CN102898537B - 一种脂多糖的纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种脂多糖的纯化方法，属于生物技术领域，其步骤为：经超滤浓缩、疏水层析、离子交换层析纯化后获得纯度较高的脂多糖。本发明提供了一种纯化效果好、有利于产业化的脂多糖纯化新方法，纯化后的脂多糖核酸和蛋白含量均低于1%，适合于制备疫苗。

Description

一种脂多糖的纯化方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及对细菌脂多糖的纯化方法。 

背景技术

副伤寒是一种常见的急性肠道传染性疾病，是许多国家，特别是发展中国家的主要公共卫生问题之一。目前《中国药典》2010版收录的伤寒副伤寒联合疫苗（TAB）属于全菌体疫苗，副反应严重，相关的发热和全身反应发生率为9%~34%；有效免疫力维持时间较短，保护率仅为51%~67%，，在临床使用多年后现已停止生产使用。世界卫生组织（WHO）估计2000年，全球伤寒患病人数约2170万，其中死亡人数为21.7万，副伤寒发病人数约540万，近年由于伤寒Vi多糖疫苗的普遍接种，副伤寒的发病率有上升趋势。在中国，2006年，除吉林和青海省无副伤寒病例报道外，其余各省市都有较多病例报道，且病例总数已经超过伤寒病例。2010年广西壮族自治区卫生厅10月30日证实，广西河池市罗城仫佬族自治县部分中小学近日暴发甲型副伤寒疫情。目前，全世界范围内尚没有安全性高、有效性好的副伤寒疫苗获批，因此副伤寒疫苗的研制迫在眉睫。

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革兰氏阴性菌细胞壁组成成分，由脂质A、核心多糖和O-特异多糖（O-SP）三部分组成。伤寒沙门氏菌的脂多糖不仅是一个毒力因子，它也是一种保护性抗原。目前已经发现将脂多糖脱毒后的O-SP特异多糖具有免疫保护性，可以通过将O-SP与载体蛋白结合后制备成结合疫苗。 关于O-SP与载体蛋白结合疫苗的研发已经取得突破性进展，该项目实施产业化的关键技术瓶颈在于如何大批量的获得O-SP。

解决LPS中核酸含量一直是个难题，目前采用的纯化方法主要是酶解和超速离心等方法，如Edward等（Edward K. Synthesis, characterization and immunological properties in mice of conjugates composed of detoxified LPS of salmonella paratyphi A bound to Tetanus toxoid, with Emphasis on the role of O-Acetyl[J]. Infection and immunity 1996,64(7):2709-2715.）在LPS提取过程中使用了DNA酶、RNA酶和蛋白酶K消化，超速离心（64000~100000×g）5h的方法,但该方法的缺点在于成本高、处理量小，不利于产业化，且会由于酶的使用带来外源因子污染；另据我国文献报道，秦敏等人（秦敏. 甲型副伤寒沙门氏菌LPS提取和O-SP纯化. 微生物学免疫性进展 2005,33(1) 27-31 ）用乙醇分级沉淀等方法，也只能将LPS的核酸含量控制在5%左右。

柱层析技术的优势在于纯化条件温和、易操作、易放大，作为一种新型的技术正逐渐替代传统的沉淀、离心等方法，成为生物分子纯化的主流。采用凝胶过滤的方法对脂多糖的水解脱毒产物OSP进行纯化的文献有报道，但使用该方法的前提是将LPS的残余核酸、蛋白含量控制在5%以内才有效果。（赵志强. 甲型副伤寒结合疫苗的制备及其免疫原性研究. 中华微生物学和免疫性杂质 2006,26（11）,1048-1052）。而利用超滤、疏水层析和离子交换层析技术的有机结合纯化脂多糖，使其中蛋白、核酸的含量降低到1%以内尚无文献报道。

发明内容

本发明要解决现有技术存在脂多糖核酸、蛋白含量较高，制品中添加外源因子，投入成本高、不利于产业化的问题，其目的是提供了一种能有效去除脂多糖中核酸、蛋白的方法，且该方法方便、重复性好、便于产业化。

本发明所提供的一种脂多糖的纯化方法，包括以下步骤：

（1）脂多糖的纯化：

① 第一次超滤：将脂多糖用0.01～0.5mol/L氯化钙溶液溶解，离心收集上清，上清液采用10～300KD超滤膜，用0.01～0.5mol/L氯化钙溶液超滤得超滤浓缩液1，超滤时所用的氯化钙溶液的体积为上清液体积的10～30倍；

② 疏水层析：超滤浓缩液1中加入硫酸铵溶液至硫酸铵终浓度为1～3mol/L，于4～12℃、3000～8000rpm条件下离心15～60min，收集上清液；上样于疏水层析柱，用混合液1或混合液2淋洗疏水层析柱，收集疏水层析穿透峰，得疏水层析液，混合液1由Tris-HCl和硫酸铵混合而成，pH为5.0~8.0，混合液1中Tris-HCl的终浓度为0.005～0.5mol/L，硫酸铵的终浓度为0.5~2.0 mol/L；混合液2由磷酸盐缓冲液和硫酸铵混合而成，pH为5.0~8.0，混合液2中磷酸盐的终浓度为0.005～0.5mol/L，硫酸铵的终浓度为0.5~2.0 mol/L； 

③ 第二次超滤：将疏水层析液采用10～50KD超滤膜，用注射用水超滤得超滤浓缩液2，所述的注射用水的用量为疏水层析液体积的3～7倍；

④ 离子交换层析：

在超滤浓缩液2中加入Tris-HCl缓冲液至Tris-HCl的终浓度为0.005～0.5mol/L得混合液3，混合液3的pH为5.0~8.0；将混合液3上样于阴离子交换柱，用终浓度为0.005～0.5mol/L及pH为5.0~8.0的Tris-HCl缓冲液淋洗阴离子交换层析柱至紫外吸光值不再下降，再用洗脱液洗脱，收集洗脱峰即为目标物溶液，所述的洗脱液由Tris-HCl和盐混合而成，洗脱液的pH为5.0~8.0、洗脱液中Tris-HCl的终浓度为0.005～0.5mol/L、盐的终浓度为0.001~1 mol/L；或在超滤浓缩液2中加入磷酸盐缓冲液至磷酸盐的终浓度为0.005～0.5mol/L得混合液4，混合液4的pH为5.0~8.0,将混合液4上样于阴离子交换柱，用终浓度为0.005～0.5mol/L及pH为5.0~8.0的磷酸盐缓冲液淋洗阴离子交换层析柱至紫外吸光值不再下降，再用洗脱液洗脱，收集洗脱峰即为目标物溶液，所述的洗脱液由磷酸盐和盐混合而成，洗脱液的pH为5.0~8.0、洗脱液中磷酸盐的终浓度为0.005～0.5mol/L、盐的终浓度为0.001~1 mol/L；

（2）   目标物溶液的浓缩干燥：将目标物溶液采用10～50KD超滤膜，用注射用水超滤缩液，真空干燥即得纯化的脂多糖，注射用水的用量为目标物溶液体积的3～7倍。

步骤（1）②中所述的疏水层析柱所用的疏水填料为Phenyl Sepharose HP、Phenyl Sepahrose 6 Fast Flow high sub、Phenyl Sepahrose 6 Fast Flow low sub或SOURCE 15 PHE。

步骤（1）④中所述的阴离子交换层析柱所用的填料为DEAE Sepharose FF、Q-SepharoseFF 、Q Sepharose HP、SOURCE 30Q、或Capto Q。

步骤（1）④所述的洗脱液中的盐为氯化钠、磷酸钠或乙酸钠。

步骤（1）①  第一次超滤所述的将脂多糖用0.01～0.5mol/L氯化钙溶液溶解，所述的脂多糖为甲型副伤寒脂多糖或乙型副伤寒脂多糖。

本发明还提供了一种脂多糖，所述的脂多糖是用本发明所述的脂多糖的纯化方法制备得到。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、本发明方法采用超滤技术、疏水层析技术和离子交换层析技术的有机结合和合理的纯化条件对脂多糖进行纯化，解决了脂多糖纯化后核酸含量高的难题，使脂多糖中的蛋白含量和核酸含量分别小于1%，大幅度提高了脂多糖的纯度，与现有技术相比（如乙醇分级沉淀等方法，也只能将LPS的核酸含量控制在5%左右），其纯化程度提高了80%以上，产生了预料不到的技术效果，且克服了现有技术对脂多糖纯化设备投入成本高，酶试剂成本高及带来相应污染、处理量少，不利于产业化的缺陷和不足。

2、本发明方法为副伤寒疫苗的制备奠定了良好的基础。

甲、乙型副伤寒沙门氏菌无荚膜多糖结构，在大量研究的基础上美国NIH提出肠道革兰氏阴性杆菌脂多糖水解后的OSP与相关蛋白结合后具有保护性免疫（Robbins JB. Hypothesis for vaccine development: protective immunity to enteric diseases caused by nontyphoidal salmonellae and shigellae may be conferred by serum IgG antibodies to the O-specific polysaccharide of their lipopolysaccharides, Clin Infect Dis, 1992, 15(2):346-361），因此我们的工作为副伤寒疫苗的制备奠定了良好的基础。

3、本发明方法可同时有效的去除LPS中的蛋白和核酸，批处理量大、工艺步骤简单易操作，投入相对较低，有利于产业化的实现。

常用的热酚水法提取获得脂多糖较易去除LPS中蛋白含量，但核酸难以去除，而本发明能同时有效的去除LPS中的蛋白和核酸。与传统工艺中常常使用超速离心法或脱氧核糖核酸酶（DNA酶）、核糖核酸酶（RNA酶）等方法去除核酸等杂质相比，其中超速离心机等设备投入较高、处理量少，不利于产业化；DNA酶、RNA酶成本高，且由于酶的使用会带来外源因子污染等问题，步骤复杂、不利于实现产业化。相比本分发明条件温和、残余核酸蛋白去除效果明显、批处理量大、投入相对较低，有利于产业化的实现。

附图说明

图1是脂多糖电泳图，图中：M：分子量标准，①为甲型副伤寒脂多糖，②为乙型副伤寒脂多糖。

图2是甲型副伤寒脂多糖鉴别试验结果，图中：1为甲型副伤寒脂多糖的上样孔；2为甲型副伤寒特异性抗血清上样孔；阴为阴性对照上样孔。

图3是乙型副伤寒脂多糖鉴别试验结果，图中： 1、2、3、4、5均为乙型副伤寒脂多糖的上样孔；6为乙型副伤寒特异性抗血清的上样孔；阴为阴性对照上样孔。

具体实施方式

以下实施例将进一步阐明本发明。

材料来源：

甲型副伤寒脂多糖和乙型副伤寒脂多糖为云南沃森生物技术有限公司发酵研究室提供。也可从云南沃森生物技术有限公司购买。甲型副伤寒脂多糖和乙型副伤寒脂多糖以及其他脂多糖可以从中国生物制品检定所或Sigma公司购买。

超滤膜及夹具：0.5平米、0.1平米（Pall 公司）

纯化仪：AKTA explorer（GE Healthcare公司）

离心机：CR 21G（日立公司）

层析填料：Phenyl Sepharose HP、Phenyl Sepahrose 6 Fast Flow (high sub) 、Phenyl Sepahrose 6 Fast Flow (low sub)、SOURCE 15 PHE（GE公司）；

   DEAE Sepharose FF、Q SepharoseFF 、Q Sepharose HP、SOURCE 30Q、Capto Q（GE公司）

其余化学试剂购自国药集团化学试剂有限公司

实施例1—实施例4是甲型副伤寒脂多糖的纯化，实施例5—实施例7是乙型副伤寒脂多糖的纯化。

实施例1：甲型副伤寒脂多糖的纯化

（1）脂多糖的纯化：

①  第一次超滤：

将甲型副伤寒脂多糖用0.01mol/L 氯化钙溶解，离心收集上清液，上清液采用10KD超滤膜，用0.01mol/L 氯化钙溶液超滤，得超滤浓缩液1，超滤时所用的氯化钙溶液体积为上清液体积的20倍体积；

②     疏水层析：

超滤浓缩液1中加入硫酸铵溶液至硫酸铵终浓度为1mol/L，于4℃、3000rpm条件下离心60min，收集上清液；上样于Phenyl Sepharose HP疏水层析柱，用混合液1淋洗疏水层析柱，收集疏水层析穿透峰，得疏水层析液，混合液1由Tris-HCl和硫酸铵混合而成，混合液1的pH为5.0，混合液1中Tris-HCl的终浓度为0.005mol/L，硫酸铵的终浓度为0.5 mol/L；

③     第二次超滤：

将疏水层析液采用10KD超滤膜，用注射用水超滤得超滤浓缩液2，所述的注射用水的用量为疏水层析液体积的3倍；

④ 离子交换层析：

在超滤浓缩液2中加入Tris-HCl缓冲液至Tris-HCl的终浓度为0.05mol/L得混合液3，混合液3的pH为8.0；将混合液3上样于DEAE Sepahrose FF阴离子交换柱，用终浓度为0.05mol/L，pH为8.0的Tris-HCl缓冲液淋洗阴离子交换层析柱至紫外吸光值不再下降，再用洗脱液洗脱，收集洗脱峰即为目标物溶液，所述的洗脱液由Tris-HCl和氯化钠混合而成，洗脱液的pH为8.0，洗脱液中Tris-HCl的终浓度为0. 05mol/L及氯化钠的终浓度为0.001 mol/L；

（2）目标脂多糖峰溶液的浓缩干燥： 

将疏水层析液采用10KD超滤膜，用注射用水超滤浓缩，真空干燥即得纯化的脂多糖，注射用水的用量为目标物溶液体积的3倍。

（3）纯化的脂多糖产品的检测：

分别将纯化前的脂多糖与经本发明法纯化获得的脂多糖进行检测：其中蛋白含量的检测依据《中国药典》2010版三部（附录Ⅵ B 第二法）进行；核酸含量的检测依据依据《中国药典》2010版三部（附录Ⅱ A）进行；鉴别试验依据《中国药典》2010版三部（附录Ⅷ C）进行，其结果见表1。

实施例1表明：采用本发明方法获得的脂多糖其蛋白含量和核酸含量均小于1%，与纯化前脂多糖中蛋白含量、核酸含量相比，分别降低了84.4%和98.8%。

实施例2：甲型副伤寒脂多糖的纯化

（1）脂多糖的纯化：

①第一次超滤：

将甲型副伤寒脂多糖用0.5mol/L 氯化钙溶解，离心收集上清液，上清液采用300KD超滤膜，用0.5mol/L 氯化钙溶液超滤，得超滤浓缩液1，超滤时所用的氯化钙溶液体积为上清液体积的30倍体积；

②疏水层析：

超滤浓缩液1中加入硫酸铵溶液至硫酸铵终浓度为3mol/L，于12℃、8000rpm条件下离心15min，收集上清液；上样于Phenyl Sepharose 6FF hight Sub疏水层析柱，用混合液1淋洗疏水层析柱，收集疏水层析穿透峰，得疏水层析液，混合液1由Tris-HCl和硫酸铵混合而成，混合液1的pH为8.0，混合液1中Tris-HCl的终浓度为0. 5mol/L，硫酸铵的终浓度为2.0 mol/L；

②    第二次超滤：

将疏水层析液采用50KD超滤膜，用注射用水超滤得超滤浓缩液2，所述的注射用水的用量为疏水层析液体积的5倍；

④离子交换层析：

在超滤浓缩液2中加入磷酸盐缓冲液至磷酸盐的终浓度为0.005mol/L得混合液4，混合液4的pH为5.0；将混合液4上样于SOURCE 30Q阴离子交换柱，用终浓度为0.005mol/L，pH为5.0的磷酸盐缓冲液淋洗阴离子交换层析柱至紫外吸光值不再下降，再用洗脱液洗脱，收集洗脱峰即为目标物溶液，所述的洗脱液由磷酸盐和乙酸钠混合而成，洗脱液的pH为5.0，洗脱液中磷酸盐的终浓度为0. 005mol/L，乙酸铵的终浓度为0.001 mol/L；

（2）目标脂多糖峰溶液的浓缩干燥： 

将疏水层析液采用50KD超滤膜，用注射用水超滤浓缩，真空干燥即得纯化的脂多糖，注射用水的用量为目标物溶液体积的7倍。

（3）纯化的脂多糖产品的检测：

分别将纯化前的脂多糖与步骤（2）获得的纯化后的脂多糖进行检测：其中蛋白含量依据《中国药典》2010版三部（附录Ⅵ B 第二法）进行；核酸含量依据依据《中国药典》2010版三部（附录Ⅱ A）进行；鉴别试验依据《中国药典》2010版三部（附录Ⅷ C）进行，其结果见表2。

实施例2表明：采用本发明方法获得的脂多糖其蛋白含量和核酸含量均小于1%，与纯化前脂多糖中蛋白含量、核酸含量相比，分别降低了88.5%和98.4%。

实施例3：甲型副伤寒脂多糖的纯化

（1）脂多糖的纯化：

①第一次超滤：

将甲型副伤寒脂多糖用0.02mol/L 氯化钙溶解，离心收集上清液，上清液采用100KD超滤膜，用0.02mol/L 氯化钙溶液超滤，得超滤浓缩液1，超滤时所用的氯化钙溶液体积为上清液体积的20倍体积；

② 疏水层析：

超滤浓缩液1中加入硫酸铵溶液至硫酸铵终浓度为2mol/L，于8℃、4000rpm条件下离心30min，收集上清液；上样于Phenyl Sepharose 6FF low sub疏水层析柱，用混合液2淋洗疏水层析柱，收集疏水层析穿透峰，得疏水层析液，混合液2由磷酸盐和硫酸铵混合而成，混合液2的pH为5.0，混合液2中磷酸盐的终浓度为0.005mol/L，硫酸铵的终浓度为0.5 mol/L；

③ 第二次超滤：

将疏水层析液采用30KD超滤膜，用注射用水超滤得超滤浓缩液2，所述的注射用水的用量为疏水层析液体积的7倍；

④ 离子交换层析：

在超滤浓缩液2中加入Tris-HCl缓冲液至Tris-HCl的终浓度为0.5mol/L得混合液3，混合液3的pH为5.0；将混合液3上样于Capto Q阴离子交换柱，用终浓度为0. 5mol/L，pH为5.0的Tris-HCl缓冲液淋洗阴离子交换层析柱至紫外吸光值不再下降，再用洗脱液洗脱，收集洗脱峰即为目标物溶液，所述的洗脱液由Tris-HCl和磷酸钠混合而成，洗脱液的pH为5.0，洗脱液中Tris-HCl的终浓度为0. 5mol/L，磷酸钠的终浓度为1mol/L；

（2）目标脂多糖峰溶液的浓缩干燥： 

将疏水层析液采用30KD超滤膜，用注射用水超滤浓缩，真空干燥即得纯化的脂多糖，注射用水的用量为目标物溶液体积的5倍。

（3）纯化的脂多糖产品的检测：

分别将纯化前的脂多糖与步骤（2）获得的纯化后的脂多糖进行检测：其中蛋白含量依据《中国药典》2010版三部（附录Ⅵ B 第二法）进行；核酸含量依据依据《中国药典》2010版三部（附录Ⅱ A）进行；鉴别试验依据《中国药典》2010版三部（附录Ⅷ C）进行，其结果见表3。

实施例3表明：采用本发明方法获得的脂多糖其蛋白含量和核酸含量均小于1%，与纯化前脂多糖中蛋白含量、核酸含量相比，分别降低了92.0%和99.0%。

实施例4：甲型副伤寒脂多糖的纯化

（1）脂多糖的纯化：

①第一次超滤：

将甲型副伤寒脂多糖用0.008mol/L 氯化钙溶解，离心收集上清液，上清液采用30KD超滤膜，用0.008mol/L 氯化钙溶液超滤，得超滤浓缩液1，超滤时所用的氯化钙溶液体积为上清液体积的20倍体积；

② 疏水层析：

超滤浓缩液1中加入硫酸铵溶液至硫酸铵终浓度为1.5mol/L，于10℃、6000rpm条件下离心20min，收集上清液；上样于SOURCE 15 PHE疏水层析柱，用混合液2淋洗疏水层析柱，收集疏水层析穿透峰，得疏水层析液，混合液2由磷酸盐和硫酸铵混合而成，混合液2的pH为8.0，混合液2中磷酸盐的终浓度为0.5mol/L，硫酸铵的终浓度为2 mol/L；

③ 第二次超滤：

将疏水层析液采用10KD超滤膜，用注射用水超滤得超滤浓缩液2，所述的注射用水的用量为疏水层析液体积的6倍；

④ 离子交换层析：

在超滤浓缩液2中加入磷酸盐缓冲液至磷酸盐的终浓度为0.5mol/L得混合液4，混合液4的pH为8.0；将混合液4上样于SOURCE 30Q阴离子交换柱，用终浓度为0.5mol/L，pH为8.0的磷酸盐缓冲液淋洗阴离子交换层析柱至紫外吸光值不再下降，再用洗脱液洗脱，收集洗脱峰即为目标物溶液，所述的洗脱液由磷酸盐和氯化钠混合而成，洗脱液的pH为8.0，洗脱液中磷酸盐的终浓度为0. 5mol/L，氯化钠的终浓度为1mol/L；

（2）目标脂多糖峰溶液的浓缩干燥： 

将疏水层析液采用10KD超滤膜，用注射用水超滤浓缩，真空干燥即得纯化的脂多糖，注射用水的用量为目标物溶液体积的4倍。

(3) 纯化的脂多糖产品的检测：

分别将纯化前的脂多糖与步骤（2）获得的纯化后的脂多糖进行检测：其中蛋白含量依据《中国药典》2010版三部（附录Ⅵ B 第二法）进行；核酸含量依据依据《中国药典》2010版三部（附录Ⅱ A）进行；鉴别试验依据《中国药典》2010版三部（附录Ⅷ C）进行，其结果见表4。

实施例4表明：采用本发明方法获得的脂多糖其蛋白含量和核酸含量均小于1%，与纯化前脂多糖中蛋白含量、核酸含量相比，分别降低了88.40%和99.55%。

实施例5：乙型副伤寒脂多糖的纯化

（1）脂多糖的纯化：

① 第一次超滤：

将乙型副伤寒脂多糖用0.01mol/L 氯化钙溶解，离心收集上清液，上清液采用50KD超滤膜，用0.01mol/L 氯化钙溶液超滤，得超滤浓缩液1，超滤时所用的氯化钙溶液体积为上清液体积的15倍体积；

② 疏水层析：

超滤浓缩液1中加入硫酸铵溶液至硫酸铵终浓度为1mol/L，于4℃、3000rpm条件下离心40min，收集上清液；上样于Phenyl Sepharose HP疏水层析柱，用混合液1淋洗疏水层析柱，收集疏水层析穿透峰，得疏水层析液，混合液1由Tris-HCl和硫酸铵混合而成，混合液1的pH为5.0，混合液1中Tris-HCl的终浓度为0.005mol/L，硫酸铵的终浓度为0.5mol/L；

③ 第二次超滤：

将疏水层析液采用10KD超滤膜，用注射用水超滤得超滤浓缩液2，所述的注射用水的用量为疏水层析液体积的3倍；

④ 离子交换层析：

在超滤浓缩液2中加入Tris-HCl缓冲液至Tris-HCl的终浓度为0.005mol/L得混合液3，混合液3的pH为5.0；将混合液3上样于Q Spharose HP阴离子交换柱，用终浓度为0.005mol/L，pH为5.0的Tris-HCl缓冲液淋洗阴离子交换层析柱至紫外吸光值不再下降，再用洗脱液洗脱，收集洗脱峰即为目标物溶液，所述的洗脱液由Tris-HCl和氯化钠混合而成，洗脱液的pH为5.0，洗脱液中Tris-HCl的终浓度为0. 005mol/L，氯化钠的终浓度为0.001 mol/L；

（2）目标脂多糖峰溶液的浓缩干燥： 

将疏水层析液采用10KD超滤膜，用注射用水超滤浓缩，真空干燥即得纯化的脂多糖，注射用水的用量为目标物溶液体积的3倍。

（3）纯化的脂多糖产品的检测：

分别将纯化前的脂多糖与步骤（2）获得的纯化后的脂多糖进行检测：其中蛋白含量依据《中国药典》2010版三部（附录Ⅵ B 第二法）进行；核酸含量依据依据《中国药典》2010版三部（附录Ⅱ A）进行；鉴别试验依据《中国药典》2010版三部（附录Ⅷ C）进行，其结果见表5。

实施例5表明：采用本发明方法获得的脂多糖其蛋白含量和核酸含量均小于1%，与纯化前脂多糖中蛋白含量、核酸含量相比，分别降低了87.7%和99.0%。

实施例6：乙型副伤寒脂多糖的纯化

（1）脂多糖的纯化：

①第一次超滤：

将乙型副伤寒脂多糖用0.5mol/L 氯化钙溶解，离心收集上清液，上清液采用30KD超滤膜，用0.5mol/L 氯化钙溶液超滤，得超滤浓缩液1，超滤时所用的氯化钙溶液体积为上清液体积的20倍体积；

② 疏水层析：

超滤浓缩液1中加入硫酸铵溶液至硫酸铵终浓度为3mol/L，于12℃、8000rpm条件下离心15min，收集上清液；上样于Phenyl Sepharose 6 Fast Flow hight sub疏水层析柱，用混合液2淋洗疏水层析柱，收集疏水层析穿透峰，得疏水层析液，混合液2由磷酸盐和硫酸铵混合而成，混合液2的pH为5.0，混合液2中磷酸盐的终浓度为0.2mol/L，硫酸铵的终浓度为1 mol/L；

③ 第二次超滤：

将疏水层析液采用10KD超滤膜，用注射用水超滤得超滤浓缩液2，所述的注射用水的用量为疏水层析液体积的7倍；

④ 离子交换层析：

在超滤浓缩液2中加入磷酸盐缓冲液至磷酸盐的终浓度为0.005mol/L得混合液4，混合液4的pH为5.0；将混合液4上样于DEAE Sepahrose FF阴离子交换柱，用终浓度为0.005mol/L，pH为5.0的磷酸盐缓冲液淋洗阴离子交换层析柱至紫外吸光值不再下降，再用洗脱液洗脱，收集洗脱峰即为目标物溶液，所述的洗脱液由磷酸盐和磷酸钠混合而成，洗脱液的pH为5.0，洗脱液中磷酸盐的终浓度为0. 005mol/L，磷酸钠的终浓度为0.02mol/L；

（2）目标脂多糖峰溶液的浓缩干燥： 

将疏水层析液采用10KD超滤膜，用注射用水超滤浓缩，真空干燥即得纯化的脂多糖，注射用水的用量为目标物溶液体积的5倍。

（3）纯化的脂多糖产品的检测：

分别将纯化前的脂多糖与步骤（2）获得的纯化后的脂多糖进行检测：其中蛋白含量依据《中国药典》2010版三部（附录Ⅵ B 第二法）进行；核酸含量依据依据《中国药典》2010版三部（附录Ⅱ A）进行；鉴别试验依据《中国药典》2010版三部（附录Ⅷ C）进行，其结果见表6。

实施例6表明：采用本发明方法获得的脂多糖其蛋白含量和核酸含量均小于1%，与纯化前脂多糖中蛋白含量、核酸含量相比，分别降低了93.7%和98.2%。

实施例7：乙型副伤寒脂多糖的制备

（1）脂多糖的纯化：

①第一次超滤：

将乙型副伤寒脂多糖用0.3mol/L 氯化钙溶解，离心收集上清液，上清液采用50KD超滤膜，用0.3mol/L 氯化钙溶液超滤，得超滤浓缩液1，超滤时所用的氯化钙溶液体积为上清液体积的20倍体积；

② 疏水层析：

超滤浓缩液1中加入硫酸铵溶液至硫酸铵终浓度为1.8mol/L，于8℃、5000rpm条件下离心20min，收集上清液；上样于Phenyl Sepharose 6 Fast Flow low sub疏水层析柱，用混合液1淋洗疏水层析柱，收集疏水层析穿透峰，得疏水层析液，混合液1由Tris-HCl和硫酸铵混合而成，混合液1的pH为7.0，混合液1中Tris-HCl的终浓度为0.2mol/L，硫酸铵的终浓度为1.5 mol/L；

③ 第二次超滤：

将疏水层析液采用30KD超滤膜，用注射用水超滤得超滤浓缩液2，所述的注射用水的用量为疏水层析液体积的5倍；

④ 离子交换层析：

在超滤浓缩液2中加入磷酸盐缓冲液至磷酸盐的终浓度为0.1mol/L得混合液4，混合液4的pH为6.0；将混合液4上样于Q Sepharose FF阴离子交换柱，用终浓度为0.1mol/L，pH为6.0的磷酸盐缓冲液淋洗阴离子交换层析柱至紫外吸光值不再下降，再用洗脱液洗脱，收集洗脱峰即为目标物溶液，所述的洗脱液由磷酸盐和乙酸钠混合而成，洗脱液的pH为6.0，洗脱液中磷酸盐的终浓度为0. 1mol/L，乙酸铵的终浓度为1mol/L；

（2）目标脂多糖峰溶液的浓缩干燥： 

将疏水层析液采用10KD超滤膜，用注射用水超滤浓缩，真空干燥即得纯化的脂多糖，注射用水的用量为目标物溶液体积的5倍。

（3）纯化的脂多糖产品的检测：

分别将纯化前的脂多糖与步骤（2）获得的纯化后的脂多糖进行检测：其中蛋白含量依据《中国药典》2010版三部（附录Ⅵ B 第二法）进行；核酸含量依据依据《中国药典》2010版三部（附录Ⅱ A）进行；鉴别试验依据《中国药典》2010版三部（附录Ⅷ C）进行，其结果见表7。

实施例7表明：采用本发明方法获得的脂多糖其蛋白含量和核酸含量均小于1%，与纯化前脂多糖中蛋白含量、核酸含量相比，分别降低了86.2%和99.1%。

实施例1—实施例7表明采用本发明方法获得的脂多糖其蛋白含量和核酸含量均小于1%，与纯化前脂多糖中蛋白含量、核酸含量相比，分别降低了84.4%～93.7%、98.2%～98.8%，表明本发明法的纯化程度效果显著，与现有技术如乙醇分级沉淀等方法只能将LPS的核酸含量控制在5%左右相比，纯化程度提高了80%以上，且克服了酶解和超速离心等方法酶试剂成本高、设备投入成本较高、酶的使用会带来外源因子污染等问题，步骤复杂、处理量少，不利于实现产业化的缺陷和不足。本发明方法与现有技术相比，产生了预料不到的技术效果。       

Claims (4)

1.一种脂多糖的纯化方法，包括以下步骤：

（1）脂多糖的纯化：

①第一次超滤：将脂多糖用0.01～0.5mol/L氯化钙溶液溶解，离心收集上清，上清液采用10～300KD超滤膜，用0.01～0.5mol/L氯化钙溶液超滤得超滤浓缩液1，超滤时所用的氯化钙溶液的体积为上清液体积的10～30倍；

②疏水层析：超滤浓缩液1中加入硫酸铵溶液至硫酸铵终浓度为1～3mol/L，于4～12℃、3000～8000rpm条件下离心15～60min，收集上清液；上样于疏水层析柱，用混合液1或混合液2淋洗疏水层析柱，收集疏水层析穿透峰，得疏水层析液，混合液1由Tris-HCl和硫酸铵混合而成，pH为5.0～8.0，混合液1中Tris-HCl的终浓度为0.005～0.5mol/L，硫酸铵的终浓度为0.5～2.0 mol/L；混合液2由磷酸盐缓冲液和硫酸铵混合而成，pH为5.0~8.0，混合液2中磷酸盐的终浓度为0.005～0.5mol/L，硫酸铵的终浓度为0.5～2.0 mol/L； 

③第二次超滤：将疏水层析液采用10～50KD超滤膜，用注射用水超滤得超滤浓缩液2，所述的注射用水的用量为疏水层析液体积的3～7倍；

④离子交换层析：

在超滤浓缩液2中加入Tris-HCl缓冲液至Tris-HCl的终浓度为0.005～0.5mol/L得混合液3，混合液3的pH为5.0~8.0；将混合液3上样于阴离子交换柱，用终浓度为0.005～0.5mol/L 、pH为5.0~8.0的Tris-HCl缓冲液淋洗阴离子交换层析柱至紫外吸光值不再下降，再用洗脱液洗脱，收集洗脱峰即为目标物溶液，所述的洗脱液由Tris-HCl和盐混合而成，洗脱液的pH为5.0～8.0，洗脱液中Tris-HCl的终浓度为0.005～0.5mol/L、盐的终浓度为0.001~1 mol/L；或在超滤浓缩液2中加入磷酸盐缓冲液至磷酸盐的终浓度为0.005～0.5mol/L得混合液4，混合液4的pH为5.0~8.0，将混合液4上样于阴离子交换柱，用终浓度为0.005～0.5mol/L，pH为5.0~8.0的磷酸盐缓冲液淋洗阴离子交换层析柱至紫外吸光值不再下降，再用洗脱液洗脱，收集洗脱峰即为目标物溶液，所述的洗脱液由磷酸盐和盐混合而成，洗脱液的pH为5.0~8.0，洗脱液中磷酸盐的终浓度为0.005～0.5mol/L、盐的终浓度为0.001~1 mol/L；所述的洗脱液中的盐为氯化钠或乙酸钠；

（2）目标物溶液的浓缩干燥：将目标物溶液采用10～50KD超滤膜，用注射用水超滤缩液，真空干燥即得纯化的脂多糖，注射用水的用量为目标物溶液体积的3～7倍。

2.根据权利要求1所述的脂多糖的纯化方法，其特征是：步骤（1）②中所述的疏水层析柱所用的疏水填料为Phenyl Sepharose HP、Phenyl Sepahrose 6 Fast Flow high sub、Phenyl Sepahrose 6 Fast Flow low sub或SOURCE 15 PHE。

3.根据权利要求1所述的脂多糖的纯化方法，其特征是：步骤（1）④中所述的阴离子交换层析柱所用的填料为DEAE Sepharose FF、Q-SepharoseFF 、Q Sepharose HP、SOURCE 30Q、或Capto Q。

4.根据权利要求1至3中任一权利要求所述的脂多糖的纯化方法，其特征是：步骤（1）①第一次超滤所述的将脂多糖用0.01～0.5mol/L氯化钙溶液溶解，所述的脂多糖为甲型副伤寒脂多糖或乙型副伤寒脂多糖。