CN104404114B - 甘露聚糖肽的发酵工艺及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物发酵技术(C12P)和药用肽(C07K)领域，具体而言，本发明提供了甘露聚糖肽的发酵制备方法，其中在溶血性链球菌的接种、浓缩和活性炭处理处理等方面进行了改进，使得获得的甘露聚糖肽中内毒素含量显著减少，提高了用药的安全性。另外，本发明还提供了该甘露聚糖肽及其制剂和应用等。

Description

甘露聚糖肽的发酵工艺及其应用

技术领域

本发明属于微生物发酵技术(C12P)和药用肽(C07K)领域，具体而言，本发明涉及甘露聚糖肽的发酵制备方法、其产品和应用等。

背景技术

甘露聚糖肽，也称α-甘露聚糖肽或多抗甲素，是一种糖基化肽类大分子物质，目前临床上主要作为免疫增强剂使用，用于免疫功能低下、肿瘤的辅助治疗(减轻放化疗的不良反应)。

目前，甘露聚糖肽主要通过溶血性链球菌(Streptococcus hemolyticus)发酵制备获得。例如，中国专利03117578和03117579公开了一种甘露聚糖肽药物组合物及其发酵方法，其发酵过程包括以0.2％的接种量接入溶血性链球菌，发酵20-100小时，高温灭活后浓缩至比重1.20-1.22，然后重复醇沉水溶的步骤直至检测合格(这种过程无法进行标准化生产)，期间加入0.1-1％的活性炭于40-100℃处理，最后对沉淀用无水乙醇和丙酮洗涤，获得的甘露聚糖肽的重均分子量为1-20万(可以进一步截留出1-5万的分子量的产物)，分布系数(分布宽度)在4.0以下。

中国专利200510020106公开了甘露聚糖肽注射剂及其制备方法，其中对重均分子量为4-65万的甘露聚糖肽在活性炭处理步骤中使用80℃保温30分钟的手段，使得甘露聚糖肽中含的内毒素含量能够小于10EU/mg(实测通常在6-13EU/mg之间，超标后只能供非静脉注射、甚至兽医用制剂使用)，勉强达到国家标准。尤其值得注意的是，该专利认为，要避免高于90℃的高温活性炭处理，因为这有害于甘露聚糖肽的含量，而且在加了活性炭的情况下也没有降低内毒素的含量。

然而，由于甘露聚糖肽是溶血性链球菌的发酵产物，无论如何进行纯化，其中仍旧不可避免地包含一定量的容易引起不良反应的内毒素等。尽管通常人群对甘露聚糖肽中的内毒素的耐受极限可以达到15EU/mg，小于10EU/mg的内毒素看似安全，但是甘露聚糖肽的不良反应报道仍旧层出不穷，包括休克，过敏，哮喘，甚至死亡等，尤其是身体状况本身就不佳的老年人群(也是免疫功能低下和肿瘤的主要病患人群)更为严重(参见高宁,等.甘露聚糖肽不良反应分析.中国药师,2011,14(1):121)。这样的不良反应在公众对药物安全性关注日益增强、药监部门对药物干全性监管日益加强的情况下，极大地影响了甘露聚糖肽及其制剂的推广使用。

尽管如此，现有技术反而不太关注于此，涉及甘露聚糖肽的文献更多关注其制剂配方，主要由于受到技术改进难度和无法预期的影响，对降低其不良反应的因素和工艺的研究很少，其中，中国专利200710093102和200710093103公开的甘露聚糖肽制备工艺中，在乙醇沉淀后使用超滤处理截留5万到8万重均分子量的产物，并对其用溶菌酶处理。然而，溶菌酶处理非但不能消除菌体残留物，反而使得较完整而不易释放出内毒素的死菌体裂解，释放出内毒素，反而增加了产物中内毒素的含量，所以该方法没有得到推广使用。

发明内容

本发明人在没有现有技术所能给出成功预期的情况下，经过艰苦而长期的摸索，跳出了上述现有技术中的一些内容的阻碍，在形式非常多样的甘露聚糖肽组成和工艺环节中，令人意外地摸索出了新的甘露聚糖肽的发酵工艺，不但能够标准化进行，而且可以使获得的产物的重均分子量稳定在3.5-5.8万的窄范围内，分布系数小于2.4，即组分更为专一可控，尤其是显著降低了其中的内毒素含量，使得用药安全性得以显著提高，方便推广使用。另外，该制备工艺能够基本沿用现有技术所需的设备和试剂，无需额外投入，使得生产成本得以降低。

本发明的目的在于提供新的甘露聚糖肽的发酵制备方法，由该方法制备获得的甘露聚糖肽安全有效。本发明还提供了相应的甘露聚糖肽、其制剂和应用等。

具体而言，在第一方面，本发明提供了甘露聚糖肽的发酵制备方法，其包括：

(1)接种溶血性链球菌进行发酵；

(2)对发酵产物进行灭活和浓缩；

(3)重复进行乙醇沉淀再将沉淀溶解，还包括用活性炭处理；和

(4)用有机溶剂沉淀和/或洗涤；

其特征在于，

(A)步骤(1)中溶血性链球菌的接种量为0.03-0.1％，优选为0.05-0.09％，更优选为0.06-0.08％，如0.07％；

(B)步骤(2)中浓缩达到的比重为1.12-1.19，优选为1.13-1.18，更优选为1.15-1.17，如1.16；

(C)步骤(3)中重复最后一次后用活性炭处理，所述活性炭处理的温度为90-98℃，优选为92-97℃，更优选为93-96℃，如95℃；和/或，

(D)有机溶剂是氯仿和/或乙醇。目前通常利用溶血性链球菌发酵(如，深层发酵)获得甘露聚糖肽。溶血性链球菌也称溶血链球菌。本发明人发现发酵接种量的减少，有利于溶血性链球菌在发酵罐环境中的活化，使得发酵产生的甘露聚糖肽更为专一，而且以本发明的接种量接种，也不会由于接种量过少而大幅延长发酵时间。优选在本发明第一方面的方法中，溶血性链球菌是α-溶血性链球菌，如在本发明的具体实施方式中，α-溶血性链球菌，优选是H₁S-33菌。

另外优选在本发明第一方面的方法中，发酵时间为65-75小时，优选为68-72小时，如70小时。也优选在本发明第一方面的方法中，发酵温度为37±2℃，优选为37±1℃。本发明人确定了溶血性链球菌的接种量、发酵时间和发酵温度，使得发酵过程更为标准化，易于操作，克服了现有技术经验性操作的缺点。

本发明第一方面的方法在现有技术的基础上进行了多方面改良，发酵制备获得的甘露聚糖肽中内毒素的含量显著降低，使得用药安全性得到保证，也避免了生产的产品的浪费或者低附加值使用。优选在本发明第一方面的方法中，发酵制备获得的甘露聚糖肽中内毒素的含量小于5EU/mg，优选小于3EU/mg，更优选小于2EU/mg，如小于1.5EU/mg或1EU/mg。

本发明第一方面的方法可以直接获得分布性质更佳的甘露聚糖肽，提升了药物产品的质量稳定性，也方便了生产操作。优选在本发明第一方面的方法中，发酵制备获得的甘露聚糖肽的重均分子量为3-7万，优选为3.2-6.3万，在本发明的具体实施方式中，重均分子量为3.5-5.8万。也优选在本发明第一方面的方法中，发酵制备获得的甘露聚糖肽的分布系数小于2.4，优选小于2.2，更优选小于2。

本文中的“重均分子量”是本领域技术人员所熟知的术语，指的是对高分子聚合物(对于本发明而言，是甘露聚糖肽)中不同分子量进行个数和重量加权平均后得到的聚合物分子量的表征值。

由于组合物中不同分子量的甘露聚糖肽的分布宽度可以有较大差异，即使相同的重均分子量的组合物，其分布宽度也可以不同，这进一步带来了非常大的多样性，而本发明的药用高效而安全的甘露聚糖肽的分布系数小于2.4，优选小于2.2，更优选小于2。多分散度(polydispersity)，在本文或其他文献中又被称为分散指数、多分散性、分布系数或分布宽度，是本领域常用的衡量聚合物分子量分布的指数，用于表征聚合物分子量分布的宽度，它是重均分子量(Mw)与数均分子量(Mn)之比，即Mw/Mn。这个比值随分子量分布宽度而变化。在单分散时，Mw/Mn等于1，随着分子量分布变宽，Mw/Mn值逐渐变大。要获得符合分布(符合重均分子量和分布系数)要求的甘露聚糖肽可以通过改进发酵制备的工艺来实现，也可以通过专门截留相应分子量分布的甘露聚糖肽来实现。

灭活细菌通常是高温灭活细菌，如在80℃灭活细菌，然后收集(如离心或过滤收集)发酵液，进行浓缩。浓缩的设备可以是从市场上购买的，在本发明的具体实施方式中，使用刮板式薄膜浓缩器。但是与现有技术不同，浓缩达到的比重比现有技术小，为1.12-1.19，优选为1.13-1.18，更优选为1.15-1.17，如1.16。这可以减少浓缩操作，节约成本。本发明人发现，这样节约成本的方式非但没有影响最终产品的质量，反而有一点改善甘露聚糖肽产品质量的作用。

优选在本发明第一方面的方法中，步骤(3)中重复次数为4-5次，优选为4次。这是本发明人摸索出的可以标准化操作的次数，可以有效进行标准化生产，而可以不必像现有技术那样不断进行中间体检测。优选步骤(3)中，乙醇沉淀时乙醇的浓度大于75％(V/V)，优选为75-85％(V/V)。另外优选步骤(3)中，用低浓度的乙醇水溶液溶解，如用小于25％(V/V)的乙醇水溶液溶解，优选用15-22％(V/V)的乙醇水溶液溶解。这样有利于收集的甘露聚糖肽的分布性质。

优选在本发明第一方面的方法中，步骤(3)中每次重复中包括调节pH的步骤。在本文中，调节pH可以使用酸和碱性物质进行，如三氯乙酸和/或碳酸氢钠。然而本发明人跳出了现有技术要求将pH值保持为1.5至5.0的阻碍，发现如果能在调节中调高一次pH，可以有效降低内毒素含量并且能够改善甘露聚糖肽的分布性质。所以更优选在本发明第一方面的方法中，最后一次重复中调节pH至6.0-6.5，优选6.1-6.3，如6.2。另外优选在本发明第一方面的方法中，最后一次重复之前的重复可以将pH保持在2.5至4.5之间，如在本发明的具体实施方式中，第一次重复调节pH至4.0-4.5，优选4.3；第二次重复调节pH至3.0-3.5，优选3.3；第三次重复调节pH至2.5-3.0，优选2.7。

本发明人跳出了现有技术较低温度处理活性炭的阻碍，发现温度较高有助于进一步降低内毒素的含量，综合其他步骤，可以显著降低最终的甘露聚糖肽产品中的内毒素含量。

优选在本发明第一方面的方法中，步骤(4)还包括调节pH的步骤，优选在用有机溶剂沉淀和/或洗涤前进行，更优选调节pH至3.0-3.5，优选3.1-3.4，在本发明的具体实施方式中，调节至3.3。

优选在本发明第一方面的方法中，步骤(4)中，先用氯仿洗涤(即萃取)，然后用乙醇沉淀。

在第二方面，本发明提供了甘露聚糖肽，所述甘露聚糖肽中内毒素的含量小于5EU/mg，优选小于3EU/mg，更优选小于2EU/mg，如小于1.5EU/mg或1EU/mg。优选本发明第二方面的甘露聚糖肽是由本发明第一方面的方法制备的。

优选本发明第二方面的甘露聚糖肽的均重分子量为3-7万，优选为3.2-6.3万，特别优选在本发明的具体实施方式中，重均分子量为3.5-5.8万。也优选本发明第二方面的甘露聚糖肽的分布系数小于2.4，优选小于2.2，更优选小于2。

本发明第二方面特别优选的甘露聚糖肽的质量(包括分布性质和内毒素含量等)优于当前报道的甘露聚糖肽。

在第三方面，本发明提供了甘露聚糖肽制剂，其包含本发明第二方面的甘露聚糖肽和药学上可接受的辅料。优选其中，以甘露聚糖肽计，内毒素的含量小于5EU/mg，优选小于3EU/mg，更优选小于2EU/mg，如小于1.5EU/mg或1EU/mg。

在本文中，药学上可接受的辅料包括药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂、pH调节剂等，它们与活性成分相容。运用药学上可接受的辅剂制备药物组合物对本领域普通技术人员来说是公知的。本发明的甘露聚糖肽制剂包含本发明第二个方面的甘露聚糖肽作为活性成分，将该活性成分和药学上可接受的辅料组合在一起，配制成各种制剂，优选为固体制剂和液体制剂。本发明的制剂可以为单位剂量形式，如片剂、丸剂、胶囊(包括持续释放或延迟释释放形式)、粉剂、混悬剂、颗粒剂、酊剂、糖浆剂、乳液剂、悬浮液、注射剂等剂型以及各种缓释剂型，从而适合各种给药方式，例如口服、非肠道注射、粘膜、肌肉、静脉内、皮下、眼内、皮内或经过皮肤等的给药形式。优选本发明的药物制剂为注射剂或冻干粉针剂，最优选为注射剂。

载体、赋形剂、稀释剂、pH调节剂是药学上可接受的并与活性成分相容。可以选用的合适的赋形剂优选但不仅限于水、生理盐水、甘油、乙醇或其类似物及其组合，更优选是水。当本发明的药物制剂为注射剂时，优选其中药学上可接受的载体选自甘露醇、乳糖、右旋糖酐、葡萄糖、甘氨酸、水解明胶、聚维酮和氯化钠中的一种或几种，更优选是甘露醇；优选其中药学上可接受的pH调节剂使酸性或碱性物质，如盐酸、柠檬酸、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸氢钠，更优选是碳酸氢钠。本发明的药物制剂中活性成分的含量可以根据具体剂型、给药方式以及给药对象的情况而定，如，优选注射剂中每支甘露聚糖肽的含量为1-12mg，如2.5、5或10mg。由于本发明的甘露聚糖肽的内毒素含量低，而其他辅料无需细菌发酵获得，理论上可以做到无菌，所以即使配制成大剂量的制剂，也能使其中内毒素含量低于人体耐受极限。所以，本发明优选提供大剂量的甘露聚糖肽制剂。

在第四方面，本发明进一步提供了本发明的甘露聚糖肽制剂的制备方法，其包括将本发明第二方面的甘露聚糖肽和药学上可接受的辅料混合的过程。药物制剂的制备方式可以采用本专业的一般技术人员所公知的方法从而制备成合适的制剂。例如，可包括将甘露聚糖肽稀释成注射剂的过程。在第五方面，本发明提供了本发明第二方面的甘露聚糖肽在制备免疫增强的药物中的应用。所述药物是安全的，例如比现有技术或者SFDA的标准的内毒素含量更低。具体地，优选在本发明第五方面的应用中，所述药物以甘露聚糖肽计，内毒素的含量小于5EU/mg，优选小于3EU/mg，更优选小于2EU/mg，如小于1.5EU/mg或1EU/mg。另外本发明第五方面的应用中，所述药物是本发明第三方面的甘露聚糖肽制剂。

在本文中，给药的有效量和形式一般由医师根据患者的具体情况(如年龄、体重、性别、患病时间、身体状况等)确定。适合的给药形式有口服、非肠道注射、粘膜、肌肉、静脉内、皮下、眼内、皮内或经过皮肤等给药形式，优选注射给药。给药的有效量也可以通过本发明具体实施方式中所列的动物实验中所使用的有效剂量来换算，换算规则可以根据各国药物监管机构(如，SFDA)的指引来进行，也可以参见黄继汉等(药理试验中动物间和动物与人体间的等效剂量换算.中国临床药理学与治疗学,2004Sep；9(9):1069-1072)报道的换算规则。由于本发明的甘露聚糖肽更加安全，因此更加方便医师使用，用药更少地受身体状况本身就不佳的老年人群(也是免疫功能低下和肿瘤的主要病患人群)限制。

本发明的有益效果在于：成功地获得了新的甘露聚糖肽，不但能够标准化进行发酵生产，而且其实践中生产出的组成分布稳定且分布宽度窄，尤其是显著降低了其中的内毒素含量，使得用药安全性得以显著提高，方便推广使用；另外，该甘露聚糖肽的制备工艺能够基本沿用现有技术所需的设备和试剂，无需额外投入，使得生产成本得以降低。

为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明进行描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。

另外，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。

具体实施方式

以下采用具体的实施例进行描述，如有未尽之处，可以参考本领域通用的书籍和手册以及中国药监管理部门(SFDA)的指引和所用试剂和设备的厂商所提供的说明书等。

对比例现有技术优化的甘露聚糖肽的制备

基本参照中国专利03117578所述的实例1(其中包含实例2的鉴定过程)发酵制备甘露聚糖肽，只是其中活性炭的使用参照中国专利200510020106记载的最优条件(80℃保温30分钟)进行，获得了现有技术(对比)的甘露聚糖肽。该方法生产的不同批次的产物的分子量分布不稳定，重均分子量在2-20万的范围内都有出现，分布宽度很广，如需要较专一的组分，则要在上述过程中增加截留特定分子量的膜过滤等进一步的步骤才能获得，所以可以增加采用膜过滤截留的方式制备较低重均分子量的甘露聚糖肽。

实施例1本发明的甘露聚糖肽的制备

基本参照中国专利03117578所述的实例1进行，所不同点在于：将α-溶血性链球菌在无菌条件下按0.07％接种量接入发酵罐，以37±1℃的温度恒温培养70小时，期间通入无菌空气，使得罐压处在0.005-0.01MPa之间；然后，灭活细菌，放出发酵罐中的发酵液，通入刮板式薄膜浓缩器(可购自上海中晨数字技术设备有限公司)浓缩至浓缩液比重达到1.16；

然后，向浓缩液加入90％(V/V)乙醇直至乙醇浓度达到78％(V/V)，边加边搅拌，而后室温(25℃)静置12小时，离心收集沉淀，获得第一次乙醇沉淀物；然后，加入第一次乙醇沉淀物5倍重量的纯化水进行溶解，然后加入三氯乙酸调节pH至4.3，再加入90％(V/V)乙醇直至乙醇浓度达到20％(V/V)，静置12小时，离心收集溶液，获得第一次水溶液；

然后，向第一次水溶液加入90％(V/V)乙醇直至乙醇浓度达到78％(V/V)，边加边搅拌，而后室温(25℃)静置3.5小时，离心收集沉淀，获得第二次乙醇沉淀物；然后，加入第二次乙醇沉淀物5倍重量的纯化水进行溶解，然后加入三氯乙酸调节pH至3.3，再加入90％(V/V)乙醇直至乙醇浓度达到20％(V/V)，静置4.5小时，离心收集溶液，获得第二次水溶液；

然后，向第二次水溶液加入90％(V/V)乙醇直至乙醇浓度达到78％(V/V)，边加边搅拌，而后室温(25℃)静置3.5小时，离心收集沉淀，获得第三次乙醇沉淀物；然后，加入第三次乙醇沉淀物5倍重量的纯化水进行溶解，然后加入三氯乙酸调节pH至2.7，再加入90％(V/V)乙醇直至乙醇浓度达到20％(V/V)，静置4.5小时，离心收集溶液，获得第三次水溶液；

然后，向第三次水溶液加入90％(V/V)乙醇直至乙醇浓度达到78％(V/V)，边加边搅拌，而后室温(25℃)静置2.5小时，离心收集沉淀，获得第四次乙醇沉淀物；然后，加入第四次乙醇沉淀物5倍重量的纯化水进行溶解，然后加入饱和碳酸氢钠溶液调节pH至6.2，静置4小时，离心收集溶液，获得第四次水溶液；

然后，向第四次水溶液以1％(W/V)的比例加入活性炭，于95℃保温50分钟，然后于室温(25℃)静置1.5小时，过滤收集滤液，即获得活性炭处理水溶液；

然后，向活性炭处理水溶液加入三氯乙酸调节pH至3.3，加入等体积氯仿，离心后收集水相，并向水相加入90％(V/V)乙醇直至乙醇浓度达到78％(V/V)，边加边搅拌，而后室温(25℃)静置3.5小时，离心收集沉淀，干燥后即获得本发明方法制备的甘露聚糖肽。

对采用上述方法制备的不同批次的甘露聚糖肽进行检测，其重均分子量和分布系数如下表1所示，表明本发明的方法可以直接获得重均分子量较小而且分布较专一的甘露聚糖肽。

表1不同批次的甘露聚糖肽的重均分子量和分布系数

批次	重均分子量(Da)	分布系数
			T140109	57431	2.30
T140128	40585	1.87
			T140307	48190	2.13

实施例2本发明和对比的甘露聚糖肽的内毒素测定

对按照对比例和实施例1的方法制备的甘露聚糖肽的内毒素进行测定，结果如表2所示，表明本发明的方法制备获得的甘露聚糖肽中每mg所包含的内毒素的量显著小于现有技术的，几乎相差了一个数量级，提高了用药安全性，便于推广，更能够轻易使得各批次产物的内毒素指标达标而可供静脉注射之用，减少产物的浪费或者低附加值使用。

表2不同方法制备的甘露聚糖肽的理化性质和内毒素含量

实施例3本发明的甘露聚糖肽注射剂的制备

本发明示例性的甘露聚糖肽注射剂的处方如表3所示，其制备过程为：采用注射用级辅料，在无菌条件下，将处方量的甘露聚糖肽和处方量的甘露醇混合，加入1/5处方量的水溶解，然后加入碳酸氢钠调节pH至7.2，加入余量的水，过滤后分装，即得。经检测，各批次内毒素含量(以其中的甘露聚糖肽计)与实施例2的相同。

表3本发明的甘露聚糖肽注射剂的处方

实施例4本发明和对比的甘露聚糖肽的动物试验

将按照对比例和实施例1的方法制备的甘露聚糖肽对小鼠进行免疫增强试验，测定由于抗肿瘤药使用后促进骨髓细胞恢复性增殖。

Balb/C小鼠(SPF级)随机分组，每组20只，其中：组1为阴性对照组，相应时间腹腔注射生理盐水；组2为阳性对照组，每天腹腔注射100mg/kg环磷酰胺一次，连续进行三天，第四天起相应时间腹腔注射生理盐水；其余组为各药物组，每天腹腔注射100mg/kg环磷酰胺一次，连续进行三天，第四天起每天腹腔注射4mg/kg剂量的各药物，连续进行5天。在第4天(造模完成)和第9天(治疗完成)分别对各组小鼠取血，镜检计数股骨中的骨髓有核细胞。

结果如下表4所示，给药环磷酰胺会显著降低小鼠的骨髓有核细胞数量，停止给药后一段时间还会继续有所下降；给药现有技术和本发明制备的甘露聚糖肽，都能显著恢复小鼠的骨髓有核细胞数量，其中重均分子量较小、分布系数较小的甘露聚糖肽，效果也略好些。

表4不同方法制备的甘露聚糖肽的动物试验结果

实施例5本发明和对比的甘露聚糖肽的临床试验

按照对比例和实施例1的方法制备的甘露聚糖肽的注射剂对2423位患者进行临床给药，其中，721位给药根据对比例的方法制备的甘露聚糖肽的患者中，有10位报告不良反应，其中有3位排除是由甘露聚糖肽引起的，由于或可能是由于该甘露聚糖肽用药引起的不良反应率约0.98％；1702位给药根据对实施例1的方法制备的甘露聚糖肽的患者中，有9位报告不良反应，其中有5位排除是由甘露聚糖肽引起的，由于或可能是由于该甘露聚糖肽用药引起的不良反应率仅约0.24％。由此可见，本发明的甘露聚糖肽及其注射剂安全性更好，在公众和药检部门对用药安全性日益重视的今天，更值得推广应用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (49)

1.甘露聚糖肽的发酵制备方法，其包括：

(1)接种溶血性链球菌进行发酵；

(2)对发酵产物进行灭活和浓缩；

(3)重复进行乙醇沉淀再将沉淀溶解，还包括用活性炭处理；和

(4)用有机溶剂沉淀和/或洗涤；

其特征在于，

(A)步骤(1)中溶血性链球菌的接种量为0.03-0.1％；

(B)步骤(2)中浓缩达到的比重为1.12-1.19；

(C)步骤(3)中重复最后一次后用活性炭处理，所述活性炭处理的温度为90-98℃；和，

(D)步骤(4)中有机溶剂是氯仿和/或乙醇。

2.权利要求1所述的甘露聚糖肽的发酵制备方法，其中步骤(1)中溶血性链球菌的接种量为0.05-0.09％。

3.权利要求2所述的甘露聚糖肽的发酵制备方法，其中步骤(1)中溶血性链球菌的接种量为0.06-0.08％。

4.权利要求3所述的甘露聚糖肽的发酵制备方法，其中步骤(1)中溶血性链球菌的接种量为0.07％。

5.权利要求1所述的甘露聚糖肽的发酵制备方法，其中步骤(2)中浓缩达到的比重为1.13-1.18。

6.权利要求5所述的甘露聚糖肽的发酵制备方法，其中步骤(2)中浓缩达到的比重为1.15-1.17。

7.权利要求6所述的甘露聚糖肽的发酵制备方法，其中步骤(2)中浓缩达到的比重为1.16。

8.权利要求1所述的甘露聚糖肽的发酵制备方法，其中步骤(3)中所述活性炭处理的温度为92-97℃。

9.权利要求8所述的甘露聚糖肽的发酵制备方法，其中步骤(3)中所述活性炭处理的温度为93-96℃。

10.权利要求9所述的甘露聚糖肽的发酵制备方法，其中步骤(3)中所述活性炭处理的温度为95℃。

11.权利要求1所述的甘露聚糖肽的发酵制备方法，其中溶血性链球菌是α-溶血性链球菌；和/或，发酵时间为65-75小时；和/或，发酵温度为37±2℃。

12.权利要求11所述的甘露聚糖肽的发酵制备方法，其中发酵时间为68-72小时。

13.权利要求12所述的甘露聚糖肽的发酵制备方法，其中发酵时间为70小时。

14.权利要求11所述的甘露聚糖肽的发酵制备方法，其中发酵温度为37±1℃。

15.权利要求1所述的甘露聚糖肽的发酵制备方法，其中发酵制备获得的甘露聚糖肽中内毒素的含量小于5EU/mg。

16.权利要求15所述的甘露聚糖肽的发酵制备方法，其中发酵制备获得的甘露聚糖肽中内毒素的含量小于3EU/mg。

17.权利要求16所述的甘露聚糖肽的发酵制备方法，其中发酵制备获得的甘露聚糖肽中内毒素的含量小于2EU/mg。

18.权利要求17所述的甘露聚糖肽的发酵制备方法，其中发酵制备获得的甘露聚糖肽中内毒素的含量小于1.5EU/mg。

19.权利要求18所述的甘露聚糖肽的发酵制备方法，其中发酵制备获得的甘露聚糖肽中内毒素的含量小于1EU/mg。

20.权利要求1所述的甘露聚糖肽的发酵制备方法，其中发酵制备获得的甘露聚糖肽的重均分子量为3-7万；和/或，发酵制备获得的甘露聚糖肽的分布系数小于2.4。

21.权利要求20所述的甘露聚糖肽的发酵制备方法，其中发酵制备获得的甘露聚糖肽的重均分子量为3.2-6.3万。

22.权利要求21所述的甘露聚糖肽的发酵制备方法，其中发酵制备获得的甘露聚糖肽的重均分子量为3.5-5.8万。

23.权利要求20所述的甘露聚糖肽的发酵制备方法，其中发酵制备获得的甘露聚糖肽的分布系数小于2.2。

24.权利要求23所述的甘露聚糖肽的发酵制备方法，其中发酵制备获得的甘露聚糖肽的分布系数小于2。

25.权利要求1所述的甘露聚糖肽的发酵制备方法，其中步骤(3)中重复次数为4-5次。

26.权利要求25所述的甘露聚糖肽的发酵制备方法，其中步骤(3)中重复次数为4次。

27.权利要求1所述的甘露聚糖肽的发酵制备方法，其中步骤(3)中每次重复中包括调节pH的步骤。

28.权利要求27所述的甘露聚糖肽的发酵制备方法，其中步骤(3)中最后一次重复中调节pH至6.0-6.5。

29.权利要求28所述的甘露聚糖肽的发酵制备方法，其中步骤(3)中最后一次重复中调节pH至6.1-6.3。

30.权利要求29所述的甘露聚糖肽的发酵制备方法，其中步骤(3)中最后一次重复中调节pH至6.2。

31.权利要求1所述的甘露聚糖肽的发酵制备方法，其中步骤(4)还包括调节pH的步骤。

32.权利要求31所述的甘露聚糖肽的发酵制备方法，其中步骤(4)中调节pH至3.0-3.5。

33.权利要求32所述的甘露聚糖肽的发酵制备方法，其中步骤(4)中调节pH至3.1-3.4。

34.权利要求33所述的甘露聚糖肽的发酵制备方法，其中步骤(4)中调节pH至3.3。

35.甘露聚糖肽，所述甘露聚糖肽中内毒素的含量小于3EU/mg。

36.权利要求35所述的甘露聚糖肽，所述甘露聚糖肽中内毒素的含量小于2EU/mg。

37.权利要求36所述的甘露聚糖肽，所述甘露聚糖肽中内毒素的含量小于1.5EU/mg。

38.权利要求37所述的甘露聚糖肽，所述甘露聚糖肽中内毒素的含量小于1EU/mg。

39.权利要求35～38之一所述的甘露聚糖肽，所述甘露聚糖肽的重均分子量为3-7万。

40.权利要求39所述的甘露聚糖肽，所述甘露聚糖肽的重均分子量为3.2-6.3万。

41.权利要求40所述的甘露聚糖肽，所述甘露聚糖肽的重均分子量为3.5-5.8万。

42.权利要求35～38之一所述的甘露聚糖肽，所述甘露聚糖肽的分布系数小于2.4。

43.权利要求42所述的甘露聚糖肽，所述甘露聚糖肽的分布系数小于2.2。

44.权利要求43所述的甘露聚糖肽，所述甘露聚糖肽的分布系数小于2。

45.权利要求35～38之一所述的甘露聚糖肽，其是由权利要求1～14和16～34之一所述的甘露聚糖肽的发酵制备方法发酵制备的。

46.甘露聚糖肽制剂，其包含权利要求35～45之一所述的甘露聚糖肽和药学上可接受的辅料。

47.权利要求46所述的甘露聚糖肽制剂，其是注射剂。

48.权利要求46所述的甘露聚糖肽制剂，其中药学上可接受的辅料是甘露醇和碳酸氢钠。

49.权利要求35～45之一所述的甘露聚糖肽在制备免疫增强的药物中的应用。