CN103721249B - 一种流脑疫苗及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种流脑疫苗。该流脑疫苗由A群脑膜炎奈瑟氏球菌（Neisseria meningitidis）发酵得到的多糖、C群脑膜炎奈瑟氏球菌发酵得到的多糖、Y群脑膜炎奈瑟氏球菌发酵得到的多糖和W135群脑膜炎奈瑟氏球菌发酵得到的多糖、乳糖和水组成。实验证明，本发明方法制备的多糖中内毒素含量非常低，为1EU/μg，由该多糖制成的疫苗中内毒素含量非常低，为1EU/μg。本发明的疫苗安全、有效，接种后不良反应更小，利于受众接纳，有利于国家预防免疫政策推广。
Description
技术领域
本发明涉及一种四价流脑多糖疫苗及其制备方法及工艺。
背景技术
流行性脑脊髓膜炎，是由脑膜炎双球菌感染脑膜或者脑脊髓膜引起的呼吸道传染病，临床表现主要有高烧、头痛、喷射状呕吐、脖子发硬。也可引起败血症，皮肤出现紫色淤血、瘀斑，脑膜炎会引起脑部损伤而遗留听力下降或耳聋、智力低下等后遗症。病死率在5%～10%。流脑冬春季节病例高发，一般11～12月份病例开始增多，第二年的2～5月份为发病高峰期。该病是发病率高，危险性大，是严重危害儿童健康的传染病。流行性脑脊髓膜炎（流脑）和败血症是由多种血清群的脑膜炎奈瑟菌引起的，本病在全球呈地方性流行，主要由A群、B群或C群脑膜炎球菌引起，但Y群也变得越来越重要，至少在美国部分地区如此。A群脑膜炎球菌是较大流行的主要致病血清群，特别是在所谓的非洲“流脑流行带”，每隔7～14年就会出现一次较大流行，引起儿童和年轻成人超额发病率与死亡率。近年来，这些地区及沙特阿拉伯也出现过W135群导致的流脑爆发，一些西方国家则出现过C群引起的流脑爆发。即使是在医疗条件比较完善的地方，流脑病死率仍然很高（5%～15%）。一般来说，仅靠药物预防措施来控制此病是不够的。
目前主要采取注射流脑疫苗的方式来预防流行性脑脊髓膜炎。我国主要接种A群脑膜炎多糖疫苗和/或AC群脑膜炎多糖疫苗为主，研制多价疫苗和联合疫苗是疫苗发展方向，但是疫苗中的非主要成分的叠加又会带来副反应大的问题，如何有效去除细菌内毒素是其中最为突出的难题。细菌内毒素是革兰氏阴性杆菌的细胞壁成分之一，是一种脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），LPS是脑膜炎球菌感染的主要致病物质，进入人体能引起机体发热，又称为热原质。按照现有的脑膜炎多糖疫苗的细菌内毒素药典标准，大部分人接种疫苗只有非常轻微的发热反应，但是个别人会因此出现严重发热反应。因此，去除流脑多糖中的细菌内毒素，减少疫苗不良反应，是研制多价疫苗和联合疫苗，提高疫苗品质的关键技术。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种四价流脑疫苗及其制备方法和工艺。
本发明所提供的流脑疫苗，由A群脑膜炎奈瑟氏球菌（Neisseria meningitidis）发酵得到的多糖、C群脑膜炎奈瑟氏球菌发酵得到的多糖、Y群脑膜炎奈瑟氏球菌发酵得到的多糖和W135群脑膜炎奈瑟氏球菌发酵得到的多糖、乳糖和水组成；
其中，A群脑膜炎奈瑟氏球菌发酵得到的多糖在疫苗中的浓度为70μg/ml～130μg/ml，C群脑膜炎奈瑟氏球菌发酵得到的多糖在疫苗中的浓度为70μg/ml～130μg/ml，Y群脑膜炎奈瑟氏球菌发酵得到的多糖在疫苗中的浓度为70μg/ml～130μg/ml，W135群脑膜炎奈瑟氏球菌发酵得到的多糖在疫苗中的浓度为70μg/ml～130μg/ml，乳糖在疫苗中的浓度为5mg/ml～10mg/ml。
上述流脑疫苗可按照如下方法制备。
本发明所提供的流脑疫苗的制备方法，包括如下步骤：
（1）分别发酵A群脑膜炎奈瑟氏球菌、C群脑膜炎奈瑟氏球菌、Y群脑膜炎奈瑟氏球菌和W135群脑膜炎奈瑟氏球菌，得到的发酵液依次记作A菌发酵液、C菌发酵液、Y菌发酵液、W135菌发酵液；
（2）分别从A菌发酵液、C菌发酵液、Y菌发酵液、W135菌发酵液中分离多糖，将得到的多糖依次记作A多糖、C多糖、Y多糖、W135多糖；
（3）将A多糖、C多糖、Y多糖、W135多糖分别用QSepharoseFF琼脂糖凝胶进行柱层析，收集洗脱峰，即分别得到由A群脑膜炎奈瑟氏球菌发酵得到的多糖、C群脑膜炎奈瑟氏球菌发酵得到的多糖、Y群脑膜炎奈瑟氏球菌发酵得到的多糖和W135群脑膜炎奈瑟氏球菌发酵得到的多糖；
（4）将由A群脑膜炎奈瑟氏球菌发酵得到的多糖、C群脑膜炎奈瑟氏球菌发酵得到的多糖、Y群脑膜炎奈瑟氏球菌发酵得到的多糖和W135群脑膜炎奈瑟氏球菌发酵得到的多糖、乳糖和水按照权利要求1中所述浓度进行混合，即得到流脑疫苗。
上述制备方法中，所述步骤（3）中，用QSepharoseFF琼脂糖凝胶进行柱层析的方法中，上样的样品为分别将步骤（2）得到的A多糖、C多糖、Y多糖、W135多糖分别用水溶解后得到的多糖浓度为10～20mg/ml的溶液，洗脱液为生理盐水，监测波长为206nm，收集第一峰。
上述制备方法中，在所述柱层析之后，还包括如下超滤脱盐步骤：将柱层析收集的样品用截留分子量为100kD的膜包，用10～20倍体积水进行洗滤脱盐。
上述制备方法中，在所述超滤脱盐步骤之后，还包括如下除菌步骤：将脱盐样品用0.2μm孔径膜进行除菌过滤。
上述制备方法中，所述步骤（2）中，从发酵液中分离多糖的方法包括如下步骤：
1）分别去除A菌发酵液、C菌发酵液、Y菌发酵液和W135菌发酵液中的菌体；
2）为如下a）和/或b）：
a）、用十六烷基三甲基溴化铵分别沉淀去除菌体的A菌发酵液或去除菌体的C菌发酵液中的多糖，分别收集沉淀；
b）、先用截留分子量为30kD的超滤膜分别对去除菌体的Y菌发酵液或去除菌体的W135菌发酵液进行超滤浓缩，得到Y菌浓缩液或W135菌浓缩液；再用十六烷基三甲基溴化铵分别沉淀Y菌浓缩液或W135菌浓缩液中的多糖，分别收集沉淀；
3）、用氯化钙分别将步骤2）所得沉淀中的多糖与十六烷基三甲基溴化铵解离，得到解离液；
4）、用95%乙醇水溶液分别去除步骤3）的解离液中的杂质，收集上清液；
5）、用95%乙醇水溶液分别从步骤4）的上清液中沉淀多糖，收集沉淀；
6）、依次用无水乙醇和丙酮分别洗涤步骤5）所得沉淀；
7）、分别将步骤6）洗涤后沉淀进行干燥；
8）、将步骤7）所得干燥后沉淀用1:10饱和中性醋酸钠水溶液溶解，分别得到粗糖溶液，依次记作A菌粗糖溶液、C菌粗糖溶液、Y菌粗糖溶液、W135菌粗糖溶液；
9）、用酚分别对步骤8）所得粗糖溶液进行提取，弃去中层及酚层，收集上层液；
10）、用氯化钙水溶液分别对步骤9）所得上层液进行透析，收集透析后的溶液；
11）、用95%乙醇水溶液分别对步骤10）所得透析后的溶液进行沉淀，收集沉淀；
12）、依次用无水乙醇和丙酮分别洗涤步骤11）所得沉淀；
13）、分别将步骤12）洗涤后沉淀进行干燥，分别得到A多糖、C多糖、Y多糖、W135多糖。
上述制备方法中，所述步骤2）的a）中，用十六烷基三甲基溴化铵分别沉淀去除菌体A菌发酵液或去除菌体C菌发酵液中多糖的方法包括如下步骤：分别向所述去除菌体的A菌发酵液或去除菌体的C菌发酵液中加入十六烷基三甲基溴化铵水溶液，使十六烷基三甲基溴化铵在混合液中的浓度为0.1%～0.3%（质量百分含量），在温度为10～15℃的条件下搅拌反应0.5～1小时，再静置10～16小时，离心，收集沉淀；
上述制备方法中，所述步骤2）的b）中，用十六烷基三甲基溴化铵分别沉淀Y菌浓缩液或W135菌浓缩液中的多糖的方法包括如下步骤：分别向所述Y菌浓缩液或W135菌浓缩液中加入十六烷基三甲基溴化铵水溶液，使十六烷基三甲基溴化铵在混合溶液中的浓度为0.1%～0.3%（质量百分含量），在温度为10～15℃的条件下搅拌反应0.5～1小时，再静置10～16小时，离心，收集沉淀；
上述制备方法中，所述步骤3）中，用氯化钙解离的方法包括如下步骤：向所述沉淀中加入2mol/L氯化钙水溶液，2mol/L氯化钙水溶液与所述沉淀的配比为3～10ml：1g，再加入水，使氯化钙在体系中的最终浓度为1mol/L，搅拌1～3小时，使多糖与十六烷基三甲基溴化铵解离；
上述制备方法中，所述步骤4）中，用95%乙醇水溶液分别去除步骤3）的解离液中的杂质的方法包括如下步骤：分别向解离液中加入95%乙醇水溶液，使乙醇在混合液中的体积百分比为25%，混匀，在2～8℃静置1～3小时，离心去沉淀，收集上清液；
上述制备方法中，所述步骤5）中，用95%乙醇水溶液分别从步骤4）的上清液中沉淀多糖的方法包括如下步骤：向上清液中加入95%乙醇水溶液，至乙醇在混合液中的体积百分比为80%，混匀，在2～8℃条件下静置8～16小时，离心去上清，收集沉淀；
上述制备方法中，所述步骤8）中，所述1:10饱和中性醋酸钠水溶液由饱和醋酸钠水溶液和水组成，其中饱和醋酸钠水溶液与水的体积比为1:9，1:10饱和中性醋酸钠水溶液的pH值为7.0；各粗糖溶液中多糖的浓度均为10～25mg/ml；
上述制备方法中，所述步骤9）中，用酚对粗糖溶液进行提取的方法包括如下步骤：分别向各粗糖溶液中加入2倍体积的酚，混匀，离心分离，弃去中层及酚层，收集上层液；
上述制备方法中，所述步骤10）中，用氯化钙水溶液透析的方法中，氯化钙水溶液的浓度为0.1mol/L；
上述制备方法中，所述步骤11）中，用95%乙醇水溶液沉淀的方法包括如下步骤：向透析后的溶液中加入95%乙醇水溶液，使乙醇在混合液中的体积百分比为80%，混匀，在2～8℃条件下静置8～16小时，离心去上清，收集沉淀。
上述制备方法中，所述发酵的方法包括如下发酵罐培养步骤：将菌种分别以5×108/ml的浓度接种于装有流脑半综合液体培养基的发酵罐中，37℃培养6～8小时，至对数生长后期，得到发酵液，将发酵罐中所有物质记作发酵液。
上述制备方法中，所述发酵的方法中，在所述发酵罐培养之前，还包括如下步骤：
1）制备生产菌种：
第一代培养：将工作种子批菌种接种在10％羊血普通琼脂培养基上，放37℃、8％二氧化碳环境培养18小时；
第二代和第三代培养：将第一代菌种接种于流脑半综合培养基，37℃培养12小时；
将第二代菌种接种于流脑半综合培养基，37℃培养12小时；
2）第四代菌种罐培养
将第三代菌种以5×108/ml的浓度接种于装有流脑半综合液体培养基的菌种罐中，37℃培养3～4小时。
其中，所述10％羊血普通琼脂培养基的组成及其在培养基中的浓度可为如下：胰蛋白胨，1％（质量）；酵母浸粉，0.3％（质量）；氯化钠，0.5％（质量）；牛肉浸膏，0.7％（质量）；琼脂粉，1.6％（质量）；注射用水，加至总量；新鲜去纤维羊血，10％（体积）；葡萄糖水溶液（葡萄糖水溶液浓度为50%），1％（体积）。
上述任一所述疫苗或任一所述疫苗的制备方法中，所述A群脑膜炎奈瑟氏球菌为A群脑膜炎奈瑟氏球菌菌株A4，其在CMCC的编号为29201；
所述C群脑膜炎奈瑟氏球菌为C群脑膜炎奈瑟氏球菌菌株C11，其在CMCC的编号为29205；
所述Y群脑膜炎奈瑟氏球菌为Y群脑膜炎奈瑟氏球菌菌株Y，其在CMCC的编号为29303；
所述W135群脑膜炎奈瑟氏球菌为W135群脑膜炎奈瑟氏球菌菌株W135，其在CMCC的编号为29055。
上述任一所述疫苗或任一所述疫苗的制备方法中，所述水均为生理盐水或无热源注射用水。
实验证明，本专利发明工艺制备的A群多糖、C群多糖、Y群多糖、W135群多糖中内毒素含量均非常低，为1EU/μg，大大低于国家要求小于10EU/μg。由该多糖制成的疫苗中内毒素含量非常低，最高为1EU/μg。本发明的疫苗安全性很好，无明显的全身反应。
具体实施方式
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本实施例中所使用的菌株为A群脑膜炎奈瑟氏球菌菌株A4CMCC29201，C群脑膜炎奈瑟氏球菌菌株C11CMCC29205，Y群脑膜炎奈瑟氏球菌菌株YCMCC29303，W135群脑膜炎奈瑟氏球菌菌株W135CMCC29055，各菌株均购自中国医学微生物菌种保藏管理中心（CMCC）。
10％羊血普通琼脂培养基的组成：
流脑半综合液体培养基：
| 组分 | 试剂名称 | 含量 |
| 1 | 酸水解酪蛋白 | 1.2mg氨基氮/ml培养基 |
| 2 | 磷酸二氢钾(KH2PO4) | 0.02％（质量百分比） |
| 3 | 磷酸氢二钠(Na2HPO4﹒12H2O) | 0.1%（质量百分比） |
| 4 | 氯化铵(NH4Cl) | 0.125%（质量百分比） |
| 5 | 甘氨酸(C2H5NO2) | 0.01％（质量百分比） |
| 6 | L～谷氨酸钠(C5H8NNaO4﹒H2O) | 0.1％（质量百分比） |
| 7 | 酵母透析液 | 1%（体积百分比） |
| 8 | 10%L～胱氨酸(C6H12N2O4S2)水溶液 | 0.03%（体积百分比） |
| 9 | 无水硫酸镁(MgSO4) | 0.0294％（质量百分比） |
| 10 | 葡萄糖(C6H12O6﹒H2O) | 0.55%（质量百分比） |
实施例1、制备流脑疫苗Ⅰ
一、分别发酵A群脑膜炎奈瑟氏球菌、C群脑膜炎奈瑟氏球菌、Y群脑膜炎奈瑟氏球菌和W135群脑膜炎奈瑟氏球菌
（一）生产菌种制备
第一代：启开工作种子批菌种，接种在10％羊血普通琼脂培养基上，放37℃、8％二氧化碳环境培养18小时。
第二代和第三代培养：将第一代菌种接种于流脑半综合培养基，37℃培养12小时；将第二代菌种接种于流脑半综合培养基，37℃培养12小时。
（二）第四代（菌种罐）培养
将第三代菌种以5×108/ml的浓度接种于装有流脑半综合液体培养基的菌种罐中，37℃培养3.5小时。
（三）第五代（发酵罐）培养：
将第四代菌种以5×108/ml的浓度接种于装有流脑半综合液体培养基的发酵罐中，37℃培养7小时，至对数生长后期，得到发酵液，将发酵罐中所有物质记作发酵液。
（四）发酵液灭菌
向步骤（三）得到的发酵液中加入甲醛，使甲醛的终浓度为0.5％（体积百分比），在室温下（25℃）搅拌反应1小时，对培养物进行杀菌灭活。
二、从发酵液中分离多糖
（一）制备粗糖
1、去除菌体：对灭活后的发酵液进行连续流离心，去除死菌体，收集澄清的上清液（记作发酵液上清），菌体沉淀废弃。
2、收获复合糖：用十六烷基三甲基溴化铵水溶液进行沉淀，具体如下：
1）对于A群和C群脑膜炎球菌：向发酵液上清液中加入10%十六烷基三甲基溴化铵水溶液，使十六烷基三甲基溴化铵在混合溶液中的浓度为0.2%（质量百分含量），在温度为13℃的条件下搅拌反应0.7小时，再静置13小时，离心收集沉淀即得到复合糖。
2）对于Y群和W135群脑膜炎球菌：将发酵液上清液先用截留分子量为30kD的超滤膜超滤浓缩20倍后，再向发酵液上清液中加入1%十六烷基三甲基溴化铵水溶液，使十六烷基三甲基溴化铵在混合溶液中的浓度为0.2%（质量百分含量），在温度为13℃的条件下搅拌反应0.7小时，再静置13小时，离心收集沉淀即得到复合糖。
3、多糖粗制
（1)复合糖溶解与解离：向复合糖中加入2mol/L氯化钙水溶液，2mol/L氯化钙水溶液的加入量为7ml：1g复合糖，再加入无热原注射用水，使氯化钙的最终浓度为1mol/L。搅拌2小时，使多糖与十六烷基三甲基溴化铵解离；
（2)粗多糖除杂质：向解离液中加入预冷95%乙醇溶液至最终浓度25%（ml/ml），搅拌均匀，在5℃静置2小时，离心去沉淀，收集上清液；
（3)收获粗糖：向上清液中加入预冷95%乙醇溶液至最终浓度80%（ml/ml），搅拌均匀，在5℃条件下静置12小时，离心去上清，收集沉淀；
（4）洗涤粗糖沉淀：向沉淀中加入4ml/g无水乙醇，洗涤，重复一次；再向沉淀中加入4ml/g丙酮，洗涤，重复一次；
（5）粗多糖干燥：
洗涤后的湿粗糖沉淀用0.03MPa洁净干燥压气干燥5小时或负压抽空干燥后，称取重量并记录。
4、多糖精制
（1）粗糖溶解：将粗糖溶解于1:10饱和中性醋酸钠水溶液（饱和醋酸钠水溶液：水=1:9，溶液pH值为7.0）中，得到粗糖溶液；粗糖溶液中粗糖浓度为20mg/ml。
（2）冷酚提取：向粗糖溶液中加入2倍体积的冷酚，搅拌均匀，离心分离，收集上层液，弃去中层及酚层。提取3次，以上清透亮无颜色为限。
（3）制品透析：经冷酚提取的上清液，用0.1mol/L氯化钙水溶液超滤透析。
（4）沉淀精糖：收集透析后的多糖液，加95%乙醇水溶液，使乙醇在混合液中的体积百分比为80%，搅拌均匀，在5℃条件下静置12小时，离心去上清，收取多糖沉淀。
（5）洗涤精糖沉淀：向沉淀中加入20ml/g无水乙醇，洗涤，重复一次；再向沉淀中加入20ml/g丙酮，洗涤，重复一次。
（6）精糖干燥与储存：洗涤后的湿精糖沉淀用0.03MPa洁净干燥压气干燥4～6小时或负压抽空干燥后，称取重量并记录。
三、凝胶层析
精糖溶解：将精糖用灭菌注射用水溶解，使其浓度达15mg/ml，进行上样。
柱层析：采用柱层析方法进一步去除内毒素。所用填料为QSepharoseFF琼脂糖凝胶，用等体积灭菌生理盐水洗脱，在206nm波长下监测多糖峰，收集第一峰。
超滤脱盐：用截留分子量为100kD的膜包超滤透析，用15倍体积注射用水洗滤脱盐。
除菌过滤：超滤收获液采用0.2μm孔径膜进行除菌过滤，得到多糖原液。
四、多糖混合
将步骤三得到的A群脑膜炎奈瑟氏球菌多糖原液、C群脑膜炎奈瑟氏球菌多糖原液、Y群脑膜炎奈瑟氏球菌多糖原液和W135群脑膜炎奈瑟氏球菌多糖原液按照等质量比混合，并加入灭菌注射用水和浓度为10%的乳糖水溶液，使最终半成品溶液中A、C、Y、W135群多糖浓度分别为100μg/ml，乳糖浓度为7mg/ml，充分搅拌30分钟，用0.2μm孔径膜进行除菌过滤。即得到流脑疫苗。
五、内毒素检查
内毒素检测根据《中华人民共和国药典》三部（2010年版）附录ⅫE）中所述方法进行。
将步骤三得到的多糖原液进行干燥，分别得到A、C、Y、W135群固体多糖。分别对每种固体多糖中的内毒素含量进行检测。
再对步骤四制得的疫苗中的内毒素含量进行检测。
结果，A群固体多糖中内毒素含量为1EU/μg，C群固体多糖中内毒素含量为1EU/μg，Y群固体多糖中内毒素含量为1EU/μg，W135群固体多糖中内毒素含量为1EU/μg。步骤四制得的疫苗中内毒素含量为1EU/μg。
实施例2、制备流脑疫苗Ⅱ
一、分别发酵A群脑膜炎奈瑟氏球菌、C群脑膜炎奈瑟氏球菌、Y群脑膜炎奈瑟氏球菌和W135群脑膜炎奈瑟氏球菌
（一）生产菌种制备
第一代：启开工作种子批菌种，接种在10％羊血普通琼脂培养基上，放37℃、8％二氧化碳环境培养18小时。
第二代和第三代培养：将第一代菌种接种于流脑半综合培养基，37℃培养12小时；将第二代菌种接种于流脑半综合培养基，37℃培养12小时。
（二）第四代（菌种罐）培养
将第三代菌种以5×108/ml的浓度接种于装有流脑半综合液体培养基的菌种罐中，37℃培养3小时。
（三）第五代（发酵罐）培养：
将第四代菌种以5×108/ml的浓度接种于装有流脑半综合液体培养基的发酵罐中，37℃培养6小时，至对数生长后期，得到发酵液，将发酵罐中所有物质记作发酵液。
（四）发酵液灭菌
向步骤（三）得到的发酵液中加入甲醛，使甲醛的终浓度为0.5％（体积百分比），在室温下（25℃）搅拌反应1小时，对培养物进行杀菌灭活。
二、从发酵液中分离多糖
（一）制备粗糖
1、去除菌体：对灭活后的发酵液进行连续流离心，去除死菌体，收集澄清的上清液（记作发酵液上清），菌体沉淀废弃。
2、收获复合糖：用十六烷基三甲基溴化铵水溶液进行沉淀，具体如下：
1）对于A群和C群脑膜炎球菌：向发酵液上清液中加入10%十六烷基三甲基溴化铵水溶液，使十六烷基三甲基溴化铵在混合溶液中的浓度为0.1%（质量百分含量），在温度为10℃的条件下搅拌反应0.5小时，再静置10小时，离心收集沉淀即得到复合糖。
2）对于Y群和W135群脑膜炎球菌：将发酵液上清液先用截留分子量为30kD的超滤膜超滤浓缩10倍后，再向发酵液上清液中加入1%十六烷基三甲基溴化铵水溶液，使十六烷基三甲基溴化铵在混合溶液中的浓度为0.1%（质量百分含量），在温度为10℃的条件下搅拌反应0.5小时，再静置10小时，离心收集沉淀即得到复合糖。
3、多糖粗制
（1)复合糖溶解与解离：向复合糖中加入2mol/L氯化钙水溶液，2mol/L氯化钙水溶液的加入量为3ml：1g复合糖，再加入无热原注射用水，使氯化钙的最终浓度为1mol/L。搅拌1小时，使多糖与十六烷基三甲基溴化铵解离；
（2)粗多糖除杂质：向解离液中加入预冷95%乙醇溶液至最终浓度25%（ml/ml），搅拌均匀，在2℃静置1小时，离心去沉淀，收集上清液；
（3)收获粗糖：向上清液中加入预冷95%乙醇溶液至最终浓度80%（ml/ml），搅拌均匀，在2℃条件下静置8小时，离心去上清，收集沉淀；
（4）洗涤粗糖沉淀：向沉淀中加入3ml/g无水乙醇，洗涤，重复一次；再向沉淀中加入3ml/g丙酮，洗涤，重复一次；
（5）粗多糖干燥：
洗涤后的湿粗糖沉淀用0.02MPa洁净干燥压气干燥4小时或负压抽空干燥后，称取重量并记录。
4、多糖精制
（1）粗糖溶解：将粗糖溶解于1:10饱和中性醋酸钠水溶液（饱和醋酸钠水溶液：水=1:9，溶液pH值为7.0）中，得到粗糖溶液；粗糖溶液中粗糖浓度为10mg/ml。
（2）冷酚提取：向粗糖溶液中加入2倍体积的冷酚，搅拌均匀，离心分离，收集上层液，弃去中层及酚层。提取3次，以上清透亮无颜色为限。
（3）制品透析：经冷酚提取的上清液，用0.1mol/L氯化钙水溶液冷透析。
（4）沉淀精糖：收集透析后的多糖液，加95%乙醇水溶液，使乙醇在混合液中的体积百分比为80%，搅拌均匀，在2℃条件下静置8小时，离心去上清，收取多糖沉淀。
（5）洗涤精糖沉淀：向沉淀中加入10ml/g无水乙醇，洗涤，重复一次；再向沉淀中加入10ml/g丙酮，洗涤，重复一次。
（6）精糖干燥与储存：洗涤后的湿精糖沉淀用0.02MPa洁净干燥压气干燥4～6小时或负压抽空干燥后，称取重量并记录。
三、凝胶层析
精糖溶解：将精糖用灭菌注射用水溶解，使其浓度达10mg/ml，进行上样。
柱层析：采用柱层析方法进一步去除内毒素。所用填料为Q Sepharose FF琼脂糖凝胶，用等体积灭菌生理盐水洗脱，在206nm波长下监测多糖峰，收集第一峰。
超滤脱盐：用截留分子量为100kD的膜包超滤透析，用10倍体积注射用水洗滤脱盐。
除菌过滤：超滤收获液采用0.2μm孔径膜进行除菌过滤，得到多糖原液。
四、多糖混合
将步骤三得到的A群脑膜炎奈瑟氏球菌多糖原液、C群脑膜炎奈瑟氏球菌多糖原液、Y群脑膜炎奈瑟氏球菌多糖原液和W135群脑膜炎奈瑟氏球菌多糖原液按照等质量比混合，并加入灭菌注射用水和浓度为10%的乳糖水溶液，使最终半成品溶液中A、C、Y、W135群多糖浓度分别为70μg/ml，乳糖浓度为5mg/ml，充分搅拌30分钟，用0.2μm孔径膜进行除菌过滤。即得到流脑疫苗。
五、内毒素检查
内毒素检测根据《中华人民共和国药典》三部（2010年版）附录ⅫE）中所述方法进行。
将步骤三得到的多糖原液进行干燥，分别得到A、C、Y、W135群固体多糖。分别对每种固体多糖中的内毒素含量进行检测。
再对步骤四制得的疫苗中的内毒素含量进行检测。
结果，A群固体多糖中内毒素含量为1EU/μg，C群固体多糖中内毒素含量为1EU/μg，Y群固体多糖中内毒素含量为1EU/μg，W135群固体多糖中内毒素含量为1EU/μg。步骤四制得的疫苗中内毒素含量为1EU/μg。
实施例3、制备流脑疫苗Ⅲ
一、分别发酵A群脑膜炎奈瑟氏球菌、C群脑膜炎奈瑟氏球菌、Y群脑膜炎奈瑟氏球菌和W135群脑膜炎奈瑟氏球菌
（一）生产菌种制备
第一代：启开工作种子批菌种，接种在10％羊血普通琼脂培养基上，放37℃、8％二氧化碳环境培养18小时。
第二代和第三代培养：将第一代菌种接种于流脑半综合培养基，37℃培养12小时；将第二代菌种接种于流脑半综合培养基，37℃培养12小时。
（二）第四代（菌种罐）培养
将第三代菌种以5×108/ml的浓度接种于装有流脑半综合液体培养基的菌种罐中，37℃培养4小时。
（三）第五代（发酵罐）培养：
将第四代菌种以5×108/ml的浓度接种于装有流脑半综合液体培养基的发酵罐中，37℃培养8小时，至对数生长后期，得到发酵液，将发酵罐中所有物质记作发酵液。
（四）发酵液灭菌
向步骤（三）得到的发酵液中加入甲醛，使甲醛的终浓度为0.5％（体积百分比），在室温下（25℃）搅拌反应1小时，对培养物进行杀菌灭活。
二、从发酵液中分离多糖
（一）制备粗糖
1、去除菌体：对灭活后的发酵液进行连续流离心，去除死菌体，收集澄清的上清液（记作发酵液上清），菌体沉淀废弃。
2、收获复合糖：用十六烷基三甲基溴化铵水溶液进行沉淀，具体如下：
1）对于A群和C群脑膜炎球菌：向发酵液上清液中加入10%十六烷基三甲基溴化铵水溶液，使十六烷基三甲基溴化铵在混合溶液中的浓度为0.3%（质量百分含量），在温度为15℃的条件下搅拌反应1小时，再静置16小时，离心收集沉淀即得到复合糖。
2）对于Y群和W135群脑膜炎球菌：将发酵液上清液先用截留分子量为30kD的超滤膜超滤浓缩30倍后，再向发酵液上清液中加入1%十六烷基三甲基溴化铵水溶液，使十六烷基三甲基溴化铵在混合溶液中的浓度为0.3%（质量百分含量），在温度为15℃的条件下搅拌反应1小时，再静置16小时，离心收集沉淀即得到复合糖。
3、多糖粗制
（1)复合糖溶解与解离：向复合糖中加入2mol/L氯化钙水溶液，2mol/L氯化钙水溶液的加入量为10ml：1g复合糖，再加入无热原注射用水，使氯化钙的最终浓度为1mol/L。搅拌3小时，使多糖与十六烷基三甲基溴化铵解离；
（2)粗多糖除杂质：向解离液中加入预冷95%乙醇溶液至最终浓度25%（ml/ml），搅拌均匀，在8℃静置3小时，离心去沉淀，收集上清液；
（3)收获粗糖：向上清液中加入预冷95%乙醇溶液至最终浓度80%（ml/ml），搅拌均匀，在8℃条件下静置16小时，离心去上清，收集沉淀；
（4）洗涤粗糖沉淀：向沉淀中加入5ml/g无水乙醇，洗涤，重复一次；再向沉淀中加入5ml/g丙酮，洗涤，重复一次；
（5）粗多糖干燥：
洗涤后的湿粗糖沉淀用0.05MPa洁净干燥压气干燥6小时或负压抽空干燥后，称取重量并记录。
4、多糖精制
（1）粗糖溶解：将粗糖溶解于1:10饱和中性醋酸钠水溶液（饱和醋酸钠水溶液：水=1:9，溶液pH值为7.0）中，得到粗糖溶液；粗糖溶液中粗糖浓度为25mg/ml。
（2）冷酚提取：向粗糖溶液中加入2倍体积的冷酚，搅拌均匀，离心分离，收集上层液，弃去中层及酚层。提取4次，以上清透亮无颜色为限。
（3）制品透析：经冷酚提取的上清液，用0.1mol/L氯化钙水溶液冷透析。
（4）沉淀精糖：收集透析后的多糖液，加95%乙醇水溶液，使乙醇在混合液中的体积百分比为80%，搅拌均匀，在8℃条件下静置16小时，离心去上清，收取多糖沉淀。
（5）洗涤精糖沉淀：向沉淀中加入30ml/g无水乙醇，洗涤，重复一次；再向沉淀中加入30ml/g丙酮，洗涤，重复一次。
（6）精糖干燥与储存：洗涤后的湿精糖沉淀用0.05MPa洁净干燥压气干燥4～6小时或负压抽空干燥后，称取重量并记录。
三、凝胶层析
精糖溶解：将精糖用灭菌注射用水溶解，使其浓度达20mg/ml，进行上样。
柱层析：采用柱层析方法进一步去除内毒素。所用填料为Q Sepharose FF琼脂糖凝胶，用等体积灭菌生理盐水洗脱，在206nm波长下监测多糖峰，收集第一峰。
超滤脱盐：用截留分子量为100kD的膜包超滤透析，用20倍体积注射用水洗滤脱盐。
除菌过滤：超滤收获液采用0.2μm孔径膜进行除菌过滤，得到多糖原液。
四、多糖混合
将步骤三得到的A群脑膜炎奈瑟氏球菌多糖原液、C群脑膜炎奈瑟氏球菌多糖原液、Y群脑膜炎奈瑟氏球菌多糖原液和W135群脑膜炎奈瑟氏球菌多糖原液按照等质量比混合，并加入灭菌注射用水和浓度为10%的乳糖水溶液，使最终半成品溶液中A、C、Y、W135群多糖浓度分别为130μg/ml，乳糖浓度为10mg/ml，充分搅拌30分钟，用0.2μm孔径膜进行除菌过滤。即得到流脑疫苗。
五、内毒素检查
内毒素检测根据《中华人民共和国药典》三部（2010年版）附录ⅫE）中所述方法进行。
将步骤三得到的多糖原液进行干燥，分别得到A、C、Y、W135群固体多糖。分别对每种固体多糖中的内毒素含量进行检测。
再对步骤四制得的疫苗中的内毒素含量进行检测。
结果，A群固体多糖中内毒素含量为1EU/μg，C群固体多糖中内毒素含量为1EU/μg，Y群固体多糖中内毒素含量为1EU/μg，W135群固体多糖中内毒素含量为1EU/μg。步骤四制得的疫苗中内毒素含量为1EU/μg。
实施例4、疫苗效果检测
一、检测方法
受试人群：受试者为2岁及其以上年龄的常住健康人群，无流脑感染史、3个月内无流脑疫苗接种史、无疫苗接种禁忌症者。近1周内未接种其它预防制品。腋下体温≤37℃。受试者（或其监护人）以知情同意，自愿参加为原则。
将符合条件的受试者分为3个年龄组：少儿组（2～6岁）、少年组（7～15岁）、成人组（16～30岁），每个年龄组的入选受试者按性别年龄排序，所有受试者均编有唯一识别号码，该识别号码与疫苗编号一致，即受试者接种相应编号的疫苗。
以兰州生物制品研究所生产的AC群脑膜炎球菌多糖疫苗作为对照疫苗。
对每个受试者的实验步骤如下：
（1）免前血，分离血清，～20℃保存待检。
（2）接种疫苗。每人分别在上臂外侧三角肌附着处皮肤，用75%酒精消毒，待皮肤微干后皮下注射试验用疫苗，疫苗使用前已充分摇匀。疫苗规格为0.5ml/支，每支疫苗中含有四种多糖各50ug，1支/人。
（3）接种疫苗后观察30分钟即时反应，系统观察72小时，随访4周。
（4）4周后采血，分离血清，～20℃保存待检。
（5）观察终止，实验室统一检测，资料分析，效果评价。
检测指标如下：
免疫原性观察指标与观察时间：以免疫后较免疫前杀菌抗体4倍增长（阳转）率、8倍增长率、免后杀菌抗体GMT及杀菌抗体增长倍数为效果指标。在疫苗免疫前、全程免疫后4周分别采集受试者静脉血清，统一用微量杀菌力试验(TTC法)进行A群、C群、W135群、Y群脑膜炎球菌的杀菌抗体检测。
安全性观察指标与观察时间：所有受试者在疫苗接种后应于接种现场观察30分钟，在疫苗接种后72小时内，研究人员对受试者全面系统性地进行全身和局部接种反应观察。从接种疫苗后第4天起至第4周止，每周定期随访一次。
二、实施例1中制备的疫苗的免疫效果
1.免疫后杀菌抗体4倍增长率和8倍增长率
（1）接种实施例1制备的疫苗后，受试者体内A群杀菌抗体4倍增长率为99.17%；8倍增长率为98.13%。各年龄组免疫后A群杀菌抗体4倍增长率及8倍增长率均＞95%。接种对照疫苗后，受试者体内A群杀菌抗体4倍增长率为98.75%；8倍增长率为97.92%。
（2）接种实施例1制备的疫苗后，受试者体内C群杀菌抗体4倍增长率为94.79%；8倍增长率为85.83%。接种对照疫苗后，受试者体内C群杀菌抗体4倍增长率为95.42%；8倍增长率为90%。
人群免前C群杀菌抗体GMT比另外三个群稍高，若将免前C群杀菌抗体GMT≥1:64的人不列入统计的话，各年龄组两种疫苗免疫后C群抗体4倍增长率均＞95%，8倍增长率均＞94%（见表3）。
（3）接种实施例1制备的疫苗后，受试者体W135群杀菌抗体4倍增长率为97.71%；8倍增长率为96.67%，各年龄组免疫后W135群杀菌抗体4倍增长率及8倍增长率均＞95%。接种对照疫苗后，受试者体内C群杀菌抗体4倍增长率为9.58%；8倍增长率为9.58%。
（4）接种实施例1制备的疫苗后，受试者体Y群杀菌抗体4倍增长率为97.92%；8倍增长率为96.04%，各年龄组免疫后Y群杀菌抗体4倍增长率及8倍增长率均＞95%。接种对照疫苗后，受试者体内C群杀菌抗体4倍增长率为17.08%；8倍增长率为9.58%。
2、免疫后杀菌抗体GMT比较
试验疫苗组和对照疫苗组免疫后A群杀菌抗体GMT合计为1:351.2246和1:452.2051。各年龄组两种疫苗免疫后A群GMT均较高，＞1:300已达人群保护水平以上。少儿组两种疫苗免疫后A群抗体GMT差异无统计学意义（见表6-1）。
*由于变换后的数据方差不齐，组间比较采用t′检验
试验疫苗组和对照疫苗组免疫后C群杀菌抗体GMT合计为1:384.1209和1:431.7842。各年龄组两种疫苗免疫后C群GMT均较高，＞1:300已达人群保护水平以上。各年龄组两种疫苗免疫后C群抗体GMT差异均无统计学意义（见表6-2）。
试验疫苗组和对照疫苗组免疫后W135群杀菌抗体GMT合计为1:166.9571和1:1.8341。试验疫苗组免疫后W135群杀菌抗体GMT均＞1:120，已达人群保护水平以上；对照疫苗组免疫后W135群杀菌抗体GMT均低。各年龄组两种疫苗免疫后W135群抗体GMT差异均有统计学意义（见表6-3）。
*由于变换后的数据方差不齐，组间比较采用t′检验。
试验疫苗组和对照疫苗组免疫后Y群杀菌抗体GMT合计为1:279.9774和1:2.6466。试验疫苗组免疫后Y群杀菌抗体GMT均＞1:200，已达人群保护水平以上；对照疫苗组免疫后Y群杀菌抗体GMT均低。各年龄组两种疫苗免疫后Y群抗体GMT差异均有统计学意义（见表6-4）。
*由于变换后的数据方差不齐，组间比较采用t′检验
结果表明：试验疫苗组和对照疫苗组免疫后A群、C群杀菌抗体GMT均＞1:300，已达到人群保护水平以上。试验疫苗组免疫后W135群和Y群杀菌抗体GMT＞1:120，已达到人群保护水平以上。对照疫苗组免疫后W135群和Y群杀菌抗体GMT均很低。试验疫苗组免疫后W135群和Y群杀菌抗体GMT与对照疫苗组相比差异有统计学意义。
3、免疫后杀菌抗体平均增长倍数比较
试验疫苗组和对照疫苗组免疫后A群杀菌抗体平均增长倍数合计为228.73倍和319.76倍；C群分别为74.16倍和91.03倍；W135群分别为156.91倍和1.52倍；Y群分别为181.02倍和1.75倍。
少儿组和少年组的试验疫苗组免疫后A群杀菌抗体平均增长倍数与对照疫苗组相比差异无统计学意义；各年龄组试验疫苗组免疫后C群杀菌抗体平均增长倍数与对照疫苗组相比差异无统计学意义。
各年龄组试验疫苗组免疫后W135群、Y群杀菌抗体平均增长倍数与对照疫苗组相比差异有统计学意义。（见表7）。
注：表中G为几何均数，sG为相应标准差
三、实施例1中制备的疫苗的免疫安全性评价
1、全身反应观察
在疫苗接种后72小时的系统观察期内，试验疫苗组共有21人出现轻中度反应，均为轻中度发热，全身反应率为3.5%（21/600）；对照疫苗组共有9人出现轻中度反应，均为轻中度发热，全身反应率为3.0%（9/300）。发热反应一般于接种后6～24小时内开始，经对症处理于48小时内退热；试验疫苗组和对照疫苗组均未有严重发热情况。具体如下：
试验疫苗组有9人出现全身轻度反应，全身轻度反应率为1.50%(9/600)，最高体温37.5℃；有12人出现全身中度反应，全身中度反应率为2.00%(12/600)，最高体温39.0℃；所有的发热者均在48小时内体温恢复正常。
对照疫苗组有3人出现全身轻度反应，全身轻度反应率为1.00%(3/300)，最高体温37.5℃；有6人出现全身中度反应，全身中度反应率为2.0%(6/300)，最高体温38.5℃；所有的发热者均在72小时内体温恢复正常（表8）。
注：两组等级资料的比较，采用Wilcoxon秩和检验，统计量为z
2、局部反应观察
在接种疫苗后72小时系统观察期内，试验疫苗组共有5人于接种后6～24小时出现中度的局部反应，主要表现为接种部位疼痛、发红和肿胀，直径最大为2.5cm，无硬结，经对症处理在48小时内消退；在发生的中度局部反应中，少儿组3人，少年组和成人组各1人。
在接种疫苗后72小时系统观察期内，对照疫苗组共有5人出现轻中度反应，表现为接种部位疼痛、发红或肿胀，直径最大为2.5cm，无硬结，经对症处理在48小时内消退。其中有1人于接种后6小时出现轻度的局部反应，直径为1.3cm，在24小时内消退；有4人于6～24小时出现中度的局部反应，最大直径为2.5cm，对症处理后在48小时内消退；在发生的局部反应中，少儿组3人，成人组2人(见表9)。
试验疫苗组和对照疫苗组全身反应和局部反应发生率均较低，各年龄组试验疫苗组免疫后全身和局部反应发生率与对照疫苗组相比差异无统计学意义。
实施例2和实施例3制备得到的疫苗的免疫效果与实施例1制备的疫苗的免疫效果无显著差异。实施例2和实施例3制备得到的疫苗的免疫安全性与实施例1制备的疫苗的免疫安全性无显著差异。
Claims (6)
1.一种制备流脑疫苗的方法，包括如下步骤：
(1)分别发酵A群脑膜炎奈瑟氏球菌、C群脑膜炎奈瑟氏球菌、Y群脑膜炎奈瑟氏球菌和W135群脑膜炎奈瑟氏球菌，得到的发酵液依次记作A菌发酵液、C菌发酵液、Y菌发酵液、W135菌发酵液；
(2)分别从A菌发酵液、C菌发酵液、Y菌发酵液、W135菌发酵液中分离多糖，将得到的多糖依次记作A多糖、C多糖、Y多糖、W135多糖；
(3)将A多糖、C多糖、Y多糖、W135多糖分别用Q Sepharose FF琼脂糖凝胶进行柱层析，收集洗脱峰，即分别得到由A群脑膜炎奈瑟氏球菌发酵得到的多糖、C群脑膜炎奈瑟氏球菌发酵得到的多糖、Y群脑膜炎奈瑟氏球菌发酵得到的多糖和W135群脑膜炎奈瑟氏球菌发酵得到的多糖；
(4)将由A群脑膜炎奈瑟氏球菌发酵得到的多糖、C群脑膜炎奈瑟氏球菌发酵得到的多糖、Y群脑膜炎奈瑟氏球菌发酵得到的多糖和W135群脑膜炎奈瑟氏球菌发酵得到的多糖、乳糖和水进行混合，即得到流脑疫苗；
所述A群脑膜炎奈瑟氏球菌发酵得到的多糖在疫苗中的浓度为70μg/ml～130μg/ml，所述C群脑膜炎奈瑟氏球菌发酵得到的多糖在疫苗中的浓度为70μg/ml～130μg/ml，所述Y群脑膜炎奈瑟氏球菌发酵得到的多糖在疫苗中的浓度为70μg/ml～130μg/ml，所述W135群脑膜炎奈瑟氏球菌发酵得到的多糖在疫苗中的浓度为70μg/ml～130μg/ml，乳糖在疫苗中的浓度为5mg/ml～10mg/ml；
所述步骤(3)中，用Q Sepharose FF琼脂糖凝胶进行柱层析的方法中，上样的样品为分别将步骤(2)得到的A多糖、C多糖、Y多糖、W135多糖分别用水溶解后得到的多糖浓度为10～20mg/ml的溶液，洗脱液为生理盐水，监测波长为206nm；
所述步骤(2)中，从发酵液中分离多糖的方法包括如下步骤：
1)分别去除A菌发酵液、C菌发酵液、Y菌发酵液和W135菌发酵液中的菌体；
2)为如下a)和/或b)：
a)、用十六烷基三甲基溴化铵分别沉淀去除菌体的A菌发酵液或去除菌体的C菌发酵液中的多糖，分别收集沉淀；
b)、先用截留分子量为30kD的超滤膜分别对去除菌体的Y菌发酵液或去除菌体的W135菌发酵液进行超滤浓缩，得到Y菌浓缩液或W135菌浓缩液；再用十六烷基三甲基溴化铵分别沉淀Y菌浓缩液或W135菌浓缩液中的多糖，分别收集沉淀；
3)、用氯化钙分别将步骤2)所得沉淀中的多糖与十六烷基三甲基溴化铵解离，得到解离液；
4)、用95％乙醇水溶液分别去除步骤3)的解离液中的杂质，收集上清液；
5)、用95％乙醇水溶液分别从步骤4)的上清液中沉淀多糖，收集沉淀；
6)、依次用无水乙醇和丙酮分别洗涤步骤5)所得沉淀；
7)、分别将步骤6)洗涤后沉淀进行干燥；
8)、将步骤7)所得干燥后沉淀用1:10饱和中性醋酸钠水溶液溶解，分别得到粗糖溶液，依次记作A菌粗糖溶液、C菌粗糖溶液、Y菌粗糖溶液、W135菌粗糖溶液；
9)、用酚分别对步骤8)所得粗糖溶液进行提取，弃去中层及酚层，收集上层液；
10)、用氯化钙水溶液分别对步骤9)所得上层液进行透析，收集透析后的溶液；
11)、用95％乙醇水溶液分别对步骤10)所得透析后的溶液进行沉淀，收集沉淀；
12)、依次用无水乙醇和丙酮分别洗涤步骤11)所得沉淀；
13)、分别将步骤12)洗涤后沉淀进行干燥，分别得到A多糖、C多糖、Y多糖、W135多糖。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述步骤2)的a)中，用十六烷基三甲基溴化铵分别沉淀去除菌体的A菌发酵液或去除菌体的C菌发酵液中的多糖的方法包括如下步骤：分别向所述去除菌体的A菌发酵液或去除菌体的C菌发酵液中加入十六烷基三甲基溴化铵水溶液，使十六烷基三甲基溴化铵在混合液中的浓度为0.1％～0.3％(质量百分含量)，在温度为10～15℃的条件下搅拌反应0.5～1小时，再静置10～16小时，离心，收集沉淀；
所述步骤2)的b)中，用十六烷基三甲基溴化铵分别沉淀Y菌浓缩液或W135菌浓缩液中的多糖的方法包括如下步骤：分别向所述Y菌浓缩液或W135菌浓缩液中加入十六烷基三甲基溴化铵水溶液，使十六烷基三甲基溴化铵在混合溶液中的浓度为0.1％～0.3％(质量百分含量)，在温度为10～15℃的条件下搅拌反应0.5～1小时，再静置10～16小时，离心，收集沉淀；
所述步骤3)中，用氯化钙解离的方法包括如下步骤：向所述沉淀中加入2mol/L氯化钙水溶液，2mol/L氯化钙水溶液与所述沉淀的配比为3～10ml：1g，再加入水，使氯化钙在体系中的最终浓度为1mol/L，搅拌1～3小时，使多糖与十六烷基三甲基溴化铵解离；
所述步骤4)中，用95％乙醇水溶液分别去除步骤3)的解离液中的杂质的方法包括如下步骤：分别向解离液中加入95％乙醇水溶液，使乙醇在混合液中的体积百分比为25％，混匀，在2～8℃静置1～3小时，离心去沉淀，收集上清液；
所述步骤5)中，用95％乙醇水溶液分别从步骤4)的上清液中沉淀多糖的方法包括如下步骤：向上清液中加入95％乙醇水溶液，至乙醇在混合液中的体积百分比为80％，混匀，在2～8℃条件下静置8～16小时，离心去上清，收集沉淀；
所述步骤8)中，所述1:10饱和中性醋酸钠水溶液由饱和醋酸钠水溶液和水组成，其中饱和醋酸钠水溶液与水的体积比为1:9，1:10饱和中性醋酸钠水溶液的pH值为7.0；各粗糖溶液中多糖的浓度均为10～25mg/ml；
所述步骤9)中，用酚对粗糖溶液进行提取的方法包括如下步骤：分别向各粗糖溶液中加入2倍体积的酚，混匀，离心分离，弃去中层及酚层，收集上层液；
所述步骤10)中，用氯化钙水溶液透析的方法中，氯化钙水溶液的浓度为0.1mol/L；
所述步骤11)中，用95％乙醇水溶液沉淀的方法包括如下步骤：向透析后的溶液中加入95％乙醇水溶液，使乙醇在混合液中的体积百分比为80％，混匀，在2～8℃条件下静置8～16小时，离心去上清，收集沉淀。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
所述发酵的方法包括如下发酵罐培养步骤：
将菌种分别以5×108/ml的浓度接种于装有流脑半综合液体培养基的发酵罐中，37℃培养6～8小时，至对数生长后期，得到发酵液，将发酵罐中所有物质记作发酵液。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：
所述发酵的方法中，在所述发酵罐培养之前，还包括如下步骤：
1)制备生产菌种：
第一代培养：将工作种子批菌种接种在10％羊血普通琼脂培养基上，放37℃、8％二氧化碳环境培养18小时；
第二代和第三代培养：将第一代菌种接种于流脑半综合培养基，37℃培养12小时；
将第二代菌种接种于流脑半综合培养基，37℃培养12小时；
2)第四代菌种罐培养
将第三代菌种以5×108/ml的浓度接种于装有流脑半综合液体培养基的菌种罐中，37℃培养3～4小时。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述A群脑膜炎奈瑟氏球菌为A群脑膜炎奈瑟氏球菌菌株A4，其在CMCC的编号为29201；
所述C群脑膜炎奈瑟氏球菌为C群脑膜炎奈瑟氏球菌菌株C11，其在CMCC的编号为29205；
所述Y群脑膜炎奈瑟氏球菌为Y群脑膜炎奈瑟氏球菌菌株Y，其在CMCC的编号为29303；
所述W135群脑膜炎奈瑟氏球菌为W135群脑膜炎奈瑟氏球菌菌株W135，其在CMCC的编号为29055。
6.根据权利要求1-5所述的方法制备得到的流脑疫苗。
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