CN106117388A

CN106117388A - 一种a群c群脑膜炎球菌多糖的纯化方法

Info

Publication number: CN106117388A
Application number: CN201610745741.1A
Authority: CN
Inventors: 吴强; 陈元芬; 王宇
Original assignee: Chengdu Olymvax Biopharmaceuticals Inc
Current assignee: Chengdu Olymvax Biopharmaceuticals Inc
Priority date: 2016-08-29
Filing date: 2016-08-29
Publication date: 2016-11-16

Abstract

本发明公开了一种A群C群脑膜炎球菌多糖的纯化方法，包括以下步骤：（1）将脑膜炎球菌进行发酵培养并进行杀菌处理，得到已杀菌的培养液；（2）脑膜炎球菌荚膜多糖制备；（3）将粗制多糖溶进行层析洗脱，收集含有多糖的目标峰，再将收集的多糖溶液以注射用水为超滤液，用超滤膜包进行脱盐，脱盐后的溶液即为A群C群脑膜炎球菌多糖溶液，其中缓冲液A为20mM Tris‑HCl，0.5%脱氧胆酸钠，pH 8.0；缓冲液B为20mM Tris‑HCl，pH 8.0。本发明创造性的采用了层析法，避免了传统纯化方法中对苯酚的大量使用，在保证了纯化质量的基础上，有效的避免了苯酚对环境的破坏，并且多糖回收率与传统苯酚抽提法相近，操作简单，适合大规模生产。

Description

一种A群C群脑膜炎球菌多糖的纯化方法

技术领域

本发明涉及生物医药领域，更具体的说是涉及一种A群C群脑膜炎球菌多糖的纯化方法。

背景技术

流行性脑脊髓膜炎(简称流脑，下同)是一种由奈瑟氏脑膜炎球菌(Neisseriameningitidis)引起的急性呼吸道传染病。一百多年来，一直在世界各地流行或散在发生，感染病原菌后可引起败血症、脑膜炎。易感人群主要为儿童，以暴发型病死率最高，可达40%～60%。当今世界各大洲发病率在1/10万～10/10万，总病死率在5%～15%，高达20%的脑膜炎患者会有神经系统后遗症，包括智力受损和耳聋等。根据荚膜多糖型别进行血清学分类可分13个血清型，其中A群、B群、C群约占流行菌群的90%。A群脑膜炎球菌是较大流行的主要致病血清群，特别是在所谓的非洲“流脑流行带”，每隔7-14年就会出现一次较大流行。

我国于1938年、1949年、1959年、1967年和1977年曾发生过5次全国性流脑流行；其中以1967年春季流行最为严重，发病率高达403/10万，病死率为5.49%。我国过去90%以上的病例是A群病菌致病，现在B群或C群病菌有时亦引起流脑暴发。2003年开始，C群流脑的发病率明显上升。目前A群和C群共占所有血清群的50%以上，且C群仍有进一步增高的趋势。因此，目前我国预防流脑工作的重点是以预防A 群和C 群为主。

荚膜多糖是大分子物质，分离纯化比单糖或小分子寡糖复杂。在荚膜多糖的分离纯化中，需去除核酸、蛋白质、内毒素等杂质。目前国内上市的A群C群脑膜炎球菌荚膜多糖的纯化主要采用苯酚抽提，因此苯酚抽提成为了生产规模纯化荚膜多糖的主要方法。但是苯酚抽提法，需要使用大量的苯酚，对人体和环境的危害很大，而且最终的多糖制品中含有少量的苯酚残留物。

苯酚对皮肤、粘膜有强烈的腐蚀作用，可抑制中枢神经或损害肝、肾功能。吸入高浓度苯酚气体可致头痛、头晕、视物模糊，肺水肿。皮肤接触可致灼伤，可经灼伤皮肤吸收经一定潜伏期后引起急性肾功能衰竭。同时，苯酚对环境有严重危害，对水体和大气可造成污染。随着社会的进步，人们对安全和环保的标准也不断提高，因此要求以更安全有效的方法纯化细菌的荚膜多糖。

发明内容

本发明提供一种更安全有效的A群C群脑膜炎球菌多糖的纯化方法，该方法采用层析法对荚膜多糖进行纯化，有效的避免了传统的采用苯酚抽提的方式纯化细菌的荚膜多糖，即避免纯化过程对苯酚的使用，防止了荚膜多糖纯化过程中苯酚对环境的损害。

为解决上述的技术问题，本发明采用以下技术方案：

一种A群C群脑膜炎球菌多糖的纯化方法，包括以下步骤：将粗制多糖溶解于缓冲液A中，粗制多糖的溶解浓度为5～10mg/ml，溶解后的粗制多糖经澄清过滤后，上样于用缓冲液预先平衡好的DEAE-Sepharose Fast Flow层析柱，收集未吸附的流穿峰，然后上样于以缓冲液B预先平衡好的Capto Adhere层析柱，以缓冲液B作为流动相进行洗脱，收集含有多糖的目标峰，再将收集的多糖溶液以注射用水为超滤液，用超滤膜包进行脱盐，脱盐后的溶液即为A群C群脑膜炎球菌多糖溶液，其中缓冲液A为20mM Tris-HCl，0.5%脱氧胆酸钠，pH8.0；缓冲液B为20mM Tris-HCl，pH 8.0。

粗制多糖的溶解浓度为5～10mg/ml。

粗制多糖的溶解浓度为6～8mg/ml。

超滤膜包的截留分子量为300KD。

溶解后的粗制多糖需经0.45µm滤膜进行澄清过滤。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明创造性的采用了层析法，避免了传统纯化方法中对苯酚的大量使用，在保证了纯化质量的基础上，有效的避免了苯酚对环境的破坏，且多糖回收率与传统苯酚抽提法相近，操作简单，适合大规模生产。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。本发明的实施方式包括但不限于下列实施例。

实施例1

A群脑膜炎球菌多糖的纯化

将A群脑膜炎球菌粗糖溶解于缓冲液（20mM Tris-HCl，0.5%脱氧胆酸钠，pH 8.0）中，溶解浓度为5-10mg/ml。溶解后的样品经0.45µm滤膜澄清过滤后，上样于用缓冲液（20mMTris-HCl，0.5%脱氧胆酸钠，pH 8.0）预先平衡好的DEAE-Sepharose Fast Flow层析柱，收集未吸附的流穿峰，然后上样于以缓冲液（20mM Tris-HCl，pH 8.0）预先平衡好的CaptoAdhere层析柱，以20mM Tris-HCl，pH 8.0缓冲液作为流动相进行洗脱，收集含有多糖的目标峰。然后将收集的多糖溶液以注射用水为超滤液，用截留分子量为300KD的超滤膜包进行脱盐。脱盐后的溶液即为A群C群脑膜炎球菌多糖溶液，取样检测质量指标。由下表可见，制得的三批C群多糖的各项质量指标均符合药典要求。

实施例2

C群脑膜炎球菌多糖制备

将C群脑膜炎球菌粗糖溶解于缓冲液（20mM Tris-HCl，0.5%脱氧胆酸钠，pH 8.0）中，溶解浓度为6-8mg/ml。溶解后的样品经0.45µm滤膜澄清过滤后，上样于用缓冲液（20mM Tris-HCl，0.5%脱氧胆酸钠，pH 8.0）预先平衡好的DEAE-Sepharose Fast Flow层析柱，收集未吸附的流穿峰，然后上样于以缓冲液（20mM Tris-HCl，pH 8.0）预先平衡好的Capto Adhere层析柱，以20mM Tris-HCl，pH 8.0缓冲液作为流动相进行洗脱，收集含有多糖的目标峰。然后将收集的多糖溶液以注射用水为超滤液，用截留分子量为300KD的超滤膜包进行脱盐。脱盐后的溶液即为A群C群脑膜炎球菌多糖溶液，取样检测质量指标。由下表可见，制得的三批C群多糖的各项质量指标均符合药典要求。

按照上述的实施例，即可很好的完成本发明。

如上所述即为本发明的实施例。本发明不局限于上述实施方式，任何人应该得知在本发明的启示下做出的结构变化，凡是与本发明具有相同或相近的技术方案，均落入本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种A群C群脑膜炎球菌多糖的纯化方法，其特征在于，将粗制多糖溶解于缓冲液A中，溶解后的粗制多糖经澄清过滤后，上样于用缓冲液预先平衡好的DEAE-Sepharose FastFlow层析柱，收集未吸附的流穿峰，然后上样于以缓冲液B预先平衡好的Capto Adhere层析柱，以缓冲液B作为流动相进行洗脱，收集含有多糖的目标峰，再将收集的多糖溶液以注射用水为超滤液，用超滤膜包进行脱盐，脱盐后的溶液即为A群C群脑膜炎球菌多糖溶液，其中缓冲液A为20mM Tris-HCl，0.5%脱氧胆酸钠，pH 8.0；缓冲液B为20mM Tris-HCl，pH 8.0。

2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，粗制多糖的溶解浓度为5～10mg/ml。

3.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤（3）中粗制多糖的溶解浓度为6～8mg/ml 。

4.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤（3）中溶解后的粗制多糖需经0.45µm滤膜进行澄清过滤。

5.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤（3）中超滤膜包的截留分子量为300KD。