CN109486689B

CN109486689B - 一种增强l-天冬酰胺酶耐酸性的方法

Info

Publication number: CN109486689B
Application number: CN201811609742.9A
Authority: CN
Inventors: 刘松; 李岑; 陈坚; 堵国成
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2018-12-27
Filing date: 2018-12-27
Publication date: 2020-06-16
Anticipated expiration: 2038-12-27
Also published as: CN109486689A

Abstract

本发明公开了一种增强L‑天冬酰胺酶耐酸性的方法，属于酶工程技术领域。本发明通过将黑曲霉来源的L‑天冬酰胺酶与糖化酶催化区域进行融合表达，改变糖基化程度，以改变L‑天冬酰胺酶的酶学性质。本发明获得的重组L‑天冬酰胺酶的最适pH从7.5改变至5，由碱性变至酸性，且在pH为3的条件下仍能保持60％的酶活，这些性质有利于其在食品加工领域的进一步应用。

Description

一种增强L-天冬酰胺酶耐酸性的方法

技术领域

本发明涉及一种增强L-天冬酰胺酶耐酸性的方法，属于酶工程技术领域。

背景技术

L-天冬酰胺酶(L-asparaginase amidohydrolase，E.C.3.5.1.1)是一种水解酶，专一性水解天冬酰胺。L-天冬酰胺酶具有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三种类型，其中的Ⅱ型L-天冬酰胺酶具有良好的应用前景，一方面可用于医药行业中治疗急性粒细胞型白血病等癌症；另一方面，其在食品工业中可降低食品加工中致癌成分丙烯酰胺的生成，尤其是在烘焙食品、油炸食品等。

Ⅱ型L-天冬酰胺酶的来源丰富，不同来源的酶学性质表现出了一定的差异性，该酶分子为四聚体，含有四个亚基，分子量为43kDa。其中L-天冬酰胺酶的最适pH主要集中在7-9，最适反应温度主要集中在40℃-60℃。而食品加工过程中酸性的条件下处理原料有利于减少丙烯酰胺的生成，因此需要L-天冬酰胺酶在酸性环境下保留足够的活性。

目前，常见的改变酶学性质的方法有通过易错PCR非理性的手段或者理性改造方法改变酶的结构，突变酶基因的位点以改变酶的糖基化程度等方法来改变酶学性质，但这些方法各有其缺陷。比如酶基因的突变对于改造酶的热稳定性有较好的效果，但是对于pH的改变不明显，而且突变体的筛选工作量大。而对于L-天冬酰胺酶而言，改变其酶学性质的方法主要集中在提高L-天冬酰胺酶的热稳定性，对pH的改变效果不显著。到目前为止增强L-天冬酰胺酶耐酸性的方法未见报道。

糖基化是在酶的控制下，蛋白质或脂质附加上糖类的过程，发生于内质网。在糖基转移酶作用下将糖转移至蛋白质上，和蛋白质上的氨基酸残基形成糖苷键。蛋白质经过糖基化作用，形成糖蛋白。糖基化是对蛋白的重要的修饰作用，有调节蛋白质功能作用。糖基化有两种形式，即N-连接糖基化和O-连接糖基化。糖基化常用于蛋白标志、影响多肽构象，促使其正确折叠、改变蛋白水溶性、促进蛋白表达等，但也可能造成蛋白变异或失活。

因此，提供一种增强L-天冬酰胺酶耐酸性的方法，不改变酶基因的序列，通过简单的融合方法增强L-天冬酰胺酶的耐酸性，使其在酸性条件下保持良好的活性，对于其在工业上的进一步应用具有重要的意义。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种产L-天冬酰胺酶的重组黑曲霉，融合表达了L-天冬酰胺酶与糖化酶催化区域，所述糖化酶催化区域含SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

在本发明的一种实施方式中，以pUC19为表达载体。

在本发明的一种实施方式中，L-天冬酰胺酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，L-天冬酰胺酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在本发明的一种实施方式中，糖化酶催化区域基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明的第二个目的是提供一种增强L-天冬酰胺酶耐酸性的方法，是将L-天冬酰胺酶与糖化酶催化区域进行融合表达，所述糖化酶催化区域含SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

本发明的第三个目的是提供一种发酵上述重组黑曲霉生产L-天冬酰胺酶的方法。

在本发明的一种实施方式中，将获得的重组黑曲霉接入YPM培养基中，220-250rpm，27-35℃，发酵72-120h。

本发明的第四个目的是提供上述的重组黑曲霉的构建方法，通过构建融合表达L-天冬酰胺酶与含SEQ ID NO.2所示序列的糖化酶催化区域的重组质粒，将重组质粒转入黑曲霉中表达。

在本发明的一种实施方式中，将重组质粒转入黑曲霉采用的是原生质体转化法。

本发明的第五个目的是提供上述的重组黑曲霉在食品、制药或保健品领域的应用。

本发明的第六个目的是提供上述的一种增强L-天冬酰胺酶耐酸性的方法在食品、制药或保健品领域的应用。

本发明通过将黑曲霉来源的L-天冬酰胺酶与糖化酶催化区域进行融合表达，改变其糖基化程度，以改变L-天冬酰胺酶的酶学性质。本发明获得的重组L-天冬酰胺酶的最适pH从7.5改变至5，由碱性变至酸性，且在pH为3的条件下仍能保持60％的酶活，且酶活可提高至融合表达前的4倍。这些性质有利于其在食品加工领域的进一步应用。

附图说明

图1：重组质粒pUC19-LA-GlaA图谱。

图2：糖基化前后L-天冬酰胺酶的蛋白电泳图，1:EndoH酶切后的L-天冬酰胺酶条带，2：糖基化后的L-天冬酰胺酶纯化条带，M：蛋白marker(条带对应长度见图片最右方)。

图3：L-天冬酰胺酶糖基化前在不同pH条件下的相对活力变化，在pH为7.5的磷酸盐缓冲液中，温度为60℃的条件下保温30min，未糖基化的重组酶的酶活定义为100％。

图4：L-天冬酰胺酶糖基化后在不同pH条件下的相对活力变化，在pH为5的磷酸盐缓冲液中，温度为60℃的条件下保温30min，糖基化的重组酶的酶活定义为100％。

具体实施方式

(一)L-天冬酰胺酶活力测定：

L-天冬酰胺酶酶活定义：在37℃条件下，每分钟催化L-天冬酰胺释放1μmol NH₃所需要的酶量为一个酶活单位(U/mL)。

测定方法：在37℃条件下，将900μL 10mM K₂HPO₄-KH₂PO₄(pH 7.5)缓冲液与0.1mL189mM天冬酰胺充分混匀，加入0.1mL酶液，反应30min后加入0.1mL 1.5M TCA终止反应。在436nm波长下测定吸光值，通过硫酸铵绘制标准曲线，根据标准曲线计算发酵液酶活。

(二)最适反应pH测定

将待测样品在温度为60℃的条件下保温30min，分别在pH为3、4、5、5.5、6、7、7.5、8、9、10、11、12下测定L-天冬酰胺酶酶活。

(三)培养基

PDA培养基：土豆200g，葡萄糖20g，琼脂15-20g，加水定容至1L。

LB培养基：10g蛋白胨，5g酵母粉，10g NaCl，加水定容至1L。

YPM培养基：2g酵母提取物，2g蛋白胨，20g麦芽提取物，加水定容至1L。

(四)试剂配方

STC缓冲液：1.2M山梨糖醇，50mM CaCl₂，10mM Tris,pH 7.5-8。

PEG缓冲液：25％PEG 6000，50mM CaCl₂，10mM Tris,pH 7.5-8。

实施例1融合表达L-天冬酰胺酶的重组质粒构建

选择曲霉启动子Pgla、PgpdA或PaclA，在选择的启动子序列5’和3’端分别加上原启动子上下游20bp的同源臂(上下同源臂序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示)。

标记包括曲霉中常用的潮霉素B(hyg)、乳清酸核苷-5’-磷酸脱羟酶、乙酰胺酶等具有类似功效的丝状真菌标记。重组质粒中的潮霉素抗性基因来源于PAN7-1质粒，表达框引物如下(Hyg-F/R，见表1)，若要选择其他抗性可替换表达框中的hyg进行构建。

表1引物表

引物名称	引物序列
		Hyg-F	GAATTCCCTTGTATCTCTACACACAG
Hyg-R	TGAAGAACGAATACCGCGACATCCAACCCATC

利用Vazyme的

II One Step Cloning Kit，以pUC19为载体骨架，将SEQ ID NO.3所示的L-天冬酰胺酶基因序列、SEQ ID NO.4所示的糖化酶催化区域基因glaA、加了同源臂的启动子序列、抗性基因进行一步合成，得到L-天冬酰胺酶表达质粒pUC19-LA-GlaA(质粒图谱见图1)。其中，糖化酶催化区域基因glaA与L-天冬酰胺酶基因的N端用蛋白酶KEX-2(AAGCGC)连接，同时，L-天冬酰胺酶基因C端加了6个his标签，以便后续纯化。

利用Vazyme的

II One Step Cloning Kit，以pUC19为载体骨架，将SEQ ID NO.3所示的L-天冬酰胺酶基因序列、加了同源臂的启动子序列、抗性基因进行一步合成，得到未融合表达糖化酶催化区域的重组质粒，以该质粒作为对照。

采用原生质体转化方法将L-天冬酰胺酶表达质粒pUC19-LA-GlaA、对照质粒转入宿主：

在PDA培养基中过夜培养黑曲霉菌丝，收集菌丝体，用生理盐水清洗菌丝体三遍；用Lysozyme酶解3h，用四层擦镜纸过滤后制备原生质体；4℃，1000rpm离心收集原生质体，用预冷的STC洗涤原生质体2-3次；取制备好的原生质体100μL加入10μL表达质粒混匀放置30min；加入2mL PEG 6000后再放置25min；加入1mL STC，倒入PDA培养基，培养基中加入相应抗性进行筛选。30℃培养5-7天，挑单菌落转板，每个单菌落转板三次，挑选转化子，菌落PCR验证，得到重组黑曲霉。

实施例2重组L-天冬酰胺酶酶学性质变化

将获得的重组黑曲霉接入YPM培养基中，250rpm，30℃，发酵72-120h。将融合糖化酶催化区域前后的L-天冬酰胺酶表达后分别进行镍柱纯化。将重组菌发酵液于10000rpm离心10min，使菌体与发酵上清分离，收集上清液经0.22μm滤膜的样品进行纯化。样品经Ni²⁺亲和层析柱(GE Histrap FF 5mL)纯化得到重组L-天冬酰胺酶。

取10μL纯化样品进行SDS-PAGE电泳检测，未融合糖化酶催化区域的蛋白条带大小约为42kDa，融合后出现一条约55kDa的条带。用NEB的去糖基化酶EndoH(29kDa)对融合后的样品条带进行酶切回收得到图2，处理后的55kDa恢复成42kDa，证明融合糖化酶催化区域后，L-天冬酰胺酶被糖基化。

将糖基化前后的重组菌发酵液上清在温度为60℃的条件下保温30min，分别在pH为3、4、5、5.5、6、7、7.5、8、9、10、11、12下测定L-天冬酰胺酶酶活，得到图3和图4。结果表明，糖基化前，最适pH为7.5，此时发酵液上清的酶活为1.5U/mL；糖基化后，最适pH为5，此时发酵液上清的酶活为6.0U/mL，酶活提高至糖基化前的4倍。当pH为3时糖基化后的L-天冬酰胺酶仍能保留60％以上的酶活力，而糖基化前的L-天冬酰胺酶在pH为3时已经基本丧失酶活。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种增强L-天冬酰胺酶耐酸性的方法

<130> 233

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 378

<212> PRT

<213> Aspergillus niger

<400> 1

Met Pro Leu Lys Pro Ile Leu Leu Ser Ala Leu Ala Ser Leu Ala Ser

1 5 10 15

Ala Ser Pro Leu Leu Tyr Ser Arg Thr Thr Asn Glu Thr Phe Val Phe

20 25 30

Thr Asn Ala Asn Gly Leu Asn Phe Thr Gln Met Asn Thr Thr Leu Pro

35 40 45

Asn Val Thr Ile Phe Ala Thr Gly Gly Thr Ile Ala Gly Ser Asp Ser

50 55 60

Ser Ser Thr Ala Thr Thr Gly Tyr Thr Ser Gly Ala Val Gly Val Leu

65 70 75 80

Ser Leu Ile Asp Ala Val Pro Ser Met Leu Asp Val Ala Asn Val Ala

85 90 95

Gly Val Gln Val Ala Asn Val Gly Ser Glu Asp Ile Thr Ser Asp Ile

100 105 110

Leu Ile Ser Met Ser Lys Lys Leu Asn Arg Val Val Cys Glu Asp Pro

115 120 125

Thr Met Ala Gly Ala Val Ile Thr His Gly Thr Asp Thr Leu Glu Glu

130 135 140

Thr Ala Phe Phe Leu Asp Ala Thr Val Asn Cys Gly Lys Pro Ile Val

145 150 155 160

Ile Val Gly Ala Met Arg Pro Ser Thr Ala Ile Ser Ala Asp Gly Pro

165 170 175

Phe Asn Leu Leu Glu Ala Val Thr Val Ala Ala Ser Thr Ser Ala Arg

180 185 190

Asp Arg Gly Ala Met Val Val Met Asn Asp Arg Ile Ala Ser Ala Tyr

195 200 205

Tyr Val Thr Lys Thr Asn Ala Asn Thr Met Asp Thr Phe Lys Ala Met

210 215 220

Glu Met Gly Tyr Leu Gly Glu Met Ile Ser Asn Thr Pro Phe Phe Phe

225 230 235 240

Tyr Pro Pro Val Lys Pro Thr Gly Lys Val Ala Phe Asp Ile Thr Asn

245 250 255

Val Thr Glu Ile Pro Arg Val Asp Ile Leu Phe Ser Tyr Glu Asp Met

260 265 270

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275 280 285

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ctgctctact cgcggaccac caatgaaacc ttcgtcttca ccaatgccaa tggcctcaac 120

ttcacccaga tgaacaccac cctgccgaac gtgaccattt tcgcaacggg tggtaccatc 180

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ctgtccctca tcgatgcggt gccatccatg ctggatgtgg ccaatgttgc cggcgtccag 300

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<210> 5

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<210> 8

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

tgaagaacga ataccgcgac atccaaccca tc 32

Claims

1.一种产L-天冬酰胺酶的重组黑曲霉，其特征在于，融合表达了L-天冬酰胺酶与糖化酶催化区域，所述L-天冬酰胺酶的N端融合了所述糖化酶催化区域，所述L-天冬酰胺酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述糖化酶催化区域的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.如权利要求1所述的重组黑曲霉，其特征在于，以pUC19为表达载体。

3.一种增强L-天冬酰胺酶耐酸性的方法，其特征在于，是在L-天冬酰胺酶的N端融合糖化酶催化区域后在黑曲霉当中进行融合表达，所述L-天冬酰胺酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，所述糖化酶催化区域的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.一种生产L-天冬酰胺酶的方法，其特征在于，应用权利要求1-2任一所述的重组黑曲霉进行发酵。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，将获得的重组黑曲霉接入YPM培养基中，220-250rpm，27-35℃，发酵72-120h。

6.权利要求1-2任一所述重组黑曲霉的构建方法，其特征在于，构建融合表达L-天冬酰胺酶与氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的糖化酶催化区域的重组质粒，将重组质粒转入黑曲霉中表达。

7.如权利要求6所述的构建方法，其特征在于，将重组质粒转入黑曲霉采用的是原生质体转化法。

8.权利要求1-2任一所述的重组黑曲霉在食品、制药或保健品领域的应用。

9.权利要求3所述的方法在食品、制药或保健品领域的应用。