CN104558225B - 一种针对肠道细菌的荚膜多糖提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种针对肠道细菌的荚膜多糖提取方法。该方法主要通过对肠道细菌发酵液两次使用阳离子去垢剂的浓度和两次使用盐浓度的差异，对阳离子去垢剂的浓度采用先低后高进行调控，同时配合使用先高后低的盐浓度对提取多糖进行控制，有效去除了菌体残留的核酸、蛋白、内毒素等杂质，获得的针对肠道细菌的荚膜多糖不仅符合《中国药典》(2010版)要求，并在内毒素含量指标优于《中国药典》(2010版)要求。本发明简化了工序，步骤简单、快捷、环保、易操作、易产业化、成本低，制成的针对肠道细菌的荚膜多糖适用于制备伤寒Vi多糖、副溶血性弧菌荚膜多糖等针对肠道细菌的荚膜多糖的参比品、标准品、多糖疫苗及多糖蛋白结合疫苗的原材料。
Description
技术领域
本发明属于生物制药技术领域，具体为一种针对肠道细菌的荚膜多糖提取的方法。
背景技术
伤寒是由肠道病原体伤寒杆菌引发的严重全身性感染，其传染性强、病程长、易复发、并发症多，是严重影响人类健康的常见肠道传染病，据WHO的保守估计，全球每年发生2100万伤寒病例，其中有1％-4％的病例死亡。病例主要集中在发展中国家，尤其亚洲。中国1990年以后，平均发病率在4.08-10.45万/10万之间，每年报告病例5.1-12万例，近年来多重耐药菌株的出现，使伤寒的抗生素治疗方法日益复杂，因此研究和使用疫苗无疑是预防伤寒疾病的有效手段。
之前虽然有伤寒灭活全菌体疫苗，但由于全菌体疫苗的菌体成分复杂，易产生不良反应。现已有两种新一代的伤寒疫苗：口服Ty21a活疫苗和注射用伤寒Vi多糖疫苗。伤寒Vi多糖疫苗于1994年在美国首先获得上市许可，因其含有纯化的伤寒杆菌Ty2株Vi荚膜多糖，可引起T细胞非依赖性IgG为主的免疫应答，具有预防伤寒的作用。
副溶血性弧菌是一种嗜盐性革兰氏阴性细菌,存在于近海岸的海水、海底沉积物及鱼类和贝类海产品中。人类进食该菌可能引起食物中毒，临床上以腹痛呕吐腹泻及水样便为主，严重者可引起败血症。
对于肠道细菌的荚膜多糖提取的方法，传统上主要是通过苯酚重复抽提去除菌体蛋白质、乙醇沉淀去除菌体残留核酸等。其过程需要使用大量的苯酚，经超滤或透析去除残余苯酚，而且苯酚对人体有伤害，使用后的废液对环境有污染。因此，寻找新的纯化工艺，提高产品的质量是生物制药领域未来不断的发展方向，据第十届中国药典委员会细菌制品专业委员2012年第三次会议内容，2015年修订版《中国药典》将新增订伤寒Vi多糖疫苗原的内毒素标准和成品O-乙酰基含量检定项。本发明本着国家及国际社会对生物制品的质量指标不断提高的要求，在分析伤寒Vi多糖疫苗传统制备工艺技术的基础上，探索出放弃使用苯酚抽提的新技术。
发明内容
本发明的目的是提供一种操作更简单、易于产业化、环保，能避免对操作人员的伤害、能快速提取高质量的针对肠道细菌的荚膜多糖的方法。
为达到本发明目的，本发明通过以下技术方案实现：
一种针对肠道细菌的荚膜多糖提取方法，包括以下步骤：
(1)在肠道致病细菌发酵培养液中加入甲醛杀菌，离心去除菌体沉淀，收集培养液上清；甲醛的加入量为：每升发酵培养液加入5～20毫升浓度为37％(ml/ml)的甲醛溶液；
(2)培养液上清中加入阳离子去垢剂，于20～25℃静置沉淀3～24h，离心收集沉淀，阳离子去垢剂的加入量为：每升培养液上清加入0.5～5克阳离子去垢剂；
(3)沉淀用浓度为0.7～1.5mol/L的盐解离；
(4)解离液用50-300KD的超滤膜或用中空纤维滤膜超滤得超滤液Ⅰ，超滤所用的注射用水的体积为解离液体积的5～10倍；或解离液用透析袋透析得透析液Ⅰ；或解离液用凝胶过滤层析得层析液Ⅰ；
(5)调节超滤液Ⅰ或透析液Ⅰ或层析液Ⅰ的pH值为6.5-8.0后，在超滤液Ⅰ或透析液Ⅰ或层析液中加入阳离子去垢剂，放置3～24小时，离心收集沉淀；阳离子去垢剂的加入量为：每升超滤液Ⅰ或每升透析液Ⅰ或每升层析液Ⅰ分别加入10～60克阳离子去垢剂，
(6)沉淀用pH值为6.0-7.5且浓度为0.1～0.5mol/L的盐解离，离心后收集上清液；
(7)上清液用50-300KD超滤膜或用中空纤维滤膜超滤得超滤液Ⅱ，超滤所用的注射用水的体积为上清液体积的3～10倍；或上清液用透析袋透析得透析液Ⅱ；或上清液用凝胶过滤层析得层析液Ⅱ；
(8)真空冷冻干燥超滤液Ⅱ或透析液Ⅱ或层析液Ⅱ后即为提取的肠道致病细菌的荚膜多糖。
步骤(2)和(5)中所述的阳离子去垢剂包括但不限于十六烷基三甲基溴化铵、十四烷基三甲基溴化铵、十四烷基二甲基苄基氯化铵或十二烷基二甲基苄基氯化铵。
步骤(3)和(6)中解离所用的盐包括但不限于KCl、NaCl、CaCl2、MgCl2或Al(OH)3。
步骤(1)所述的肠道致病细菌包括但不限于伤寒沙门氏菌，或副溶血性弧菌。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明通过两次使用阳离子去垢剂的浓度和两次使用盐浓度的差异，对阳离子去垢剂的浓度采用先低后高进行调控，同时配合使用先高后低的盐浓度对提取多糖进行控制，有效去除了菌体残留的核酸、蛋白、内毒素等杂质，最终所获得的针对肠道细菌的荚膜多糖不仅符合《中国药典》(2010版)的要求，并且内毒素含量指标优于采用《中国药典》(2010版)中伤寒Vi多糖疫苗按现有传统工艺提取的伤寒Vi多糖的质量指标要求。
2、本发明方法不仅能去除伤寒Vi多糖、副溶血性弧菌荚膜多糖等针对肠道细菌的荚膜多糖中的蛋白、核酸，且提取的荚膜多糖中内毒素杂质含量指标比现有传统工艺提取的效果更优，与现有传统工艺相比，其多糖中内毒素含量能控制在4Eu/μg或以下。制得的伤寒Vi多糖、副溶血性弧菌荚膜多糖等针对肠道细菌的荚膜多糖适用于制备伤寒Vi多糖、副溶血性弧菌荚膜多糖等针对肠道细菌的荚膜多糖的参比品、标准品、制备伤寒Vi多糖疫苗、伤寒Vi多糖蛋白结合疫苗、副溶血性弧菌荚膜多糖疫苗，副溶血性弧菌荚膜多糖蛋白结合疫苗等针对肠道细菌的荚膜多糖疫苗及多糖蛋白结合疫苗的原材料。
3、本发明方法生产的荚膜多糖质量优、产量高，简化了《中国药典》(2010版)现有传统工艺中制备伤寒Vi多糖的工艺流程，工序简化，减少操作环节及时间，步骤简单易行，所需试剂及材料经济，成本低廉，提取效果好，易于产业化，平均每升发酵液的伤寒Vi多糖产量提高约14.75mg/L，。
4、本发明方法环保，无苯酚的使用，避免对操作人员的伤害和环境的污染，表明本发明新工艺具有明显的优势，更符合国家未来不断提高质量标准的要求。
具体实施方式
提供以下实施例，对本发明说明解释而非限制本发明。以下各实施例无特殊说明为常规方法。以下各实施例所使用的菌株均为市售，所使用的菌株发酵液均按常规方法制备。
主要实验仪器设备：
CR21G日立离心机，DJ-1磁力搅拌器，PALL超滤系统，SARTORIUS PP-15-P11PH计，ZG60-600蠕动泵，LABCONCO 4.5Freeze冷冻干燥系统。
实施例1
批号为20140201，20140202的伤寒沙门氏菌发酵液中沙门氏菌购自中国食品药品检定研究院的中国医学细菌保藏管理中心。对批号为20140201，20140202的伤寒沙门氏菌发酵液均按《中国药典》(2010版)相同工艺参数制备。
提取批号为20140201，20140202的伤寒沙门氏菌发酵液的伤寒Vi多糖的步骤及结果如下：
(1)在伤寒沙门氏菌发酵液中加入浓度为37％(ml/ml)的甲醛溶液杀菌，于8000r/min、8℃条件下离心20min去除菌体沉淀，收集培养液上清；甲醛的加入量为：每升伤寒沙门氏菌发酵液加入5毫升浓度为37％(ml/ml)的甲醛溶液；
(2)培养液上清中加入十六烷基三甲基溴化铵，于20℃静置沉淀3h，于8000r/min、8℃条件下离心30min，收集沉淀，十六烷基三甲基溴化铵的加入量为：每升培养液上清加入0.5克十六烷基三甲基溴化铵；
(3)沉淀用浓度为0.7mol/L的NaCl解离；
(4)解离液用50KD的超滤膜超滤得超滤液Ⅰ，超滤所用的注射用水的体
积为解离液体积的5倍；
(5)用浓度为5％(g/ml)的碳酸氢钠溶液调节超滤液Ⅰ的pH值为6.5后，加入十六烷基三甲基溴化铵，放置3小时，于10000r/min、23℃条件下离心30min，收集沉淀；十六烷基三甲基溴化铵的加入量为：每升超滤液Ⅰ加入10克十六烷基三甲基溴化铵；
(6)沉淀用pH值为6.0且浓度为0.1mol/L的氯化钙溶液充分溶解，于10000r/min、2～8℃条件下离心45min，后收集上清液；
(7)上清液用50KD超滤膜超滤得超滤液Ⅱ，超滤所用的注射用水的体积为上清液体积的3倍；
(8)-40℃条件下真空冷冻干燥超滤液Ⅱ后即为提取的伤寒Vi多糖。
结果如下：
表1实例1提取的伤寒Vi多糖检测指标
备注：收率＝精糖收获质量(mg)/发酵液体积(L)
表1表明：按实施例1方法进行提取，每升伤寒沙门氏菌发酵液中可获得伤寒Vi多糖36～37mg，提取后的伤寒Vi多糖中蛋白、核酸、O-乙酰基、多糖分子大小几项指标均符合《中国药典》(2010版)规定；且作为内毒素仅为2Eu/μg的伤寒Vi多糖，安全性得到保证。
实施例2
批号为20140303，20140304的伤寒沙门氏菌发酵液中沙门氏菌购自中国食品药品检定研究院的中国医学细菌保藏管理中心。对批号为20140303，20140304的伤寒沙门氏菌发酵液均按《中国药典》(2010版)相同工艺参数制备。
提取批号为20140303，20140304的伤寒沙门氏菌发酵液的伤寒Vi多糖的步骤及结果如下：
(1)在伤寒沙门氏菌发酵液中加入浓度为37％(ml/ml)的甲醛溶液杀菌，于8000r/min、8℃条件下离心20min去除菌体沉淀，收集培养液上清；甲醛的加入量为：每升伤寒沙门氏菌发酵液加入20毫升浓度为37％(ml/ml)的甲醛溶液；
(2)培养液上清中加入十四烷基三甲基溴化铵，于25℃静置沉淀24h，于8000r/min、8℃条件下离心30min，收集沉淀，十四烷基三甲基溴化铵的加入量为：每升培养液上清加入5克十四烷基三甲基溴化铵；
(3)沉淀用浓度为1.5mol/L的氯化钠充分溶解；
(4)解离液用300KD的超滤膜超滤得超滤液Ⅰ，超滤所用的注射用水的体积为解离液体积的10倍；
(5)用浓度为5％(g/ml)的碳酸氢钠溶液调节超滤液Ⅰ的pH至8.0后，加入十四烷基三甲基溴化铵，放置24小时，于10000r/min、23℃条件下离心30min，收集沉淀；十四烷基三甲基溴化铵的加入量为：每升超滤液加入60克十四烷基三甲基溴化铵；
(6)沉淀用pH值为7.5且浓度为0.5mol/L的氯化钙充分溶解，于10000r/min、2～8℃条件下离心45min，后收集上清液；
(7)上清液用300KD中空纤维滤膜超滤得超滤液Ⅱ,超滤所用的注射用水的体积为上清液体积的10倍；
(8)-40℃条件下真空冷冻干燥超滤液Ⅱ后即为提取的伤寒Vi多糖。
结果如下：
表2实施例2提取的伤寒Vi多糖检测指标
备注：收率＝精糖收获质量(mg)/发酵液体积(L)
表2表明：按实施例2方法进行提取，每升伤寒沙门氏菌发酵液中可获得伤寒Vi多糖27～28mg，提取后的伤寒Vi多糖中蛋白、核酸、O-乙酰基、多糖分子大小几项指标均符合《中国药典》(2010版)规定；且作为内毒素仅为4Eu/μg的伤寒Vi多糖，安全性得到保证。
实施例3(对比试验)
为了更好的阐述本发明，分别对20140305,20140306,20140407，20140408四个批次的伤寒沙门氏菌发酵进行提取，每个批次的发酵液平均分成-1，-2两份，以便进行更好的对比。20140305,20140306,20140407，20140408四个批次的伤寒沙门氏菌发酵中沙门氏菌购自中国食品药品检定研究院的中国医学细菌保藏管理中心。对批号为20140305,20140306,20140407，20140408四个批次的伤寒沙门氏菌发酵液均按《中国药典》(2010版)相同工艺参数制备。
-1批用本发明方法，按如下步骤进行提取，分别制备了20140305-1,20140306-1，20140407-1,20140408-1，共4个批次。
(1)在伤寒沙门氏菌发酵液中加入浓度为37％(ml/ml)的甲醛溶液杀菌，
于8000r/min、8℃条件下离心20min去除菌体沉淀，收集培养液上清；甲醛
的加入量为：每升伤寒沙门氏菌发酵液加入10毫升浓度为37％(ml/ml)的
甲醛溶液；
(2)培养液上清中加入十四烷基二甲基苄基氯化铵，于23℃静置沉淀8h，于8000r/min、8℃条件下离心30min，收集沉淀物，十四烷基二甲基苄基氯化铵的加入量为：每升培养液上清加入2克十四烷基二甲基苄基氯化铵；
(3)沉淀用0.9mol/L氯化钾充分溶解；
(4)解离液用透析袋透析得透析液Ⅰ；
(5)用浓度为5％(g/ml)的碳酸氢钠溶液调节透析液Ⅰ的pH值为6.5后，加入十八烷基三甲基溴化铵，放置8小时，于10000r/min、23℃条件下离心30min，收集沉淀；十八烷基三甲基溴化铵的加入量为：每升透析液Ⅰ加入20克十八烷基三甲基溴化铵；
(6)沉淀用pH值为7.2且浓度为0.35mol/L的氯化镁溶液充分溶解，于10000r/min、2～8℃条件下离心45min，后收集上清液；
(7)上清液用凝胶过滤层析得层析液Ⅱ；
(8)-40℃条件下真空冷冻干燥层析液Ⅱ后即为提取的伤寒Vi多糖。
表3实施例3四个批次中-1批提取的伤寒Vi多检测指标
备注：收率＝精糖收获质量(mg)/发酵液体积(L)
表3表明：按实例3方法进行提取，每升伤寒沙门氏菌发酵液中可获得伤寒Vi多糖35～37mg，提取后的伤寒Vi多糖中蛋白、核酸、O-乙酰基、多糖分子大小几项指标均符合《中国药典》(2010版)规定；且作为内毒素仅小于等于4Eu/μg的伤寒Vi多糖，安全性得到保证。
-2批按《中国药典》(2010版)第32页2.2.5步骤进行提取，制备了20120305-2,20120306-2，20120407-2,20120408-2，共4个批次，其结果如下：
表4实施例3四个批次中-2批提取的伤寒Vi多糖检测指标
备注：收率＝精糖收获质量(mg)/发酵液体积(L)
表4表明：按照《中国药典》(2010版)步骤进行提取，每升伤寒沙门氏菌发酵液可获得伤寒Vi多糖20～22mg，提取后的伤寒Vi多糖中蛋白、核酸、O-乙酰基、多糖分子量大小、鉴别等指标均符合药典规定，但内毒素指标为20～40Eu/μg,相较于-1批指标高18-36Eu/μg。
实施例4
批号为20140501的副溶血性弧菌发酵液中副溶血性弧菌购自中国食品药品检定研究院的中国医学细菌保藏管理中心。对批号为20140501的副溶血性弧菌发酵液按《中国药典》(2010版)工艺参数制备。
提取批号为20140501的副溶血性弧菌发酵液的荚膜多糖的步骤及结果如下：
(1)在副溶血性弧菌发酵液中加入浓度为37％(ml/ml)的甲醛溶液杀菌，于8000r/min、8℃条件下离心20min去除菌体沉淀，收集培养液上清；甲醛的加入量为：每升副溶血性弧菌发酵液加入15毫升浓度为37％(ml/ml)的甲醛溶液；
(2)培养液上清中加入十六烷基三甲基溴化铵，于20℃静置沉淀6h，于8000r/min、8℃条件下离心30min，收集沉淀，十六烷基三甲基溴化铵的加入量为：每升培养液上清加入1克十六烷基三甲基溴化铵；
(3)沉淀用浓度为1mol/L的NaCl解离；
(4)解离液用100KD的中空纤维滤膜超滤得超滤液Ⅰ，超滤所用的注射用水的体积为解离液体积的6倍；
(5)用浓度为5％(g/ml)的碳酸氢钠溶液调节得超滤液Ⅰ的pH值为7.5后，加入十四烷基二甲基苄基氯化铵，放置3小时，于10000r/min、23℃条件下离心30min，收集沉淀；十四烷基二甲基苄基氯化铵的加入量为：每升超滤液加入40克十四烷基二甲基苄基氯化铵；
(6)沉淀用pH值为6.8且浓度为0.25mol/L的氢氧化铝溶液充分溶解，于10000r/min、2～8℃条件下离心45min，后收集上清液；
(7)上清液用100KD超滤膜超滤得超滤液Ⅱ，超滤所用的注射用水的体积为上清液体积的8倍；
(8)-40℃条件下真空冷冻干燥超滤液Ⅱ后即为提取的副溶血性弧菌荚膜多糖。
结果如下：
表5实施例4提取的副溶血性弧菌荚膜多糖检测指标
备注：收率＝精糖收获质量(mg)/发酵液体积(L)
表5表明：按实施例4方法进行提取，每升副溶血性弧菌发酵液中可获得副溶血性弧菌荚膜多糖31mg，提取后的副溶血性弧菌荚膜多糖中蛋白、核酸指标均在1％以内，且内毒素为4Eu/μg的副溶血性弧菌荚膜，安全性得到保证。
实施例5
批号为20140602的副溶血性弧菌发酵液中副溶血性弧菌购自中国食品药品检定研究院的中国医学细菌保藏管理中心。对批号为20140602的副溶血性弧菌发酵液的制备与实施例4相同。
提取批号为20140602的副溶血性弧菌发酵液的荚膜多糖的步骤及结果如下：
(1)在副溶血性弧菌发酵液中加入浓度为37％(ml/ml)的甲醛溶液杀菌，于8000r/min、8℃条件下离心20min去除菌体沉淀，收集培养液上清；甲醛的加入量为：每升副溶血性弧菌发酵液加入18毫升甲醛浓度为37％(ml/ml)的甲醛溶液；
(2)培养液上清中加入十四烷基二甲基苄基氯化铵，于20℃静置沉淀6h，于8000r/min、8℃条件下离心30min，收集沉淀，十四烷基二甲基苄基氯化铵的加入量为：每升培养液上清加入3克十四烷基二甲基苄基氯化铵；
(3)沉淀用浓度为1.2mol/L的CaCl2解离；
(4)解离液用凝胶过滤层析得层析液Ⅰ；
(5)用浓度为5％(g/ml)碳酸氢钠溶液调节得层析液Ⅰ的pH值为8.0后，加入十二烷基二甲基苄基氯化铵，放置10小时，于10000r/min、23℃条件下离心30min，收集沉淀；十二烷基二甲基苄基氯化铵的加入量为：每升超滤液加入50克十二烷基二甲基苄基氯化铵；
(6)沉淀用pH值为7.2且浓度为0.4mol/L的氯化镁溶液充分溶解，于10000r/min、2～8℃条件下离心45min，后收集上清液；
(7)上清液用透析袋透析得透析液Ⅱ；
(8)-40℃条件下真空冷冻干燥透析液Ⅱ后即为提取的副溶血性弧菌荚膜多糖。
结果如下：
表6实施例5提取的副溶血性弧菌荚膜多糖检测指标
备注：收率＝精糖收获质量(mg)/发酵液体积(L)
表6表明：按实施例5方法进行提取，每升副溶血性弧菌发酵液中可获得副溶血性弧菌荚膜多糖35mg，提取后的副溶血性弧菌荚膜多糖中蛋白、核酸指标均在1％以内，且内毒素为4Eu/μg的副溶血性弧菌荚膜，安全性得到保证。
上述实施例表明：
1、本发明方法及传统工艺都符合中国国家药典要求。
2、由表3和表4的各项结果的数据来看，表3中的内毒素、收量两项指标是明显优于表4：表3中内毒素平均含量为3Eu/μg，表4中内毒素的平均含量为30Eu/μg，前者仅为后者的10％；表3中伤寒Vi多糖平均收量为35.75mg/L，表4中伤寒Vi多糖平均收量为21mg/L，前者比后者多14.75mg/L。表明本发明方法提取的荚膜多糖质量优于现有传统荚膜多糖工艺，质量更好。
3、本发明方法更符合国家未来不断提高质量标准的要求。且本发明方法操作步骤简单，无苯酚的使用，环保，表明新工艺具有明显的优势。
Claims (5)
1.一种针对肠道细菌的荚膜多糖提取方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)在肠道致病细菌发酵培养液中加入甲醛杀菌，离心去除菌体沉淀，收集培养液上清；甲醛的加入量为：每升发酵培养液加入5～20毫升浓度为37％V/V的甲醛溶液；
(2)培养液上清中加入阳离子去垢剂，于20～25℃静置沉淀3～24h，离心收集沉淀，阳离子去垢剂的加入量为：每升培养液上清加入0.5～5克阳离子去垢剂；
(3)沉淀用浓度为0.7～1.5mol/L的盐解离；
(4)解离液用50-300KD的超滤膜超滤得超滤液Ⅰ，超滤所用的注射用水的体积为解离液体积的5～10倍；或解离液用透析袋透析得透析液Ⅰ；或解离液用凝胶过滤层析得层析液Ⅰ；
(5)调节超滤液Ⅰ或透析液Ⅰ或层析液Ⅰ的pH值为6.5-8.0后，在超滤液Ⅰ或透析液Ⅰ或层析液Ⅰ中加入阳离子去垢剂，放置3～24小时，离心收集沉淀；阳离子去垢剂的加入量为：每升超滤液Ⅰ或每升透析液Ⅰ或每升层析液Ⅰ分别加入10～60克阳离子去垢剂，
(6)沉淀用pH值为6.0-7.5且浓度为0.1～0.5mol/L的盐解离，离心后收集上清液；
(7)上清液用50-300KD超滤膜超滤得超滤液Ⅱ，超滤所用的注射用水的体积为上清液体积的3～10倍；或上清液用透析袋透析得透析液Ⅱ；或上清液用凝胶过滤层析得层析液Ⅱ；
(8)真空冷冻干燥超滤液Ⅱ或透析液Ⅱ或层析液Ⅱ后即为针对肠道细菌的的荚膜多糖。
2.根据权利要求1所述的针对肠道细菌的荚膜多糖提取方法，其特征在于：步骤(2)和(5)中所述的阳离子去垢剂包括但不限于十六烷基三甲基溴化铵、十四烷基三甲基溴化铵、十四烷基二甲基苄基氯化铵或十二烷基二甲基苄基氯化铵。
3.根据权利要求1或2所述的针对肠道细菌的荚膜多糖提取方法，其特征在于：步骤(3)和(6)中解离所用的盐包括但不限于KCl、NaCl、CaCl2或MgCl2。
4.根据权利要求1或2所述的针对肠道细菌的荚膜多糖提取方法，其特征在于：步骤(1)所述的肠道致病细菌包括但不限于伤寒沙门氏菌或副溶血性弧菌。
5.根据权利要求3所述的针对肠道细菌的荚膜多糖提取方法，其特征在于：步骤(1)所述的肠道致病细菌包括但不限于伤寒沙门氏菌或副溶血性弧菌。
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| CN201410764203.8A CN104558225B (zh) | 2014-12-11 | 2014-12-11 | 一种针对肠道细菌的荚膜多糖提取方法 |
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