CN102633897B - b型流感嗜血杆菌荚膜多糖纯化工艺 - Google Patents

Abstract

本发明公开了b型流感嗜血杆菌荚膜多糖纯化工艺，它包括以下步骤：a.用缓冲液A平衡离子交换层析柱2个柱体积；b.用20mMTirs，1%（w/v）脱氧胆酸钠，pH8.0溶液溶解粗多糖，过滤后，将滤液上样于已经平衡好的离子交换层析柱；c.用缓冲液A和缓冲液B的线性梯度洗脱，收集206nm吸收值较高，280nm吸收值较低的洗脱峰；d.将收集的洗脱峰上样于平衡好的SephadexG-25凝胶柱，收集206nm的吸收峰。本发明的有益效果是：质量指标可达到行业标准，纯化过程不使用苯酚，避免了对人体健康和环境造成的危害，减少了处理步骤中可能造成的污染与损失，操作简单、方便，有利于规模化生产。

Description

b型流感嗜血杆菌荚膜多糖纯化工艺

技术领域

本发明涉及荚膜多糖纯化技术领域，特别是一种b型流感嗜血杆菌荚膜多糖纯化工艺。

背景技术

流感嗜血杆菌迄今仍是导致人类侵袭性疾病的主要致病菌，其中绝大部分由b型流感嗜血杆菌(Hib)引起，是导致2岁以下婴幼儿脑膜炎和细菌性肺炎的主要病因。全世界估计每年至少造成300万例严重疾病和40万～70万人死亡，已成为全球性的一大公共卫生问题。在工业化国家和发展中国家，疫苗接种都是唯一能迅速降低Hib疾病发病的公共卫生措施。将Hib疫苗纳入儿童常规免疫规划的国家多数在数年内就实际上消除了Hib严重病例。由于细菌对一些最有效的抗生素耐药性正在不断增加，通过疫苗预防Hib疾病就变得比以往更为重要。

在Hib疫苗制备的过程中，荚膜多糖的制备是关键的步骤。在我国多采用和流行性脑膜炎球菌以及伤寒Vi多糖提取相似的工艺来提取Hib荚膜多糖。此工艺采用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)与酸性多糖形成季胺络合物从而沉淀多糖。但是CTAB对核酸、蛋白质也有不同程度的沉淀作用，因此要获得纯度较高的荚膜多糖，必须进一步去除一起沉淀的核酸和蛋白质。常规的去除蛋白质的方法是将Hib粗制多糖溶解于饱和中性醋酸钠溶液中，然后用冷酚溶液抽提，根据粗制多糖中含有的蛋白的情况，此步骤通常需要重复数次。该工艺的缺点是会使用大量的苯酚，苯酚是一种强腐蚀性的高毒性物质，对人的皮肤和粘膜有强烈的腐蚀作用，可抑制中枢神经或损害肝、肾功能。人吸入高浓度苯酚气体可致头痛、头晕、乏力、视物模糊、肺水肿等。皮肤接触可致灼伤。可经灼伤皮肤吸收，经一定潜伏期后引起急性肾功能衰竭。同时，该工艺会产生大量的废弃苯酚，对水体和大气可造成污染，对环境有严重危害。随着对环保意识的增强，以及对工人工作环境状况的重视，人们一直在寻找合适的方法来避免在疫苗制造过程中使用象苯酚这样有毒的化学试剂。使用现代的技术对传统的生产工艺进行改进以减少或弃用有毒化学试剂对于保护人类健康以及减少环境污染都具有重要的意义。

Hib粗多糖的制备参照文献公开的方法(Anderson等，1977.INFECTION AND IMMUNITY.15(2)：472～477)。培养基采用CY培养基，1升培养基含10g酸水解酪蛋白，5g酵母提取物，5g葡萄糖，1mg氯化血红素，1mg辅酶I，0.1M磷酸盐缓冲液，培养基的pH值为7.6。培养温度为37℃，振荡速度为220rpm，待菌种浓度OD₆₆₀为0.5后接种至发酵罐继续培养，维持培养温度37℃，搅拌速度150rpm，培养8～10h后加入浓度为0.5％(v/v)的甲醛杀菌，收获时菌液浓度OD₆₆₀＞4.0。

杀菌后的培养液采用10000rpm离心30min沉淀菌体，收集上清液。将CTAB加入上清液中，CTAB与上清液的重量体积比(w/v)为1∶1000，室温搅拌1h，得到的混合液10000rpm离心30min后收集CTAB与Hib荚膜多糖的复合物沉淀。沉淀用0.5～1M氯化钠溶液溶解，室温搅拌2小时，使Hib荚膜多糖与CTAB解离。加入4℃预冷的无水乙醇至乙醇终浓度为25％(v/v)，4℃搅拌过夜。10000rpm离心30min，收集上清液，上清液中继续加入无水乙醇至乙醇终浓度为75％(v/v)，4℃搅拌过夜，10000rpm离心30min，收集沉淀。沉淀用无水乙醇和丙酮各洗涤两次，最终得到的沉淀即为Hib荚膜多糖粗多糖。

国外的Pato等人(Pato等，2006.Purification of capsular polysaccharide from Neisseriameningitides serogroup C by liquid chromatography.Jouranl of Chromatography B.832：262)通过层析法对C群流脑荚膜多糖进行了了纯化探索。

根据b型流感嗜血杆菌荚膜多糖可以用阳离子型去污剂十六烷基三甲基溴化铵沉淀这一现象推断该类多糖是带有负电荷的酸性多糖，按照离子交换层析的理论可以选用阴离子交换层析进行纯化。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种安全有效、减轻对人体和环境危害的b型流感嗜血杆菌荚膜多糖纯化工艺。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：

b型流感嗜血杆菌荚膜多糖纯化工艺，它包括以下步骤：

a、用缓冲液A平衡离子交换层析柱2个柱体积直至电导基线平稳并且与上柱之前的缓冲液的电导值一致；

b、用20mM Tirs，1％(w/v)脱氧胆酸钠，pH8.0溶液溶解粗多糖，使得溶解后的溶液中多糖浓度为5～10mg/ml，用0.45μm的滤膜澄清过滤后，将滤液上样于已经平衡好的离子交换层析柱；

c、采用缓冲液A和缓冲液B的线性梯度洗脱，监测吸收波长为206nm和280nm的吸收曲线，收集206nm吸收值较高，280nm吸收值较低的洗脱峰；

d、将收集的洗脱峰上样于预先用生理盐水平衡好的Sephadex G-25凝胶柱，监测吸收波长为206nm的吸收曲线，收集206nm的吸收峰，即得b型流感嗜血杆菌荚膜多糖纯化样品。

所述的缓冲液A为20mM Tirs，pH8.0溶液；所述的缓冲液B为20mM Tris，1M NaCl，pH8.0溶液。

本发明具有以下优点：

1、本发明制备的Hib多糖的质量指标可达到行业标准。

2、本发明的纯化过程不使用苯酚，避免了对人体健康和环境造成的危害。

3、本发明通过凝胶过滤层析改变离子交换洗脱液的缓冲体系，使所获得的洗脱液可以直接用于制剂的配制，而无须采用透析等其他改换溶液体系的处理，减少了处理步骤中可能造成的污染与损失。

4、本发明操作简单、方便，有利于规模化生产。

本发明制备的b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的质量指标如下表：

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的描述：

实施例1：

b型流感嗜血杆菌荚膜多糖纯化工艺，包括以下步骤：

a、装填一根离子交换层析柱(1.6cm×10cm)，用缓冲液A平衡离子交换层析柱2个柱体积直至电导基线平稳，所述的缓冲液A为20mM Tirs，pH8.0溶液；所述的缓冲液B为20mMTris，1M NaCl，pH8.0溶液。；

b、称取粗多糖50mg，溶解于10ml的20mM Tirs，1％(w/v)脱氧胆酸钠，pH8.0溶液中，室温搅拌1小时，用0.45μm的滤膜过滤后，将滤液上样于已经平衡好的离子交换层析柱；

c、上样完成后先用缓冲液A洗2个柱体积洗脱未结合的物质，用缓冲液A和缓冲液B的线性梯度洗脱，监测206nm和280nm的吸收曲线，分部收集206nm吸收值较高，280nm吸收值较低的洗脱峰，再生层析柱；

d、预先装填一根Sephadex G-25凝胶柱(5cm×20cm)，用生理盐水平衡层析柱直至OD206nm基线平稳，然后将收集的洗脱液上样于Sephadex G-25凝胶柱上，用生理盐水作为流动相洗脱，收集洗脱峰，最终得到b型流感嗜血杆菌荚膜多糖精糖原液。

实施例2：

b型流感嗜血杆菌荚膜多糖纯化工艺，包括以下步骤：

a、装填一根离子交换层析柱(1.6cm×10cm)，用缓冲液A平衡离子交换层析柱2个柱体积直至电导基线平稳，所述的缓冲液A为20mM Tirs，pH8.0溶液；所述的缓冲液B为20mMTris，1M NaCl，pH8.0溶液。；

b、称取粗多糖80mg，溶解于10ml的20mM Tirs，1％(w/v)脱氧胆酸钠，pH8.0溶液中，室温搅拌1小时，用0.45μm的滤膜过滤后，将滤液上样于已经平衡好的离子交换层析柱；

c、上样完成后先用缓冲液A洗2个柱体积洗脱未结合的物质，用缓冲液A和缓冲液B的线性梯度洗脱，监测206nm和280nm的吸收曲线，分部收集206nm吸收值较高，280nm吸收值较低的洗脱峰，再生层析柱；

d、预先装填一根Sephadex G-25凝胶柱(5cm×20cm)，用生理盐水平衡层析柱直至OD206nm基线平稳，然后将收集的洗脱液上样于Sephadex G-25凝胶柱上，用生理盐水作为流动相洗脱，收集洗脱峰，最终得到b型流感嗜血杆菌荚膜多糖精糖原液。

实施例3：

b型流感嗜血杆菌荚膜多糖纯化工艺，包括以下步骤：

a、装填一根离子交换层析柱(1.6cm×10cm)，用缓冲液A平衡离子交换层析柱2个柱体积直至电导基线平稳，所述的缓冲液A为20mM Tirs，pH8.0溶液；所述的缓冲液B为20mMTris，1M NaCl，pH8.0溶液。；

b、称取粗多糖100mg，溶解于10ml的20mM Tirs，1％(w/v)脱氧胆酸钠，pH8.0溶液中，室温搅拌1小时，用0.45μm的滤膜过滤后，将滤液上样于已经平衡好的离子交换层析柱；

c、上样完成后先用缓冲液A洗2个柱体积洗脱未结合的物质，用缓冲液A和缓冲液B的线性梯度洗脱，监测206nm和280nm的吸收曲线，分部收集206nm吸收值较高，280nm吸收值较低的洗脱峰，再生层析柱；

d、预先装填一根Sephadex G-25凝胶柱(5cm×20cm)，用生理盐水平衡层析柱直至OD206nm基线平稳，然后将收集的洗脱液上样于Sephadex G-25凝胶柱上，用生理盐水作为流动相洗脱，收集洗脱峰，最终得到b型流感嗜血杆菌荚膜多糖精糖原液。

Claims (1)

1.b型流感嗜血杆菌荚膜多糖纯化工艺，其特征在于：它包括以下步骤：

a、用20mM Tris，pH8.0缓冲液A平衡离子交换层析柱2个柱体积直至电导基线平稳并且与上柱之前的缓冲液的电导值一致；

b、用20mM Tris，1%（w/v）脱氧胆酸钠，pH8.0溶液溶解粗多糖，使得溶解后的溶液中多糖浓度为5～10mg/ml，用0.45μm的滤膜澄清过滤后，将滤液上样于已经平衡好的离子交换层析柱；

c、采用20mM Tris，pH8.0缓冲液A和20mM Tris，1M NaCl，pH8.0缓冲液B线性梯度洗脱上样后的离子交换层析柱，监测吸收波长为206nm和280nm的吸收曲线，收集206nm吸收值较高，280nm吸收值较低的洗脱峰；

d、将收集的洗脱峰上样于预先用生理盐水平衡好的Sephadex G-25凝胶柱，监测吸收波长为206nm的吸收曲线，收集206nm的吸收峰，即得b型流感嗜血杆菌荚膜多糖纯化样品。