CN109021136A - 一种b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的制备工艺 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的制备工艺，属于革兰氏阴性细菌荚膜多糖技术领域。本发明方法将发酵液仅需通过离心、浓缩、除杂、超滤4步，并且无需柱层析即可得到b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的精糖溶液。该制备工艺避免了苯酚、乙醇、丙酮及外源蛋白的使用，安全有效，极大地降低了对人体及环境的危害。本发明制备的b型流感嗜血杆菌荚膜多糖精糖溶液中精糖的各项指标均符合药典要求；工艺简单稳定，重现性好，对厂房设备要求较低，且成本低廉，适于大规模的生产。

Description

一种b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的制备工艺

技术领域

本发明属于革兰氏阴性细菌荚膜多糖技术领域，具体涉及一种b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的制备工艺。

背景技术

b型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae type b, Hib)，是引起小儿细菌性脑膜炎和急性呼吸道传染病的主要致病菌，也可导致败血症、会厌炎、脊髓炎等多种侵袭性疾病。目前，Hib结合疫苗是国际公认的最为有效的细菌性疫苗之一。根据2015版中国药典可以知道，目前上市的Hib结合疫苗，在多糖提取过程中普遍使用的是冷酚抽提法。该方法的主要缺点是苯酚的大量使用，苯酚属高毒类物质，对实验操作人员及自然环境造成严重危害，而乙醇、丙酮虽然毒性相对较低，但其易燃易爆，生产厂房建设是需考虑防爆装置，增加生产成本。为此，人们不断寻找新方法来替代传统工艺中这些危险有毒试剂的使用，这对于操作人员的身体健康及自然环境的保护具有重要的现实意义，同时可以极大地降低或避免了多糖或结合疫苗中残留试剂所存在的安全隐患。

目前研究较多的方法主要是利用柱层析对多糖进行纯化，2006年，Pato等人（Purification of capsular polysaccharide from Neisseria meningitides serogroup C byliquid chromatography, Journal of Chromatography B, 832, 262–267）利用柱层析法对C群流脑荚膜多糖进行了纯化研究，而国内研究人员[层析法去除Ａ群流脑多糖疫苗粗糖中杂蛋白. 中国生物工程杂志, 2010, 30(8):88-92]对A群流脑荚膜多糖也进行了纯化研究。2011年Anrdrew等对Hib多糖利用分步柱层析的简单方法获得合格精糖（SIMPLE METHODFOR SIMULTANEOUS REMOVAL OF MULTIPLE IMPURITIES FROM CULTURE SUPERNATANTS TOULTRALOW LEVELS, 2011, US 20110263834M）。虽然柱层析方法所得精糖检测指标均符合要求，但此方法受层析柱载样量的限制，大规模生产时花费时间较长，填料的活化处理麻烦费时长，填料浪费较大，且柱层析需要纯化仪器，设备要求成本较高。

2012年Silvia等（Improvement in the Purification Process of theCapsular Polysaccharide from Haemophilus influenzae Type b by UsingTangential Ultrafiltration and Diafiltration. Appl Biochem Biotechnol, 2012,167:2068–2075.）利用超滤、醇沉、酶解等方法获得合格Hib精糖，该方法虽杜绝了苯酚的使用，但仍不可避免地使用了乙醇，且还引入了外源蛋白进行酶解。同样，本实验室于2014年申请了Hib多糖纯化的专利（一种b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的制备方法, 2014,ZL20141068453.2），其中，利用非离子表面活性剂/硫酸铵抽提法可以有效去除杂蛋白，能够达到替代苯酚的作用，但过程中仍使用了乙醇、丙酮等有机试剂。因此，b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的提取有待进一步优化，以期达到杜绝苯酚、乙醇、丙酮等高毒、易燃易爆试剂的使用，同时也无需再次添加外源蛋白，建立更高标准的绿色环保、安全有效的制备工艺。

发明内容

为克服目前纯化技术所存在的上述缺点，本发明提供了一种b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的制备工艺，该工艺安全有效，成本低廉，且对人体及环境无害。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的制备工艺，包括如下步骤：

a、离心：将b型流感嗜血杆菌荚发酵液灭活后离心，取上清液；

b、浓缩：用中空纤维滤柱对步骤a得到的上清液进行浓缩，得到发酵浓缩液；

c、除杂：将发酵浓缩液离心，取上清液，然后添加终浓度为1～30 w/v%的非离子表面活性剂，搅拌至混合均匀，然后添加终浓度为20 w/v%至饱和的硫酸铵，搅拌至混合均匀，再次离心，取下层溶液，即为多糖提取液；

所述的非离子表面活性剂为曲拉通X-100、曲拉通X-114、吐温-80和乙基苯基聚乙二醇中1种或几种的组合；

d、超滤：将步骤c所得多糖提取液经截留分子量为50～100 KD超滤膜超滤，然后向截留液中加入PBS缓冲液或Tris–HCl缓冲液并继续透过该超滤膜超滤以清洗截留液，重复清洗多次；再向截留液中加入洗脱液并继续透过该超滤膜超滤以清洗截留液，重复清洗多次；之后向截留液中加入PBS缓冲液或Tris–HCl缓冲液并继续透过该超滤膜超滤以清洗截留液，重复清洗多次；接着向截留液中加入生理盐水并继续透过该超滤膜超滤以清洗截留液，重复清洗多次，最终所得到的截留液为b型流感嗜血杆菌荚膜多糖溶液；

所述的洗脱液为PBS缓冲液或Tris-HCl缓冲液中添加0.05～0.5 w/v%脱氧胆酸钠和1～10 mM 乙二胺四乙酸二钠。

进一步，优选的是，步骤a中，所述的离心具体是8000～10000 rpm离心30～60min。

进一步，优选的是，步骤b中，中空纤维滤柱的截留分子量为100 KD。

进一步，优选的是，步骤b中，每次超滤均是浓缩至体积为原上清液体积的1/10～1/20，然后加入相应的液体至原多糖提取液体积。

进一步，优选的是，步骤c中，两次离心均是在8000～10000 rpm下进行离心15～60min。

进一步，优选的是，步骤c中，两次搅拌的时间均为15～60 min。

进一步，优选的是，步骤d中，重复清洗的次数均为1-5次。

进一步，优选的是，步骤d中，PBS缓冲液的浓度为200 mM。

进一步，优选的是，步骤d中，Tris–HCl缓冲液中含25 mM Tris–HCl，150 mM NaCl。

进一步，优选的是，步骤d中，每次超滤均是浓缩至体积为原多糖提取液体积的1/10～1/20，然后加入相应的液体至原多糖提取液体积。

所述步骤a～d均无苯酚、乙醇、丙酮试剂及外源蛋白酶的添加。

本发明是在前人及本实验室前期专利工作的基础上，针对多糖纯化过程中的各种杂质，利用非离子表面活性剂、硫酸铵、超滤等技术方法，进行重新组合设计，建立完善了一种简单的制备工艺，完全达到了预期目标。该技术简化、优化并深化了原来的专利技术，并且该工艺可以拓展应用于其他细菌荚膜多糖纯化工艺。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：

1、本发明制备的b型流感嗜血杆菌荚膜多糖各项指标均符合药典要求，且纯度高，杂质残留要远低于药典要求，经核磁检测本发明制备的b型流感嗜血杆菌荚膜多糖在结构上与传统方法完全一致；

2、本发明最大优点在于：在原来专利中杜绝苯酚使用的基础上，进一步避免了乙醇、丙酮的使用，且不会引入外源蛋白，整体工艺对人体及环境友好，后期质量可控；

3、本发明流程简单，仅需离心、浓缩、抽提、超滤四步即可得到合格产品，操作简便，无需柱层析，样品处理量大，工艺稳定，可线性放大，且对厂房设备要求低，成本低廉，适于大规模的生产。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。

本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

本发明所述的b型流感嗜血杆菌荚发酵液是Hib菌株经发酵罐发酵后获得发酵菌液。

本发明中w/v为质量与体积比，单位为g/ml。

实施例1

a、Hib菌株经100 L发酵罐发酵后获得发酵菌液，将菌液灭活后10000 rpm离心30 min，取上清液，为发酵液；

b、将步骤a所得发酵液用100 KD分子量的中空纤维滤柱进行浓缩，浓缩至原上清液体积的1/10，得到发酵浓缩液；

c、在步骤b所得发酵浓缩液在8000 rpm下进行离心分离60 min，取上清液，然后添加终浓度为10%（w/v）的曲拉通 X-100，搅拌40 min，然后添加终浓度为25%（w/v）的硫酸铵，搅拌30 min，10000 rpm离心30 min，取下层溶液，即为多糖提取液；

d、超滤：将步骤c所得多糖提取液经截留分子量为100 KD超滤膜超滤，然后向截留液中加入PBS缓冲液并继续透过该超滤膜超滤以清洗截留液，重复清洗1次；再向截留液中加入洗脱液并继续透过该超滤膜超滤以清洗截留液，重复清洗1次；之后向截留液中加入PBS缓冲液并继续透过该超滤膜超滤以清洗截留液，重复清洗1次；接着向截留液中加入生理盐水并继续透过该超滤膜超滤以清洗截留液，重复清洗1次，最终所得到的截留液为b型流感嗜血杆菌荚膜多糖溶液；

所述的洗脱液为PBS缓冲液中添加0.05w/v%脱氧胆酸钠和1 mM 乙二胺四乙酸二钠。

其中，PBS缓冲液的浓度为200 mM。

每次超滤均是浓缩至体积为原多糖提取液体积的1/10，然后加入相应的液体至原多糖提取液体积。

实施例2

a、Hib菌株经100 L发酵罐发酵后获得发酵菌液，将菌液灭活后8000 rpm离心30 min，取上清液，为发酵液；

b、将步骤a所得发酵液用100 KD分子量的中空纤维滤柱进行浓缩，浓缩至原上清液体积的1/15，得到发酵浓缩液；

c、在步骤b所得发酵浓缩液在9000 rpm下进行离心分离40 min，取上清液，然后添加终浓度为17%（w/v）的曲拉通 X-114和曲拉通 X-100（二者质量比为1：1），搅拌15min，然后添加终浓度为20%（w/v）的硫酸铵，搅拌15 min，8000 rpm离心60 min，取下层溶液，即为多糖提取液；

d、超滤：将步骤c所得多糖提取液经截留分子量为50 KD超滤膜超滤，然后向截留液中加入Tris–HCl缓冲液并继续透过该超滤膜超滤以清洗截留液，重复清洗5次；再向截留液中加入洗脱液并继续透过该超滤膜超滤以清洗截留液，重复清洗5次；之后向截留液中加入Tris–HCl缓冲液并继续透过该超滤膜超滤以清洗截留液，重复清洗5次；接着向截留液中加入生理盐水并继续透过该超滤膜超滤以清洗截留液，重复清洗5次，最终所得到的截留液为b型流感嗜血杆菌荚膜多糖溶液；

所述的洗脱液为Tris-HCl缓冲液中添加0.05～0.5 w/v%脱氧胆酸钠和1～10 mM 乙二胺四乙酸二钠。

其中，Tris–HCl缓冲液中含25 mM Tris–HCl，150 mM NaCl。

每次超滤均是浓缩至体积为原多糖提取液体积的1/20，然后加入相应的液体至原多糖提取液体积。

实施例3

a、Hib菌株经100 L发酵罐发酵后获得发酵菌液，将菌液灭活后8000 rpm离心60 min，取上清液，为发酵液；

b、将步骤a所得发酵液用100 KD分子量的中空纤维滤柱进行浓缩，浓缩至原上清液体积的1/15，得到发酵浓缩液；

c、在步骤b所得发酵浓缩液在8000 rpm下进行离心分离50 min，取上清液，然后添加终浓度为1%（w/v）的吐温-80，搅拌30 min，然后添加终浓度为30%（w/v）的硫酸铵，搅拌60min，9000 rpm离心50 min，取下层溶液，即为多糖提取液；

d、超滤：将步骤c所得多糖提取液经截留分子量为100 KD超滤膜超滤，然后向截留液中加入PBS缓冲液并继续透过该超滤膜超滤以清洗截留液，重复清洗2次；再向截留液中加入洗脱液并继续透过该超滤膜超滤以清洗截留液，重复清洗2次；之后向截留液中加入Tris–HCl缓冲液并继续透过该超滤膜超滤以清洗截留液，重复清洗3次；接着向截留液中加入生理盐水并继续透过该超滤膜超滤以清洗截留液，重复清洗3次，最终所得到的截留液为b型流感嗜血杆菌荚膜多糖溶液；

所述的洗脱液为Tris-HCl缓冲液中添加0.1 w/v%脱氧胆酸钠和6 mM 乙二胺四乙酸二钠。

其中，PBS缓冲液的浓度为200 mM。

Tris–HCl缓冲液中含25 mM Tris–HCl，150 mM NaCl。

每次超滤均是浓缩至体积为原多糖提取液体积的1/15，然后加入相应的液体至原多糖提取液体积。

实施例4

a、Hib菌株经100 L发酵罐发酵后获得发酵菌液，将菌液灭活后9000 rpm离心40 min，取上清液，为发酵液；

b、将步骤a所得发酵液用100 KD分子量的中空纤维滤柱进行浓缩，浓缩至原上清液体积的1/20，得到发酵浓缩液；

c、在步骤b所得发酵浓缩液在10000 rpm下进行离心分离30 min，取上清液，然后添加终浓度为30%（w/v）的乙基苯基聚乙二醇，搅拌60 min，然后添加硫酸铵至饱和，搅拌30min，10000 rpm离心45 min，取下层溶液，即为多糖提取液；

d、超滤：将步骤c所得多糖提取液经截留分子量为80 KD超滤膜超滤，然后向截留液中加入Tris–HCl缓冲液并继续透过该超滤膜超滤以清洗截留液，重复清洗4次，每次超滤均是浓缩至体积为原多糖提取液体积的1/18，然后加入Tris–HCl缓冲液至原多糖提取液体积；再向截留液中加入洗脱液并继续透过该超滤膜超滤以清洗截留液，重复清洗2次，每次超滤均是浓缩至体积为原多糖提取液体积的1/12，然后加入洗脱液至原多糖提取液体积；之后向截留液中加入PBS缓冲液并继续透过该超滤膜超滤以清洗截留液，重复清洗3次，每次超滤均是浓缩至体积为原多糖提取液体积的1/15，然后加入PBS缓冲液至原多糖提取液体积；接着向截留液中加入生理盐水并继续透过该超滤膜超滤以清洗截留液，重复清洗2次，每次超滤均是浓缩至体积为原多糖提取液体积的1/16，然后加入生理盐水至原多糖提取液体积，最终所得到的截留液为b型流感嗜血杆菌荚膜多糖溶液；

所述的洗脱液为PBS缓冲液中添加0.2 w/v%脱氧胆酸钠和8 mM 乙二胺四乙酸二钠。

其中，PBS缓冲液的浓度为200 mM。

Tris–HCl缓冲液中含25 mM Tris–HCl，150 mM NaCl。

实施例1～4制备的各b型流感嗜血杆菌荚膜多糖按照2015版中国药典要求，对其质量指标进行检测，其结果如表1。

表1 本发明制备的b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的质量指标检测结果

由上表可知，本发明制备的b型流感嗜血杆菌荚膜多糖各项指标均符合药典要求，且纯度高，与现有技术相比，避免了苯酚、乙醇、丙酮及外源蛋白的使用，绿色环保，安全有效，工艺简单，样品处理量大，适用于大规模使用。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (10)

1.一种b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的制备工艺，其特征在于，包括如下步骤：

a、离心：将b型流感嗜血杆菌荚发酵液灭活后离心，取上清液；

b、浓缩：用中空纤维滤柱对步骤a得到的上清液进行浓缩，得到发酵浓缩液；

c、除杂：将发酵浓缩液离心，取上清液，然后添加终浓度为1～30 w/v%的非离子表面活性剂，搅拌至混合均匀，然后添加终浓度为20 w/v%至饱和的硫酸铵，搅拌至混合均匀，再次离心，取下层溶液，即为多糖提取液；

所述的非离子表面活性剂为曲拉通X-100、曲拉通X-114、吐温-80和乙基苯基聚乙二醇中1种或几种的组合；

d、超滤：将步骤c所得多糖提取液经截留分子量为50～100 KD超滤膜超滤，然后向截留液中加入PBS缓冲液或Tris–HCl缓冲液并继续透过该超滤膜超滤以清洗截留液，重复清洗多次；再向截留液中加入洗脱液并继续透过该超滤膜超滤以清洗截留液，重复清洗多次；之后向截留液中加入PBS缓冲液或Tris–HCl缓冲液并继续透过该超滤膜超滤以清洗截留液，重复清洗多次；接着向截留液中加入生理盐水并继续透过该超滤膜超滤以清洗截留液，重复清洗多次，最终所得到的截留液为b型流感嗜血杆菌荚膜多糖溶液；

所述的洗脱液为PBS缓冲液或Tris-HCl缓冲液中添加0.05～0.5 w/v%脱氧胆酸钠和1～10 mM 乙二胺四乙酸二钠。

2.根据权利要求1所述的b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的制备工艺，其特征在于：步骤a中，所述的离心具体是8000～10000 rpm离心30～60 min。

3.根据权利要求1所述的b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的制备工艺，其特征在于：步骤b中，中空纤维滤柱的截留分子量为100 KD。

4.根据权利要求1所述的b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的制备工艺，其特征在于：步骤b中，浓缩至体积为原上清液体积的1/10～1/20。

5.根据权利要求1所述的b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的制备工艺，其特征在于：步骤c中，两次离心均是在8000～10000 rpm下进行离心15～60 min。

6.根据权利要求1所述的b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的制备工艺，其特征在于：步骤c中，两次搅拌的时间均为15～60 min。

7.根据权利要求1所述的b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的制备工艺，其特征在于：步骤d中，重复清洗的次数均为1-5次。

8.根据权利要求1所述的b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的制备工艺，其特征在于：步骤d中，PBS缓冲液的浓度为200 mM。

9.根据权利要求1所述的b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的制备工艺，其特征在于：步骤d中，Tris–HCl缓冲液中含25 mM Tris–HCl，150 mM NaCl。

10.根据权利要求1所述的b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的制备工艺，其特征在于：步骤d中，每次超滤均是浓缩至体积为原多糖提取液体积的1/10～1/20，然后加入相应的液体至原多糖提取液体积。