CN102308904A

CN102308904A - 一种快速制备糖肽的方法

Info

Publication number: CN102308904A
Application number: CN201110203435A
Authority: CN
Inventors: 齐军茹; 卓秀英; 杨晓泉
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2011-07-20
Filing date: 2011-07-20
Publication date: 2012-01-11

Abstract

本发明公开了一种快速制备糖肽的方法，包括如下步骤：(1)将蛋白酶解成多肽，反应结束后灭酶、离心、取上清液干燥；(2)将拥挤试剂置于反应装置中，加入缓冲溶液，使之充分溶解；(3)将多糖和步骤(1)得到的多肽加入步骤(2)的溶液中，充分搅拌2h后，加入0.02％w/w的NaN₃防腐，5℃静置过夜后，50-70℃搅拌1-8h，反应结束后迅速冷却至低于25℃，若拥挤试剂为聚蔗糖70、聚乙二醇2000，则还要除去拥挤试剂；(4)最后离心、取上清液干燥，得到糖肽产品。本发明操作方便，反应时间短，反应效率高，所得产物——糖肽具有优越的功能性，产品在食品工业中有广泛的应用前景。

Description

一种快速制备糖肽的方法

技术领域

本发明属于食品领域，涉及蛋白改性以及制备糖肽的方法，特别涉及一种多肽糖基化接枝的方法。

背景技术

大部分天然蛋白质都带有共价键相连的多糖侧链，糖蛋白以各种形式广泛存在于动植物和某些微生物中，它在生物体中起着很关键的作用，诸如细胞信号识别、生长调控、细胞间的信息传达，及免疫调节等多种生理功能。因此，糖蛋白引起了人们的广泛关注。但分离纯化糖蛋白很困难，靠基因工程技术制备也很受限制，所以在生化，免疫细胞生物学及医学研究中必须通过化学合成糖蛋白的部分结构——糖肽来作为模型分子，以供活性和构效关系研究，糖肽合成也就应运而生。除此之外，糖肽具有明显的抗肿瘤、镇痛、免疫调节、抗缺氧、促进多种细胞因子、抗乙肝病毒的产生和改善某些老年性疾病症状等作用。由于肽链较短，糖肽比糖蛋白有更优越的乳化性质，乳化稳定性更好，可用作乳化剂、稳定剂等。另外，作为一种生理活性肽，糖肽引起了国内外研究者的广泛关注。

近几年生命科学家强烈建议把“大分子拥挤”环境与pH、离子强度和溶液组成等因素一样用于研究生物大分子，加入拥挤物质逐渐成为一种研究大分子的途径，从而加深对分子间相互作用的了解。采用“大分子拥挤环境”作为温和的反应体系，将生命科学领域的拥挤理论应用于糖基化接枝反应中，当体系中存在高浓度的生物大分子时，大分子之间的反应遵循分子排斥容积理论，反应向溶质总体积减小的方向移动，即朝结合方向移动。大分子拥挤环境能够使蛋白分子在水溶液中同样处于非聚集或者较少聚集的反应状态，同时，促进蛋白质与多糖的反应向着共价结合的方向进行，所得产物具有优越的功能性，有良好的工业应用前景。作为一种新的有效的方法，解决了传统方法的弊端(申请号：201010237456.1)。比如干热法，干热处理前原料水分含量应较低，需要干燥，而且在反应过程中需要保持恒定的温度和湿度，通常是在60℃反应1～3周，实验条件不容易控制，固相反应中反应物接触不均匀，反应不充分，产物通常带有浅黄或浅棕的颜色。

发明内容

本发明的目的是提供一种多肽糖基化接枝方法。本发明模拟生命科学领域的大分子拥挤体系，体系中的拥挤试剂可以是惰性高聚物或葡聚糖。该法具有操作方便、反应时间短、所得糖肽功能性优越等优点，克服了现有蛋白质糖基化接枝改性方法难以实现工业化的缺陷，产品在食品工业中具有规模化的应用前景。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种快速制备糖肽的方法，包括如下步骤：

(1)将蛋白酶解成多肽，反应结束后灭酶、离心、取上清液干燥；

(2)模拟生命科学领域的大分子拥挤体系，将拥挤试剂置于反应装置中，加入缓冲溶液，使之充分溶解；

(3)将多糖和步骤(1)得到的多肽加入步骤(2)的溶液中，充分搅拌2h后，加入0.02％w/w的NaN₃防腐，5℃静置过夜后，50-70℃搅拌1-8h，反应结束后迅速冷却至低于25℃，若拥挤试剂为聚蔗糖70、聚乙二醇2000，则还要除去拥挤试剂；

(4)最后离心、取上清液干燥，得到糖肽产品。

优选地，所述多肽与拥挤试剂的质量比为1∶1～1∶8，多肽与多糖的质量比为1∶0.5～1∶4。

优选地，步骤(1)所述蛋白为大豆分离蛋白、脱脂大豆粉、大豆浓缩蛋白、乳清蛋白、β-乳球蛋白或小麦面筋蛋白。

优选地，步骤(1)所述酶为酸性蛋白酶、复合蛋白酶或中性蛋白酶，所述酸性蛋白酶优选胃蛋白酶，酶解程度控制在水解度DH≤2.0。

优选地，所述酶解程度控制是将蛋白配制成质量分数为10％的溶液，加热至37～55℃，加入酶，酶解30min，其中，酶与蛋白的质量比为1∶100。

所述拥挤试剂为高分子惰性聚合物，优选聚蔗糖70、聚乙二醇2000或葡聚糖。

优选地，所述多糖为葡聚糖、半乳甘露聚糖、卡拉胶和可溶性淀粉中的一种或者一种以上。

优选地，所述反应装置为带恒温加热搅拌装置的密闭容器。

优选地，所述缓冲溶液是pH5.5～7.5的磷酸盐缓冲液。

上述方法制备的糖肽应用于营养品、抗氧化剂、乳化剂或稳定剂等食品添加剂行业。

在食品工业中，高效率是一个重要的因素，缩短反应时间可以更好的促进反应的进行，提高生产效率。蛋白质分子中加入酶制剂可以打开肽链促进接枝反应的进行，从而大大缩短反应时间。采用蛋白酶水解蛋白，能够有效地打开蛋白大分子的三级空间结构，同时将蛋白的长肽链切断成中长链，使更多的ε-氨基基团暴露出来，通过酶解蛋白再进行糖基化接枝，此时的产物是糖肽。相对于球蛋白来说，更多的肽链上ε-氨基基团与多糖的还原性羰基末端结合，使蛋白与多糖的Maillard反应共价结合更为有效的进行，缩短了反应时间，所得糖肽比糖蛋白复合物的功能性更加优越。糖肽同时具有促进能量代谢，减肥，抗疲劳，增强肌肉爆发力、促进双歧杆菌繁殖、降胆固醇、抗过氧化、降血压、免疫调节等生理活性功效。本发明利用蛋白适度酶解成多肽，再利用生命科学领域中大分子拥挤环境作为反应介质，添加拥挤试剂，使多肽和多糖发生Maillard反应，得到具有优越的功能性的糖肽共价结合物，该发明反应时间短，操作方便。通过接枝改性，共价键合的蛋白质-多糖复合物既保留了蛋白质的表面活性又具有多糖的亲水性能，与以次级力结合的蛋白质-多糖体系相比，对于环境条件具有较高的适应性，其结合不受热或pH值的影响。就乳化性能而言，这种复合物具有优越的乳化性质，因此在反应过程中选用乳化活性作为检测指标。乳状液中粒度分布是影响乳状液稳定性的关键因素，也是评价样品乳化性的重要指标，乳状液粒子越大，乳析的速率越快，乳化活性越差。乳化活性采用D_[4，3]来表征，D_[4，3]越小，粒径越小，乳化活性越强，反之亦然。

本发明利用蛋白适度酶解成多肽，后采用“大分子拥挤环境”作为生成糖基化蛋白的反应体系，使多肽与多糖的反应向着共价结合的方向进行，得到功能性糖肽结合物。

作为功能性糖肽的新的有效的制备方法，具有如下的优点：

(1)在本发明中，先将蛋白进行适度酶解，自由氨基暴露，特别是芳香族氨基酸暴露，加快了与多糖接枝反应的进程，提高了效率；

(2)该发明在水溶液中搅拌加热，克服了干热反应中反应不均匀的缺点，不可控制的现象，最大程度地让多糖和多肽充分接触；

(3)与其他接枝改性方法相比，本发明具有规模化的应用前景，工业可操作性强。

具体实施方式

实施例1

将大豆蛋白配制成质量分数为10％的溶液，加热至37℃，加入胃蛋白酶(酶∶蛋白质量＝1∶100)，酶解30min后，加热到100℃保温3min灭酶，离心(5000rpm，20min)，取上清液冻干，此为大豆多肽。将1.0g葡聚糖作为拥挤试剂置于密闭容器中，加入10mL 0.01mol/L pH 6.5的磷酸钠缓冲溶液，搅拌2h，使之充分溶解，将0.5g大豆多肽和1.0g葡聚糖加入该含有拥挤试剂的溶液中，充分搅拌2h后，加入2滴NaN₃(0.02％w/w)防腐，5℃静置过夜后，60℃搅拌4h，反应结束后迅速冷却至25℃终止反应，离心(8000rpm，20min)，上清液冷冻干燥，得到糖肽产品。

取上述糖肽产品制备乳液，分别静置1d和30d后，采用Mastersizer 2000粒度分布仪测定体积平均粒径D_[4，3]的大小，结果见表1。

对比实施例1

将大豆蛋白配制成质量分数为10％的溶液，加热到37℃，加入胃蛋白酶(酶∶蛋白质量＝1∶100)，酶解30min，后加热到100℃保温3min灭酶，离心(5000rpm，20min)，取上清液冻干，此为大豆多肽。准确称取0.5g多肽，溶解于10mL 0.01mol/L pH 6.5的磷酸钠缓冲溶液，容器密闭，室温搅拌2h后，加入2滴NaN₃(0.02％w/w)防腐，置于5℃过夜后，恒温60℃搅拌4h。反应结束后，迅速冷却至25℃终止反应，离心(8000rpm，20min)，上清液冷冻干燥。

表1实施例1和对比实施例1结合物的性能对比

从表1可以看出，本发明实施例1中以葡聚糖既作为拥挤试剂又作为反应多糖所得糖基化多肽粒径最小，乳化性最强，颜色白色，多肽进行同样条件下的热处理(对比实施例1)后说明多肽本身无法发生结合反应，只能发生热聚集，使产物粒径增大，乳化性能降低。

实施例2

将大豆蛋白配制成质量分数为10％的溶液，加热到37℃，加入胃蛋白酶(酶∶蛋白质量＝1∶100)，酶解30min，后加热到100℃保温3min灭酶，离心(5000rpm，20min)，取上清液冻干，此为大豆多肽。将2.0g葡聚糖作为拥挤试剂置于反应装置中，加入10mL 0.01mol/L pH 5.5的磷酸钠缓冲溶液，搅拌2h，使之充分溶解，将0.25g大豆多肽和0.25g葡聚糖加入该含有拥挤试剂的溶液中，充分搅拌2h后，加入2滴NaN₃(0.02％w/w)防腐，5℃静置过夜后，恒温70℃搅拌4h，反应结束后迅速冷却至25℃终止反应，离心(8000rpm，20min)，上清液冷冻干燥，得到糖肽产品。

取上述糖肽产品制备乳液，分别静置1d和30d后，采用Mastersizer 2000粒度分布仪测定体积平均粒径D_[4，3]的大小，结果见表2。

对比实施例2

将2.0g葡聚糖作为拥挤试剂置于反应装置中，加入10mL 0.01mol/L pH5.5的磷酸钠缓冲溶液，搅拌2h，使之充分溶解，将0.25g大豆分离蛋白和0.25g葡聚糖加入该含有拥挤试剂的溶液中，充分搅拌2h后，加入2滴NaN₃(0.02％w/w)防腐，5℃静置过夜后，恒温70℃搅拌4h，反应结束后迅速冷却至25℃终止反应，离心(8000rpm，20min)，上清液冷冻干燥，得到糖肽产品。

表2实施例2和对比实施例结合物的性能对比

从表2可以看出，本发明实施例2在适度酶解后再接枝，产物具有较小的粒径，优越的乳化性质；对比实施例2中由于没有进行酶解，糖基化蛋白接枝反应速率相对较慢，接枝程度较低，反应效果不明显。

实施例3

将脱脂大豆粉配制成质量分数为10％的溶液，加热到55℃，加入中性蛋白酶(酶∶蛋白质量＝1∶100)，酶解30min，后加热到100℃保温3min灭酶，离心(5000rpm，20min)，取上清液冻干，此为大豆多肽。将1.0g聚乙二醇2000作为拥挤试剂置于反应装置中，加入10mL 0.01mol/L pH 7.0的磷酸钠缓冲溶液，搅拌2h，使之充分溶解，将1.0g大豆多肽和0.5g葡聚糖加入该含有拥挤试剂的溶液中，充分搅拌2h后，加入2滴NaN₃(0.02％w/w)防腐，5℃静置过夜后，恒温50℃搅拌6h，反应结束后迅速冷却至25℃终止反应，离心(8000rpm，20min)，上清液冷冻干燥，得到糖肽产品。

取上述糖肽产品制备乳液，分别静置1d和30d后，采用Mastersizer 2000粒度分布仪测定体积平均粒径D_[4，3]的大小，结果见表3。

对比实施例3

将1.0g聚乙二醇2000作为拥挤试剂置于反应装置中，加入10mL0.01mol/L pH 7.0的磷酸钠缓冲溶液，搅拌2h，使之充分溶解，将1.0g脱脂大豆粉和0.5g葡聚糖加入该含有拥挤试剂的溶液中，充分搅拌2h后，加入2滴NaN₃(0.02％w/w)防腐，5℃静置过夜后，恒温50℃搅拌6h，反应结束后迅速冷却至25℃终止反应，离心(8000rpm，20min)，上清液冷冻干燥，得到糖肽产品。

表3实施例3和对比实施例结合物的性能对比

从表3可以看出，本发明实施例3脱脂大豆粉在适度酶解后再接枝，所得产物具有较小的粒径，优越的乳化活性；对比实施例3中由于脱脂大豆粉没有进行酶解，在相同的反应时间6h对于蛋白质大分子来讲反应效果不明显，接枝反应速率较慢，得到的糖基化蛋白乳化活性改善不明显。

实施例4

将大豆分离蛋白配制成质量分数为10％的溶液，加热到37℃，加入胃蛋白酶(酶∶蛋白质量＝1∶100)，酶解30min，后加热到100℃保温3min灭酶，离心(5000rpm，20min)，取上清液冻干，此为大豆多肽。将2.0g聚蔗糖70作为拥挤试剂置于反应装置中，加入10mL 0.01mol/L pH 7.5的磷酸钠缓冲溶液，搅拌2h，使之充分溶解，将0.5g大豆多肽和2.0g葡聚糖加入该含有拥挤试剂的溶液中，充分搅拌2h后，加入2滴NaN₃(0.02％w/w)防腐，5℃静置过夜后，65℃搅拌8h，反应结束后迅速冷却至25℃终止反应，透析除去聚蔗糖70，离心(8000rpm，20min)，上清液冷冻干燥，得到糖肽产品。

实施例5

将大豆蛋白配制成质量分数为10％的溶液，加热到50℃，加入复合蛋白酶(酶∶蛋白质量＝1∶100)，酶解30min，后加热到100℃保温3min灭酶，离心(5000rpm，20min)，取上清液冻干，此为大豆多肽。将0.5g聚乙二醇2000作为拥挤试剂置于反应装置中，加入10mL 0.01mol/L pH 6.5的磷酸钠缓冲溶液，搅拌2h，使之充分水化溶解，准确称取0.5g多肽、0.25g半乳甘露聚糖，加入该含有拥挤试剂的溶液中，室温搅拌2h后，加入NaN₃(0.02％w/w)防腐，5℃静置过夜后，60℃搅拌4h。反应结束后，迅速冷却至25℃终止反应，透析除去聚乙二醇2000，离心(8000rpm，20min)，上清液冷冻干燥，得到糖肽产品。

Claims

1.一种快速制备糖肽的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(2)将拥挤试剂置于反应装置中，加入缓冲溶液，使之充分溶解；

(4)最后离心、取上清液干燥，得到糖肽产品。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多肽与拥挤试剂的质量比为1∶1～1∶8，多肽与多糖的质量比为1∶0.5～1∶4。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述拥挤试剂为聚蔗糖70、聚乙二醇2000或葡聚糖。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述蛋白为大豆分离蛋白、脱脂大豆粉、大豆浓缩蛋白、乳清蛋白、β-乳球蛋白或小麦面筋蛋白；所述酶为酸性蛋白酶、复合蛋白酶或中性蛋白酶，酶解程度控制在水解度DH≤2.0。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述酶解程度控制是将蛋白配制成质量分数为10％的溶液，加热至37～55℃，加入酶，酶解30min，其中，酶与蛋白的质量比为1∶100。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述多糖为葡聚糖、半乳甘露聚糖、卡拉胶和可溶性淀粉中的一种或者一种以上。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述反应装置为带恒温加热搅拌装置的密闭容器。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述缓冲溶液是pH5.5～7.5的磷酸盐缓冲液。

9.一种快速制备的糖肽，其特征在于，该糖肽是由权利要求1～8任一项所述方法制备的。

10.权利要求9所述的糖肽应用于营养品、抗氧化剂、乳化剂或稳定剂中。