CN109371003A

CN109371003A - 一种对胃蛋白酶抗性提高的β-葡萄糖苷酶

Info

Publication number: CN109371003A
Application number: CN201811258392.6A
Authority: CN
Inventors: 姚冬生; 吴凤梅; 汪浩; 谢春芳; 刘大岭
Original assignee: Jinan University
Current assignee: Guangdong Fang can animal health care Co.,Ltd.
Priority date: 2018-10-26
Filing date: 2018-10-26
Publication date: 2019-02-22
Anticipated expiration: 2038-10-26
Also published as: CN109371003B

Abstract

本发明公开了一种对胃蛋白酶抗性提高的β‑葡萄糖苷酶及其应用。本发明通过蛋白质工程技术对野生型β‑葡萄糖苷酶分子内的关键氨基酸残基进行了改造，提供了一种获得对胃蛋白酶抗性提高的β‑葡萄糖苷酶突变体。本发明所述的作用于纤维二糖和短链纤维寡糖的突变体β‑葡萄糖苷酶(mBGL1^{S84C；Q643P；G696V})对胃蛋白酶的抗性半衰期比野生型BGL1延长了，残留酶比活力提高了4.8倍，其他酶学性质与野生型β‑葡萄糖苷酶基本一致。

Description

一种对胃蛋白酶抗性提高的β-葡萄糖苷酶

技术领域

本发明涉及β-葡萄糖苷酶，特别涉及到对胃蛋白酶抗性提高的β-葡萄糖苷酶。

背景技术

β-葡萄糖苷酶(β-D-Glucosidase,EC3.2.1.21,简称BGL1)，又称为葡萄糖苷水解酶。β-葡萄糖苷酶属于水解酶类，是纤维素酶系的重要组成成分。它能够水解结合于末端非还原性的β-D-葡萄糖键，同时释放出β-D-葡糖糖和相应的配基。它能水解纤维二糖和短链纤维寡糖生成葡萄糖，解除纤维二糖和纤维寡糖对内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶的反馈抑制，还可酶解水果和茶叶中的香气前体物，起到增强香气的作用。

β-葡萄糖苷酶广泛存在于植物和动物以及微生物体内。在人类的糖原降解和动物、植物、微生物的糖类代谢方面具有重要的生理功能。近年来，其在食品工业中表现出了重要的应用前景：β-葡萄糖苷酶可水解果蔬中的风味前体物质如单帖烯醇糖苷等，释放出具有浓郁天然香气的物质，已成为食品工业中重要的风味增香剂。在制备功能性食品时则用于生物活性物质的转化，如豆奶中添加β-葡萄糖苷酶或接种产β-葡萄糖苷酶的微生物，都能够将豆奶及豆奶粉中生物有效性较低的异黄酮糖苷化合物高效转化为高活性的异黄酮苷元。β-葡萄糖苷酶的另一重要用途是作用于纤维素生物转化，纤维素这一巨大可再生资源的有效利用对解决环境污染、食品短缺、能源危机具有重大现实意义。

在饲料工业中，β-葡萄糖苷酶常被作为一种饲料添加剂，因为它可以酶解富含纤维的细胞壁，使细胞内包含的蛋白质等营养物质释放出来，同时又将纤维降解为便于动物消化吸收的还原糖，从而提高饲料利用率。但是在实际应用中还存在许多不足，如稳定性不佳等，这将影响β-葡萄糖苷酶使用的有效性而增加了应用成本。因此对β-葡萄糖苷酶进行改造具有十分重要的意义。

迄今，有关β-葡萄糖苷酶的研究主要集中于发现和筛选来自不同来源的产不同特征的β-葡萄糖苷酶的菌株或通过基因重组方法获得产不同特征的β-葡萄糖苷酶的菌株，以及β-葡萄糖苷酶的制备与应用等。检索中国专利文库，发现有关β-葡萄糖苷酶的专利有近190个，关于发现或筛选来自不同微生物来源的具有不同特征的β-葡萄糖苷酶及其编码基因的专利有：ZL201110214130.1、 ZL201410713835.1、ZL201110334815.X、ZL200510116748.9、ZL200910218167.4、 ZL201510460386.9、ZL201410718610.5、ZL201010577713.6、ZL201410235451.3、 ZL201410037538.X、ZL201410037437.2、ZL201710698739.8、ZL201610095165.0、 ZL201710839935.2、ZL201710839898.5、ZL201110417104.9；通过基因重组方法获得产不同特征的β-葡萄糖苷酶的菌株或突变体的专利有：ZL201610060528.7、 ZL201410717927.7、ZL201410753327.6、ZL201010170523.2、ZL201210540712.3、 ZL201210541293.5、ZL 201710366423.9、ZL201310224173.7、ZL201610407183.8、 ZL201610061066.0、ZL201610060603.X、ZL201610061593.1、ZL201310187648.X、 ZL201510626711.4等；关于筛选产β-葡萄糖苷酶菌株的方法的专利有： ZL201510903621.5、ZL201210127162.2、ZL201710279045.0、ZL201410075528.5、ZL200710114837.9等；关于制备β-葡萄糖苷酶纯化方法的专利有： ZL200710043571.3等；关于β-葡萄糖苷酶酶活测定方法的专利有： ZL200910096109.9等；关于β-葡萄糖苷酶固定化方法的专利有： ZL201510920113.8、ZL201710579688.7、ZL201710689763.5、ZL201610348992.6、 ZL201610899746.X、ZL201310712037.2、ZL201210449928.9、ZL201210052838.6、 ZL201110293398.9、ZL200810035950.2、ZL201810109984.5等；关于β-葡萄糖苷酶制备方法的专利有：ZL201710581264.4、ZL201510026295.4、ZL201410510836.6、ZL201110374822.2、ZL200910153807.8、ZL200910092695.X、ZL201810034473.1等；关于构建产β-葡萄糖苷酶基因工程菌方法的专利有：ZL201410126924.6、ZL 201410699758.9、ZL201610285023.0、ZL201610838951.5、ZL201510172770.9、ZL201510658194.9、ZL201410801030.2、ZL201410801031.7、ZL201210017857.5、ZL201110221185.5、ZL201110301931.1、ZL201110034926.9、ZL201110132525.7、ZL201110266535.X、ZL200910092527.0、ZL200610025503.X、ZL201110120297.1、ZL200910029055.4、ZL200910159235.4等；关于产β-葡萄糖苷酶菌株及其突变体的应用的专利有：ZL201310049606.X、ZL201510203453.9、 ZL201510203484.4、ZL201010565278.5、ZL201510175655.7等。检索中国学位论文库有关β-葡萄糖苷酶的主要研究包括针对微生物来源β-葡萄糖苷酶的分类、来源、酶学性质、催化反应机理、酶活性测定方法、酶活性中心、底物特异性、三维结构、催化残基、水解糖苷机制、酶基因克隆与表达、酶的定向改造及在食品工业等中的应用等。而有关具有胃蛋白酶抗性提高的β-葡萄糖苷酶的研究和专利，迄今尚未见报道。

发明内容

本发明的首要目的是提供一种对胃蛋白酶抗性提高的β-葡萄糖苷酶。

本发明是对β-葡萄糖苷酶的基因(称为bgL1基因)进行定点突变。由绿色木霉(Trichoderma viride)AS3.3711中获得的β-葡萄糖苷酶的基因序列的 GENBANK登录号为FJ882071.1。该酶的成熟蛋白的氨基酸序列为ACS93768 (SEQ ID NO.1)。

本发明利用酶促反应过渡态理论及计算生物学的方法，对β-葡萄糖苷酶进行分子设计并筛选到了一株β-葡萄糖苷酶突变体，所获得的β-葡萄糖苷酶突变体对葡萄糖苷水解功能不受影响，对胃蛋白酶的抗性半衰期比野生型BGL1延长，残留酶活力提高了4.8倍，命名为mBGL1^{S84C；Q643P；G696V}。

本发明所述的一种定点突变改造的β-葡萄糖苷酶，是由氨基酸序列为 ACS93768的来源于绿色木霉(Trichoderma viride)的β-葡萄糖苷酶中制造单个氨基酸取代而产生的，对胃蛋白酶抗性提高的β-葡萄糖苷酶，所述的氨基酸取代是第84位、第643位和第696位的取代。

根据本发明所述的定点突变改造的β-葡萄糖苷酶的进一步特征，所述在第 84位的氨基酸取代是用半胱氨酸取代丝氨酸；在第643位的氨基酸取代是用脯氨酸取代谷氨酰胺；在第696位的氨基酸取代是用缬氨酸取代甘氨酸。所述的定点突变改造的β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

本发明所述的β-葡萄糖苷酶突变体(mBGL1^{S84C；Q643P；G696V})，经模拟人工胃液(pH为1.2，浓度为0.15mg/mL的胃蛋白酶在37℃条件下)消化处理60分钟后，溶液中残留突变体mBGL1^{S84C；Q643P；G696V}比残留野生型BGL1^wt的百分含量多了31.15％，显示突变体mBGL1^S84C ^{；Q643P；G696V}对胃蛋白酶的抗性比野生型BGL1 提高了。经酶活力测定和酶比活力计算得:突变体mBGL1^{S84C；Q643P/G696V}蛋白经胃蛋白酶(人工胃液)处理60min后的残留酶比活力比野生型BGL1^wt提高了4.8 倍。突变体mBGL1^{S84C；Q643P；G696V}的其他酶学性质与野生型BGL1^wt基本一致。

进一步地，本发明提供了一种DNA分子，其编码本发明所述的对胃蛋白酶抗性提高的β-葡萄糖苷酶。

本发明所述的突变体DNA分子的核苷酸序列为SEQ ID NO.3。

本发明的另一个目的是提供一种载体，其含有本发明所述的DNA分子。

本发明的又一个目的是提供一种宿主细胞，其含有本发明所述的DNA分子，或者含有本发明所述的载体。

上述载体和宿主细胞都可以通过本领域公知的技术手段进行制备。

本发明还提供了本发明所述的对胃蛋白酶抗性提高的β-葡萄糖苷酶的生产方法，包括：在适于β-葡萄糖苷酶表达的条件下培养本发明所述的宿主细胞，并从培养基中分离所述的β-葡萄糖苷酶。

当本发明所述的DNA分子以合适的取向和正确的阅读框插入到所述的载体，或者转入所述的宿主细胞中，所述的DNA分子可以在任何真核或者原核表达系统中表达。许多宿主-载体系统都可以用来表达蛋白质编码序列。宿主-载体系统包括但不限于：用噬菌体、质粒或粘粒转化的细菌；含有酵母载体的微生物，如酵母；用病毒感染的哺乳动物细胞系统；用病毒感染的昆虫细胞系统；用细菌感染的植物细胞系统。本发明优选的载体包括病毒载体、质粒、粘粒或者寡核苷酸。

本发明优选的宿主为真核系统如毕赤酵母；本发明优选的蛋白质表达方法为毕赤酵母分泌表达。

本发明的另一个方面是提供了所述的对胃蛋白酶抗性提高的β-葡萄糖苷酶的用途，具体是所述的对胃蛋白酶抗性提高的β-葡萄糖苷酶在制备食品添加剂或饲料添加剂中的应用。

附图说明

图1是SDS-PAGE蛋白电泳图，黑色箭头所指处为目的蛋白条带，大小为 78.4Kd左右。其中，泳道1为野生型β-葡萄糖苷酶蛋白“BGL1^wt”；泳道2为不含目的基因的野生型毕赤酵母SMD1168对照样品；泳道3、4、5为突变体β- 葡萄糖苷酶蛋白mBGL1^{S84C；Q643P；G696V}。

图2是本发明所述的野生型BGL1^wt与突变体mBGL1^{S84C；Q643P；G696V}蛋白在人工胃液处理前和经人工胃液处理后的残留蛋白扫描结果图。人工胃液中含胃蛋白酶。

图3是本发明所述的野生型BGL1^wt与突变体mBGL1^{S84C；Q643P；G696V}的酶活测定标准曲线。

图4是野生型BGL1^wt与突变体mBGL1^{S84C；Q643P；G696V}蛋白在人工胃液处理前和经人工胃液处理后的残留酶比活力测定结果图。人工胃液中含胃蛋白酶。

具体实施方式

本文中所采用的术语，除非另有说明，均为本领域技术人员所通常理解的含义。以下提供在本发明中使用的一些特殊术语的定义。

“BGL1^wt”表示野生型β-葡萄糖苷酶，其基因以斜体“BGL1^wt”表示。

“mBGL1^{S84C；Q643P；G696V}”表示突变体β-葡萄糖苷酶，其基因以斜体“mBGL1^S84C ^{；Q643P；G696V}”表示。

实施例1：β-葡萄糖苷酶基因的合成

本发明采用绿色木霉来源的野生型β-葡萄糖苷酶的基因(GenBank注册号为FJ882071.1)，由金唯智公司合成(其它具有全基因合成的商业公司同样可以完成)。

实施例2：β-葡萄糖苷酶基因(bgL1)与克隆载体Taox+PgHT+BBPB的连接

1.将全基因合成的含bgL1目的基因的pGH质粒和克隆载体 Taox+PgHT+BBPB分别用限制性内切酶EcoRI和SpeI/XbaI于37℃酶切30min，酶切条件如下：

2.酶切产物经1％的琼脂糖凝胶电泳后分别回收两个目的片段，用T₄DNA 连接酶连接，连接体系如下：

用DNA连接酶16℃连接16h，连接产物转化DH5α感受态细胞扩增后用质粒抽提试剂盒抽提质粒，用EcoRI和PstI双酶切后跑电泳结果显示有3.8kb和 7.0kb两条带，表明连接成功，通过DNA测序，确定为β-葡萄糖苷酶基因。

实施例3：基因片段Paox+SS1与克隆载体M+Taox+PgHT+PB连接

1.基因片段Paox+SS1由本研究所保存的克隆载体Paox+SS1+PB中调出，使用EcoRI和SpeI内切酶双酶切并纯化回收获得；

2.克隆载体M+Taox+PgHT+PB由实施例2获得，基因片段Paox+SS1与克隆载体M+Taox+PgHT+PB的连接方法同实施例2。

实施例4：定点突变

经过利用酶促反应过渡态理论和蛋白分子之间相互识别的原理，以及计算化学的方法在Discovery Studio 4.5软件平台上进行，发明人确定对第84位、第643 位、第696位氨基酸进行定点突变，突变后的突变体mBGL1^{S84C；Q643P；G696V}基因由苏州金唯智生物技术有限公司合成。也可以由其它具有全基因合成的商业公司完成基因合成。

实施例5：野生型BGL1^wt基因与突变体mBGL1^{S84C；Q643P；G696V}基因分别整合毕赤酵母基因组及重组蛋白的分泌表达为了提高单拷贝表达盒在毕赤酵母染色体上的整合效率，用限制性内切酶XbaI 和SpeI将表达盒Paox+SS1+M+Taox+PgHT从Paox+SS1+M+Taox+PgHT+PB上切下来并用试剂盒纯化回收。本实验的受体菌为毕赤酵母SMD1168，电转化后使用MD平板进行初步筛选，然后挑取MD平板上的单克隆于2mL的YPG液体培养基中培养14～16h后抽取毕赤酵母基因组进行PCR验证和进一步筛选阳性克隆重组子。

实施例6：野生型BGL1^wt及突变体mBGL1^{S84C；Q643P；G696V}重组蛋白的SDS-PAGE 电泳检测

(1)配置10mL 10％的分离胶，混匀后用微量移液器往玻璃板中灌胶，直到离短玻璃板上沿2～3厘米处停止，然后用蒸馏水封住胶面，可轻轻抬起制胶器一端然后放下使胶面平整，聚合40min后到弃蒸馏水，用滤纸吸去多余水分；

(2)配置4mL 5％的浓缩胶，均匀的灌在分离胶之上，插入相应规格的梳子同时应避免产生气泡，聚合30min待胶凝固；

(3)装好电泳槽，将槽内灌电泳液，体积宜大于电泳槽体积的一半，把制好的胶移入电泳槽中，小心拔去梳子；

(4)依次点样，点样量不宜过多，15μL每孔为合适；

(5)电泳开始时先设置90V跑胶，指示剂至浓缩胶部分将电压改为120V继续电泳，目的条带跑到中间位置时可停止电泳(目的条带对应于Maker的相应条带，事先可获知)；

(6)小心剥下凝胶，考马斯亮蓝R-250染色30min后，脱色液脱色至背景较浅蛋白条带清晰即可；

(7)凝胶成像并观察结果。SDS-PAGE蛋白电泳结果如图1所示。

实施例7：电泳检测野生型BGL1^wt及突变体mBGL1^{S84C；Q643P；G696V}重组蛋白的胃蛋白酶抗性检测

将野生BGL1^wt和突变体用人工胃液(pH为1.2，浓度为0.15mg/mL的胃蛋白酶在37℃条件下)消化(野生型BGL1^wt蛋白与突变体mBGL1^{S84C；Q643P；G696V}蛋白的添加量相同，人工胃液和酶蛋白含量按照质量比为1：3.33的比例)分别在0、10、20、30、40、50、60min取出15μl并加入5μl蛋白电泳缓冲液终止消化并立即煮沸5min，然后进行SDS-PAGE电泳检测胃蛋白酶的消化效果，对 SDS-PAGE电泳蛋白条带进行灰度扫描检测残留蛋白量，计算野生型BGL1^wt与突变体mBGL1^{S84C；Q643P/G696V}蛋白经胃蛋白酶处理前和处理后的酶半衰期，结果如图2所示。

实施例8：野生型BGL1^wt及突变体mBGL1^{S84C；Q643P；G696V}重组蛋白的胃蛋白酶抗性检测和酶比活力测定

1.制作野生型BGL1^wt与突变体mBGL1^{S84C；Q643P；G696V}的蛋白定量标准曲线，吸光度值均在标准曲线范围之内。

2.将野生BGL1^wt和突变体mBGL1^{S84C；Q643P；G696V}用人工胃液(pH为1.2，浓度为0.15mg/mL的胃蛋白酶在37℃条件下)消化(野生型BGL1^wt蛋白与突变体mBGL1^{S84C；Q643P；G696V}蛋白的添加量相同，人工胃液和酶蛋白含量按照质量比为1：3.33的比例)60min取出15μl并加入5μl蛋白电泳buffer终止消化并立即煮沸5min，然后进行酶活力测定，比较野生BGL1^wt和mBGL1^{S84C；Q643P；G696V}突变体蛋白在处理前后的比酶活。

3.酶活力和酶比活力的测定：

酶活力定义：以5mmol/LpNPG溶液为底物，在pH为4.5、50℃条件下，每分钟催化底物产生1μmol的pNP所需的酶量为1个酶活力单位(U/mL)。

酶比活力定义：将每毫克蛋白质中的酶的单位数，定义为比活力(U/mg)。

(1)用pH为4.5的0.2M Na₂HPO₄-0.1M柠檬酸缓冲液配置5mmol/LpNPG 溶液。

(2)向96孔板中加入40μL的0.2M Na₂HPO₄-0.1M柠檬酸缓冲液，再加入 75μL的5mmol/LpNPG溶液，金属浴50℃预热5min。

(3)向96孔板加入10μL适当稀释的酶液，50℃反应30min。以灭活的酶液作为对照组，每组三个重复。

(4)加入75μL的1M Na₂CO₃溶液(增强显色并终止反应)，室温静置5min。

(5)在OD₄₀₅下测定吸光值。

(6)根据已制作的pNP标准曲线(如图3所示)计算pNP的浓度，再根据酶活力计算公式计算酶活力。

(7)酶活力计算公式：

酶活力其中，C为代入标曲的pNP浓度(μmol/mL)；V1为反应体积(mL)；N为稀释倍数；V2为所用酶量(mL)；t为酶反应时间。

(8)酶比活力计算公式：

酶比活力其中，U为酶总活力(U/mL)；m为样品中蛋白重量(mg)。

酶活力测定pNP标准曲线如图3所示，将1M碳酸钠溶液和0.1M柠檬酸溶液以1：2的比例混匀，作为混合液。将已配置好的0.01M的pNP溶液稀释10 倍，得到0.001M的pNP标准液。按下表1依次量取试剂，混匀后测定OD₄₀₅的吸光值。

表1：pNP浓度的标准曲线

酶比活力测定结果(如图4所示)显示：野生型BGL1^wt蛋白在胃蛋白酶(人工胃液)处理前酶比活力为362.4±2.5U/mg，经胃蛋白酶(人工胃液)处理后残留酶比活力为31.94±2.1U/mg；突变体mBGL1^{S84C；Q643P/G696V}蛋白在胃蛋白酶(人工胃液)处理前酶比活力为390.4±2.6U/mg，经胃蛋白酶(人工胃液)处理后残留酶比活力为185.3±3.2U/mg；突变体mBGL1^S84C ^{；Q643P/G696V}蛋白经胃蛋白酶(人工胃液)处理60min后的残留酶比活力比野生型BGL1^wt提高了4.8倍。

SEQUENCE LISTING

<110> 暨南大学

<120> 一种对胃蛋白酶抗性提高的β-葡萄糖苷酶

<130>

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 744

<212> PRT

<213> 绿色木霉(Trichoderma viride）

<400> 1

Met Arg Tyr Arg Thr Ala Ala Ala Leu Ala Leu Ala Thr Gly Pro Phe

1 5 10 15

Ala Arg Ala Asp Ser His Ser Thr Ser Gly Ala Ser Ala Glu Ala Val

20 25 30

Val Pro Pro Ala Gly Thr Pro Trp Gly Thr Ala Tyr Asp Lys Ala Lys

35 40 45

Ala Ala Leu Ala Lys Leu Asn Leu Gln Asp Lys Val Gly Ile Val Ser

50 55 60

Gly Val Gly Trp Asn Gly Gly Pro Cys Val Gly Asn Thr Ser Pro Ala

65 70 75 80

Ser Lys Ile Ser Tyr Pro Ser Leu Cys Leu Gln Asp Gly Pro Leu Gly

85 90 95

Val Arg Tyr Ser Thr Gly Ser Thr Ala Phe Thr Pro Gly Val Gln Ala

100 105 110

Ala Ser Thr Trp Asp Val Asn Leu Ile Arg Glu Arg Gly Gln Phe Ile

115 120 125

Gly Glu Glu Val Lys Ala Ser Gly Ile His Val Ile Leu Gly Pro Val

130 135 140

Ala Gly Pro Leu Gly Lys Thr Pro Gln Gly Gly Arg Asn Trp Glu Gly

145 150 155 160

Phe Gly Val Asp Pro Tyr Leu Thr Gly Ile Ala Met Gly Gln Thr Ile

165 170 175

Asn Gly Ile Gln Ser Val Gly Val Gln Ala Thr Ala Lys His Tyr Ile

180 185 190

Leu Asn Glu Gln Glu Leu Asn Arg Glu Thr Ile Ser Ser Asn Pro Asp

195 200 205

Asp Arg Thr Leu His Glu Leu Tyr Thr Trp Pro Phe Ala Asp Ala Val

210 215 220

Gln Ala Asn Val Ala Ser Val Met Cys Ser Tyr Asn Lys Val Asn Thr

225 230 235 240

Thr Trp Ala Cys Glu Asp Gln Tyr Thr Leu Gln Thr Val Leu Lys Asp

245 250 255

Gln Leu Gly Phe Pro Gly Tyr Val Met Thr Asp Trp Asn Ala Gln His

260 265 270

Thr Thr Val Gln Ser Ala Asn Ser Gly Leu Asp Met Ser Met Pro Gly

275 280 285

Thr Asp Phe Asn Gly Asn Asn Arg Leu Trp Gly Pro Ala Leu Thr Asn

290 295 300

Ala Val Asn Ser Asn Gln Val Pro Thr Ser Arg Val Asp Asp Met Val

305 310 315 320

Thr Arg Ile Leu Ala Ala Trp Tyr Leu Thr Gly Gln Asp Gln Ala Gly

325 330 335

Tyr Pro Ser Phe Asn Ile Ser Arg Asn Val Gln Gly Asn His Lys Thr

340 345 350

Asn Val Arg Ala Ile Ala Arg Asp Gly Ile Val Leu Leu Lys Asn Asp

355 360 365

Ala Asn Ile Leu Pro Leu Lys Lys Pro Ala Ser Ile Ala Val Val Gly

370 375 380

Ser Ala Ala Ile Ile Gly Asn His Ala Arg Asn Ser Pro Ser Cys Asn

385 390 395 400

Asp Lys Gly Cys Asp Asp Gly Ala Leu Gly Met Gly Trp Gly Ser Gly

405 410 415

Ala Val Asn Tyr Pro Tyr Phe Val Ala Pro Tyr Asp Ala Ile Asn Thr

420 425 430

Arg Ala Ser Ser Gln Gly Thr Gln Val Thr Leu Ser Asn Thr Asp Asn

435 440 445

Thr Ser Ser Gly Ala Ser Ala Ala Arg Gly Lys Asp Val Ala Ile Val

450 455 460

Phe Ile Thr Ala Asp Ser Gly Glu Gly Tyr Ile Thr Val Glu Gly Asn

465 470 475 480

Ala Gly Asp Arg Asn Asn Leu Asp Pro Trp His Asn Gly Asn Ala Leu

485 490 495

Val Gln Ala Val Ala Gly Ala Asn Ser Asn Val Ile Val Val Val His

500 505 510

Ser Val Gly Ala Ile Ile Leu Glu Gln Ile Leu Ala Leu Pro Gln Val

515 520 525

Lys Ala Val Val Trp Ala Gly Leu Pro Ser Gln Glu Ser Gly Asn Ala

530 535 540

Leu Val Asp Val Leu Trp Gly Asp Val Ser Pro Ser Gly Lys Leu Val

545 550 555 560

Tyr Thr Ile Ala Lys Ser Pro Asn Asp Tyr Asn Thr Arg Ile Val Ser

565 570 575

Gly Gly Ser Asp Ser Phe Ser Glu Gly Leu Phe Ile Asp Tyr Lys His

580 585 590

Phe Asp Asp Ala Asn Ile Thr Pro Arg Tyr Glu Phe Gly Tyr Gly Leu

595 600 605

Ser Tyr Thr Lys Phe Asn Tyr Ser Arg Leu Ser Val Leu Ser Thr Ala

610 615 620

Lys Ser Gly Pro Ala Thr Gly Ala Val Val Pro Gly Gly Pro Ser Asp

625 630 635 640

Leu Phe Gln Asn Val Ala Thr Val Thr Val Asp Ile Ala Asn Ser Gly

645 650 655

Gln Val Thr Gly Ala Glu Val Ala Gln Leu Tyr Ile Thr Tyr Pro Ser

660 665 670

Ser Ala Pro Arg Thr Pro Pro Lys Gln Leu Arg Gly Phe Ala Lys Leu

675 680 685

Asn Leu Thr Pro Gly Gln Ser Gly Thr Ala Thr Phe Asn Ile Arg Arg

690 695 700

Arg Asp Leu Ser Tyr Trp Asp Thr Ala Ser Gln Lys Trp Val Val Pro

705 710 715 720

Ser Gly Ser Phe Gly Ile Ser Val Gly Ala Ser Ser Arg Asp Ile Arg

725 730 735

Leu Thr Ser Thr Leu Ser Val Ala

740

<210> 2

<211> 744

<212> PRT

<213> 改造后的氨基酸序列

<400> 2

Met Arg Tyr Arg Thr Ala Ala Ala Leu Ala Leu Ala Thr Gly Pro Phe

1 5 10 15

Ala Arg Ala Asp Ser His Ser Thr Ser Gly Ala Ser Ala Glu Ala Val

20 25 30

Val Pro Pro Ala Gly Thr Pro Trp Gly Thr Ala Tyr Asp Lys Ala Lys

35 40 45

Ala Ala Leu Ala Lys Leu Asn Leu Gln Asp Lys Val Gly Ile Val Ser

50 55 60

Gly Val Gly Trp Asn Gly Gly Pro Cys Val Gly Asn Thr Ser Pro Ala

65 70 75 80

Ser Lys Ile Cys Tyr Pro Ser Leu Cys Leu Gln Asp Gly Pro Leu Gly

85 90 95

Val Arg Tyr Ser Thr Gly Ser Thr Ala Phe Thr Pro Gly Val Gln Ala

100 105 110

Ala Ser Thr Trp Asp Val Asn Leu Ile Arg Glu Arg Gly Gln Phe Ile

115 120 125

Gly Glu Glu Val Lys Ala Ser Gly Ile His Val Ile Leu Gly Pro Val

130 135 140

Ala Gly Pro Leu Gly Lys Thr Pro Gln Gly Gly Arg Asn Trp Glu Gly

145 150 155 160

Phe Gly Val Asp Pro Tyr Leu Thr Gly Ile Ala Met Gly Gln Thr Ile

165 170 175

Asn Gly Ile Gln Ser Val Gly Val Gln Ala Thr Ala Lys His Tyr Ile

180 185 190

Leu Asn Glu Gln Glu Leu Asn Arg Glu Thr Ile Ser Ser Asn Pro Asp

195 200 205

Asp Arg Thr Leu His Glu Leu Tyr Thr Trp Pro Phe Ala Asp Ala Val

210 215 220

Gln Ala Asn Val Ala Ser Val Met Cys Ser Tyr Asn Lys Val Asn Thr

225 230 235 240

Thr Trp Ala Cys Glu Asp Gln Tyr Thr Leu Gln Thr Val Leu Lys Asp

245 250 255

Gln Leu Gly Phe Pro Gly Tyr Val Met Thr Asp Trp Asn Ala Gln His

260 265 270

Thr Thr Val Gln Ser Ala Asn Ser Gly Leu Asp Met Ser Met Pro Gly

275 280 285

Thr Asp Phe Asn Gly Asn Asn Arg Leu Trp Gly Pro Ala Leu Thr Asn

290 295 300

Ala Val Asn Ser Asn Gln Val Pro Thr Ser Arg Val Asp Asp Met Val

305 310 315 320

Thr Arg Ile Leu Ala Ala Trp Tyr Leu Thr Gly Gln Asp Gln Ala Gly

325 330 335

Tyr Pro Ser Phe Asn Ile Ser Arg Asn Val Gln Gly Asn His Lys Thr

340 345 350

Asn Val Arg Ala Ile Ala Arg Asp Gly Ile Val Leu Leu Lys Asn Asp

355 360 365

Ala Asn Ile Leu Pro Leu Lys Lys Pro Ala Ser Ile Ala Val Val Gly

370 375 380

Ser Ala Ala Ile Ile Gly Asn His Ala Arg Asn Ser Pro Ser Cys Asn

385 390 395 400

Asp Lys Gly Cys Asp Asp Gly Ala Leu Gly Met Gly Trp Gly Ser Gly

405 410 415

Ala Val Asn Tyr Pro Tyr Phe Val Ala Pro Tyr Asp Ala Ile Asn Thr

420 425 430

Arg Ala Ser Ser Gln Gly Thr Gln Val Thr Leu Ser Asn Thr Asp Asn

435 440 445

Thr Ser Ser Gly Ala Ser Ala Ala Arg Gly Lys Asp Val Ala Ile Val

450 455 460

Phe Ile Thr Ala Asp Ser Gly Glu Gly Tyr Ile Thr Val Glu Gly Asn

465 470 475 480

Ala Gly Asp Arg Asn Asn Leu Asp Pro Trp His Asn Gly Asn Ala Leu

485 490 495

Val Gln Ala Val Ala Gly Ala Asn Ser Asn Val Ile Val Val Val His

500 505 510

Ser Val Gly Ala Ile Ile Leu Glu Gln Ile Leu Ala Leu Pro Gln Val

515 520 525

Lys Ala Val Val Trp Ala Gly Leu Pro Ser Gln Glu Ser Gly Asn Ala

530 535 540

Leu Val Asp Val Leu Trp Gly Asp Val Ser Pro Ser Gly Lys Leu Val

545 550 555 560

Tyr Thr Ile Ala Lys Ser Pro Asn Asp Tyr Asn Thr Arg Ile Val Ser

565 570 575

Gly Gly Ser Asp Ser Phe Ser Glu Gly Leu Phe Ile Asp Tyr Lys His

580 585 590

Phe Asp Asp Ala Asn Ile Thr Pro Arg Tyr Glu Phe Gly Tyr Gly Leu

595 600 605

Ser Tyr Thr Lys Phe Asn Tyr Ser Arg Leu Ser Val Leu Ser Thr Ala

610 615 620

Lys Ser Gly Pro Ala Thr Gly Ala Val Val Pro Gly Gly Pro Ser Asp

625 630 635 640

Leu Phe Pro Asn Val Ala Thr Val Thr Val Asp Ile Ala Asn Ser Gly

645 650 655

Gln Val Thr Gly Ala Glu Val Ala Gln Leu Tyr Ile Thr Tyr Pro Ser

660 665 670

Ser Ala Pro Arg Thr Pro Pro Lys Gln Leu Arg Gly Phe Ala Lys Leu

675 680 685

Asn Leu Thr Pro Val Gln Ser Gly Thr Ala Thr Phe Asn Ile Arg Arg

690 695 700

Arg Asp Leu Ser Tyr Trp Asp Thr Ala Ser Gln Lys Trp Val Val Pro

705 710 715 720

Ser Gly Ser Phe Gly Ile Ser Val Gly Ala Ser Ser Arg Asp Ile Arg

725 730 735

Leu Thr Ser Thr Leu Ser Val Ala

740

<210> 3

<211> 2235

<212> DNA

<213> 改造后的核酸序列

<400> 3

atgcgttacc gaacagcagc tgcgctggca cttgccactg ggccctttgc tagggcagac 60

agtcactcaa catcgggggc ctcggctgag gcagttgtac ctcctgcagg gactccatgg 120

ggaaccgcgt acgacaaggc gaaggccgca ttggcaaagc tcaatctcca agataaggtc 180

ggcatcgtga gcggtgtcgg ctggaacggc ggtccttgcg ttggaaacac atctccggcc 240

tccaagatct gctatccatc gctatgcctt caagacggac ccctcggtgt tcgatactcg 300

acaggcagca cagcctttac gccgggcgtt caagcggcct cgacgtggga tgtcaatttg 360

atccgcgaac gtggacagtt catcggtgag gaggtgaagg cctcggggat tcatgtcata 420

cttggtcctg tggctgggcc gctgggaaag actccgcagg gcggtcgcaa ctgggagggc 480

ttcggtgtcg atccatatct cacgggcatt gccatgggtc aaaccatcaa cggcatccag 540

tcggtaggcg tgcaggcgac agcgaagcac tatatcctca acgagcagga gctcaatcga 600

gaaaccattt cgagcaaccc agatgaccga actctccatg agctgtatac ttggccattt 660

gccgacgcgg ttcaggccaa tgtcgcttct gtcatgtgct cgtacaacaa ggtcaatacc 720

acctgggcct gcgaggatca gtacacgctg cagactgtgc tgaaagacca gctggggttc 780

ccaggctatg tcatgacgga ctggaacgca cagcacacga ctgtccaaag cgcgaattct 840

gggcttgaca tgtcaatgcc tggcacagac ttcaacggta acaatcggct ctggggtcca 900

gctctcacca atgcggtaaa tagcaatcag gtccccacga gcagagtcga cgatatggtg 960

actcgtatcc tcgccgcatg gtacttgaca ggccaggacc aggcaggcta tccgtcgttc 1020

aacatcagca gaaatgttca aggaaaccac aagaccaatg tcagggcaat tgccagggac 1080

ggcatcgttc tgctcaagaa tgacgccaac atcctgccgc tcaagaagcc cgctagcatt 1140

gccgtcgttg gatctgccgc aatcattggt aaccacgcca gaaactcgcc ctcgtgcaac 1200

gacaaaggct gcgacgacgg ggccttgggc atgggttggg gttccggcgc cgtcaactat 1260

ccgtacttcg tcgcgcccta cgatgccatc aataccagag cgtcttcgca gggcacccag 1320

gttaccttga gcaacaccga caacacgtcc tcaggcgcat ctgcagcaag aggaaaggac 1380

gtcgccatcg tcttcatcac cgccgactcg ggtgaaggct acatcaccgt ggagggcaac 1440

gcgggcgatc gcaacaacct ggatccgtgg cacaacggca atgccctggt ccaggcggtg 1500

gccggtgcca acagcaacgt cattgttgtt gtccactccg ttggcgccat cattctggag 1560

cagattcttg ctcttccgca ggtcaaggcc gttgtctggg cgggtcttcc ttctcaggag 1620

agcggcaatg cgctcgtcga cgtgctgtgg ggagatgtca gcccttctgg caagctggtg 1680

tacaccattg cgaagagccc caatgactat aacactcgca tcgtttccgg cggcagtgac 1740

agcttcagcg agggactgtt catcgactat aagcacttcg acgacgccaa tatcacgccg 1800

cggtacgagt tcggctatgg actgtcttac accaagttca actactcacg cctctccgtc 1860

ttgtcgaccg ccaagtctgg tcctgcgact ggggccgttg tgccgggagg cccgagtgat 1920

ctgttcccga atgtcgcgac agtcaccgtt gacatcgcaa actctggcca agtgactggt 1980

gccgaggtag cccagctgta catcacctac ccatcttcag cacccaggac ccctccgaag 2040

cagctgcgag gctttgccaa gctgaacctc acgcctggtc agagcgtaac agcaacgttc 2100

aacatccgac gacgagatct cagctactgg gacacggctt cgcagaaatg ggtggtgccg 2160

tcggggtcgt ttggcatcag cgtgggagcg agcagccggg atatcaggct gacgagcact 2220

ctgtcggtag cgtag 2235

Claims

1.一种对胃蛋白酶抗性提高的β-葡萄糖苷酶，其特征在于：它是由氨基酸序列为SEQID NO.1的来源于绿色木霉(Trichoderma viride)的β-葡萄糖苷酶中制造多个氨基酸取代而产生的、对胃蛋白酶抗性更强的酶，所述的氨基酸取代是第84、643和696位的取代。

2.根据权利要求1所述的对胃蛋白酶抗性提高的β-葡萄糖苷酶，其特征在于：所述在第84位的氨基酸取代是用半胱氨酸取代丝氨酸；在643位的氨基酸取代是用脯氨酸取代谷氨酰胺；在第696位的氨基酸取代是用缬氨酸取代甘氨酸；所述的定点突变改造的β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

3.一种DNA分子，其特征在于：其编码权利要求2所述的对胃蛋白酶抗性提高的β-葡萄糖苷酶。

4.根据权利要求3所述的DNA分子，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ ID NO.3。

5.一种载体，其特征在于：其含有权利要求3或4所述的DNA分子。

6.一种宿主细胞，其特征在于：其含有权利要求3或4所述的DNA分子，或者含有权利要求5所述的载体。

7.一种根据权利要求1所述的对胃蛋白酶抗性提高的β-葡萄糖苷酶的生产方法，其特征在于，所述方法包括：在适于β-葡萄糖苷酶表达的条件下培养权利要求6所述的宿主细胞，并从培养基中分离所述的β-葡萄糖苷酶。

8.如权利要求1所述的对胃蛋白酶抗性提高的β-葡萄糖苷酶在制备食品添加剂或饲料添加剂中的应用。