菌株的活性。一株支原体，掌握其变色规律，严格按照活性较好的情况下按相同比例传代，其变色单位（CCU）也趋于稳定。
对于支原体变色后，进行收获，可放置4℃冰箱内保存，可放置一周左右，收获后直接分装冻存-20℃可保存一个月。收获后直接分装冻存-80℃可保存三年。也可采用支原体加50%甘油1：1混匀进行保存。或者采用冻干的方法进行保存。最长时间不超过三年，需进行复苏传代。不同的保存方法均会影响支原体活力，再次传代，变色时间会延长。支原体冻存后复苏时，需要进行连续传代，恢复其活性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一株鸡滑液囊支原体的培养传代和保存方法，其特征在于，包括改良Frey氏培养基的配制，滑液囊支原体的分离，同时还包括滑液囊支原体的传代和保存方法；
所述改良Frey氏培养基的配制包括如下步骤：
（1）准备如下原料：氯化钠5.0g，氯化钾 0.4g，硫酸镁0.2g，磷酸氢二钠1.6g，磷酸二氢钾0.2g，葡萄糖10.0g，进口水解乳蛋白（BD）5.0g，酵母浸出粉5.0g，以上成分按比例称重，加入注射用水逐一溶解；
（2）加入进口猪血清100.0ml，1%辅酶I10.0ml，1%L-半胱氨酸盐酸盐 10.0ml，2%精氨酸盐酸盐 20.0ml，8万IU/ml青霉素10.0ml，1%酚红 1.0ml，新制注射用水加至1000ml；
（3）将以上成分按比例称重，加入注射用水逐一溶解后，用1mol/L氢氧化钠调整PH7.6-8.0，用0.22um滤膜过滤除菌，定量分装，放4℃冷藏不超过7d，否则需放-20℃冻存；
所述滑液囊支原体的分离包括如下步骤：
（1）挑取发生滑液囊支原体疾病的鸡，取不同程度发病症状的鸡的病变关节，喉头拭子送检，并将脏器取样后切勿冷冻，以最快的速度低温送检实验室进行分离；
（2）将病鸡的关节部位，清洗外部，放置操作台进行无菌分离，剪开病变部位，用配制好的改良Frey氏的培养基对病变部位进行冲洗，冲洗液备用；
（3）取病变的筋腱、粘液放置到冲洗液中，进行震动混匀，放置冰箱浸内泡一段时间；
（4）取病料液8000r/min离心，5min，取上清，用0.22um的滤器进行过滤，得到过滤液，放置到玻璃试管中，用1mol/L氢氧化钠调节PH，并置于温箱培养；
所述滑液囊支原体的传代和保存方法包括如下步骤：
取分离到滑液囊支原体，按照10%接种量接种到改良Fery氏培养基里，置于37℃温箱培养，待培养基的PH值下降至6.7-7.0时收获；
得到菌株后将菌株进行纯化，将培养颜色变黄的滑液囊支原体菌液涂布支原体固体培养基上，倒置于培养箱内进行培养一段时间，挑取固体培养基上的单菌落至滑液囊支原体液体培养基中进行培养，重复以上操作3次即得纯化后的滑液囊支原体，继续传代。
2.如权利要求1所述的一株鸡滑液囊支原体的培养传代和保存方法，其特征在于，所述滑液囊支原体的分离的步骤（3）中，取病变的筋腱、粘液放置到冲洗液中，进行震动混匀，放置4℃冰箱浸泡4小时。
3.如权利要求1所述的一株鸡滑液囊支原体的培养传代和保存方法，其特征在于，所述滑液囊支原体的分离的步骤（4）中，使培养基PH在7.6-8.0之间，并置于37℃温箱培养。
4.如权利要求1所述的一株鸡滑液囊支原体的培养传代和保存方法，其特征在于，所述滑液囊支原体的传代和保存方法的步骤（2）中，将培养颜色变黄的滑液囊支原体菌液涂布支原体固体培养基上，倒置于5%CO2培养箱内37℃进行培养5～7d。
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CN116267787A (zh) * 2023-01-13 2023-06-23 佛山科学技术学院 一种鸡滑液囊支原体感染模型及其构建方法和应用

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