CN1440980A - 甘露聚糖肽及其制备工艺和用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种甘露聚糖肽，具体地说，它是来自于α－溶血性链球菌(Streptococcus hemolyticus－α－Hemolysis)的发酵产物。这种甘露聚糖肽重均分子量为1～20万，分子量分布系数为4.0以下，本发明还提供了甘露聚糖肽的制备工艺和用途。

Description

甘露聚糖肽及其制备工艺和用途

                           技术领域

本发明提供一种甘露聚糖肽及其制备工艺和用途，具体地说，是来自于α-溶血性链球菌(Streptococcus hemolyticus-α-Hemolysis)的发酵产物的一定重均分子量范围的甘露聚糖肽及其制备工艺和用途。

                           背景技术

随着环境的改变，人类肿瘤的发生率不断提高，发生年龄也较过去降低，寻找安全、有效的抗肿瘤药物是人类一直努力的目标。

通过人体防御机理进行肿瘤治疗，是70年代末期由美国国立癌症研究所提倡，80年代在世界范围内逐渐开展，日本在采用免疫激活剂抗肿瘤的研究和开发方面走在前列，已批准生产上市的溶血性链球菌(OK-432)的链球菌制剂1975年上市，云芝胞内多糖(PSK即Krestin)真菌多糖制剂1977年上市，两种药品的销售额每年达1000亿日元，行销世界，销售额占日本抗肿瘤药品的一半，1985年十二月又批准上市的香菇多糖注射剂，正在申请批准的Sohizop-hyllan(SPG)系列皱菌属提取的葡聚糖注射剂、ruburatin诺卡氏菌菌体注射剂和bestatin(苯丁异亮氨酸)口服剂，还有十种类似的免疫激活剂正在临床研究。这类药物能激活机体的免疫功能，通过改变肿瘤宿主对肿瘤细胞的反应能力，改变肿瘤细胞与宿主的关系，以达到治疗肿瘤疾患的效果。日本的溶血性链球菌SU(OK-432)是减毒的溶血性链球菌菌体悬浮于青霉素中的一种生物制剂，副反应较重，主要副反应是发热，注射部位疼痛及细胞减少而应用受限。

中国专利98121898公开了“一种复合甘露聚糖肽口服液”，该口服液中含有多种成分，其甘露聚糖肽分别来自担子真菌、隔担子真菌、多孔目真菌，伞科真菌，成分较为复杂，口服剂量大。

寻找一种新的疗效确切、成分清楚、方便服用的抗肿瘤药物十分必要。

                           发明内容

本发明的目的是提供一种甘露聚糖肽，它是从α-溶血性链球菌(Streptococcus hemolyticus-α-hemolysis)的发酵产物中分离提取精制而成。

本发明的另一目的是提供该甘露聚糖肽的制备以及用途。

本发明提供一种甘露聚糖肽，主要由甘露聚糖肽组成，其重均分子量为1～20万，分子量分布系数在4.0以下，比旋光度为+60°至+90°。

它来自于α-溶血性链球菌(Streptococcus hemolyticus-α-Hemolysis)的发酵产物。

本发明还提供了甘露聚糖肽的制备方法，包含下列步骤：

a、以α-溶血性链球菌(Streptococcus hemolyticus-α-hemolysis)为生产菌进行发酵；

b、从发酵液提取甘露聚糖肽；

c、进一步分离得到重均分子量为1～20万，分子量分布系数在4.0以下的甘露聚糖肽。

其中还包含步骤d、干燥。

在步骤b中，PH值保持为1.5至6.0；提取溶剂为60％～99.9％的乙醇。

本发明还提供了甘露聚糖肽在制备免疫增强药物中的用途。具体的说，所述的免疫增强药物是肿瘤辅助治疗药物。它还是治疗反复呼吸道感染的药物，它也是治疗白细胞减少症的药物，它还是治疗再生障碍性贫血的药物。

本发明还提供了一种药物组合物，由有效量甘露聚糖肽与药学上可接受的辅助添加成分混合而成。

甘露聚糖肽具有升高白细胞及增强机体免疫功能的作用，临床主要用于免疫功能低下、反复呼吸道感染、白细胞减少症和再生障碍性贫血及肿瘤的辅助治疗，也可作为肿瘤辅助治疗，减轻放、化疗对造血系统的副作用和胃肠道反应。

通常，α-溶血性链球菌(Streptococcus hemolyticus-α-hemolysis)的发酵产物中的甘露聚糖肽是重均分子量为1万至100万的甘露聚糖肽的混合物，研究者对各种重均分子量范围的甘露聚糖肽的药理活性进行研究，发现截流的重均分子量为1～20万的甘露聚糖肽的药理活性较原有的重均分子量为1至100万的甘露聚糖肽高，且毒性小，因此以本发明的甘露聚糖肽为药理活性物质制备药物，其成分更加清楚，疗效更好，安全性更高，截流方法简单，成本低。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

                           具体实施方式实例1甘露聚糖肽的制备：

发酵过程：i、菌种的制备：选用菌种是α-溶血性链球菌(Streptococcushemolyticus-α-hemolysis)；

培养基：    菌种培养基：葡萄糖0.4-0.8％、氯化钠0.4-0.8％、蛋白

            胨0.4-1％、牛肉膏0.1-0.5％、绵羊血10％、琼脂1.5-2％、

            PH7.2-7.8

发酵培养基：葡萄糖0.1-0.5％、蛋白胨0.4-0.7％、酵母膏0.4-0.6％、

            氯化钠0.4-0.8％、泡敌0.01％

提取、精制过程所需原辅材料：酒精、丙酮、三氯乙酸、无水乙醇

a、母瓶制备：启封菌种冷冻管，用无菌肉汤培养基稀释，在无菌条件下接入血斜面。18-45℃恒温培养10-30h；

b、子瓶制备：将培养好的血斜面菌种在无菌条件下按1-5％接种量接入肉汤培养基内，18-45℃恒温培养10-30h；

c、菌种培养基灭菌温度为120-124℃，灭菌时间30分钟，灭菌蒸汽压力0.12-0.14Mpa；

d、发酵：将优良的子瓶菌种在无菌条件下按0.2％接种量接入发酵罐，全过程18-45℃恒温培养，无菌空气进气量以能翻动培养液为宜，罐压不超过0.01Mpa，发酵周期20-100小时。发酵培养基灭菌温度为120-124℃，蒸汽压力为0.12-0.14Mpa，时间30min；发酵至20-100小时，灭活放罐，灭活采用加温使发酵液温度达到80℃，恒温30-50分钟后再降温放罐，进行浓缩，使浓缩液比重控制在1.20-1.22即可；

ii、提取：

a、将i步骤的浓缩液加入1-5倍体积量的乙醇，充分搅拌静置后离心去除上清液即得到沉淀物；

b、将所得沉淀物用蒸馏水溶解，调PH，得到溶解液并将溶解液静置并控制静置后的溶解液PH值；

c、将溶解液离心去除杂质得到清液，准确量取清液体积，调PH值，按清液体积计算出所需酒精量，将酒精缓慢加入到清液中，并充分搅拌，静置后离心去除上清液得到沉淀物；

d、以上提取方法按从b-c步骤反复操作至中间检测合格为止，即得到的沉淀物为甘露聚糖肽半成品；

e、截流，得到重均分子量范围分别为1-20万及1-5万、6-10万、11-15万、16-20万的甘露聚糖肽。

当发酵条件在上述范围变动时，发酵产物中的甘露聚糖肽的重均分子量也会变动，如果在1-20万重均分子量范围内，可以不经过截流，直接使用。

iii、精制：将ii步骤反复提取截流得到的重均分子量为1-20万甘露聚糖肽半成品沉淀物，取样检测符合质量标准后，用无水乙醇进行一次脱水，充分研磨成粉状，得到一次湿粉，再用丙酮进行二次脱水，充分搅拌得到二次湿粉，将二次湿粉在60-100℃烘烤4-10小时即得甘露聚糖肽。

其中ii步骤的提取过程中活性炭的使用方法：使用量为1L溶解液所需活性炭1-10g，加入活性炭后调溶解液PH值，将该液体在40-100℃温度下保温20-70min，离心，并控制炭脱液PH值。

上述提取全过程中的PH值保持为1.5至6.0。

ii步骤的提取过程中的乙醇浓度为60-99.9％。实例二、甘露聚糖肽鉴定

1、菌种的鉴定：见菌种鉴定记录。

2、半成品的鉴定：

i、吸收度测定：取半成品小样适量，加水制成每1ml中含0.4mg的溶液，照分光光度法(中国药典2000年版二部附录VI A)，在260nm的波长处，其吸收度不得大于0.25，在280nm的波长处，其吸收度不得大于0.20。

ii、含量测定：

a、对照品溶液的制备    精密称取经105℃干燥至恒重的D-甘露糖对照品0.1g，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取5ml，置100ml的量瓶中，加水至刻度，摇匀。每1ml中含甘露糖50μg。

b、供试品的制备    取本品适量，精密称定，加水溶解制成每1ml中含40μg的溶液。

c、标准曲线的制备    精密称取对照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml，分别置具塞试管中，各加水至1.0m，再加3％苯酚溶液1.0ml，摇匀，冲入硫酸4.5ml，摇匀，放置于室温，以0管为空白，照分光光度法(中国药典2000年版二部附录IV A)在490nm的波长处测定吸收度。以甘露糖μg数对相应的吸收度，计算回归方程。

d、测定法    精密量取供品溶液1.0ml，照标准曲线制备项下自“再加苯酚溶液1.0ml”起，依法操作，测定吸收度，由回归方程计算甘露糖的含量。

3、成品的鉴定：

[性状]本品为白色或微黄色无定形粉末；无臭、无味。

      本品在水中易溶，在乙醇、氯仿及丙酮中不溶。

比旋度：取本品，精密称定，加水溶解并，加水溶解并稀释成每1ml中约含10mg的溶液，依法测定(中国药典2000年版二部附录VI E)，比旋度为+60°至+90°。

[鉴别]

i、取本品10mg，加水0.5ml使溶解，加a-萘酚乙醇溶液(5→100)1ml，摇匀，沿管壁缓缓加硫酸0.5ml，数分钟后，界面呈紫红色。

ii、取本品，加水制成每1ml中含1mg的溶液，取约10μl点于滤纸上，晾干，用无水乙醇固定，置高碘酸溶液(取高碘酸1.2g，加水30ml溶解后，加0.2mol/L醋酸钠溶液1.5ml与乙醇100ml，混匀即得。置暗处保存，可使用数月)中浸泡5分钟，取出，用70％乙醇溶液冲洗，置还原液(取碘化钾5g，硫代硫酸钠5g，加水100ml使溶解，再加乙醇150ml、2mol/L盐酸液2.5ml，随加随搅拌，临用时配)中浸泡5分钟，取出，用70％乙醇溶液冲洗，置品红亚硫酸试液中浸泡约30分钟，取出，用焦亚硫酸钠溶液(取焦亚硫酸钠0.4g，加盐酸1ml，加水溶解使成100ml，即得)，冲洗，晾干，在滤纸片点样处应呈紫红色。

iii、取供试品和对照品适量，分别加氯化钠注射液制成每1ml中含1mg的溶液作为供试品溶液和对照品溶液，依法试验(附甘露聚糖肽免疫原性测定法)，供试品和对照品管应均无溶血发生。

[检查]

i、酸度：取本品，加水制成每1ml中含10mg的溶液，依法测定(中国药典2000年版二部附录VI H)，pH值应为3.0~5.0。

ii、吸收度：取本品，加水制成每1ml中含0.4mg的溶液，照分光光度法(中国药典2000年版二部附录VI A)，在260nm的波长处，其吸收度不得大于0.25，在280nm的波长处，其吸收度不得大于0.20。

iii、总氮量度：取本品，照氮测定法(中国药典2000年版二部附录VII D第二法)测定，按干燥品计算，含总氮量应为0.8-2.0％。

iv、免疫原性：取供试品和对照品适量，分别加氯化钠注射液制成每1ml中含10mg的溶液，再分别用磷酸盐缓冲液制成1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256的稀释液作为供试品溶液和对照品溶液，依法检查(附甘露聚糖肽免疫原性测定法)，供试品不溶血管的最低浓度应不得高于对照品相应浓度的一倍以上。

v、干燥失重    取本品，在105℃干燥至恒重，减失重量不得过5.0％(中国药典2000年版二部附录VIII队L)。

vi、重金属    取本品1.0g，依法检查(中国药典2000年版VIII H)，含重金属不得过百万分之二十。

vii、异常毒性    取本品，加氯化钠注射液制成每1ml中含0.5mg的溶液，依法检查(中国药典2000年版附录XI C)，按静脉注射法给药，应符合规定(供注射用)。[含量测定]

a、对照品溶液的制备    精密称取经105℃干燥至恒重的D-甘露糖对照品0.1g，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取5ml，置100ml的量瓶中，加水至刻度，摇匀。每1ml中含甘露糖50μg。

b、供试品的制备    取不同含量的甘露聚糖肽供试品5份，精密称定，加水溶解制成每1ml中含40μg的溶液。

c、标准曲线的制备    精密称取对照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml，分别置具塞试管中，各加水至1.0m，再加3％苯酚溶液1.0ml，摇匀，冲入硫酸4.5ml，摇匀，放置于室温，以0管为空白，照分光光度法(中国药典2000年版二部附录IV A)在490nm的波长处测定吸收度。以甘露糖μg数对相应的吸收度，计算回归方程。

d、测定法    精密量取供品溶液1.0ml，照标准曲线制备项下自“再加苯酚溶液1.0ml”起，依法操作，测定吸收度，由回归方程计算甘露糖的含量。

经测定，上述方法得到的产品为甘露聚糖肽，含量分别为5mg、10mg、15mg、20mg、25mg、30mg。实例三：测定实例一制备的甘露聚糖肽重均分子量一、仪器

岛津高效液相色谱仪(包括LC-10AT泵，CTO-10A恒温柱箱，DGU-14A脱气装置，RID-10A示差折光检测器)；TSK-G4000PW_XL(或Shodex Ohpak SB-804HQ)色谱柱；龙智达接口，计算机(内装多糖专用GPC软件)；50ul注射器；Millipore超纯水器；0.45um滤膜帮柱头过滤器，真空抽滤装置；分析天平。二、试剂和样品的制备

1、超纯水

2、柱贮存液：0.05叠氮化钠溶液(NaN₃)溶液

3、流动相：0.7％硫酸钠溶液(内含0.02％NaN₃)

4、供试品溶液：分别取原料适量，加流动相制成10mg/ml的溶液。室温放置过夜0.45um柱头滤器滤过。

5、标准品溶液：分别取右旋糖酐重均分子量测定对照品(购自中检所)D0、D4、D5、D6、D7、D8、D2000适量，用流动相溶解制成每1ml约含10mg的溶液。三、实验方法

照2000年版中国药典右旋糖酐40项下方法测定。四、数据处理

采用多糖专用GPC软件计算分子量。五、结果

测定五个重均分子量范围的样品，结果如下：重均分子量分别为：8.5万，3.6万、8.5万、13.1万、17.5万，分布系数分别为3.3、3.0、3.3、3.0、3.2。

以下通过试验来进一步阐述本发明所述药物的有益效果。这些试验包括药效学试验，临床疗效观察试验。试验一  药效学试验(一)受试药物

甘露聚糖肽(重均分子量1-20万)原料：由成都利尔药业有限公司提供，批号：000301，含量：84.7％。用此原料生产甘露聚糖肽注射液000401批，规格：5mg/2ml。

原大重均分子量(重均分子量在20万以上，下同)甘露聚糖肽原料：由成都利尔药业有限公司提供，批号：000101，含量：82.1％。用此原料生产甘露聚糖肽注射液000402批，规格：5mg/2ml。

甘露聚糖肽(重均分子量1-5万)原料：由成都利尔药业有限公司提供，批号：000302，含量：84.1％。用此原料生产甘露聚糖肽注射液000403批，规格：5mg/2ml。

甘露聚糖肽(重均分子量6-10万)原料：由成都利尔药业有限公司提供，批号：000303，含量：84.5％。用此原料生产甘露聚糖肽注射液000404批，规格：5mg/2ml。

甘露聚糖肽(重均分子量11-15万)原料：由成都利尔药业有限公司提供，批号：000304，含量：84.3％。用此原料生产甘露聚糖肽注射液000405批，规格：5mg/2ml。

甘露聚糖肽(重均分子量16-20万)原料：由成都利尔药业有限公司提供，批号：000305，含量：83.9％。用此原料生产甘露聚糖肽注射液000406批，规格：5mg/2ml。(二)实验动物

因不同实验需选用不同的实验动物，故具体使用动物见实验方法。(三)剂量选择

采用等剂量比较，即甘露聚糖肽各重均分子量组和原大重均分子量甘露聚糖肽(重均分子量在20万以上)均选用临床剂量的10倍量组静脉注射给药进行实验比较。(四)统计学方法

采用T检验法。(五)甘露聚糖肽对环磷酰胺引起白细胞减少的影响1、实验药物

甘露聚糖肽注射液000401、000402、000403、000404、000405、000406批，将药物用灭菌生理盐水配制成0.4l溶液，按体重静脉注射相同体积0.2ml/20g(体重)。2、实验动物

ICR小鼠：由四川省医药实验动物质量监测中心提供

动物级别：一级

合格证号码：川实动管质第80号3、实验方法

取18-22gICR小鼠140只，随机分为7组，每组20只，雌雄各半，分组及给药剂量如下：

第一组：正常对照组，静脉注射灭菌生理盐水0.2ml/20g(体重)

第二组：环磷酰胺模型组：环磷酰胺腹腔注射100mg/Kg。

第三组：甘露聚糖肽(重均分子量1-20万)组，给以甘露聚糖肽(重均分子量1-20万)4mg/Kg，0.4mg/ml溶液给以0.2ml/20g

第四组：甘露聚糖肽(重均分子量1-5万)组，给以甘露聚糖肽(重均分子量1-5万)4mg/Kg，0.4mg/ml溶液给以0.2ml/20g

第五组：甘露聚糖肽(重均分子量6-10万)组，给以甘露聚糖肽(重均分子量6-10万)4mg/Kg，0.4mg/ml溶液给以0.2ml/20g

第六组：甘露聚糖肽(重均分子量11-15万)组，给以甘露聚糖肽(重均分子量11-15万)4mg/Kg，0.4mg/ml溶液给以0.2ml/20g

第六组：甘露聚糖肽(重均分子量16-20万)组，给以甘露聚糖肽(重均分子量16-20万)4mg/Kg，0.4mg/ml溶液给以0.2ml/20g

第七组：原大重均分子量甘露聚糖肽组，给以原大重均分子量甘露聚糖肽4mg/Kg，0.4mg/ml溶液给以0.2ml/20g

小鼠分组后，除空白对照组外，其余各组每只动物腹腔注射环磷酰胺100mg/Kg，每日一次，连续三天，三天后开始给药，连续给药8天。给药第4、8天，小鼠眼眶取血20ul，用ERMA-PV603自动血细胞计数仪(北京埃尔玛公司生产)测定白细胞数，实验结果见表一，第10天眼眶取血后再股动脉取血用赖氏法测定仪测定丙氨酸氨基转换酶，然后将小白鼠处死，剥离出股骨，用1ml注射器(连有6号半针头)吸取一定体积的Hank’s液，冲出股骨中的全部骨髓细胞，最后将细胞悬液通过4号针头的注射器，使细胞在悬液中充分分散.在显微镜下观察有核细胞数，计算骨髓中的有核细胞数，实验结果见表1。表1甘露聚糖肽对环磷酰胺引起白细胞减少的影响组别    动物只数       给药剂量                白细胞

                   (mg/Kg)                (×10⁹/L)

                                  第4天            第8天第一组    20         N.S             14.43±2.14       14.0±1.98第二组    20         CY100mg ip      5.51±0.95      ^^4.69±1.06^^第三组    20         4+CY100mg ip    7.35±1.35^**##   8.54±1.25^**##第四组    20         4+CY100mg ip    7.68±1.5^**##    8.69±1.54^**##第五组    20         4+CY100mg ip    7.46±1.29^**##   8.48±1.24^**##第六组    20         4+CY100mg ip    7.59±1.75^**##   6.55±1.04^**##第七组    20         4+CY100mg ip    6.16±1.36        7.48±1.18注：^^环磷酰胺组与正常对照组比较P＜0.01

**给药组与环磷酰胺组比较P＜0.01

##甘露聚糖肽各重均分子量组与原大重均分子量甘露聚糖肽组比较P＜0.01

以上实验结果表明，环磷酰胺引起动物白细胞明显降低，与正常对照组比较(P＜0.01)；甘露聚糖肽各重均分子量组及原大重均分子量甘露聚糖肽对环磷酰胺引起的白细胞减少有明显对抗作用，甘露聚糖肽各重均分子量组第4天能明显增加白细胞数量，给药组与环磷酰胺组比较有显著性差异；给药8天后甘露聚糖肽各重均分子量组及原大重均分子量甘露聚糖肽均能明显增加白细胞数量，给药组与环磷酰胺组比较有显著性差异(P＜0.01)；甘露聚糖肽各重均分子量组与原大重均分子量甘露聚糖肽高剂量组比较(P＜0.01)。甘露聚糖肽各重均分子量组较原大重均分子量甘露聚糖肽升高白细胞作用起效快，作用效果好。甘露聚糖肽各重均分子量组间比较，P＞0.05，无显著性差异，表明甘露聚糖肽各重均分子量组作用相当。

  表2甘露聚糖肽对环磷酰胺引起副作用的影响组别    动物只数         给药剂量       丙氨酸氨基转换酶     有核细胞数

                     (mg/Kg)            (单位)         (个×10⁴/股骨)第一组    20            N.S              24.6±8.32          1097±384.5第二组    20            CY100mg ip       42.5±9.16        ^^415±193.5^^第三组    20            4+CY100mg ip     29.9±8.94^**       849±218.4^**第四组    20            4+CY100mg ip     33.4±9.45^**       718±225.1^**第五组    20            4+CY100mg ip     32.6±8.74^**       797±184.6^**第六组    20            4+CY100mg ip     35.9±8.19^**       686±174.9^**第七组    20            4+CY100mg ip     32.6±8.74^**       797±184.6^**

由以上实验结果可见，环磷酰胺给药后对小鼠产生明显的毒副反应，丙氨酸氨基转换酶明显高于空白对照组，骨髓有核细胞数明显低于空白对照组(P＜0.01)，甘露聚糖肽各重均分子量组及原大重均分子量甘露聚糖肽对环磷酰胺引起的毒副反应有明显减轻作用，给药组丙氨酸氨基转换酶明显低于环磷酰胺对照组，骨髓有核细胞数明显高于环磷酰胺对照组(P＜0.01)。(六)甘露聚糖肽注射液对小鼠脾细胞诱生IL-2的影响1、实验药物与材料

甘露聚糖肽注射液000401、000402、000403、000404、000405、000406批，将药物用灭菌生理盐水配制成0.4溶液，按体重给以相同体积0.2ml/20g(体重)。

ConA(德国Serva公司产品)

RPMI1640(美国GIBCO产品)

HurIL-2标准品(美国Sigma公司产品)

3H-Tdr(中科院北京原子能研究所制品)2、实验动物

BALB/C小鼠：由四川省医药实验动物质量监测中心提供

动物级别：一级

合格证号码：川实动管质第80号3、实验方法

取18-22gBALA/C小鼠140只，随机分为7组，每组20只，雌雄各半，分组及给药剂量如下：

第一组：正常对照组，静脉注射灭菌生理盐水0.2ml/20g(体重)

第二组：环磷酰胺模型组：环磷酰胺腹腔注射100mg/kg。

第三组：甘露聚糖肽(重均分子量1-20万)组，给以甘露聚糖肽(重均分子量1-20万)4mg/Kg，0.4mg/ml溶液给以0.2ml/20g

第四组：甘露聚糖肽(重均分子量1-5万)组，给以甘露聚糖肽(重均分子量1-5万)4mg/Kg，0.4mg/ml溶液给以0.2ml/20g

第五组：甘露聚糖肽(重均分子量6-10万)组，给以甘露聚糖肽(重均分子量6-10万)4mg/Kg，0.4mg/ml溶液给以0.2ml/20g

第六组：甘露聚糖肽(重均分子量11-15万)组，给以甘露聚糖肽(重均分子量11-15万)4mg/Kg，0.4mg/ml溶液给以0.2ml/20g

第六组：甘露聚糖肽(重均分子量16-20万)组，给以甘露聚糖肽(重均分子量16-20万)4mg/Kg，0.4mg/ml溶液给以0.2ml/20g

第七组：原大重均分子量甘露聚糖肽组，给以原大重均分子量甘露聚糖肽4mg/Kg，0.4mg/ml溶液给以0.2ml/20g

小鼠分组后，除空白对照组外，其余各组每只动物腹腔注射环磷酰胺100mg/Kg，每日一次，连续五天，五天后开始给药，每天给药一次，连续给药5天，第6天断头处死小鼠。

首先制备小鼠脾细胞悬液：无菌条件下取小鼠脾脏置于盛有Hank’s液的平皿中，用毛玻棒研磨成单个细胞悬液，经200目细胞筛滤过到离心管中，用Hank’s液离心洗涤2次，用RPMI1640(含5％FeS)培养液调整细胞浓度到1×10⁷个细胞/ml，即制成细胞悬液。

然后进行IL-2诱生及IL-2活性测定。

IL-2诱生：取脾细胞悬液1×10⁷个细胞/ml，加入康氏试管，每管加入ConA5ug，置37℃5％CO₂孵箱中培养48小时，离心管收集上清液，置4℃冰箱保存，待活性测定。

IL-2活性测定：取生长良好的CTLL细胞1×10⁵个细胞/ml，用96孔培养板，每孔加入CTLL细胞100ml(1(10⁴个细胞/孔)实验孔加入待测样品100ul，阳性对照孔以HurIL-2标准品，阴性对照空以PRMI1640100ul代替，同时设ConA(0.5ug/孔)作对照，每组两平行孔置37℃，5％CO₂孵箱培养24小时，每孔加入3.71×10⁴Bq3H-Tdr再培养6小时，用多头细胞收集器将细胞收集在49型玻璃纤微孔滤膜上，每孔用重蒸馏水洗涤抽滤5次，取出滤膜放入闪烁瓶中用国产液闪仪计数测定Cpm。结果以CPM表示。

CPM＝实验孔Cpm-加ConA孔Cpm

实验结果见表3。表3甘露聚糖肽对小鼠脾细胞IL-2分泌的影响组别   动物只数    给药剂量        CPM(X±SD)

     (只)      (mg/Kg)第一组    20       N.S           26113.8±4745.6第二组    20       CY100mg ip    14557.6±2864.4^^第三组    20       4+CY100mg ip  19341.5±2157.3^**#第四组    20       4+CY100mg ip  19278.6±2669.7^**#第五组    20       4+CY100mg ip  19375.9±2634.0^**#第六组    20       4+CY100mg ip  19274.8±2457.1^**#第七组    20       4+CY100mg ip  17475.9±2114.6^**注：^^与正常对照组比较P＜0.01

**与环磷酰胺对照组比较P＜0.01

#原大重均分子量甘露聚糖肽组与甘露聚糖肽各重均分子量组比较P＜0.05

由以上结果表明：环磷酰胺引起小鼠脾淋巴细胞中TH细胞分泌IL-2降低，与正常对照组比较(P＜0.01)。甘露聚糖肽各重均分子量组及原大重均分子量甘露聚糖肽能明显拮抗环磷酰胺引起小鼠脾细胞中TH细胞分泌IL-2降低，能促进小鼠脾细胞中TH细胞分泌IL-2，给药组与环磷酰胺对照组比较有显著性差异(P＜0.01)，甘露聚糖肽各重均分子量组与原大重均分子量甘露聚糖肽高剂量组比较有差异(P＜0.05)，表明甘露聚糖肽(重均分子量1-20万)促进小鼠脾细胞中TH细胞分泌IL-2作用较原大重均分子量甘露聚糖肽作用好。甘露聚糖肽各重均分子量组间比较，P＞0.05，无显著性差异，表明甘露聚糖肽各重均分子量组作用相当。(七)甘露聚糖肽注射液对小鼠脾淋巴细胞转化的影响1、实验药物

甘露聚糖肽注射液000401、000402、000403、000404、000405、000406批，将药物用灭菌生理盐水配制成0.4mg/ml溶液，按体重给以相同体积0.2ml/20g(体重)。

ConA(德国Serva公司产品)；RPMI1640(美国GIBCO产品)2、实验动物：

BALB/C小鼠：由四川省医药实验动物质量监测中心提供

动物级别：一级

合格证号码：川实动管质第80号3、实验方法

取18-21gBALB/C小鼠140只，按体重、雌雄随机分为7组，每组20只，雌雄各半，其分组及给药剂量如下：

第一组：正常对照组，静脉注射灭菌生理盐水0.2ml/20g(体重)

第二组：环磷酰胺模型组：环磷酰胺腹腔注射100mg/Kg。

第三组：甘露聚糖肽(重均分子量1-20万)组，给以甘露聚糖肽(重均分子量1-20万)4mg/Kg，0.4mg/ml溶液给以0.2ml/20g

第四组：甘露聚糖肽(重均分子量1-5万)组，给以甘露聚糖肽(重均分子量1-5万)4mg/Kg，0.4mg/ml溶液给以0.2ml/20g

第五组：甘露聚糖肽(重均分子量6-10万)组，给以甘露聚糖肽(重均分子量6-10万)4mg/Kg，0.4mg/ml溶液给以0.2ml/20g

第六组：甘露聚糖肽(重均分子量11-15万)组，给以甘露聚糖肽(重均分子量11-15万)4mg/Kg，0.4mg/ml溶液给以0.2ml/20g

第六组：甘露聚糖肽(重均分子量16-20万)组，给以甘露聚糖肽(重均分子量16-20万)4mg/Kg，0.4mg/ml溶液给以0.2ml/20g

第七组：原大重均分子量甘露聚糖肽组，给以原大重均分子量甘露聚糖肽4mg/Kg，0.4mg/ml溶液给以0.2ml/20g

小鼠分组后，除空白对照组外，其余各组每只动物腹腔注射环磷酰胺100mg/Kg，每日一次，连续五天，五天后开始给药，每天给药一次，连续给药5天，第6天断头处死小鼠。首先制备小鼠脾细胞悬液：无菌条件下取小鼠脾脏置于盛有Hank’s液的平皿中，用毛玻棒研磨成单个细胞悬液，经200目细胞筛滤过到离心管中，用Hank’s液离心洗涤2次，用RPMI1640(含5％FeS)培养液调整细胞浓度到1×10⁷个细胞/ml，即制成细胞悬液。然后进行小鼠脾淋巴细胞转化实验：取96孔平底培养板，每孔加入上述脾细胞悬液100ul(1×10⁷个细胞/ml)；实验孔加入ConA(终浓度为5ug/ml)；对照孔不加ConA。每组两复孔，用RPMI1640培养液补足体积至200ml/孔，置37℃5％CO₂孵箱中培养72小时，培养结束前16小时每孔加入7.3×10⁴Bq³H-TDR培养完毕，用多头细胞收集器将细胞收集在49型玻璃纤维滤膜上，每孔用重蒸馏水洗涤抽滤5次，取出滤膜放入闪烁瓶中，用国产液闪仪计数测定cpm，结果以刺激指数(SI)表示。实验结果见表4。

表4甘露聚糖肽对小鼠脾淋巴细胞转化的影响组别   动物只数       给药剂量       SI(X±SD)

     (只)         (mg/Kg)第一组    20          N.S            74.7±13.47第二组    20          CY100mg ip     31.4±9.13^^第三组    20          4+CY100mg ip   54.0±11.24^**#第四组    20          4+CY100mg ip   55.1±9.58^**#第五组    20          4+CY100mg ip   54.9±12.06^**#第六组    20          4+CY100mg ip   53.8±10.54^**#第七组    20          4+CY100mg ip   46.3±11.35^**注：^^与正常对照组比较P＜0.01

**与环磷酰胺对照组比较P＜0.01

#原大重均分子量甘露聚糖肽组与甘露聚糖肽各重均分子量组比较P＜0.05

以上实验结果表明：环磷酰胺抑制小鼠脾淋巴细胞增殖，与正常对照组比较(P＜0.01)，甘露聚糖肽各重均分子量组及原大重均分子量甘露聚糖肽对环磷酰胺抑制小鼠脾淋巴细胞增殖具有促进作用，各剂量组与环磷酰胺对照组比较有显著性差异(P＜0.01)。甘露聚糖肽各重均分子量组与原大重均分子量甘露聚糖肽高剂量组比较有差异(P＜0.05)，甘露聚糖肽各重均分子量组对淋巴细胞的增殖作用较原大重均分子量甘露聚糖肽作用好。甘露聚糖肽各重均分子量组间比较，P＞0.05，无显著性差异，表明甘露聚糖肽各重均分子量组作用相当。(八)甘露聚糖肽注射液对血清溶血素生成的影响1、实验药物

甘露聚糖肽注射液000401、000402、000403、000404、000405、000406批，将药物用灭菌生理盐水配制成0.4溶液，按体重给以相同体积0.2ml/20g(体重)。2、实验动物：

ICR小鼠：由四川省医药实验动物质量监测中心提供

动物级别：一级

合格证号码：川实动管质第80号3、实验方法

取18-21gICR小鼠140只，按体重、雌雄随机分为7组，每组20只，雌雄各半，其分组及给药剂量如下：

第一组：正常对照组，静脉注射灭菌生理盐水0.2ml/20g(体重)

第二组：环磷酰胺模型组：腹腔注射环磷酰胺100mg/Kg。

第三组：甘露聚糖肽(重均分子量1-20万)组，给以甘露聚糖肽(重均分子量1-20万)4mg/Kg，0.4mg/ml溶液给以0.2ml/20g

第四组：甘露聚糖肽(重均分子量1-5万)组，给以甘露聚糖肽(重均分子量1-5万)4mg/Kg，0.4mg/ml溶液给以0.2ml/20g

第五组：甘露聚糖肽(重均分子量6-10万)组，给以甘露聚糖肽(重均分子量6-10万)4mg/Kg，0.4mg/ml溶液给以0.2ml/20g

第六组：甘露聚糖肽(重均分子量11-15万)组，给以甘露聚糖肽(重均分子量11-15万)4mg/Kg，0.4mg/ml溶液给以0.2ml/20g

第六组：甘露聚糖肽(重均分子量16-20万)组，给以甘露聚糖肽(重均分子量16-20万)4mg/Kg，0.4mg/ml溶液给以0.2ml/20g

第七组：原大重均分子量甘露聚糖肽组，给以原大重均分子量甘露聚糖肽4mg/Kg，0.4mg/ml溶液给以0.2ml/20g

小鼠分组后，除空白对照组外，其余各组每只动物腹腔注射环磷酰胺100mg/Kg，每日一次，连续五天，五天后开始给药，每天给药一次，连续给药4天，第四天开始进行免疫，用0.2ml/只5％鸡红细胞悬液腹腔注射进行免疫，免疫后24小时给药一次，给药后24小时再进行免疫一次，连续免疫三次，于第10天小鼠断头取血，离心分离血清，取血清按1∶100(ml/ml)加生理盐水稀释，再取1ml稀释液加0.5ml 5％鸡红细胞悬液，0.5ml豚鼠血清(在冰箱中加入)，放入37℃恒温箱中30min取出，于冰箱中终止反应，取上清液在570nm处测定光密度，比较各组光密度值。

鸡红细胞悬液的制备：从鸡翅下静脉取血盛入装有玻珠的三角瓶，除去纤维蛋白后，用阿氏液保存血球，临用前用生理盐水离心洗涤3次，按5％(ml/ml)加生理盐水配成鸡红细胞悬液备用。

豚鼠血清制备：从豚鼠心脏抽血离心，取血清按10％(ml/ml)加入生理盐水配成血清液备用。

实验结果见表5。表5甘露聚糖肽对血清溶血素生成的影响(X±SD)组别   动物只数      给药剂量          OD

                 (mg/Kg)         (X±SD)第一组    20         N.S             0.88±0.095第二组    20         CY100mg ip      0.42±0.105^^第三组    20         4+CY100mg ip    0.64±0.138^**##第四组    20         4+CY100mg ip    0.58±0.105^**##第五组    20         4+CY100mg ip    0.59±0.118^**##第六组    20         4+CY100mg ip    0.51±0.104^**##第七组    20         4+CY100mg ip    0.51±0.104^**注：^^与空白对照组比较P＜0.01，**与环磷酰胺对照组比较P＜0.01，#甘露聚糖肽各重均分子量组与原大重均分子量甘露聚糖肽低剂量组比较P＜0.01

以上实验结果表明环磷酰胺使血清溶血素的生成降低，与正常对照组比较(P＜0.01)。甘露聚糖肽各重均分子量组及原大重均分子量甘露聚糖肽能增加血清溶血素的生成，各剂量组与环磷酰胺对照组比较有显著性差异(P＜0.01)。甘露聚糖肽各重均分子量组与原大重均分子量甘露聚糖肽组比较P＜0.01，表明甘露聚糖肽各重均分子量组作用较原大重均分子量甘露聚糖肽作用好。甘露聚糖肽各重均分子量组间比较，P＞0.05，无显著性差异，表明甘露聚糖肽各重均分子量组作用相当。(九)甘露聚糖肽小鼠碳粒廓清试验1、实验药物

甘露聚糖肽注射液000401、000402、000403、000404、000405、000406批，将药物用灭菌生理盐水配制成0.4mg/ml溶液，按体重给以相同体积0.2ml/20g(体重)。2、实验动物：

ICR小鼠：由四川省医药实验动物质量监测中心提供

动物级别：一级

合格证号码：川实动管质第80号3、实验方法

取18-21gICR小鼠100只，按体重、雌雄随机分为5组，每组20只，雌雄各半，其分组及给药剂量如下：

第一组：正常对照组，静脉注射灭菌生理盐水0.2ml/20g(体重)

第二组：环磷酰胺模型组：腹腔注射环磷酰胺100mg/Kg。

第三组：甘露聚糖肽(重均分子量1-20万)组，给以甘露聚糖肽(重均分子量1-20万)4mg/Kg，0.4mg/ml溶液给以0.2ml/20g

第四组：甘露聚糖肽(重均分子量1-5万)组，给以甘露聚糖肽(重均分子量1-5万)4mg/Kg，0.4mg/ml溶液给以0.2ml/20g

第五组：甘露聚糖肽(重均分子量6-10万)组，给以甘露聚糖肽(重均分子量6-10万)4mg/Kg，0.4mg/ml溶液给以0.2ml/20g

第六组：甘露聚糖肽(重均分子量11-15万)组，给以甘露聚糖肽(重均分子量11-15万)4mg/Kg，0.4mg/ml溶液给以0.2ml/20g

第六组：甘露聚糖肽(重均分子量16-20万)组，给以甘露聚糖肽(重均分子量16-20万)4mg/Kg，0.4mg/ml溶液给以0.2ml/20g

第七组：原大重均分子量甘露聚糖肽组，给以原大重均分子量甘露聚糖肽4mg/Kg，0.4mg/ml溶液给以0.2ml/20g

小鼠分组后，除空白对照组外，其余各组每只动物腹腔注射环磷酰胺100mg/Kg，每日一次，连续五天，五天后开始给药，每天给药一次，连续给药5天，于第6天给药1小时后，小鼠尾静脉注射印度墨汁(用1％明胶液稀释4倍)0.1ml/10g体重，于注射墨汁后5分钟及20分钟用毛细吸管从小鼠眼眶后静脉丛取血0.025ml，立刻吹入0.1％Na₂CO₃液2ml中，充分洗涤毛细管中血液，用0.025ml正常小鼠血溶于0.1％Na₂CO₃液2ml中调零，于分光光度计675nm比色，计算吞噬指数K。 $K=\frac{l{\mathrm{gC}}_1-{\mathrm{lgC}}_2}{t_2-t_1}$ 式中：C为光密度值    t为时间实验结果见表6。表6甘露聚糖肽注射液碳粒廓清实验结果组别    动物只数   给药剂量           吞噬指数

               (mg/Kg)              (K)第一组     20      N.S             0.0312±0.0027第二组     20      CY100mg ip      0.0102±0.0017^^第三组     20      4+CY100mg ip    0.0222±0.0021**##第四组     20      4+CY100mg ip    0.0194±0.0017**##第五组     20      4+CY100mg ip    0.0203±0.0019**##第六组     20      4+CY100mg ip    0.0186±0.0020**##第七组     20      4+CY100mg ip    0.0203±0.0014**注：^^与正常对照组比较P＜0.01，**与环磷酰胺对照组比较P＜0.01，##甘露聚糖肽各剂量组与原大重均分子量甘露聚糖肽组比较P＜0.01

以上实验结果表明环磷酰胺腹腔注射给药使小鼠网状内皮系统吞噬功能减弱，吞噬指数K明显降低，与正常对照组比较有显著性差异(P＜0.01)；甘露聚糖肽对环磷酰胺引起小鼠网状内皮系统吞噬功能减弱具有增强作用，各剂量组与环磷酰胺对照组比较有显著性差异(P＜0.01)，甘露聚糖肽各重均分子量组与原大重均分子量甘露聚糖肽组比较P＜0.01，表明甘露聚糖肽各重均分子量组增强小鼠网状内皮系统吞噬功能作用较原大重均分子量甘露聚糖肽作用好。甘露聚糖肽各重均分子量组间比较，P＞0.05，无显著性差异，表明甘露聚糖肽各重均分子量组作用相当。(十)结论

通过甘露聚糖肽(重均分子量1-20万)及原大重均分子量甘露聚糖肽药效学实验，结果如下：

1、甘露聚糖肽(重均分子量1-20万)及原大重均分子量甘露聚糖肽对环磷酰胺引起的白细胞减少有明显拮抗作用，甘露聚糖肽(重均分子量1-20万)4天能明显增加白细胞数量，给药8天后甘露聚糖肽(重均分子量1-20万)及原大重均分子量甘露聚糖肽均能明显增加白细胞数量，表明甘露聚糖肽对白细胞减少具有明显升高作用。甘露聚糖肽(重均分子量1-20万)较原大重均分子量甘露聚糖肽升高白细胞作用起效快，作用效果好。

2、甘露聚糖肽(重均分子量1-20万)及原大重均分子量甘露聚糖肽对环磷酰胺引起的毒副反应有明显减轻作用，能降低谷丙转氨酶，使骨髓有核细胞数增加。表明甘露聚糖肽(重均分子量1-20万)及原大重均分子量甘露聚糖肽能减轻放、化疗引起的毒副作用。

3、甘露聚糖肽(重均分子量1-20万)及原大重均分子量甘露聚糖肽对环磷酰胺引起免疫功能低下具有明显增强作用，能增加小鼠脾淋巴细胞增殖，促进IL-2的生成，促进血清溶血素的生成，增强小鼠巨噬细胞的吞噬功能，表明甘露聚糖肽(重均分子量1-20万)及原大重均分子量甘露聚糖肽对免疫功能低下具有明显增强作用，以上增强免疫功能作用甘露聚糖肽(重均分子量1-20万)较原大重均分子量甘露聚糖肽作用好。

以上实验结果表明甘露聚糖肽(重均分子量1-20万)较原大重均分子量甘露聚糖肽起效快，疗效好，可能与甘露聚糖肽(重均分子量1-20万)纯度较高，更易被机体吸收有关，临床用于甘露聚糖肽(重均分子量1-20万)将会取得更好的疗效，以上实验结果为甘露聚糖肽提高质量标准，使用重均分子量为1-20万的甘露聚糖肽提供了较好的药效学实验基础。实验例二  临床试验

通过对871例白细胞减少及免疫功能低下患者(包括300例反复上感患者)的临床治疗对照观察，结果表明：1、甘露聚糖肽对反复上感患者，均有较好的疗效，两组间比较有显著性差异；结合治疗前后上感次数分析，两组治疗前后均存在显著性差异，P＜0.05，而治疗后两组间有显著性差异，甘露聚糖肽(重均分子量1-20万)较原甘露聚糖肽疗效好。2、甘露聚糖肽能有效提高白细胞数水平，其治疗前后白细胞值比较，P＜0.05，存在显著性差异，但治疗后甘露聚糖肽(重均分子量1-20万)组与原甘露聚糖肽组间有显著性差异；进一步观察提示，两组显效病人平均疗程比较，甘露聚糖肽(重均分子量1-20万)组明显优于原甘露聚糖肽组，两组间差异显著，P＜0.05；两组患者治疗停药后白细胞值稍有下降，但经统计学处理，均无显著性差异，P＞0.05；对照两组不同病因治疗后白细胞变化，P＞0.05，无显著性差异。3、免疫球蛋白IgM、IgA、IgG值变化，两组患者治疗后，均有明显升高，各单项值治疗前后比较，均存在显著性差异，P＜0.05，而治疗后两组间免疫球蛋白IgM、IgA、IgG值变化比较，有显著性差异。4、两组患者治疗后，T细胞亚群(T4、T8)，均有显著提高，两组治疗前后T细胞亚群T4、T8细胞数值比较，经统计学处理，P＜0.05，存在显著性差异，但两组治疗后各单项指标，P＜0.05，有显著性差异。根据上述结果说明，甘露聚糖肽对反复上感患者的治疗，在临床上具有较好的疗效，同时该药能显著提高患者的白细胞及免疫球蛋白等水平。在运用过程中发现，甘露聚糖肽(重均分子量1-20万)较原甘露聚糖肽疗效好，并且在白细胞减少患者治疗上，甘露聚糖肽(重均分子量1-20万)较原甘露聚糖肽疗程明显较原甘露聚糖肽为短，两者间差异显著。

结果表明：甘露聚糖肽，对临床反复易感患者，在治疗上显现了较好的效果，并能明显提高和增强白细胞数及免疫功能，其疗效满意，安全可靠，该药的临床运用，为反复上感患者的治疗，提供了一种新的治疗选择。甘露聚糖肽(重均分子量1-20万)较原甘露聚糖肽疗效好，表明选择重均分子量为1-20万的甘露聚糖肽在临床使用中能更好地发挥治疗作用。

通过实施例的方式来进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。

实施例一

    甘露聚糖肽  60g     淀粉      720g

    蒸馏水      适量    硬脂酸镁  20g

取甘露聚糖肽60g，用50～60℃蒸馏水适量溶解后，加淀粉制成软材，用14目尼龙筛制粒，50℃干燥，用12目筛整粒后，加入润滑剂硬脂酸镁混合均匀，填充胶囊，分装制成1000粒即得。

Claims (13)

1、一种甘露聚糖肽，其特征是：主要由甘露聚糖肽组成，重均分子量为1～20万。

2、根据权利要求1所述的甘露聚糖肽，其特征是：重均分子量为1～20万，分子量分布系数在4.0以下，比旋光度为+60°至+90°。

3、根据权利要求1所述的甘露聚糖肽，其特征是：来自于α-溶血性链球菌(Streptococcus hemolyticus-α-Hemolysis)的发酵产物。

4、权利要求1或2所述的甘露聚糖肽的制备方法，包含下列步骤：

a、以α-溶血性链球菌(Streptococcus hemolyticus-α-hemolysis)为生产菌进行发酵；

b、从发酵液提取甘露聚糖肽；

c、进一步分离得到重均分子量为1～20万，分子量分布系数在4.0以下的甘露聚糖肽。

5、根据权利要求3所述的甘露聚糖肽的制备方法，还包含：

d、干燥。

6、根据权利要求3所述的甘露聚糖肽的制备方法，步骤b中，PH值保持为1.5至6.0。

7、根据权利要求3所述的甘露聚糖肽的制备方法，步骤b中，提取溶剂为60％～99.9％的乙醇。

8、权利要求1或2所述的甘露聚糖肽在制备免疫增强药物中的用途。

9、根据权利要求7所述的甘露聚糖肽的用途，其特征是：所述的免疫增强药物是肿瘤辅助治疗药物。

10、根据权利要求7所述的甘露聚糖肽的用途，其特征是：所述的免疫增强药物是治疗反复呼吸道感染的药物。

11、根据权利要求7所述的甘露聚糖肽的用途，其特征是：所述的免疫增强药物是治疗白细胞减少症的药物。

12、根据权利要求7所述的甘露聚糖肽的用途，其特征是：所述的免疫增强药物是治疗再生障碍性贫血的药物。

13、一种药物组合物，其特征是：由有效量的权利要求1、2或3所述的甘露聚糖肽与药学上可接受的辅助添加成分混合而成。