CN105031634A - A群c群脑膜炎球菌多糖结合疫苗活化工艺 - Google Patents

Abstract

本发明公开的是A群C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗活化工艺，解决了现有技术中在疫苗制造过程中使用溴化氰这类的剧毒化学试剂导致不利于保护人类健康以及环境的问题。本发明包括以下步骤：（1）培养脑膜炎球菌；（2）利用培养的脑膜炎球菌提取粗制多糖；（3）将粗制多糖提纯后制成脑膜炎球菌精糖；（4）对精糖进行活化和衍生。本发明具有多糖在荚膜中的提取率更高、多糖析出率更高、精糖的回收率和纯度高、衍生效果更佳等优点。

Description

A群C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗活化工艺

技术领域

本发明涉及一种菌种的培养方法，具体涉及的是A群C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗活化工艺。

背景技术

流行性脑脊髓膜炎(简称流脑，下同)是一种由奈瑟氏脑膜炎球菌(Neisseriameningitidis)引起的急性呼吸道传染病。一百多年来，一直在世界各地流行或散在发生，感染病原菌后可引起败血症、脑膜炎。易感人群主要为儿童，以暴发型病死率最高，可达40%～60%。当今世界各大洲发病率在1/10万～10/10万，总病死率在5%～15%，高达20%的脑膜炎患者会有神经系统后遗症，包括智力受损和耳聋等。根据荚膜多糖型别进行血清学分类可分13个血清型，其中A群、B群、C群约占流行菌群的90%。A群脑膜炎球菌是较大流行的主要致病血清群，特别是在所谓的非洲“流脑流行带”，每隔7-14年就会出现一次较大流行。

我国于1938年、1949年、1959年、1967年和1977年曾发生过5次全国性流脑流行；其中以1967年春季流行最为严重，发病率高达403/10万，病死率为5.49%。我国过去90%以上的病例是A群病菌致病，现在B群或C群病菌有时亦引起流脑暴发。2003年开始，C群流脑的发病率明显上升。目前A群和C群共占所有血清群的50%以上，且C群仍有进一步增高的趋势。因此，目前我国预防流脑工作的重点是以预防A群和C群为主。

目前预防流行性脑脊髓膜炎最有效的方法是接种疫苗。研究表明，A群C群脑膜炎球菌的荚膜多糖具有良好的免疫原性，提取荚膜多糖可直接制备成疫苗，经注射免疫后的人群可以获得免疫保护。我国从2007年起已将流脑疫苗纳入国家免疫规划，在全国范围对适龄儿童普及接种。目前纳入国家免疫计划的流脑多糖疫苗包括A群脑膜炎球菌多糖疫苗，A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗。

目前，国产的所有已经上市的结合疫苗（如b型流感嗜血杆菌结合疫苗、A群C群脑膜炎球菌结合疫苗）全部采用同一种化学结合方法制备而成，即用溴化氰（CNBr）活化多糖的邻位羟基，活化后的多糖与己二酰肼（ADH）反应生成多糖-ADH衍生物。然后在碳二亚胺（EDAC）的催化作用下，多糖-ADH衍生物与载体蛋白共价结合。该工艺有个很大的缺点是在多糖的活化过程中会使用到溴化氰。溴化氰为极毒而且性质活泼的物质，受热、遇水放出剧毒气体如氰化氢和氰化氢，遇酸易引起爆炸。溴化氰的毒性作用类似氢氰酸，对眼睛和皮肤有強烈刺激性。对人来说，在极低的浓度下，就能刺激眼、咽喉而催泪、咳嗽；在0.05mg/L（20PPM）的浓度下1分钟也忍耐不了；如果在120mg/m³条件下，接触30分钟后即死亡。在第一次世界大战期间，溴化氢曾作为澳大利亚军队使用的毒气。

随着对环保意识的增强，以及对工人工作环境状况的重视，人们一直在寻找合适的方法来避免在疫苗制造过程中使用溴化氰这类的剧毒化学试剂。使用现代的技术对传统的生产工艺进行改进以减少或弃用有毒化学试剂对于保护人类健康以及减少环境污染都具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术中在疫苗制造过程中使用溴化氰这类的剧毒化学试剂导致不利于保护人类健康以及环境的问题，提供一种解决上述问题的A群C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗活化工艺。

为解决上述缺点，本发明的技术方案如下：

A群C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗活化工艺，包括以下步骤：

（1）培养脑膜炎球菌；

（2）利用培养的脑膜炎球菌提取粗制多糖；

（3）将粗制多糖提纯后制成脑膜炎球菌精糖；

（4）对精糖进行活化和衍生，该精糖的活化和衍生过程如下：

（41）称取脑膜炎球菌精糖并将其溶解于注射用水中，配制成浓度为5mg/ml的多糖溶液，并调节pH至9.0；

（42）将CDAP用乙腈溶解成浓度为100mg/ml的CDAP溶液；然后按多糖：CDAP=1：0.5的重量比例，往多糖溶液中加入CDAP溶液，室温搅拌2～5分钟制成CDAP混合液；

（43）将ADH用0.2mol/L的NaHCO₃溶解成浓度为100mg/ml的ADH溶液，按多糖：ADH=1：3.5的重量比例，往CDAP混合液中加入ADH溶液，室温搅拌1小时；

（44）再采用0.05mol/L的氯化钠溶液为超滤液，用超滤膜包进行过滤，最后冷冻干燥后即为多糖-ADH衍生物。

本发明中采用的所有化学物质均是无毒的物质，进而有效保证了人类健康，并且避免了环境的污染。

本发明的方法优化了各化学物质加入反应时的比例和浓度，有效提高了ADH衍生率，衍生效果更佳。

进一步，为了能使培育出的脑膜炎球菌的死菌较少，进而使提取出的多糖纯化更加容易，并且使多糖在荚膜中的提取率更高。所述步骤（1）的具体过程如下：

（11）制备纯化的工作种子批菌种：将A群脑膜炎奈瑟氏球菌菌种接种到纯化培养基上，在38℃条件下培育20h，挑选健壮且无杂菌污染的菌种再接种到纯化培养基上进行二次培养，再在38℃条件下培育12h，挑选健壮且无杂菌污染的菌种加入无菌脱脂牛奶中，混匀冻干制备即得纯化的工作种子批菌种；

（12）将工作种子批菌种溶解到无菌水中，将其接种在10%羊血琼脂培养基上，放于35～37℃的环境下培养16～20小时后，挑选出健壮且无杂菌污染的菌种；将开启后的纯化种子接种到半综合液体培养基中进行活化培养；活化培养的条件为温度35～37℃、pH7.0～7.2、搅拌速度140～150r/min，培养时间为6～8h；最后将活化后的纯化种子经过三代扩增培养，即可制备数量适宜的生产用种子；其中扩增培养用培养基为半综合液体培养基中；培育条件为温度35～37℃、pH7.0～7.2、搅拌速度140～150r/min；

（13）将生产用种子接种至发酵罐培养6～12小时即可；发酵罐中培养基为半综合培养基，温度为35～37℃，培养基pH为7.0～7.2，发酵罐中搅拌速度为140～150r/min，接种量为10～15万/ml。

作为一种优选，所述步骤（2）的具体过程如下：

（21）将培养出的脑膜炎球菌利用甲醛杀菌，将已杀菌的培养液离心收集上清液；

（22）在上清液中加入CTAB至CTAB的终浓度为1.0g/L时为止，然后充分搅拌后静置过夜，离心收集多糖；

（23）将沉淀的多糖用氯化钙溶液搅拌3h使多糖和CTAB解离，离心收集上清液；

（24）在上清液中加入乙醇直至乙醇的体积终浓度达到25%，在2～8℃静置过夜，离心收集上清液；再在上清液中加入乙醇直至乙醇的体积终浓度达到75～80%，充分振摇使多糖沉淀，然后静置18小时以上，离心收集沉淀；

（25）用无水乙醇和丙酮各洗三次后干燥，干燥后即为粗制多糖。

本步骤有效使脑膜炎球菌荚膜中的多糖析出率更高，进而有效提高粗制多糖的收率。

为了提高精糖的回收率和纯度，所述步骤（3）的具体过程如下：

（31）将粗制多糖溶解于8%～12%饱和中性醋酸钠溶液中，然后按体积比为1:0.8～1.2的比例加入冷酚溶液，振荡混匀后离心收集上清液，并抽提1～3次使上清液澄清；

（32）收集上清液，用超滤膜包超滤去除残余的苯酚及核酸；

（33）在超滤后的多糖溶液中加入NaCl溶液，直至NaCl终浓度为0.2～0.4mol/L，然后加入乙醇至乙醇体积终浓度为70～78%，充分混匀后2～8℃静置过夜；

（34）离心收集沉淀，然后依次用无水乙醇、丙酮各洗涤两次，干燥后即为精糖。

本发明中，CDAP即为1-氰基-2甲胺基吡啶四氟硼酸酯；ADH即为己二酰肼；CTAB即为十六烷基三甲基溴化铵。

本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：

1、本发明步骤（1）的设置，有效使培育出的A群脑膜炎球菌的死菌较少，提取出的多糖纯化更加容易；而且多糖在荚膜中的提取率更高；

2、本发明通过步骤（2）的设置，有效使脑膜炎球菌荚膜中的多糖析出率更高，进而有效提高粗制多糖的收率；

3、本发明通过步骤（3）的设置有效提高精糖的回收率和纯度；

4、本发明通过步骤（4）中优化了各化学物质加入反应时的比例和浓度，有效提高了ADH衍生率，衍生效果更佳；

5、本发明中采用的所有化学物质均是无毒的物质，进而有效保证了人类健康，并且避免了环境的污染。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

A群C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗活化工艺，包括以下步骤：

（1）培养脑膜炎球菌；

（11）制备纯化的工作种子批菌种：将A群脑膜炎奈瑟氏球菌菌种接种到纯化培养基上，在38℃条件下培育20h，挑选健壮且无杂菌污染的菌种再接种到纯化培养基上进行二次培养，再在38℃条件下培育12h，挑选健壮且无杂菌污染的菌种加入无菌脱脂牛奶中，混匀冻干制备即得纯化的工作种子批菌种；

（12）将工作种子批菌种溶解到无菌水中，将其接种在10%羊血琼脂培养基上，放于35～37℃的环境下培养16～20小时后，挑选出健壮且无杂菌污染的菌种；将开启后的纯化种子接种到半综合液体培养基中进行活化培养；活化培养的条件为温度35～37℃、pH7.0～7.2、搅拌速度140～150r/min，培养时间为6～8h；最后将活化后的纯化种子经过三代扩增培养，即可制备数量适宜的生产用种子；其中扩增培养用培养基为半综合液体培养基中；培育条件为温度35～37℃、pH7.0～7.2、搅拌速度140～150r/min；

（13）将生产用种子接种至发酵罐培养6～12小时即可；发酵罐中培养基为半综合培养基，温度为35～37℃，培养基pH为7.0～7.2，发酵罐中搅拌速度为140～150r/min，接种量为10～15万/ml。

本实施例中，上述各步骤中的具体培育条件如下：

步骤（12）工作种子批菌种开启的培育条件为35℃，培养18小时；活化培养的条件为温度37℃、pH7.2、搅拌速度140r/min，培养时间为6～8h；扩增培养的培育条件为温度36℃、pH7.0、搅拌速度145r/min；

步骤（13）中发酵罐培养的培育条件为温度为37℃，培养基pH为7.0，搅拌速度为145r/min，接种量为12万/ml；

且步骤（11）中采用的纯化培养基为加入抗生素的巧克力培养基，有效达到纯化的目的；步骤（12）中开启工作种子批菌种所使用培养基为未加入抗生素的巧克力培养基，即10%羊血琼脂培养基，通过该培养基的培养后即可有效达到开启工作种子批菌种的效果。

活化和扩增用培养所用的培养基均是半综合液体培养基，该培养基的配比为：牛肉浸出液1L，蛋白胨10g，氯化钠5g，无菌脱纤维马血、羊血或兔血100ml，葡萄糖3g，盐酸酪蛋白水解物2g，pH7.0～7.2。

（2）利用培养的脑膜炎球菌提取粗制多糖；

（21）将培养出的脑膜炎球菌利用甲醛杀菌，将已杀菌的培养液离心收集上清液；

（22）在上清液中加入CTAB至CTAB的终浓度为1.0g/L时为止，然后充分搅拌后静置过夜，离心收集多糖；

（23）将沉淀的多糖用氯化钙溶液搅拌3h使多糖和CTAB解离，离心收集上清液；

（24）在上清液中加入乙醇直至乙醇的体积终浓度达到25%，在2～8℃静置过夜，离心收集上清液；再在上清液中加入乙醇直至乙醇的体积终浓度达到75～80%，充分振摇使多糖沉淀，然后静置18小时以上，离心收集沉淀；

（25）用无水乙醇和丙酮各洗三次后干燥，干燥后即为粗制多糖。

（3）将粗制多糖提纯后制成脑膜炎球菌精糖；

（31）将粗制多糖溶解于10%饱和中性醋酸钠溶液中，然后按体积比为1:1的比例加入冷酚溶液，振荡混匀后离心收集上清液，并抽提1～3次使上清液澄清；

（32）收集上清液，用超滤膜包超滤去除残余的苯酚及核酸；

（33）在超滤后的多糖溶液中加入4mol/L的NaCl溶液，直至NaCl终浓度为0.3mol/L，然后加入95%乙醇至乙醇体积终浓度为75%，充分混匀后2～8℃静置过夜，沉淀；

（34）离心收集沉淀，然后依次用无水乙醇、丙酮各洗涤两次，干燥后即为精糖。

（4）对精糖进行活化和衍生，该精糖的活化和衍生过程如下：

（41）称取脑膜炎球菌精糖并将其溶解于注射用水中，配制成浓度为5mg/ml的多糖溶液，并调节pH至9.0；

（42）将CDAP用乙腈溶解成浓度为100mg/ml的CDAP溶液；然后按多糖：CDAP=1：0.5的重量比例，往多糖溶液中加入CDAP溶液，室温搅拌2～5分钟制成CDAP混合液；

（43）将ADH用0.2mol/L的NaHCO₃溶解成浓度为100mg/ml的ADH溶液，按多糖：ADH=1：3.5的重量比例，往CDAP混合液中加入ADH溶液，室温搅拌1小时；

（44）再采用0.05mol/L的氯化钠溶液为超滤液，用超滤膜包进行过滤，最后冷冻干燥后即为多糖-ADH衍生物。

实施例2

本实施例与实施例1的区别仅仅在于，本实施例中所述步骤（42）中的多糖与CDAP的重量比为1：0.6；所述步骤（43）中的多糖与ADH的重量比为1：4。

实施例3

本实施例与实施例1的区别仅仅在于，本实施例中各化学物质加入反应时的比例和浓度，具体设置如下：

步骤（41）中多糖溶液的浓度为10mg/ml，并采用氢氧化钠调节pH至9.0；

步骤（42）中CDAP溶液的浓度为80mg/ml，多糖：CDAP=1：0.7；

步骤（43）中ADH溶液的浓度为80mg/ml的ADH溶液，多糖：ADH=1：5。

实施例4

本实施例为实施例1的对照实施例，本实施例中步骤（4）所用的方法不同，其具体方法如下：

将溴化氰用乙腈溶解成100mg/ml的溶液。将A群脑膜炎球菌精糖溶解于注射用水中，配制成浓度为5mg/ml的溶液，调节pH至9.0。按多糖：溴化氰=1：0.5（w/w）的比例加入溴化氰溶液。维持温度23±3℃，pH10.8±0.2反应30分钟进行活化。活化完成后，按多糖：己二酰肼=1：3.5（w/w）的比例加入己二酰肼溶液。维持温度23±3℃，pH8.5±0.2反应15分钟进行衍生。反应结束后，用0.05mol/L氯化钠溶液为超滤液，用超滤膜包超滤去除溴化氰，即为多糖-ADH衍生物对照品。

对实施例1～4取样三次，检测ADH衍生率，检测结果如表1所示。

表1

通过上述表1的检测结构可知，本发明步骤（4）不仅仅采用的所有化学物质均是无毒的物质，有效保证了人类健康，避免了环境的污染；而且采用该步骤（4）中所述的各化学物质加入比例和浓度，有效提高了ADH衍生率，使衍生效果更佳。

实施例5

本实施例与实施例1的区别仅仅在于，各步骤（1）中的具体培育条件不同，具体设置如下：

步骤（12）中工作种子批菌种开启的培育条件为36℃，培养16小时；活化培养的条件为温度37℃、pH7.0、搅拌速度145r/min，培养时间为8h；扩增培养的培育条件为温度37℃、pH7.0、搅拌速度150r/min；步骤（13）中发酵罐培养的培育条件为温度为37℃，培养基pH为7.0，搅拌速度为150r/min，接种量为15万/ml。

实施例6

本实施例与实施例1的区别仅仅在于，各步骤（3）中各化学物质加入反应时的比例和浓度不同，具体设置如下：

步骤（31）中将粗制多糖溶解于8%饱和中性醋酸钠溶液中，然后按体积比为1:1.2的比例加入冷酚溶液，振荡混匀后离心收集上清液，并抽提1～3次使上清液澄清；

步骤（33）中NaCl溶液浓度为2mol/L的，直至NaCl终浓度为0.4mol/L，然后加入95%乙醇至乙醇体积终浓度为70%，充分混匀后2～8℃静置过夜。

实施例7

本实施例与实施例1的区别仅仅在于，本实施例中步骤（3）中各化学物质加入反应时的比例和浓度不同，具体设置如下：

步骤（31）中将粗制多糖溶解于15%饱和中性醋酸钠溶液中，然后按体积比为1:2的比例加入冷酚溶液，振荡混匀后离心收集上清液，并抽提1～3次使上清液澄清；

步骤（33）中NaCl溶液浓度为3mol/L的，直至NaCl终浓度为0.5mol/L，然后加入95%乙醇至乙醇体积终浓度为60%，充分混匀后2～8℃静置过夜。

对实施例1、实施例6和实施例7中制成的精糖进行取样，检测精糖的纯度和回收率，检测结果如表1所示。

表1

	纯度	回收率
			实施例1	99%	80%
实施例2	97%	81%
			实施例3	89%	70%

通过上表可以看出，采用本发明浓度的各试剂进行提纯后，该提纯的精糖的纯度可达95%以上，且回收率也更高。

上述实施例仅为本发明的优选实施例，并非对本发明保护范围的限制，但凡采用本发明的设计原理，以及在此基础上进行非创造性劳动而作出的变化，均应属于本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.A群C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗活化工艺，其特征在于，包括以下步骤：

（1）培养脑膜炎球菌；

（2）利用培养的脑膜炎球菌提取粗制多糖；

（3）将粗制多糖提纯后制成脑膜炎球菌精糖；

（4）对精糖进行活化和衍生，该精糖的活化和衍生过程如下：

（41）称取脑膜炎球菌精糖并将其溶解于注射用水中，配制成浓度为5mg/ml的多糖溶液，并调节pH至9.0；

（42）将CDAP用乙腈溶解成浓度为100mg/ml的CDAP溶液；然后按多糖：CDAP=1：0.4～0.6的重量比例，往多糖溶液中加入CDAP溶液，室温搅拌2～5分钟制成CDAP混合液；

（43）将ADH用0.2mol/L的NaHCO₃溶解成浓度为100mg/ml的ADH溶液，按多糖：ADH=1：3～5的重量比例，往CDAP混合液中加入ADH溶液，室温搅拌1小时；

（44）再采用0.05mol/L的氯化钠溶液为超滤液，用超滤膜包进行过滤，最后冷冻干燥后即为多糖-ADH衍生物。

2.根据权利要求1所述的A群C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗活化工艺，其特征在于，所述步骤（1）的具体过程如下：

（11）制备纯化的工作种子批菌种：将A群脑膜炎奈瑟氏球菌菌种接种到纯化培养基上，在38℃条件下培育20h，挑选健壮且无杂菌污染的菌种再接种到纯化培养基上进行二次培养，再在38℃条件下培育12h，挑选健壮且无杂菌污染的菌种加入无菌脱脂牛奶中，混匀冻干制备即得纯化的工作种子批菌种；

（12）将工作种子批菌种溶解到无菌水中，将其接种在10%羊血琼脂培养基上，放于35～37℃的环境下培养16～20小时后，挑选出健壮且无杂菌污染的菌种；将开启后的纯化种子接种到半综合液体培养基中进行活化培养；活化培养的条件为温度35～37℃、pH7.0～7.2、搅拌速度140～150r/min，培养时间为6～8h；最后将活化后的纯化种子经过三代扩增培养，即可制备数量适宜的生产用种子；其中扩增培养用培养基为半综合液体培养基中；培育条件为温度35～37℃、pH7.0～7.2、搅拌速度140～150r/min；

（13）将生产用种子接种至发酵罐培养6～12小时即可；发酵罐中培养基为半综合培养基，温度为35～37℃，培养基pH为7.0～7.2，发酵罐中搅拌速度为140～150r/min，接种量为10～15万/ml。

3.根据权利要求1所述的A群C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗活化工艺，其特征在于，所述步骤（2）的具体过程如下：

（21）将培养出的脑膜炎球菌利用甲醛杀菌，将已杀菌的培养液离心收集上清液；

（22）在上清液中加入CTAB至CTAB的终浓度为1.0g/L时为止，然后充分搅拌后静置过夜，离心收集多糖；

（23）将沉淀的多糖用氯化钙溶液搅拌3h使多糖和CTAB解离，离心收集上清液；

（24）在上清液中加入乙醇直至乙醇的体积终浓度达到25%，在2～8℃静置过夜，离心收集上清液；再在上清液中加入乙醇直至乙醇的体积终浓度达到75～80%，充分振摇使多糖沉淀，然后静置18小时以上，离心收集沉淀；

（25）用无水乙醇和丙酮各洗三次后干燥，干燥后即为粗制多糖。

4.根据权利要求1所述的A群C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗活化工艺，其特征在于，所述步骤（3）的具体过程如下：

（31）将粗制多糖溶解于8%～12%饱和中性醋酸钠溶液中，然后按体积比为1:0.8～1.2的比例加入冷酚溶液，振荡混匀后离心收集上清液，并抽提1～3次使上清液澄清；

（32）收集上清液，用超滤膜包超滤去除残余的苯酚及核酸；

（33）在超滤后的多糖溶液中加入NaCl溶液，直至NaCl终浓度为0.2～0.4mol/L，然后加入乙醇至乙醇体积终浓度为70～78%，充分混匀后2～8℃静置过夜；

（34）离心收集沉淀，然后依次用无水乙醇、丙酮各洗涤两次，干燥后即为精糖。