CN108795908A - 一种提高芽孢杆菌属蛋白酶活性的方法 - Google Patents

一种提高芽孢杆菌属蛋白酶活性的方法 Download PDF

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刘博群
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Abstract

本发明涉及一种提高芽孢杆菌属蛋白酶活性的方法，属于酶活性技术领域。主要步骤为在芽孢杆菌属蛋白酶液中加入不同含量(0～30％，w/w)和不同分子量(10～70kDa)的大分子拥挤试剂葡聚糖(Dextran)，形成大分子拥挤环境。由于酶与底物相对扩散速率及空间构象的改变，芽孢杆菌属蛋白酶的活性明显提升。本发明提供的方法可以将芽孢杆菌属蛋白酶活性提升为原来的227％，且操作简便，安全可靠，具有潜在的应用意义。

Description

一种提高芽孢杆菌属蛋白酶活性的方法
技术领域
本发明属于酶活性技术领域，具体涉及一种提高芽孢杆菌属蛋白酶活性的方法。
背景技术
蛋白酶是一类催化蛋白质肽键水解生产多肽和氨基酸的酶，其广泛存在于动物、植物以及微生物中，在生物体中执行着消化吸收、血压调节等生理功能及代谢活性。动物来源的主要蛋白酶包括胰蛋白酶和胃蛋白酶，受屠宰量和生长周期的限制，动物来源的蛋白酶成本相对较高；木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶等植物蛋白酶安全可靠，但其产量易受天气、耕地面积等因素影响；微生物生长迅速，所需空间资源小，已经广泛用于蛋白酶的生产，其中芽孢杆菌是用于蛋白酶工业生产中最主要的菌株。
蛋白酶主要用于洗涤剂、制革、毛皮、蛋白水解物、酿酒、酱油、纺织、医药品和化妆品等生产上。其中，芽孢杆菌属蛋白酶的应用十分广泛，主要包括：加酶洗涤剂、洗衣粉的生产；食源性活性肽的酶解制备；面筋蛋白分解；调味料制备；乌贼鱼剥皮；生物发酵饲料生产等。在使用中，一般要求蛋白酶具有较高的催化活性，酶活性的提升已经成为该领域的一个研究热点。
Minton AP和Wilf J于1981年创造了“大分子拥挤”一词，阐述了细胞内真实的拥挤情况。近几年越来越多学者把“大分子拥挤”环境与pH、温度等因素一样用于研究蛋白质等生物大分子。由于排除体积效应，大分子拥挤会影响蛋白质的稳定性、改变酶活性、引起蛋白质构象改变等。Pozdnyakova等研究发现加入20％(w/v)的Dextran20和Ficoll 70均可促进多铜氧化酶的活性；Norris等研究发现加入BSA和PEG 8000均可以提升葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的催化活性。由此，本项目提出将芽孢杆菌属蛋白酶作为生物大分子处于大分子拥挤环境中，芽孢杆菌属蛋白酶扩散速率与空间构象发生改变，并将朝着有利于酶活性的方向发展。目前，应用大分子拥挤试剂提升酶活性的相关专利尚未报道，大分子拥挤对酶活性的促进作用不容忽视。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种通过加入拥挤试剂提高芽孢杆菌属蛋白酶活性的方法，本发明提供的方法可以有效的改善芽孢杆菌属蛋白酶的活性，促进其应用效果。
本发明一种利用拥挤试剂提高芽孢杆菌属蛋白酶活性的方法，包括以下步骤：
(1)选取中华人民共和国行业标准SB/T 10S17-1999《蛋白酶活力测定法》对芽孢杆菌属蛋白酶活性进行测定；
(2)大分子拥挤试剂选取Dextran。
进一步地，在步骤(1)中，配制标准酪氨酸溶液(100μg/mL)，采用Folin酚试剂盒绘制标准曲线。
进一步地，在步骤(1)中，配制芽孢杆菌属蛋白酶液(1mg/mL)，确定稀释倍数(5000倍)，采用Folin酚试剂盒测定芽孢杆菌属蛋白酶活性。
进一步地，选取(2)中拥挤试剂Dextran，其分子量为10～70kDa，加入量为5～30％(w/w)，采用Folin酚试剂盒测定芽孢杆菌属蛋白酶活性。
本发明采用大分子拥挤试剂Dextran模拟大分子拥挤环境，改变了芽孢杆菌属蛋白酶的扩散速率和构象，从而导致其活性和稳定性发生明显的改善，有利于芽孢杆菌属蛋白酶在多领域的有效应用。
借由上述方案，本发明具有如下优点：
(1)本发明提供了一种提高芽孢杆菌属蛋白酶活性的方法，通过加入大分子拥挤试剂，芽孢杆菌属蛋白酶活性明显提高；
(2)本发明应用Dextran模拟细胞内真实的大分子拥挤环境，Dextran稳定性好、可生物降解；
(3)本发明方法操作简单、方便快捷。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步的阐述。
本发明使用的试剂及其配制方法如下：
标准酪氨酸溶液(100μg/mL)：称取0.1g烘干至恒重的酪氨酸，用1mol/L盐酸约6mL溶解后，用0.2mol/L盐酸定容至100mL，其浓度为1000μg/mL。再吸取此液10mL，以0.2mol/L盐酸定容至100mL，即配成100μg/mL的标准酪氨酸溶液；
缓冲液(pH＝7.5，0.02mol/L)：取0.2mol/L磷酸氢二钠溶液84mL与0.2mol/L磷酸二氢钠溶液16mL混合，调pH至7.5，临用时稀释10倍；
芽孢杆菌属蛋白酶液：取0.1g芽孢杆菌属蛋白酶，用pH 7.5的磷酸盐缓冲液(0.02mol/L)溶解并定容至100mL，即为芽孢杆菌属蛋白酶母液，用时稀释适当倍数；
2％酪蛋白溶液：准确称取干酪素2g，加入0.1mol/L氢氧化钠10mL在水浴中加热使其溶解，用pH 7.5的磷酸盐缓冲液(0.02mol/L)定容至100mL。配置后应及时使用，并放入冰箱保存；
Folin酚试剂：严格参照Folin-酚试剂盒(鼎国-FLF01)说明书进行配制。
本发明中芽孢杆菌属蛋白酶活性测定的标准曲线，其制作方法如下：
取6支1.5mL EP管，依次编号，按表1分别加入相应的酪氨酸标准溶液和蒸馏水，混合均匀，配制得到浓度分别为0、20、40、60、80、100(μg/mL)的酪氨酸溶液。再分别加入1mL的Folin-酚试剂甲和0.1mL的Folin-酚试剂乙，置于40℃水浴，反应20min，以1号EP管作为空白，依次于500nm测定吸光值。本实验进行3次平行实验，取平均值，以酪氨酸含量为横坐标，对应的吸光值A为纵坐标，建立标准曲线。
表1标准曲线绘制中的溶液配制
实施例1
取2支1.5mL EP管，分别为对照管和测定管。在对照管和测定管中分别加入0.2mL的芽孢杆菌属蛋白酶液，将其与2％酪蛋白溶液一同于40℃水浴预热2min；向对照管中加入0.4mL的TCA溶液，使芽孢杆菌属蛋白酶失活；取预热后的2％的酪蛋白溶液0.2mL依次加入对照管和测定管，摇匀，精确保温10min；向测定管中加入0.4mL的TCA溶液，使芽孢杆菌属蛋白酶失活；40℃水浴反应20min后，于8000rpm离心6min，取上清液0.2mL于EP管中，同时单独加入0.2mL蒸馏水作为调零管；向以上对照管、测定管和调零管中依次加入1mL Folin-酚试剂甲和0.1mL Folin-酚试剂乙，于40℃水浴反应20min后，在500nm测定吸光值。
采用以下公式计算酶活性：
式中：A为样品测得吸光值对应标准曲线得到酪氨酸的微克数；4为0.8mL反应液中取出0.2mL进行测定(即4倍)；N为酶液稀释的倍数，本实验中为5000；10为反应10min。
采用上述方法测得不加入大分子拥挤试剂时，芽孢杆菌属蛋白酶活力为136952.381。
实施例2
取2支1.5mL EP管，分别为对照管和测定管。在对照管和测定管中分别加入5％(w/w)的大分子拥挤试剂Dextran 70，用0.2mL的芽孢杆菌属蛋白酶液将其溶解，并将其与2％酪蛋白溶液一同于40℃水浴预热2min；后续操作同实施例1。
采用上述方法测得加入5％Dextran 70时，芽孢杆菌属蛋白酶活力为292190.476。
实施例3
取2支1.5mL EP管，分别为对照管和测定管。在对照管和测定管中分别加入10％(w/w)的大分子拥挤试剂Dextran 70，用0.2mL的芽孢杆菌属蛋白酶液将其溶解，并将其与2％酪蛋白溶液一同于40℃水浴预热2min；后续操作同实施例1。
采用上述方法测得加入10％Dextran 70时，芽孢杆菌属蛋白酶活力为311333.333。
实施例4
取2支1.5mL EP管，分别为对照管和测定管。在对照管和测定管中分别加入15％(w/w)的大分子拥挤试剂Dextran 70，用0.2mL的芽孢杆菌属蛋白酶液将其溶解，并将其与2％酪蛋白溶液一同于40℃水浴预热2min；后续操作同实施例1。
采用上述方法测得加入15％Dextran 70时，芽孢杆菌属蛋白酶活力为303904.762。
实施例5
取2支1.5mL EP管，分别为对照管和测定管。在对照管和测定管中分别加入20％(w/w)的大分子拥挤试剂Dextran 70，用0.2mL的芽孢杆菌属蛋白酶液将其溶解，并将其与2％酪蛋白溶液一同于40℃水浴预热2min；后续操作同实施例1。
采用上述方法测得加入20％Dextran 70时，芽孢杆菌属蛋白酶活力为274285.714。
实施例6
取2支1.5mL EP管，分别为对照管和测定管。在对照管和测定管中分别加入25％(w/w)的大分子拥挤试剂Dextran 70，用0.2mL的芽孢杆菌属蛋白酶液将其溶解，并将其与2％酪蛋白溶液一同于40℃水浴预热2min；后续操作同实施例1。
采用上述方法测得加入25％Dextran 70时，芽孢杆菌属蛋白酶活力为253238.095。
实施例7
取2支1.5mL EP管，分别为对照管和测定管。在对照管和测定管中分别加入30％(w/w)的大分子拥挤试剂Dextran 70，用0.2mL的芽孢杆菌属蛋白酶液将其溶解，并将其与2％酪蛋白溶液一同于40℃水浴预热2min；后续操作同实施例1。
采用上述方法测得加入30％Dextran 70时，芽孢杆菌属蛋白酶活力为197142.857。
实施例8
取2支1.5mL EP管，分别为对照管和测定管。在对照管和测定管中分别加入10％(w/w)的大分子拥挤试剂Dextran 10，用0.2mL的芽孢杆菌属蛋白酶液将其溶解，并将其与2％酪蛋白溶液一同于40℃水浴预热2min；后续操作同实施例1。
采用上述方法测得加入10％Dextran 10时，芽孢杆菌属蛋白酶活力为304380.952。
实施例9
取2支1.5mL EP管，分别为对照管和测定管。在对照管和测定管中分别加入10％(w/w)的大分子拥挤试剂Dextran 40，用0.2mL的芽孢杆菌属蛋白酶液将其溶解，并将其与2％酪蛋白溶液一同于40℃水浴预热2min；后续操作同实施例1。
采用上述方法测得加入10％Dextran 40时，芽孢杆菌属蛋白酶活力为291523.810。

Claims (4)

1.一种提高芽孢杆菌属蛋白酶活性的方法，其特征在于，选取应用广泛的芽孢杆菌属蛋白酶，用缓冲溶液配制成酶液；加入大分子拥挤试剂，模拟细胞内真实的拥挤环境，提升蛋白酶的活性。
2.根据权利要求1所述的方法，所述的缓冲溶液是pH＝7.5的磷酸盐缓冲液。
3.根据权利要求1所述的方法，选取的拥挤试剂为高分子惰性葡聚糖(Dextran)。
4.根据权利要求1所述的方法，Dextran的分子量为10～70kDa，加入量为0％～30％。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN102308904A (zh) * 2011-07-20 2012-01-11 华南理工大学 一种快速制备糖肽的方法

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SHRUTI MITTAL等: "Macromolecular crowding: Macromolecules friend or foe", 《BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA》 *

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