CN108779443A - 产生糖基化蛋白的方法 - Google Patents

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Abstract

本文描述了体外和体内产生糖基化蛋白的方法。所述方法包括使用宿主细胞产生糖基化蛋白。本文还描述了使用这些方法产生的糖基化蛋白及其用途。

Description

产生糖基化蛋白的方法
本发明申请主张2015年11月30日提交的美国临时专利申请No.62/260,725和2016年11月3日提交的美国临时专利申请No.62/416,853的优先权益，以上每篇专利申请的内容以它们的全部内容并入本文。
1.简介
本文描述了体外和体内产生糖基化蛋白的方法。所述方法包括使用宿主细胞产生糖基化蛋白。本文还描述了使用这些方法产生的糖基化蛋白及其用途。
2.发明背景
糖基化是真核生物中分泌蛋白的最重要的翻译后修饰。具有明确结构的糖蛋白的体内合成仍是理解和利用它们的生物活性的主要障碍，并且重组蛋白的工程设计的糖基化对于开发新型治疗性试剂和研究工具具有巨大潜力。本领域中对于N-糖蛋白合成已知的可用策略包括困难的化学合成和在真核或原核生物中通过经典N-糖基化途径的生物合成。在本领域中，仍需要新的和改善的蛋白质糖基化系统，特别是能够体内产生糖基化蛋白的宿主细胞。
3.发明概述
本发明申请描述了使用包含催化目标蛋白修饰(例如，重组目标蛋白上位点特异的修饰)的糖基转移酶(例如，原核糖基转移酶)的人工生物合成途径，用于N-连接的聚糖在宿主细胞(例如，细菌)中，例如，宿主细胞的细胞质中直接自下而上合成的平台。本文所述的N-糖基化平台不需要使用寡糖转移酶或化学偶联以实现蛋白质(例如，宿主细胞表达的重组蛋白)的糖基化。相反，本文所述的生物合成途径使用N-糖基转移酶(NGT)将单糖直接递送至目标蛋白的N-糖基化共有序列。然后，将其它单糖直接添加至N-连接的单糖，借此直接在所述目标蛋白上产生N-连接的糖基化，而无需寡糖转移酶或化学偶联。
N-糖基转移酶(NGT)能够将葡萄糖添加至存在于N-糖基化共有序列中的氨基酸。例如，NGT可以使N-糖基化共有序列Asn-X-Ser(Thr)中存在的天门冬酰胺(Asn)残基N-糖基化，其中X可以是除Pro之外的任何氨基酸。NGT还可以N-糖基化其它N-糖基化共有序列。参见部分5.1。如本文所公开的，本发明人已发现当将单糖，例如，半乳糖连接至通过NGT添加的葡萄糖时，所得Asn-葡萄糖-单糖(例如，半乳糖)可以用作寡糖/多糖合成的引物，从而导致产生了糖基化蛋白。该发现使得能够对所选蛋白，包括肽和多肽(在本文中统称为“目标蛋白”)体内或体外糖基化。具体地，可以选择多种糖基转移酶并与NGT和包含一个或多个N-糖基化共有序列的目标蛋白合并，从而导致(i)所述共有序列中天门冬酰胺(Asn)(或其它相关残基)的葡糖基化(葡萄糖的添加)；(ii)单糖(例如，半乳糖)与葡萄糖连接；和(iii)所述葡萄糖-单糖引物上寡糖或多糖的组装。另外，可以选择产生糖基化前体的多种酶(例如，CMP-Neu5Ac合成酶，如SynB)并将其与NGT、目标蛋白和所述多种糖基转移酶合并。因此，本文提供了产生糖基化目标蛋白的方法，所述方法包括(i)使用NGT将葡萄糖添加至包含一个或多个N-糖基化共有序列的目标蛋白；(ii)使用糖基转移酶(例如，半乳糖基转移酶)将单糖(例如，半乳糖)添加至所述葡萄糖；和(iii)使用一种或多种其它糖基转移酶在葡萄糖-单糖引物上产生寡糖或多糖。
重要地，已发现可以将本文所述的N-糖基化系统引入宿主细胞，从而导致在宿主细胞的细胞质中产生糖基化目标蛋白。因此，在一个方面，本文提供了能够产生糖基化蛋白，例如，N-糖基化蛋白的宿主细胞。本文所提供的宿主细胞特别地包含(i)编码能够将葡萄糖添加至N-糖基化共有序列中存在的Asn残基(或者其它相关残基)的N-糖基转移酶(NGT)的核酸和(ii)编码催化单糖，例如，半乳糖向通过NGT添加的葡萄糖添加的糖基转移酶的核酸。本文所提供的宿主细胞提供了蛋白质体内糖基化的新型系统，其中在宿主细胞的细胞质中产生了糖基化蛋白。重要地，本文所提供的宿主细胞解决了在外周胞质中产生糖基化蛋白的需要，这是现有体内糖基化平台的限制。
在具体的实施方式中，本文提供了在宿主细胞中产生糖基化重组目标蛋白的方法，其中所述方法不包括在所述细胞中使用寡糖转移酶(OST)或化学偶联。
在另一个具体的实施方式中，本文提供了用于在宿主细胞中产生糖基化目标蛋白的方法，其中所述方法包括培养包含编码所述目标蛋白的核苷酸序列和编码NGT的核苷酸序列的细胞。在某些实施方式中，这种宿主细胞还包括编码一种或多种其它糖基转移酶的核苷酸序列。
在某些实施方式中，编码目标蛋白的这种核苷酸序列包含N-糖基化共有序列(例如，Asn-X-Ser(Thr)，其中X可以是除Pro之外的任何氨基酸)。在具体的实施方式中，所述N-糖基化共有序列对所述目标蛋白是内源的。在其它具体的实施方式中，所述N-糖基化共有序列对所述目标蛋白是异源的。在某些实施方式中，将所述共有序列嵌入异源序列，从而将包含所述N-糖基化共有序列的异源序列添加至所述目标蛋白。在具体的实施方式中，将包含所述N-糖基化共有序列的异源序列添加至所述目标蛋白的N或C末端或者N和C末端，其中将包含所述N-糖基化共有序列的异源序列定义为末端糖基化标签。在其它具体的实施方式中，将包含所述N-糖基化共有序列的异源序列引入或插入到所述蛋白质一级结构的任何位置，其中将包含所述N-糖基化共有序列的异源序列定义为包埋的糖基化标签。在某些实施方式中，所述末端糖基化标签或者包埋糖基化标签位于折叠目标蛋白的表面。在某些实施方式中，所述末端糖基化标签或者所述包埋的糖基化标签不是所述目标蛋白立体构象的一部分，但是仍保持打开。参见部分5.1。
在另一个具体的实施方式中，该宿主细胞还包含编码能够合成一种或多种NGT和/或其它糖基转移酶的糖底物的蛋白(例如，能够合成UDP-葡萄糖的蛋白)的核苷酸序列。在具体的实施方式中，所述蛋白质包括CMP-Neu5Ac合成酶。在另一个具体的实施方式中，所述CMP-Neu5Ac合成酶为SynB。在另一个实施方式中，所述核苷酸序列编码UDP-N-乙酰葡萄糖胺2-表异构酶或唾液酸合酶。
在具体的实施方式中，本文提供了宿主细胞，其包含(i)编码包含N-糖基化共有序列的目标蛋白的核酸；(ii)编码将葡萄糖添加至存在于所述N-糖基化共有序列中的Asn残基(或者其它相关残基)的N-糖基转移酶(NGT)的核酸，和(iii)编码催化向所述葡萄糖添加单糖的糖基转移酶的核酸。在具体的实施方式中，所述目标蛋白对所述宿主细胞是异源的。在另一个具体的实施方式中，所述NGT对所述宿主细胞是异源的。在另一个具体的实施方式中，催化向所述葡萄糖添加单糖的所述糖基转移酶对所述宿主细胞是异源的。在另一个具体的实施方式中，所述目标蛋白，所述NGT和催化向所述葡萄糖添加单糖的所述糖基转移酶中的每一个对所述宿主细胞是异源的。在另一个具体的实施方式中，所述宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)。
在另一个具体的实施方式中，本文提供了宿主细胞，其包含(i)编码包含N-糖基化共有序列的目标蛋白的核酸；(ii)编码将葡萄糖添加至存在于所述N-糖基化共有序列中的Asn残基(或者其它相关残基)的N-糖基转移酶(NGT)的核酸，(iii)编码催化向所述葡萄糖添加单糖的糖基转移酶的核酸；和(iv)编码涎酸转移酶的核酸。在具体的实施方式中，所述涎酸转移酶将一个或多个唾液酸残基添加至所述半乳糖。在另一个具体的实施方式中，所述目标蛋白对所述宿主细胞是异源的。在另一个具体的实施方式中，所述NGT对所述宿主细胞是异源的。在另一个具体的实施方式中，催化向所述葡萄糖添加单糖的所述糖基转移酶对所述宿主细胞是异源的。在另一个具体的实施方式中，所述涎酸转移酶对所述宿主细胞是异源的。在另一个具体的实施方式中，所述目标蛋白，所述NGT，所述涎酸转移酶和催化向所述葡萄糖添加单糖的所述糖基转移酶中的每一个对所述宿主细胞是异源的。在另一个具体的实施方式中，所述宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)。
在另一个具体的实施方式中，本文提供了宿主细胞，其包含(i)编码包含N-糖基化共有序列的目标蛋白的核酸；(ii)编码将葡萄糖添加至存在于所述N-糖基化共有序列中的Asn残基(或者其它相关残基)的N-糖基转移酶(NGT)的核酸，(iii)编码催化向所述葡萄糖添加单糖的糖基转移酶的核酸；(iv)编码涎酸转移酶的核酸；和(v)编码多聚涎酸转移酶(polyST)的核酸。在具体的实施方式中，所述涎酸转移酶将一个或多个唾液酸残基添加至所述半乳糖，并且所述polyST合成聚唾液酸，从而使得能够通过所述宿主细胞产生药代动力学性质改善的多聚唾液酸化的蛋白质。在另一个具体的实施方式中，所述目标蛋白对所述宿主细胞是异源的。在另一个具体的实施方式中，所述NGT对所述宿主细胞是异源的。在另一个具体的实施方式中，催化向所述葡萄糖添加单糖的所述糖基转移酶对所述宿主细胞是异源的。在另一个具体的实施方式中，所述涎酸转移酶对所述宿主细胞是异源的。在另一个具体的实施方式中，所述polyST对所述宿主细胞是异源的。在另一个具体的实施方式中，所述目标蛋白，所述NGT，所述涎酸转移酶，所述polyST和催化向所述葡萄糖添加单糖的所述糖基转移酶中的每一个对所述宿主细胞是异源的。在另一个具体的实施方式中，所述宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)。
在另一个具体的实施方式中，本文提供了宿主细胞，其包含(i)编码包含N-糖基化共有序列的目标蛋白的核酸；(ii)编码将葡萄糖添加至存在于所述N-糖基化共有序列中的Asn残基(或者其它相关残基)的N-糖基转移酶(NGT)的核酸，(iii)编码催化向所述葡萄糖添加单糖的糖基转移酶的核酸；(iv)编码涎酸转移酶的核酸；(v)编码多聚涎酸转移酶(polyST)的核酸；和(vi)编码CMP-Neu5Ac合成酶的核酸。在具体的实施方式中，所述涎酸转移酶将一个或多个唾液酸残基添加至所述半乳糖，并且所述polyST合成聚唾液酸，从而使得能够通过所述宿主细胞产生药代动力学性质改善的多聚唾液酸化的蛋白质。在另一个具体的实施方式中，所述目标蛋白对所述宿主细胞是异源的。在另一个具体的实施方式中，所述NGT对所述宿主细胞是异源的。在另一个具体的实施方式中，催化向所述葡萄糖添加单糖的所述糖基转移酶对所述宿主细胞是异源的。在另一个具体的实施方式中，所述涎酸转移酶对所述宿主细胞是异源的。在另一个具体的实施方式中，所述polyST对所述宿主细胞是异源的。在另一个具体的实施方式中，所述CMP-Neu5Ac合成酶对所述宿主细胞是异源的。在另一个具体的实施方式中，所述目标蛋白，所述NGT，所述涎酸转移酶，所述polyST，所述CMP-Neu5Ac合成酶和催化向所述葡萄糖添加单糖的所述糖基转移酶中的每一个对所述宿主细胞是异源的。在另一个具体的实施方式中，所述宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)。
在具体的实施方式中，本文所提供的宿主细胞包含编码放线杆菌属(Actinobacillus)的种的NGT的核酸。在具体的实施方式中，所述NGT是胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)的NGT(SEQ ID NO:1，氨基酸序列；参见表2)。参见，例如，Choi等人,PLoS ONE(2010)。在另一个具体的实施方式中，所述NGT是猪放线杆菌(Actinobacillus suis)、产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)、小放线杆菌(Actinobacillus minor)或荚膜放线杆菌(Actinobacillus capsulatus)的NGT。
在另一个具体的实施方式中，本文所提供的宿主细胞包含编码嗜血杆菌属(Haemophilus)的种，例如，埃及嗜血杆菌(Haemophilus aegyptius)、软性下疳嗜血菌(Haemophilus ducreyi)、溶血性嗜血杆菌(Haemophilus haemolyticus)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)、副流感嗜血杆菌(Haemophilus parainfluenzae)、副溶血嗜血杆菌(Haemophilus parahaemolyticus)、皮氏嗜血杆菌(Haemophilus pittmaniae)或嗜血弯曲杆菌(Haemophilus sputorum)的NGT的核酸。
在另一个具体的实施方式中，本文所提供的宿主细胞包含编码曼海姆氏菌(Mannheimia)的种，例如，小粒曼海姆氏菌(Mannheimia granulomatis)、溶血曼海姆氏菌(Mannheimia haemolytica)、产琥珀酸曼海姆氏菌(Mannheimia succiniproducens)或异源曼海姆氏菌(Mannheimia varigena)的NGT的核酸。
在另一个具体的实施方式中，本文所提供的宿主细胞包含编码巴氏杆菌(Bibersteinia)的种，例如，海藻糖巴氏杆菌(Bibersteinia trehalosi)的NGT的核酸。
在另一个具体的实施方式中，本文所提供的宿主细胞包含编码耶尔森氏菌属(Yersinia)的种，例如，伯氏耶尔森氏菌(Yersinia bercovieri)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、弗氏耶尔森氏菌(Yersinia frederiksenii)、中间耶尔森氏菌(Yersinia intermedia)、克氏耶尔森菌(Yersinia kristensii)、莫氏耶尔森氏菌(Yersinia mollaretii)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)、假结核耶尔森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)、啮齿耶尔森氏菌(Yersinia rhodei)或类似耶尔森氏菌(Yersinia similis)的NGT的核酸。
在某些实施方式中，在本文所提供的宿主细胞中使用的NGT是与放线杆菌属(Actinobacillus)(例如，胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)的NGT)、嗜血菌属(Haemophilus)、曼海姆氏菌(Mannheimia)、巴氏杆菌(Bibersteinia)或耶尔森氏菌属(Yersinia)中任一种的NGT同源的NGT。例如，本文所提供的宿主细胞可以包含与编码放线杆菌属(Actinobacillus)(例如，胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)的NGT)、嗜血菌属(Haemophilus)、曼海姆氏菌(Mannheimia)、巴氏杆菌(Bibersteinia)或耶尔森氏菌属(Yersinia)的NGT的核酸约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源的核酸。
在某些实施方式中，编码催化单糖向存在于本文所提供的宿主细胞中的所述葡萄糖的添加的糖基转移酶的核酸编码半乳糖基转移酶。在具体的实施方式中，所述半乳糖基转移酶为奈氏球菌属(Neisseria)的种的LgtB。在具体的实施方式中，所述半乳糖基转移酶为脑膜炎奈氏球菌(N.meningitidis)的LgtB。在另一个具体的实施方式中，所述半乳糖基转移酶为淋病奈氏球菌(N.gonorrhoeae)的LgtB。在另一个具体的实施方式中，所述半乳糖基转移酶为脑膜炎奈氏球菌(N.meningitidis)的LgtE。在另一个具体的实施方式中，所述半乳糖基转移酶为空肠弯曲菌(C.jejuni)的CgtB。在另一个具体的实施方式中，所述半乳糖基转移酶为大肠杆菌(E.coli)的WaaX。在另一个具体的实施方式中，所述半乳糖基转移酶为幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)的HP0826。在另一个具体的实施方式中，所述半乳糖基转移酶是真核β4Gal-T1。
在某些实施方式中，在本文所提供的宿主细胞中使用的半乳糖基转移酶是与奈氏球菌属(Neisseria)、弯曲菌属(Campylobacter)、大肠杆菌(E.coli)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)或真核半乳糖基转移酶同源的半乳糖基转移酶。例如，本文所提供的宿主细胞可以包含与编码奈氏球菌属(Neisseria)的种的LgtB(例如，脑膜炎奈氏球菌(N.meningitidis)的LgtB、淋病奈氏球菌(N.gonorrhoeae)的LgtB或脑膜炎奈氏球菌(N.meningitidis)的LgtE)的核酸约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源；与编码空肠弯曲菌(C.jejuni)的CgtB的核酸约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源；与编码大肠杆菌(E.coli)的WaaX的核酸约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源；与编码幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)的HP0826的核酸约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源；或者与编码真核β4Gal-T1的核酸约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源的核酸。
在另一个具体的实施方式中，当本文所提供的宿主细胞包含编码涎酸转移酶的核酸时，所述涎酸转移酶来自弯曲菌属(Campylobacter)的种。在具体的实施方式中，所述涎酸转移酶是空肠弯曲菌(C.jejuni)的CstII。在另一个具体的实施方式中，所述涎酸转移酶是空肠弯曲菌(C.jejuni)的CstI。在另一个具体的实施方式中，所述涎酸转移酶是脑膜炎奈氏球菌(N.meningitidis)的Lst。在另一个具体的实施方式中，所述涎酸转移酶是淋病奈氏球菌(N.gonorrhoeae)的Lst。
在某些实施方式中，在本文所提供的宿主细胞中使用的涎酸转移酶是与奈氏球菌属(Neisseria)或弯曲菌属(Campylobacter)的涎酸转移酶同源的涎酸转移酶。例如，本文所提供的宿主细胞可以包含与编码空肠弯曲菌(C.jejuni)的CstII、空肠弯曲菌(C.jejuni)的CstI、脑膜炎奈氏球菌(N.meningitidis)的Lst或淋病奈氏球菌(N.gonorrhoeae)的Lst的核酸约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源的核酸。
在另一个具体的实施方式中，当本文所提供的宿主细胞包含编码多聚涎酸转移酶(polyST)的核酸时，所述polyST是脑膜炎奈氏球菌(N.meningitidis)的polyST。在具体的实施方式中，所述脑膜炎奈氏球菌(N.meningitidis)的polyST是脑膜炎奈氏球菌(N.meningitidis)血清群B的polyST。
在另一个具体的实施方式中，当本文所提供的宿主细胞包含编码多聚涎酸转移酶(polyST)的核酸时，所述polyST是大肠杆菌(E.coli)K1、溶血曼海姆氏菌(Mannheimaniahaemolytica)或Moraxella nonliquifacien的polyST。
在某些实施方式中，在本文所提供的宿主细胞中使用的多聚涎酸转移酶是与奈氏球菌属(Neisseria)的种、曼海姆氏菌(Mannheimania)的种、莫拉氏菌属(Moraxella)的种或大肠杆菌(E.coli)的多聚涎酸转移酶同源的多聚涎酸转移酶。例如，本文所提供的宿主细胞可以包含与编码脑膜炎奈氏球菌(N.meningitidis)血清群B的polyST、溶血曼海姆氏菌(Mannheimania haemolytica)的polyST、Moraxella nonliquifacien的polyST或大肠杆菌(E.coli)的polyST的核酸约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源的核酸。
在另一个具体的实施方式中，当本文所提供的宿主细胞包含编码CMP-Neu5Ac合成酶的核酸时，所述CMP-Neu5Ac合成酶是脑膜炎奈氏球菌(N.meningitidis)的SynB。在另一个具体的实施方式中，将包含编码CMP-Neu5Ac合成酶的核酸的本文所提供的宿主细胞与CMP-Neu5Ac合成酶底物(例如，唾液酸)一起培育。
在某些实施方式中，在本文所提供的宿主细胞中使用的CMP-Neu5Ac合成酶是与奈氏球菌属(Neisseria)的种的CMP-Neu5Ac合成酶同源的CMP-Neu5Ac合成酶。例如，本文所提供的宿主细胞可以包含与编码脑膜炎奈氏球菌(N.meningitidis)的SynB的核酸约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源的核酸。
在某些实施方式中，本文所提供的宿主细胞是原核宿主细胞。示例性的原核宿主细胞无限制地包括埃希氏菌属(Escherichia)的种、志贺氏菌属(Shigella)的种、克雷伯氏菌属(Klebsiella)的种、黄单胞菌属(Xhantomonas)的种、沙门氏菌属(Salmonella)的种、耶尔森氏菌属(Yersinia)的种、乳球菌属(Lactococcus)的种、乳杆菌属(Lactobacillus)的种、假单胞菌属(Pseudomonas)的种、棒状杆菌(Corynebacterium)的种、链霉菌属(Streptomyces)的种、链球菌属(Streptococcus)的种、葡萄球菌属(Staphylococcus)的种、芽孢杆菌属(Bacillus)的种和梭状芽胞杆菌(Clostridium)的种。在具体的实施方式中，本文所使用的宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)。
在某些实施方式中，本文所提供的宿主细胞是真核宿主细胞。示例性真核宿主细胞无限制地包括酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞、动质体目细胞和哺乳动物细胞。
在某些实施方式中，编码存在于本文所提供的宿主细胞中的目标蛋白的核酸编码治疗性蛋白，即在疾病或病症的治疗中使用的蛋白。例如，编码存在于本文所提供的宿主细胞中的目标蛋白的核酸可以编码用作抑制剂或抗体的酶、细胞因子、受体、配体、生长因子、蛋白质。在以下部分5.4中提供了目标蛋白的非限制性列表。
在某些实施方式中，编码本文所提供的宿主细胞中的目标蛋白的核酸不编码GFP。
在另一个方面，本文提供了用于产生糖基化目标蛋白的方法，所述方法包括(i)将本文所提供的宿主细胞在适合于蛋白质产生的条件下培养和(ii)分离所述目标蛋白。在具体的实施方式中，所述宿主细胞包含(a)编码包含N-糖基化共有序列的目标蛋白的核酸；(b)编码将葡萄糖添加至存在于所述N-糖基化共有序列中的Asn残基(或其它相关残基)的N-糖基转移酶(NGT)的核酸，和(c)编码催化向所述葡萄糖添加单糖的糖基转移酶的核酸，其中所述目标蛋白、所述NGT和催化向所述葡萄糖添加单糖的所述糖基转移酶中的至少一种、两种或全部对所述宿主细胞是异源的。在另一个具体的实施方式中，所述宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)。在另一个具体的实施方式中，所述NGT是胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)的NGT。在另一个具体的实施方式中，编码催化单糖向存在于本文所提供的宿主细胞中的所述葡萄糖添加的糖基转移酶的所述核酸编码半乳糖基转移酶，例如，脑膜炎奈氏球菌(N.meningitidis)的LgtB。
在另一个具体的实施方式中，本文提供了用于产生药代动力学性质改善的唾液酸化的目标蛋白的方法，所述方法包括(i)将本文所提供的宿主细胞在适合于蛋白质产生的条件下培养和(ii)分离所述目标蛋白。在具体的实施方式中，所述宿主细胞包含(a)编码包含N-糖基化共有序列的目标蛋白的核酸；(b)编码将葡萄糖添加至存在于所述N-糖基化共有序列中的Asn残基(或其它相关残基)的N-糖基转移酶(NGT)的核酸，(c)编码催化向所述葡萄糖添加单糖的糖基转移酶的核酸；和(d)编码涎酸转移酶的核酸，其中所述目标蛋白、所述NGT、所述涎酸转移酶和催化向所述葡萄糖添加单糖的所述糖基转移酶中的一种、两种、三种或全部对所述宿主细胞是异源的。在另一个具体的实施方式中，所述宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)。在另一个具体的实施方式中，所述NGT是胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)的NGT。在另一个具体的实施方式中，编码催化单糖向存在于本文所提供的宿主细胞中的所述葡萄糖添加的糖基转移酶的所述核酸编码半乳糖基转移酶，例如，脑膜炎奈氏球菌(N.meningitidis)的LgtB。在另一个具体的实施方式中，所述涎酸转移酶是空肠弯曲菌(C.jejuni)的CstII。
在另一个具体的实施方式中，本文提供了用于产生药代动力学性质改善的多聚唾液酸化的目标蛋白的方法，所述方法包括(i)将本文所提供的宿主细胞在适合于蛋白质产生的条件下培养和(ii)分离所述目标蛋白。在具体的实施方式中，所述宿主细胞包含(a)编码包含N-糖基化共有序列的目标蛋白的核酸；(b)编码将葡萄糖添加至存在于所述N-糖基化共有序列中的Asn残基(或其它相关残基)的N-糖基转移酶(NGT)的核酸，(c)编码催化向所述葡萄糖添加单糖的糖基转移酶的核酸；(d)编码涎酸转移酶的核酸；和(e)编码多聚涎酸转移酶(polyST)的核酸。在具体的实施方式中，所述目标蛋白，所述NGT，所述涎酸转移酶，所述polyST和催化向所述葡萄糖添加单糖的所述糖基转移酶中的1、2、3、4个或全部对所述宿主细胞是异源的。在另一个具体的实施方式中，所述宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)。在另一个具体的实施方式中，所述NGT是胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)的NGT。在另一个具体的实施方式中，编码催化单糖向存在于本文所提供的宿主细胞中的所述葡萄糖添加的糖基转移酶的所述核酸编码半乳糖基转移酶，例如，脑膜炎奈氏球菌(N.meningitidis)的LgtB。在另一个具体的实施方式中，所述涎酸转移酶是空肠弯曲菌(C.jejuni)的CstII。在另一个具体的实施方式中，所述polyST是脑膜炎奈氏球菌(N.meningitidis)的polyST(例如，脑膜炎奈氏球菌(N.meningitidis)血清群B的polyST)。
在另一个具体的实施方式中，本文提供了用于产生多聚唾液酸化的目标蛋白的方法，所述方法包括(i)将本文所提供的宿主细胞在适合于蛋白质产生的条件下培养和(ii)分离所述目标蛋白。在具体的实施方式中，所述宿主细胞包含(a)编码包含N-糖基化共有序列的目标蛋白的核酸；(b)编码将葡萄糖添加至存在于所述N-糖基化共有序列中的Asn残基(或其它相关残基)的N-糖基转移酶(NGT)的核酸，(c)编码催化向所述葡萄糖添加单糖的糖基转移酶的核酸；(d)编码涎酸转移酶的核酸；(e)编码多聚涎酸转移酶(polyST)的核酸；和(f)编码CMP-Neu5Ac合成酶的核酸。在具体的实施方式中，所述目标蛋白，所述NGT，所述涎酸转移酶，所述polyST，所述CMP-Neu5Ac合成酶和催化向所述葡萄糖添加单糖的所述糖基转移酶中的1、2、3、4、5个或全部对所述宿主细胞是异源的。在另一个具体的实施方式中，所述宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)。在另一个具体的实施方式中，所述NGT是胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)的NGT。在另一个具体的实施方式中，编码催化单糖向存在于本文所提供的宿主细胞中的所述葡萄糖添加的糖基转移酶的所述核酸编码半乳糖基转移酶，例如，脑膜炎奈氏球菌(N.meningitidis)的LgtB。在另一个具体的实施方式中，所述涎酸转移酶是空肠弯曲菌(C.jejuni)的CstII。在另一个具体的实施方式中，所述polyST是脑膜炎奈氏球菌(N.meningitidis)的polyST(例如，脑膜炎奈氏球菌(N.meningitidis)血清群B的polyST)。在另一个具体的实施方式中，所述CMP-Neu5Ac合成酶是脑膜炎奈氏球菌(N.meningitidis)的SynB。
在某些实施方式中，当将本文所提供的宿主细胞用于产生唾液酸化和/或多聚唾液酸化的蛋白质时，在添加有N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)的培养基中培养所述宿主细胞。参见Antoine等人Chem.Bio.Chem.4,406-412(2003)。
在某些实施方式中，通过所提供的宿主细胞产生的目标蛋白是治疗性蛋白，即在疾病或病症的治疗中使用的蛋白。例如，通过本文所提供的宿主细胞产生的目标蛋白可以是酶、细胞因子或抗体，其中所述目标蛋白已糖基化，例如，唾液酸化。在以下部分5.4中提供了目标蛋白的非限制性列表。
在另一个方面，本文提供了组合物，例如，药物组合物，其包含通过本文所提供的宿主细胞产生的糖基化的(例如，唾液酸化/多聚唾液酸化的)目标蛋白。参见以下部分5.5。
在具体的实施方式中，本文提供了包含使用本文所述的宿主细胞产生的糖基化蛋白的组合物，其中存在于所述蛋白质中的所述N-糖基化共有序列的至少80％、85％、90％、95％或99％包含连接至存在于所述N-糖基化共有序列中的Asn残基(或者其它相关残基)的葡萄糖。
在另一个具体的实施方式中，本文提供了包含使用本文所述的宿主细胞产生的糖基化蛋白的组合物，其中存在于所述蛋白质中的所述N-糖基化共有序列的至少80％、85％、90％、95％或99％包含连接至存在于所述N-糖基化共有序列中的Asn残基(或者其它相关残基)的相同的连接的多糖。
在另一个具体的实施方式中，本文提供了包含使用本文所述的宿主细胞产生的糖基化蛋白的组合物，其中在所述组合物中至少80％、85％、90％、95％或99％的蛋白已通过所述宿主细胞的NGT，例如，通过存在于所述宿主细胞中的异源核酸编码的NGT N-糖基化。在具体的实施方式中，存在于所述组合物中的每个蛋白中存在的N-糖基化共有序列的至少80％、85％、90％、95％或99％包含连接至存在于所述N-糖基化共有序列中的Asn残基(或者其它相关残基)的葡萄糖。在另一个具体的实施方式中，存在于所述组合物中的每个蛋白中存在的N-糖基化共有序列的至少80％、85％、90％、95％或99％包含连接至存在于所述N-糖基化共有序列中的Asn残基(或者其它相关残基)的相同的连接的多糖。
在另一个具体的实施方式中，本文提供了包含使用本文所述的宿主细胞产生的唾液酸化的蛋白质。在具体的实施方式中，在所述组合物中所述蛋白质的至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％是唾液酸化的或多聚唾液酸化的。在另一个具体的实施方式中，所述组合物中100％的所述蛋白质是唾液酸化的或多聚唾液酸化的。在另一个具体的实施方式中，在存在于所述组合物中的每个蛋白中存在的N-糖基化共有序列的至少80％、85％、90％、95％或99％在存在于所述N-糖基化共有序列中的Asn残基(或者其它相关残基)处包含相同的唾液酸化类型。
在另一个方面，本文提供了治疗对象，例如，人对象的方法，其包括向所述对象施用有效量的本文所述的组合物(例如，药物组合物)。参见以下部分5.6。
在另一个方面，本文提供了包含本文所提供的宿主细胞、蛋白质和/或组合物的试剂盒。
3.1术语
当与数字联合使用时，术语“约”是指所指数字的±1、±5或±10％之内的任何数字。
如本文所使用的，术语“N-糖基化共有序列”是指存在于N-糖基转移酶(NGT)能够将葡萄糖添加至的目标蛋白中的序列。在具体的实施方式中，N-糖基化共有序列是天门冬酰胺(Asn)-X-丝氨酸(Ser)/苏氨酸(Thr)，其中X可以是除脯氨酸(Pro)之外的任何氨基酸。在另一个具体的实施方式中，N-糖基化共有序列是Y-X-Z，其中Y可以是天门冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)或丝氨酸(Ser)，X可以是除Pro之外的任何氨基酸，并且Z可以是任何氨基酸。在具体的实施方式中，Z是Ser、Thr、甘氨酸(Gly)、缬氨酸(Val)、丙氨酸(Ala)或天冬氨酸(Asp)。
如本文所使用的，在向对象施用疗法(例如，本文所述的组合物)的背景中，术语“有效量”是指具有预防和/或治疗效果的疗法的量。在某些实施方式中，“有效量”是指足以实现以下效果中的1、2、3、4或更多个的疗法的量：(i)减轻或改善与之相关的疾病/病症或症状的严重程度；(ii)缩短与之相关的疾病/病症或症状的持续时间；(iii)预防与之相关的疾病/病症或症状的发展；(iv)导致与之相关的疾病/病症或症状消退；(v)预防与之相关的疾病/病症或症状的发展或发生；(vi)防止与之相关的疾病/病症或症状复发；(vii)减少与疾病/病症有关的器官衰竭；(viii)减少患有疾病/病症的对象的住院；(ix)缩短患有疾病/病症的对象的住院长度；(x)提高患有疾病/病症的对象的存活；(xi)消除对象中的疾病/病症；和/或(xii)提高或改善另一种疗法的预防或治疗效果。
如本文所使用的，术语“对象”是指动物(例如，鸟、爬虫和哺乳动物)。在另一个实施方式中，对象为哺乳动物，其包括非灵长类(例如，骆驼、驴、斑马、母牛、猪、马、山羊、绵羊、猫、狗、大鼠和小鼠)和灵长类(例如，猴子、黑猩猩和人)。在某些实施方式中，对象是非人动物。在一些实施方式中，对象为农畜或宠物(例如，狗、猫、马、山羊、绵羊、猪、驴或鸡)。在具体的实施方式中，对象是人。术语“对象”和“患者”可以在本文中互换使用。
4.附图说明
图1：细菌细胞质中蛋白质N-连接的多聚唾液酸化的代谢工程途径。通过ApNGT实现目标蛋白的初始位点-特异性修饰，所述ApNGT将单个N-连接的葡萄糖添加至Asn-X-Ser(Thr)共有序列子中。通过半乳糖基转移酶(LgtB)、涎酸转移酶(CstII)和多聚涎酸转移酶(polyST)实现了葡萄糖的顺序伸长。从Neu5Ac的外源供应(清除途径(scavengerpathway))或者通过从UDP-GlcNAc的Neu5Ac的内源合成(从头合成途径)合成供体分子CMP-Neu5Ac。根据功能性糖组学联合会(Consortium for Functional Glycomics)的指南绘制聚糖。
图2：唾液乳糖在scAtaC上的组装。使用scAtaC作为目标蛋白测试人工糖基化途径。scAtaC构建体是自转运蛋白的胞质保留片段(aa1866-2428)并且含有总计13个潜在的糖基化位点和6×His标签。scAtaC构建体与完整唾液乳糖途径一起(泳道5)，或与仅含ApNGT构建体的截短糖基化途径一起(泳道3)，或与ApNGT和LgtB构建体一起(泳道4)在大肠杆菌(E.coli)JM107ΔnanA::kan中共表达。对照菌株未表达糖基转移酶(泳道1)或ApNGT(泳道2)。在28℃进行蛋白表达20小时，并使用NiNTA珠以分批形式富集scAtaC。在SDS-PAGE上分离洗脱的蛋白，并通过抗6×His标签(上部)和抗N-连接的葡萄糖(下部)的免疫印迹法检测scAtaC。
图3：通过nanoLC-MS/MS确认N-连接的唾液乳糖在scAtaC上的组装。scAtaC构建体与完整唾液乳糖途径一起在大肠杆菌(E.coli)JM107ΔnanA::kan中共表达，然后通过NiNTA珠纯化。对纯化的蛋白直接进行胰蛋白酶消化，并通过nano-LC-MS/MS分析。(A)在每个色谱图中显示了来自scAtaC的一个胰蛋白酶肽GNLSTAADVTDK(N：潜在的N-糖基化位点；SEQ ID NO:4)及其相应糖基化形式的萃取离子色谱图(XIC)。每个唾液酸向所述肽的添加提高了在反相色谱上的保留时间。m/z 758.3485(z＝2)(B)、903.8954(z＝2)(C)和1049.4428(z＝2)(D)的HCD MS/MS谱图显示了连续的肽片段离子和聚糖中性丢失。对于唾液酸化的糖肽，在(C)和(D)中观察到了[NeuAc-H2O+H]+和[NeuAc+H]+的氧鎓离子。糖的符号符合功能性糖组学联合会的指南。
图4：聚唾液酸在scAtaC上的组装。使用scAtaC作为目标蛋白测试人工糖基化途径。scAtaC构建体与完整多聚唾液酸化途径一起在大肠杆菌(E.coli)JM107ΔnanA::kan中共表达(泳道3)。对照菌株未表达ApNGT(泳道1)或polyST(泳道2)。在28℃进行蛋白表达20小时，并使用NiNTA珠以分批形式富集scAtaC。在SDS-PAGE上分离洗脱的蛋白，并使用聚唾液酸特异性单克隆抗体通过免疫印迹法检测聚唾液酸。
图5：GFP的多聚唾液酸化。(a)“糖基化标签-GFP”(SEQ ID NO:5)和“糖基化环-GFP”(SEQ ID NO:6)的卡通图示。每个构建体分别在C末端延伸和环插入中含有单个Asn-Ala-Thr糖基化序列子(下划线)。目标天门冬酰胺残基是下划线的Asn-Ala-Thr糖基化序列子中的下划线的Asn。糖基化标签-GFP还包含下划线糖基化序列子下游的C末端Strep-标签。(b)具有和不具有葡糖基化的纯化的糖基化标签-和糖基化环-GFP构建体的凝胶和免疫印迹分析。在存在或不存在ApNGT的情况下，将每个GFP构建体在28℃表达20小时。通过NiNTA和Streptactin Sepharose珠对GFP双重亲合纯化。通过SDS-PAGE分离纯化的蛋白质，并进行考马斯亮蓝染色(上部)或使用人血清MS1413通过免疫印迹法分析(下部)以检测N-连接的葡萄糖。(c)来自多聚唾液酸化的糖基化标签-GFP的纯化的部分的凝胶和免疫印迹分析。将所述蛋白在28℃与完整多聚唾液酸化途径共表达20小时。通过NiNTA亲和色谱纯化总GFP，然后通过阴离子交换色谱法分级为低、中和高[NaCl]洗脱部分。将所述样品交换为低盐缓冲液，通过SDS-PAGE分离并通过考马斯亮蓝染色(上部)或通过免疫印迹分析(下部)以检测polySia。(d)通过完整糖蛋白的UPLC分析确定聚合物长度。将纯化的低聚和多聚唾液酸化的糖基化标签-GFP与未修饰的蛋白(在没有糖基化机制的情况下表达)相比较。在ProPac SAX柱上，以50至600mM NaCl在20mM Tris pH 7.0中的溶液的线性梯度，以1.2ml/min的流速，经过15分钟分离每个样品。通过在线荧光检测(Ex.385/Em.410)监测GFP糖基化形式的洗脱。对所选的峰表示聚合度(DP)。通过用特异性解聚酶，内切唾液酸酶NF消化多糖来确认GFP上α2,8-连接的多聚唾液酸的化学一致性。
图6：NanoLC-MS/MS显示了N-连接的唾液乳糖在糖基化环-GFP上的组装。糖基化环-GFP构建体与唾液乳糖途径一起在大肠杆菌(E.coli)JM107ΔnanA::kan中共表达，然后通过NiNTA珠富集。对富集的蛋白直接进行胰蛋白酶消化，并进行nano-LC-MS/MS分析。在每个色谱图中显示了含有来自糖基化环-GFP的胰蛋白酶肽(SEQ ID NO：7)及其相应糖基化形式的糖基化位点的肽序列(top)和萃取离子色谱图(XIC)。糖的符号符合功能性糖组学联合会的指南。
图7：糖基化标签-GFP的多聚唾液酸化的摇瓶培养条件优化。将具有多聚唾液酸化途径和糖基化标签-GFP的表达质粒的大肠杆菌(E.coli)JM107ΔnanA::kan株在100ml烧瓶中培养和表达。通过改变(a)中所列的标准表达条件进行每次培养。通过SDS-PAGE在10％丙烯酰胺凝胶上分离全细胞提取物，并通过抗GFP上的10×His标签(左部)或抗polySia(右部)的免疫印迹分析(b)监测GFP的多聚唾液酸化。
图8：通过制备型强阴离子交换色谱法分离糖基化标签-GFP糖基化形式。通过NiNTA亲和色谱法纯化总GFP。将浓缩的洗脱液直接加载至MonoQ强阴离子交换柱，并以0-1MNaCl(顶部)在20mM Tris pH 7.0中的溶液的梯度，以1ml/min的流速分离。通过肉眼检查鉴别含有GFP的部分，并通过测量每个部分的荧光(Ex.485nm/Em.520nm，底部)确认。收集所指示的部分“GFP”、“GFPoligoSia”和“GFPpolySia”，交换缓冲液并保留用于进一步分析(参见图5c和d)。
图9：VEGF-A-拮抗DARPin的多聚唾液酸化。(a)来自多聚唾液酸化的糖基化标签-DARPin的纯化的部分的凝胶和免疫印迹分析。将所述糖基化标签-DARPin蛋白在28℃与完整多聚唾液酸化途径共表达20小时。通过NiNTA亲和色谱纯化总糖基化标签-DARPin，然后通过阴离子交换色谱法分级为低、中和高NaCl浓度洗脱部分。在最终的尺寸排阻色谱法步骤之后，通过SDS-PAGE分离样品并通过考马斯亮蓝染色(左部)或通过免疫印迹法分析(右部)来检测polySia。(b)通过HPSEC的纯化的蛋白的分析。将纯化的多聚唾液酸化的糖基化标签-DARPin制剂(用短、中和长polySia修饰)与未修饰的蛋白质(在没有糖基化机制的情况下表达)相比较。在Agilent Bio SEC-5柱上分离每个样品，并在线监测215nm的吸光度。凝胶过滤标准品包含以下组分：(1)甲状球蛋白(牛)MW＝670kDa、(2)γ-球蛋白(牛)MW＝158kDa、(3)卵清蛋白(鸡)MW＝44kDa、(4)肌红蛋白(马)MW＝17kDa和(5)维生素B12MW＝1.35kDa。
图10：使用CMP-Neu5Ac生物合成的从头合成途径的GFP的多聚唾液酸化。将糖基化标签-GFP与编码CMP-Neu5Ac从头合成基因，siaABC的完整多聚唾液酸化途径一起在大肠杆菌(E.coli)W3110ΔlacZΔnanAΔnanK中共表达(泳道2)。对照菌株通过外源提供Neu5Ac表达完整多聚唾液酸化途径(泳道4)、不表达polyST(泳道1)和不表达糖基化途径(泳道3)。在28℃进行蛋白表达20小时，使用NiNTA珠以分批形式富集GFP。在SDS-PAGE上分离洗脱的蛋白质并通过考马斯亮蓝染色(左部)或通过免疫印迹法分析(右部)来检测polySia。
图11：使用polyST同源物的GFP的多聚唾液酸化。将糖基化标签-GFP与编码CMP-Neu5Ac从头合成基因，siaABC的完整多聚唾液酸化途径和Δ20polySTMh(泳道3)或MalE-Δ20polySTMh融合变体(泳道4)一起在大肠杆菌(E.coli)W3110ΔlacZΔnanAΔnanK中共表达。对照菌株表达完整从头合成唾液乳糖途径(泳道2)或不表达糖基化途径(泳道1)。在28℃进行蛋白表达20小时，使用NiNTA珠以分批形式富集GFP。(a)富集的糖基化标签-GFP的凝胶和免疫印迹分析。通过SDS-PAGE分离样品并通过考马斯亮蓝染色(左部)或通过免疫印迹法(右部)分析来检测polySia。(b)通过完整糖蛋白的HPAE分析确定聚合物长度。在ProPacSAX柱上，以50至600mM NaCl在20mM Tris pH 7.0中的溶液的线性梯度，以1.2ml/min的流速，经过16分钟分离富集的糖基化标签-GFP样品。通过在线荧光检测(Ex.385/Em.410)监测GFP糖基化形式的洗脱。对所选的峰表示聚合度(DP)。
5.发明详述
N-糖基转移酶(NGT)能够将葡萄糖添加至存在于N-糖基化共有序列中的氨基酸。例如，NGT可以使N-糖基化共有序列Asn-X-Ser(Thr)中存在的天门冬酰胺(Asn)残基N-糖基化，其中X可以是除Pro之外的任何氨基酸。NGT还可以N-糖基化其它N-糖基化共有序列。参见部分5.1。如本文所公开的，本发明人已发现当将单糖，例如，半乳糖连接至通过NGT添加的葡萄糖时，所得Asn-葡萄糖-单糖(例如，半乳糖)可以用作寡糖/多糖合成的引物，从而导致产生了糖基化蛋白。该发现使得能够对所选蛋白，包括肽和多肽(在本文中统称为“目标蛋白”)体内或体外糖基化。具体地，可以选择多种糖基转移酶并与NGT和包含一个或多个N-糖基化共有序列的目标蛋白合并，从而导致(i)所述共有序列中天门冬酰胺(Asn)(或其它相关残基)的葡糖基化(葡萄糖的添加)；(ii)单糖(例如，半乳糖)与葡萄糖连接；和(iii)所述葡萄糖-单糖引物上寡糖或多糖的组装。因此，本文提供了产生糖基化目标蛋白的方法，所述方法包括(i)使用NGT将葡萄糖添加至包含一个或多个N-糖基化共有序列的目标蛋白；(ii)使用糖基转移酶(例如，半乳糖基转移酶)将单糖(例如，半乳糖)添加至所述葡萄糖；和(iii)使用一种或多种其它糖基转移酶在葡萄糖-单糖引物上产生寡糖或多糖。
在部分5.1中描述了包含用于产生糖基化目标蛋白的机制的宿主细胞。在部分5.2中提供了用于将糖基化机制引入本文所述的宿主细胞的方法。在部分5.3中提供了产生糖基化目标蛋白的方法。在部分5.4中详细描述了可以引入至本文所提供的宿主细胞并因此可以使用本文所述的宿主细胞和方法糖基化的具体目标蛋白。在部分5.5中提供了组合物。在部分5.6中提供了本文提供的组合物，例如，在疾病治疗中的使用方法。
5.1宿主细胞
在一个方面，本文提供了能够产生糖基化蛋白，例如，N-糖基化蛋白的宿主细胞。本文所提供的宿主细胞特别地包含(i)编码能够将葡萄糖添加至N-糖基化共有序列中存在的Asn残基(或者其它相关残基)的N-糖基转移酶(NGT)的核酸和(ii)编码催化单糖，例如，半乳糖向通过NGT添加的葡萄糖添加的糖基转移酶的核酸。本文所提供的宿主细胞提供了蛋白质体内糖基化的新型系统，其中在宿主细胞的细胞质中产生了糖基化蛋白。重要地，本文所提供的宿主细胞解决了在外周胞质中产生糖基化蛋白的需要，这是现有体内糖基化平台的限制。
在具体的实施方式中，本文提供了宿主细胞，其包含(i)编码包含N-糖基化共有序列的目标蛋白的核酸；(ii)编码将葡萄糖添加至存在于所述N-糖基化共有序列中的Asn残基(或者其它相关残基)的N-糖基转移酶(NGT)的核酸，和(iii)编码催化向所述葡萄糖添加单糖的糖基转移酶的核酸。在具体的实施方式中，所述目标蛋白对所述宿主细胞是异源的。在另一个具体的实施方式中，所述NGT对所述宿主细胞是异源的。在另一个具体的实施方式中，催化向所述葡萄糖添加单糖的所述糖基转移酶对所述宿主细胞是异源的。在另一个具体的实施方式中，所述目标蛋白，所述NGT和催化向所述葡萄糖添加单糖的所述糖基转移酶中的每一个对所述宿主细胞是异源的。在另一个具体的实施方式中，所述宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)。
在另一个具体的实施方式中，本文提供了宿主细胞，其包含(i)编码包含N-糖基化共有序列的目标蛋白的核酸；(ii)编码将葡萄糖添加至存在于所述N-糖基化共有序列中的Asn残基(或者其它相关残基)的N-糖基转移酶(NGT)的核酸，(iii)编码催化向所述葡萄糖添加单糖的糖基转移酶的核酸；和(iv)编码涎酸转移酶的核酸。在具体的实施方式中，所述涎酸转移酶将一个或多个唾液酸残基添加至所述半乳糖。在另一个具体的实施方式中，所述目标蛋白对所述宿主细胞是异源的。在另一个具体的实施方式中，所述NGT对所述宿主细胞是异源的。在另一个具体的实施方式中，催化向所述葡萄糖添加单糖的所述糖基转移酶对所述宿主细胞是异源的。在另一个具体的实施方式中，所述涎酸转移酶对所述宿主细胞是异源的。在另一个具体的实施方式中，所述目标蛋白，所述NGT，所述涎酸转移酶和催化向所述葡萄糖添加单糖的所述糖基转移酶中的每一个对所述宿主细胞是异源的。在另一个具体的实施方式中，所述宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)。
在另一个具体的实施方式中，本文提供了宿主细胞，其包含(i)编码包含N-糖基化共有序列的目标蛋白的核酸；(ii)编码将葡萄糖添加至存在于所述N-糖基化共有序列中的Asn残基(或者其它相关残基)的N-糖基转移酶(NGT)的核酸，(iii)编码催化向所述葡萄糖添加单糖的糖基转移酶的核酸；(iv)编码涎酸转移酶的核酸；和(v)编码多聚涎酸转移酶(polyST)的核酸。在具体的实施方式中，所述涎酸转移酶将一个或多个唾液酸残基添加至所述半乳糖，并且所述polyST合成聚唾液酸，从而使得能够通过所述宿主细胞产生药代动力学性质改善的多聚唾液酸化的蛋白质。在另一个具体的实施方式中，所述目标蛋白对所述宿主细胞是异源的。在另一个具体的实施方式中，所述NGT对所述宿主细胞是异源的。在另一个具体的实施方式中，催化向所述葡萄糖添加单糖的所述糖基转移酶对所述宿主细胞是异源的。在另一个具体的实施方式中，所述涎酸转移酶对所述宿主细胞是异源的。在另一个具体的实施方式中，所述polyST对所述宿主细胞是异源的。在另一个具体的实施方式中，所述目标蛋白，所述NGT，所述涎酸转移酶，所述polyST和催化向所述葡萄糖添加单糖的所述糖基转移酶中的每一个对所述宿主细胞是异源的。在另一个具体的实施方式中，所述宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)。
在另一个具体的实施方式中，本文提供了宿主细胞，其包含(i)编码包含N-糖基化共有序列的目标蛋白的核酸；(ii)编码将葡萄糖添加至存在于所述N-糖基化共有序列中的Asn残基(或者其它相关残基)的N-糖基转移酶(NGT)的核酸，(iii)编码催化向所述葡萄糖添加单糖的糖基转移酶的核酸；(iv)编码涎酸转移酶的核酸；(v)编码多聚涎酸转移酶(polyST)的核酸；和(vi)编码CMP-Neu5Ac合成酶的核酸。在具体的实施方式中，所述涎酸转移酶将一个或多个唾液酸残基添加至所述半乳糖，并且所述polyST合成聚唾液酸，从而使得能够通过所述宿主细胞产生药代动力学性质改善的多聚唾液酸化的蛋白质。在另一个具体的实施方式中，所述目标蛋白对所述宿主细胞是异源的。在另一个具体的实施方式中，所述NGT对所述宿主细胞是异源的。在另一个具体的实施方式中，催化向所述葡萄糖添加单糖的所述糖基转移酶对所述宿主细胞是异源的。在另一个具体的实施方式中，所述涎酸转移酶对所述宿主细胞是异源的。在另一个具体的实施方式中，所述polyST对所述宿主细胞是异源的。在另一个具体的实施方式中，所述CMP-Neu5Ac合成酶对所述宿主细胞是异源的。在另一个具体的实施方式中，所述目标蛋白，所述NGT，所述涎酸转移酶，所述polyST，所述CMP-Neu5Ac合成酶和催化向所述葡萄糖添加单糖的所述糖基转移酶中的每一个对所述宿主细胞是异源的。在另一个具体的实施方式中，所述宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)。
在具体的实施方式中，本文所提供的宿主细胞包含编码放线杆菌属(Actinobacillus)的种的NGT的核酸。在具体的实施方式中，所述NGT是胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)的NGT(SEQ ID NO:1)。参见，例如，Choi等人,PLoSONE(2010)。在另一个具体的实施方式中，所述NGT是猪放线杆菌(Actinobacillus suis)、产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)、小放线杆菌(Actinobacillusminor)或荚膜放线杆菌(Actinobacillus capsulatus)的NGT。
在另一个具体的实施方式中，本文所提供的宿主细胞包含编码嗜血杆菌属(Haemophilus)的种，例如，埃及嗜血杆菌(Haemophilus aegyptius)、软性下疳嗜血菌(Haemophilus ducreyi)、溶血性嗜血杆菌(Haemophilus haemolyticus)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)、副流感嗜血杆菌(Haemophilus parainfluenzae)、副溶血嗜血杆菌(Haemophilus parahaemolyticus)、皮氏嗜血杆菌(Haemophilus pittmaniae)或嗜血弯曲杆菌(Haemophilus sputorum)的NGT的核酸。
在另一个具体的实施方式中，本文所提供的宿主细胞包含编码曼海姆氏菌(Mannheimia)的种，例如，小粒曼海姆氏菌(Mannheimia granulomatis)、溶血曼海姆氏菌(Mannheimia haemolytica)、产琥珀酸曼海姆氏菌(Mannheimia succiniproducens)或异源曼海姆氏菌(Mannheimia varigena)的NGT的核酸。
在另一个具体的实施方式中，本文所提供的宿主细胞包含编码巴氏杆菌(Bibersteinia)的种，例如，海藻糖巴氏杆菌(Bibersteinia trehalosi)的NGT的核酸。
在另一个具体的实施方式中，本文所提供的宿主细胞包含编码耶尔森氏菌属(Yersinia)的种，例如，伯氏耶尔森氏菌(Yersinia bercovieri)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、弗氏耶尔森氏菌(Yersinia frederiksenii)、中间耶尔森氏菌(Yersinia intermedia)、克氏耶尔森菌(Yersinia kristensii)、莫氏耶尔森氏菌(Yersinia mollaretii)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)、假结核耶尔森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)、啮齿耶尔森氏菌(Yersinia rhodei)或类似耶尔森氏菌(Yersinia similis)的NGT的核酸。
在某些实施方式中，在本文所提供的宿主细胞中使用的NGT是与放线杆菌属(Actinobacillus)(例如，胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)的NGT)、嗜血菌属(Haemophilus)、曼海姆氏菌(Mannheimia)、巴氏杆菌(Bibersteinia)或耶尔森氏菌属(Yersinia)中任一种的NGT同源的NGT。例如，本文所提供的宿主细胞可以包含与编码放线杆菌属(Actinobacillus)(例如，胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)的NGT)、嗜血菌属(Haemophilus)、曼海姆氏菌(Mannheimia)、巴氏杆菌(Bibersteinia)或耶尔森氏菌属(Yersinia)的NGT的核酸约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源的核酸。
在某些实施方式中，编码催化单糖向存在于本文所提供的宿主细胞中的所述葡萄糖的添加的糖基转移酶的核酸编码半乳糖基转移酶。在具体的实施方式中，所述半乳糖基转移酶为奈氏球菌属(Neisseria)的种的LgtB。在具体的实施方式中，所述半乳糖基转移酶为脑膜炎奈氏球菌(N.meningitidis)的LgtB。在另一个具体的实施方式中，所述半乳糖基转移酶为淋病奈氏球菌(N.gonorrhoeae)的LgtB。在另一个具体的实施方式中，所述半乳糖基转移酶为脑膜炎奈氏球菌(N.meningitidis)的LgtE。在另一个具体的实施方式中，所述半乳糖基转移酶为空肠弯曲菌(C.jejuni)的CgtB。在另一个具体的实施方式中，所述半乳糖基转移酶为大肠杆菌(E.coli)的WaaX。在另一个具体的实施方式中，所述半乳糖基转移酶为幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)的HP0826。在另一个具体的实施方式中，所述半乳糖基转移酶是真核β4Gal-T1。
在某些实施方式中，在本文所提供的宿主细胞中使用的半乳糖基转移酶是与奈氏球菌属(Neisseria)、弯曲菌属(Campylobacter)、大肠杆菌(E.coli)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)或真核半乳糖基转移酶同源的半乳糖基转移酶。例如，本文所提供的宿主细胞可以包含与编码奈氏球菌属(Neisseria)的种的LgtB(例如，脑膜炎奈氏球菌(N.meningitidis)的LgtB、淋病奈氏球菌(N.gonorrhoeae)的LgtB或脑膜炎奈氏球菌(N.meningitidis)的LgtE)的核酸约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源；与编码空肠弯曲菌(C.jejuni)的CgtB的核酸约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源；与编码大肠杆菌(E.coli)的WaaX的核酸约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源；与编码幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)的HP0826的核酸约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源；或者与编码真核β4Gal-T1的核酸约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源的核酸。
在另一个具体的实施方式中，当本文所提供的宿主细胞包含编码涎酸转移酶的核酸时，所述涎酸转移酶来自弯曲菌属(Campylobacter)的种。在具体的实施方式中，所述涎酸转移酶是空肠弯曲菌(C.jejuni)的CstII。在另一个具体的实施方式中，所述涎酸转移酶是空肠弯曲菌(C.jejuni)的CstI。在另一个具体的实施方式中，所述涎酸转移酶是脑膜炎奈氏球菌(N.meningitidis)的Lst。在另一个具体的实施方式中，所述涎酸转移酶是淋病奈氏球菌(N.gonorrhoeae)的Lst。
在某些实施方式中，在本文所提供的宿主细胞中使用的涎酸转移酶是与奈氏球菌属(Neisseria)或弯曲菌属(Campylobacter)的涎酸转移酶同源的涎酸转移酶。例如，本文所提供的宿主细胞可以包含与编码空肠弯曲菌(C.jejuni)的CstII、空肠弯曲菌(C.jejuni)的CstI、脑膜炎奈氏球菌(N.meningitidis)的Lst或淋病奈氏球菌(N.gonorrhoeae)的Lst的核酸约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源的核酸。
在另一个具体的实施方式中，当本文所提供的宿主细胞包含编码多聚涎酸转移酶(polyST)的核酸时，所述polyST是脑膜炎奈氏球菌(N.meningitidis)的polyST。在具体的实施方式中，所述脑膜炎奈氏球菌(N.meningitidis)的polyST是脑膜炎奈氏球菌(N.meningitidis)血清群B的polyST。
在另一个具体的实施方式中，当本文所提供的宿主细胞包含编码多聚涎酸转移酶(polyST)的核酸时，所述polyST是大肠杆菌(E.coli)K1、溶血曼海姆氏菌(Mannheimaniahaemolytica)或Moraxella nonliquifacien的polyST。
在某些实施方式中，在本文所提供的宿主细胞中使用的多聚涎酸转移酶是与奈氏球菌属(Neisseria)的种、曼海姆氏菌(Mannheimania)的种、莫拉氏菌属(Moraxella)的种或大肠杆菌(E.coli)的多聚涎酸转移酶同源的多聚涎酸转移酶。例如，本文所提供的宿主细胞可以包含与编码脑膜炎奈氏球菌(N.meningitidis)血清群B的polyST、溶血曼海姆氏菌(Mannheimania haemolytica)的polyST、Moraxella nonliquifacien的polyST或大肠杆菌(E.coli)的polyST的核酸约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源的核酸。
在另一个具体的实施方式中，当本文所提供的宿主细胞包含编码CMP-Neu5Ac合成酶的核酸时，所述CMP-Neu5Ac合成酶是脑膜炎奈氏球菌(N.meningitidis)的SynB。
在某些实施方式中，在本文所提供的宿主细胞中使用的CMP-Neu5Ac合成酶是与奈氏球菌属(Neisseria)的种的CMP-Neu5Ac合成酶同源的CMP-Neu5Ac合成酶。例如，本文所提供的宿主细胞可以包含与编码脑膜炎奈氏球菌(N.meningitidis)的SynB的核酸约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源的核酸。
在某些实施方式中，本文所提供的宿主细胞是原核宿主细胞。示例性的原核宿主细胞无限制地包括埃希氏菌属(Escherichia)的种、志贺氏菌属(Shigella)的种、克雷伯氏菌属(Klebsiella)的种、黄单胞菌属(Xhantomonas)的种、沙门氏菌属(Salmonella)的种、耶尔森氏菌属(Yersinia)的种、乳球菌属(Lactococcus)的种、乳杆菌属(Lactobacillus)的种、假单胞菌属(Pseudomonas)的种、棒状杆菌(Corynebacterium)的种、链霉菌属(Streptomyces)的种、链球菌属(Streptococcus)的种、葡萄球菌属(Staphylococcus)的种、芽孢杆菌属(Bacillus)的种和梭状芽胞杆菌(Clostridium)的种。在具体的实施方式中，本文所使用的宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)。
在某些实施方式中，本文所提供的宿主细胞是真核宿主细胞。示例性真核宿主细胞无限制地包括酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞、动质体目细胞和哺乳动物细胞。
在某些实施方式中，编码存在于本文所提供的宿主细胞中的目标蛋白的核酸编码治疗性蛋白，即在疾病或病症的治疗中使用的蛋白。例如，编码存在于本文所提供的宿主细胞中的目标蛋白的核酸可以编码用作抑制剂或抗体的酶、细胞因子、受体、配体、生长因子、蛋白质。在以下部分5.4中提供了目标蛋白的非限制性列表。
可以将编码本领域中已知的任何蛋白的核酸引入本文所述的宿主细胞。因此，可以使用本文所提供的宿主细胞来产生本领域中已知的任何蛋白的糖基化(包括唾液酸化和多聚唾液酸化)形式。在具体的实施方式中，将本文所提供的宿主细胞用于产生蛋白质的唾液酸化形式。在另一个具体的实施方式中，将本文所提供的宿主细胞用于产生蛋白质的多聚唾液酸化形式。在部分5.4中提供了可以使用本文所述的宿主细胞产生的示例性蛋白质。可以将本文所提供的宿主细胞工程设计以包含编码部分5.4中所述的任何蛋白质的核酸，并因此能够表达这些蛋白质。
在某些实施方式中，从使用质粒，即含有编码所关心的特定目标蛋白的基因的质粒引入宿主细胞的核酸表达存在于本文所提供的宿主细胞中的目标蛋白。
在某些实施方式中，从整合至修饰的宿主细胞的基因组中的核酸表达存在于本文所提供的宿主细胞中的目标蛋白。也就是说，将编码目标蛋白的核酸整合至宿主细胞基因组。
在某些实施方式中，修饰编码存在于本文所提供的宿主细胞中的目标蛋白的核酸，从而与通常与目标蛋白(例如，相对于与处于其天然/自然，例如，“野生型”状态的目标蛋白有关的糖基化位点数目)有关的相比，包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个糖基化位点(N-糖基化共有序列)。
在具体的实施方式中，糖基化位点的引入伴随有在蛋白质一级结构中的任何位置的N-糖基化共有序列(例如，Asn-X-Ser(Thr)，其中X可以是除Pro之外的任何氨基酸)的插入。在一些实施方式中，将所述共有序列嵌入异源序列，从而将包含所述N-糖基化共有序列的异源序列嵌入至所述目标蛋白，其中所述异源序列定义为嵌入的糖基化标签。可以通过(例如)将新的氨基酸增加至蛋白质的一级结构(即完全或部分添加所述糖基化位点)，或通过使所述蛋白质中已有氨基酸突变以产生糖基化位点(即氨基酸未添加至所述蛋白质，但是将所述蛋白质所选的氨基酸突变以形成糖基化位点)来完成糖基化位点的引入。本领域技术人员将认识到可以使用本领域中已知的方法，例如，包括编码蛋白的核酸序列的修饰的重组方法，容易地修饰蛋白质的氨基酸序列。在具体的实施方式中，在蛋白质的N或C末端和/或在蛋白质的基部通过二硫键稳定的环中，将N-糖基化共有序列引入目标蛋白的特定区域，例如，蛋白质的表面结构。在某些实施方式中，所述嵌入的糖基化标签位于折叠的目标蛋白的表面。在某些实施方式中，所述嵌入的糖基化标签不是目标蛋白立体构象的一部分，但是仍保持打开。因此，不受理论束缚，所述N-糖基化共有序列对N-糖基转移酶仍是更可接近的。
在具体的实施方式中，糖基化位点的引入伴随有N-糖基化共有序列(例如，Asn-X-Ser(Thr)其中X可以是除Pro之外的任何氨基酸)向蛋白质的N或C末端，或者N和C末端的添加。在一些实施方式中，将所述共有序列嵌入异源序列，从而将包含所述N-糖基化共有序列的异源序列添加至所述目标蛋白，其中连接至N或C末端的所述异源序列定义为末端糖基化标签。在某些实施方式中，所述末端糖基化标签位于折叠的目标蛋白的表面。在某些实施方式中，所述末端糖基化标签不是目标蛋白立体构象的一部分，但是仍保持打开。因此，不受理论束缚，所述N-糖基化共有序列对N-糖基转移酶仍是更可接近的。
在另一个具体的实施方式中，编码目标蛋白的核酸包含嵌入的糖基化标签或末端糖基化标签。在另一个具体的实施方式中，编码目标蛋白的核酸包含嵌入的糖基化标签和末端糖基化标签两者。
在某些实施方式中，使用本文所述的宿主细胞产生的目标蛋白包含“标签”，即在通过本文所述的宿主细胞产生后允许目标蛋白的分离和/或鉴定的氨基酸序列。例如，向本文所述的目标蛋白添加标签在所述蛋白质的纯化中可以是有用的。可以在本文中使用的示例性标签无限制地包括组氨酸(HIS)标签(例如，六组氨酸-标签或6×His-标签)、FLAG-标签和HA标签。在某些实施方式中，标签还包含如本文所述的嵌入或末端糖基化标签。在某些实施方式中，一旦不再需要，例如，在蛋白质已被纯化后，本文所使用的标签是可除去的，例如，通过化学试剂或通过酶促方式除去。
糖基化机制
N-糖基转移酶
N-糖基转移酶(NGT)能够将葡萄糖添加至存在于N-糖基化共有序列中的氨基酸。例如，NGT可以使N-糖基化共有序列Asn-X-Ser(Thr)中存在的天门冬酰胺(Asn)残基N-糖基化，其中X可以是除Pro之外的任何氨基酸。NGT还可以使N-糖基化共有序列Asn-X-Ala(Asp、Gly或Val)中存在的天门冬酰胺(Asn)残基N-糖基化，其中X可以是除Pro之外的任何氨基酸。NGT还可以使存在于N-糖基化共有序列Ser-X-Ser(Thr)中的丝氨酸(Ser)残基N-糖基化，其中X可以是除Pro之外的任何氨基酸，和使存在于N-糖基化共有序列Gln-X-Ser(Thr)中的谷氨酰胺(Gln)残基N-糖基化，其中X可以是除Pro之外的任何氨基酸。一般地，野生型NGT具有宽泛的肽底物特异性和宽泛的供体底物特异性：它们可以使用UDP-Glc以及UDP-Gal、UDP-Xyl、GDP-Glc和GDP-Man(参见Naegeli等人,2014,The Journal Of BiologicalChemistry 289(35):24521–24532)。
根据本文所述的方法，可以使用能够将葡萄糖添加至N-糖基化共有序列中的Asn残基(或者其它相关残基)的任何NGT或编码它的核酸，例如，可以将其引入本文所述的宿主细胞。
在具体的实施方式中，本文所提供的宿主细胞包含编码放线杆菌属(Actinobacillus)的种的NGT的核酸。在具体的实施方式中，所述NGT是胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)的NGT(SEQ ID NO:1)。参见，例如，Choi等人,PLoSONE(2010)。在另一个具体的实施方式中，所述NGT是猪放线杆菌(Actinobacillus suis)、产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)、小放线杆菌(Actinobacillusminor)或荚膜放线杆菌(Actinobacillus capsulatus)的NGT。
在另一个具体的实施方式中，本文所提供的宿主细胞包含编码嗜血杆菌属(Haemophilus)的种，例如，埃及嗜血杆菌(Haemophilus aegyptius)、软性下疳嗜血菌(Haemophilus ducreyi)、溶血性嗜血杆菌(Haemophilus haemolyticus)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)、副流感嗜血杆菌(Haemophilus parainfluenzae)、副溶血嗜血杆菌(Haemophilus parahaemolyticus)、皮氏嗜血杆菌(Haemophilus pittmaniae)或嗜血弯曲杆菌(Haemophilus sputorum)的NGT的核酸。
在另一个具体的实施方式中，本文所提供的宿主细胞包含编码曼海姆氏菌(Mannheimia)的种，例如，小粒曼海姆氏菌(Mannheimia granulomatis)、溶血曼海姆氏菌(Mannheimia haemolytica)、产琥珀酸曼海姆氏菌(Mannheimia succiniproducens)或异源曼海姆氏菌(Mannheimia varigena)的NGT的核酸。
在另一个具体的实施方式中，本文所提供的宿主细胞包含编码巴氏杆菌(Bibersteinia)的种，例如，海藻糖巴氏杆菌(Bibersteinia trehalosi)的NGT的核酸。
在另一个具体的实施方式中，本文所提供的宿主细胞包含编码耶尔森氏菌属(Yersinia)的种，例如，伯氏耶尔森氏菌(Yersinia bercovieri)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、弗氏耶尔森氏菌(Yersinia frederiksenii)、中间耶尔森氏菌(Yersinia intermedia)、克氏耶尔森菌(Yersinia kristensii)、莫氏耶尔森氏菌(Yersinia mollaretii)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)、假结核耶尔森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)、啮齿耶尔森氏菌(Yersinia rhodei)或类似耶尔森氏菌(Yersinia similis)的NGT的核酸。
在某些实施方式中，根据本文所述的方法使用的NGT，例如，引入本文所述的宿主细胞的NGT是与放线杆菌属(Actinobacillus)(例如，胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)的NGT)、嗜血菌属(Haemophilus)、曼海姆氏菌(Mannheimia)、巴氏杆菌(Bibersteinia)或耶尔森氏菌属(Yersinia)中任一种的NGT同源的NGT。例如，NGT或编码它的核酸可以与放线杆菌属(Actinobacillus)(例如，胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)的NGT)、嗜血菌属(Haemophilus)、曼海姆氏菌(Mannheimia)、巴氏杆菌(Bibersteinia)或耶尔森氏菌属(Yersinia)的NGT约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源。
在其它实施方式中。本文所提供的宿主细胞包含编码以下来源的NGT的核酸，凝聚杆菌(Aggregatibacter)的种，例如，嗜沫凝聚杆菌(Aggregatibacter aphrophilus)；慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)的种；伯克氏菌属(Burkholderia)的种，例如，Burkholderiabryophila、卡莱多尼亚伯克氏菌(Burkholderia caledonica)、卡瑞苯西思伯克氏菌(Burkholderia caribensis)、Burkholderia dilworthii、真菌伯克氏菌(Burkholderiafungorum)、禾谷伯克氏菌(Burkholderia graminis)、Burkholderia grimmiae、酚里拉普伯克氏菌(Burkholderia phenoliruptrix)、瘤状伯克氏菌(Burkholderia phymatum)、植物伯克氏菌(Burkholderia phytofirmans)、土生伯克氏菌(Burkholderia terrae)和谢氏伯克氏菌(Burkholderia xenovorans)；Conchiformibius菌属的种，例如，Conchiformibius steedae；贪铜菌属(Cupriavidus)的种，例如，耐金属贪铜菌(Cupriavidus metallidurans)；爱德华氏菌属(Edwardsiella)的种，例如，保科爱德华氏菌(Edwardsiella hoshinae)；肠杆菌科(Enterobacteriaceae)；居水菌属(Glaciecola)的种，例如，北极嗜冷居水菌(Glaciecola arctica)；粘杆菌属(Gloeobacter)的种，例如，Gloeobacter kilaueensis；草螺菌属(Herbaspirillum)的种，例如，弗赖森草螺菌(Herbaspirillum frisingense)、葡萄牙草螺菌(Herbaspirillum lusitanum)、红白草螺菌(Herbaspirillum rubrisubalbicans)或织片草螺菌(Herbaspirillum seropedicae)；金氏菌属(Kingella)的种，例如，金氏金氏菌(Kingella kingae)；科迪单胞菌属(Kordiimonas)的种，例如，广阳湾科迪单胞菌(Kordiimonas gwangyangensis)；鞘丝藻(Leptolyngbya)；湖沉积杆菌属(Limnobacter)的种；奈氏球菌属(Neisseria)的种，例如，浅黄奈氏球菌(Neisseria flavescens)；巴斯德氏菌属(Pasteurella)的种，例如，达可马巴斯德氏菌(Pasteurella dagmatis)或侵肺巴斯德氏菌(Pasteurella pneumotropica)；苯基杆菌属(Phenylobacterium)的种，例如，Phenylobacterium zucineum；极单胞菌属(Polaromonas)的种；普罗威登斯菌属(Providencia)的种，例如，雷氏普罗威登斯菌(Providencia rettgeri)；假鱼腥蓝细菌属(Pseudanabaena)的种，例如，Pseudanabaenabiceps；假单胞菌属(Pseudomonas)的种，例如，伞菌假单胞菌(Pseudomonas agarici)、门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)、类产碱假单胞菌(Pseudomonaspseudoalcaligenes)或托拉氏假单胞菌(Pseudomonas tolaasii)；莱茵海默氏菌属(Rheinheimera)的种；沙门氏菌属(Salmonella)的种，例如，肠沙门氏菌(Salmonellaenterica)；或者硫单胞菌属(Sulfurimonas)的种或其同源物。
向葡萄糖添加单糖的糖基转移酶
在某些实施方式中，本文所提供的方法使用了催化单糖向通过NGT添加至目标蛋白的N-糖基化共有序列中的ASN残基(或者其它相关残基)的葡萄糖残基添加的糖基转移酶，例如，本文所提供的宿主细胞可以包含编码催化单糖向通过NGT添加至目标蛋白的N-糖基化共有序列中的ASN残基(或者其它相关残基)的葡萄糖残基添加的糖基转移酶的核酸。根据本文所述的方法，可以使用能够将单糖添加至所述葡萄糖的任何糖基转移酶或编码它的核酸。
在某些实施方式中，添加单糖的糖基转移酶通过β-1,4-键添加乳糖，从而导致产生了乳糖-蛋白质缀合物。在某些实施方式中，添加单糖的糖基转移酶通过β-1,3-键添加乳糖。
在具体的实施方式中，添加单糖的糖基转移酶为半乳糖基转移酶。根据本文所述的方法，可以使用能够将半乳糖添加至所述葡萄糖的任何半乳糖基转移酶或编码它的核酸。
在具体的实施方式中，所述半乳糖基转移酶为奈氏球菌属(Neisseria)的种的LgtB。在具体的实施方式中，所述半乳糖基转移酶为脑膜炎奈氏球菌(N.meningitidis)的LgtB。在另一个具体的实施方式中，所述半乳糖基转移酶为淋病奈氏球菌(N.gonorrhoeae)的LgtB。在另一个具体的实施方式中，所述半乳糖基转移酶为脑膜炎奈氏球菌(N.meningitidis)的LgtE。在另一个具体的实施方式中，所述半乳糖基转移酶为空肠弯曲菌(C.jejuni)的CgtB。在另一个具体的实施方式中，所述半乳糖基转移酶为大肠杆菌(E.coli)的WaaX。在另一个具体的实施方式中，所述半乳糖基转移酶为幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)的HP0826。在另一个具体的实施方式中，所述半乳糖基转移酶是真核β4Gal-T1。
在某些实施方式中，所述半乳糖基转移酶是与奈氏球菌属(Neisseria)、弯曲菌属(Campylobacter)、大肠杆菌(E.coli)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)或真核半乳糖基转移酶同源的半乳糖基转移酶。例如，所述半乳糖基转移酶或编码它的核酸可以与奈氏球菌属(Neisseria)的种的LgtB(例如，脑膜炎奈氏球菌(N.meningitidis)的LgtB、淋病奈氏球菌(N.gonorrhoeae)的LgtB或脑膜炎奈氏球菌(N.meningitidis)的LgtE)、空肠弯曲菌(C.jejuni)的CgtB、大肠杆菌(E.coli)的WaaX、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)的HP0826或真核β4Gal-T1约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源。
涎酸转移酶
根据本文所述的方法，可以使用能够将一个或多个唾液酸残基添加至与连接至N-糖基化共有序列，例如，Asn-X-Ser(Thr)，其中X可以是除Pro之外的任何氨基酸中的Asn残基(或者其它相关残基)的葡萄糖连接的单糖(例如，半乳糖)的任何涎酸转移酶或编码它的核酸，例如，可以将其引入本文所述的宿主细胞。
在某些实施方式中，所述涎酸转移酶产生了包含α-2,3-连接或α-2,6-连接的Neu5Ac的目标蛋白。
在具体的实施方式中，所述涎酸转移酶来自弯曲菌属(Campylobacter)的种。在具体的实施方式中，所述涎酸转移酶是空肠弯曲菌(C.jejuni)的CstII。在另一个具体的实施方式中，所述涎酸转移酶是空肠弯曲菌(C.jejuni)的CstI。在另一个具体的实施方式中，所述涎酸转移酶是脑膜炎奈氏球菌(N.meningitidis)的Lst。在另一个具体的实施方式中，所述涎酸转移酶是淋病奈氏球菌(N.gonorrhoeae)的Lst。
在某些实施方式中，所述涎酸转移酶是与奈氏球菌属(Neisseria)或弯曲菌属(Campylobacter)的涎酸转移酶同源的涎酸转移酶。例如，所述涎酸转移酶或编码它的核酸与空肠弯曲菌(C.jejuni)的CstII、空肠弯曲菌(C.jejuni)的CstI、脑膜炎奈氏球菌(N.meningitidis)的Lst或淋病奈氏球菌(N.gonorrhoeae)的Lst约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源。
多聚涎酸转移酶
可以根据本文所述的方法使用能够合成聚唾液酸(例如，使用通过涎酸转移酶添加的唾液酸残基作为起始点)的任何多聚涎酸转移酶或编码它的核酸，例如，可以将其引入本文所述的宿主细胞。
在具体的实施方式中，所述polyST是脑膜炎奈氏球菌(N.meningitidis)的polyST。在具体的实施方式中，所述脑膜炎奈氏球菌(N.meningitidis)的polyST是脑膜炎奈氏球菌(N.meningitidis)血清群B的polyST。在另一个具体的实施方式中，所述polyST是大肠杆菌(E.coli)K1、溶血曼海姆氏菌(Mannheimania haemolytica)或Moraxellanonliquifacien的polyST。
在某些实施方式中，所述多聚涎酸转移酶是与奈氏球菌属(Neisseria)的种、曼海姆氏菌(Mannheimania)的种、莫拉氏菌属(Moraxella)的种或大肠杆菌(E.coli)的多聚涎酸转移酶同源的多聚涎酸转移酶。例如，所述多聚涎酸转移酶或编码它的核酸与脑膜炎奈氏球菌(N.meningitidis)血清群B的polyST、溶血曼海姆氏菌(Mannheimaniahaemolytica)的polyST、Moraxella nonliquifacien的polyST或大肠杆菌(E.coli)的polyST约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源。
CMP-Neu5Ac合成酶
可以根据本文所述的宿主细胞和方法使用本领域中已知的任何CMP-Neu5Ac合成酶或编码它的核酸。在具体的实施方式中，所述CMP-Neu5Ac合成酶是脑膜炎奈氏球菌(N.meningitidis)的SynB。
在某些实施方式中，所述CMP-Neu5Ac合成酶是与奈氏球菌属(Neisseria)的种的CMP-Neu5Ac合成酶同源的CMP-Neu5Ac合成酶。例如，所述CMP-Neu5Ac合成酶或编码它的核酸与脑膜炎奈氏球菌(N.meningitidis)的SynB约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源。
副酶(Accessory Enzymes)
在某些实施方式中，将编码一种或多种副酶的核酸引入修饰的本文所述的宿主细胞。这些编码一种或多种副酶的核酸可以是质粒-携带的或者是整合到本文所述的宿主细胞的基因组中的。示例性的副酶无限制地包括表异构酶(参见，例如，国际专利申请公开No.WO 2011/062615)、分支、修饰、乙酰化、甲酰化、聚合酶。
遗传背景
在某些实施方式中，通过(例如)一种或多种基因的缺失或功能失活来修饰宿主细胞的遗传背景。
在宿主细胞中可以缺失/失活的示例性基因(并且，在一些情况下，被其它所期望的核酸序列替代)包括nanA和lacZ。
在具体的实施方式中，本文所提供的宿主细胞包含nanA的缺失或功能失活。在另一个具体的实施方式中，本文所提供的宿主细胞包含lacZ的缺失或功能失活。在另一个具体的实施方式中，本文所提供的宿主细胞包含nanA和lacZ的缺失或功能失活。
5.2核酸向宿主细胞的引入
可以使用本领域中已知的任何方法将核酸(例如，基因或操纵子)引入至宿主细胞，例如，大肠杆菌(E.coli)。
在具体的实施方式中，使用质粒将异源核酸引入本文所述的宿主细胞，例如，通过质粒(例如，表达载体)在宿主细胞中表达异源核酸，并且通过电穿孔、通过热冲击的化学转化、自然转化、噬菌体转导或缀合将所述质粒引入修饰的宿主细胞。
5.3糖基化目标蛋白产生方法
本文提供了用于体内和体外产生糖基化目标蛋白，包括唾液酸化和多聚唾液酸化蛋白的方法。
在一个实施方式中，本文提供了体外产生糖基化目标蛋白的方法，所述方法包括(i)使用NGT将葡萄糖添加至包含一个或多个N-糖基化共有序列的目标蛋白；(ii)使用糖基转移酶(例如，半乳糖基转移酶)将单糖(例如，半乳糖)添加至所述葡萄糖；和(iii)使用一种或多种其它糖基转移酶在所述葡萄糖-单糖引物上产生寡糖或多糖。
在另一个实施方式中，本文提供了使用本文所述的宿主细胞体内产生糖基化目标蛋白的方法。在具体的实施方式中，本文提供了用于产生糖基化目标蛋白的方法，所述方法包括(i)将本文所提供的宿主细胞在适合于蛋白质产生的条件下培养和(ii)分离所述目标蛋白。在具体的实施方式中，所述宿主细胞包含(a)编码包含N-糖基化共有序列的目标蛋白的核酸，例如，Asn-X-Ser(Thr)，其中X可以是除Pro之外的任何氨基酸；(b)编码将葡萄糖添加至存在于所述N-糖基化共有序列中的Asn残基(或其它相关残基)的N-糖基转移酶(NGT)的核酸，和(c)编码催化向所述葡萄糖添加单糖的糖基转移酶的核酸，其中所述目标蛋白、所述NGT和催化向所述葡萄糖添加单糖的所述糖基转移酶中的至少一种、两种或全部对所述宿主细胞是异源的。在另一个具体的实施方式中，所述宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)。在另一个具体的实施方式中，所述NGT是胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)的NGT。在另一个具体的实施方式中，编码催化单糖向存在于本文所提供的宿主细胞中的所述葡萄糖添加的糖基转移酶的所述核酸编码半乳糖基转移酶，例如，脑膜炎奈氏球菌(N.meningitidis)的LgtB。
在另一个具体的实施方式中，本文提供了用于产生唾液酸化的目标蛋白的方法，所述方法包括(i)将本文所提供的宿主细胞在适合于蛋白质产生的条件下培养和(ii)分离所述目标蛋白。在具体的实施方式中，所述宿主细胞包含(a)编码包含N-糖基化共有序列的目标蛋白的核酸，例如，Asn-X-Ser(Thr)，其中X可以是除Pro之外的任何氨基酸；(b)编码将葡萄糖添加至存在于所述N-糖基化共有序列中的Asn残基(或其它相关残基)的N-糖基转移酶(NGT)的核酸，(c)编码催化向所述葡萄糖添加单糖的糖基转移酶的核酸；和(d)编码涎酸转移酶的核酸，其中所述目标蛋白、所述NGT、所述涎酸转移酶和催化向所述葡萄糖添加单糖的所述糖基转移酶中的至少一种、两种、三种或全部对所述宿主细胞是异源的。在另一个具体的实施方式中，所述宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)。在另一个具体的实施方式中，所述NGT是胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)的NGT。在另一个具体的实施方式中，编码催化单糖向存在于本文所提供的宿主细胞中的所述葡萄糖添加的糖基转移酶的所述核酸编码半乳糖基转移酶，例如，脑膜炎奈氏球菌(N.meningitidis)的LgtB。在另一个具体的实施方式中，所述涎酸转移酶是空肠弯曲菌(C.jejuni)的CstII。
在另一个具体的实施方式中，本文提供了用于产生多聚唾液酸化的目标蛋白的方法，所述方法包括(i)将本文所提供的宿主细胞在适合于蛋白质产生的条件下培养和(ii)分离所述目标蛋白。在具体的实施方式中，所述宿主细胞包含(a)编码包含N-糖基化共有序列的目标蛋白的核酸，例如，Asn-X-Ser(Thr)，其中X可以是除Pro之外的任何氨基酸；(b)编码将葡萄糖添加至存在于所述N-糖基化共有序列中的Asn残基(或其它相关残基)的N-糖基转移酶(NGT)的核酸，(c)编码催化向所述葡萄糖添加单糖的糖基转移酶的核酸；(d)编码涎酸转移酶的核酸；和(e)编码多聚涎酸转移酶(polyST)的核酸。在具体的实施方式中，所述目标蛋白，所述NGT，所述涎酸转移酶，所述polyST和催化向所述葡萄糖添加单糖的所述糖基转移酶中的1、2、3、4个或全部对所述宿主细胞是异源的。在另一个具体的实施方式中，所述宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)。在另一个具体的实施方式中，所述NGT是胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)的NGT。在另一个具体的实施方式中，编码催化单糖向存在于本文所提供的宿主细胞中的所述葡萄糖添加的糖基转移酶的所述核酸编码半乳糖基转移酶，例如，脑膜炎奈氏球菌(N.meningitidis)的LgtB。在另一个具体的实施方式中，所述涎酸转移酶是空肠弯曲菌(C.jejuni)的CstII。在另一个具体的实施方式中，所述polyST是脑膜炎奈氏球菌(N.meningitidis)的polyST(例如，脑膜炎奈氏球菌(N.meningitidis)血清群B的polyST)。
在另一个具体的实施方式中，本文提供了用于产生多聚唾液酸化的目标蛋白的方法，所述方法包括(i)将本文所提供的宿主细胞在适合于蛋白质产生的条件下培养和(ii)分离所述目标蛋白。在具体的实施方式中，所述宿主细胞包含(a)编码包含N-糖基化共有序列的目标蛋白的核酸，例如，Asn-X-Ser(Thr)，其中X可以是除Pro之外的任何氨基酸；(b)编码将葡萄糖添加至存在于所述N-糖基化共有序列中的Asn残基(或其它相关残基)的N-糖基转移酶(NGT)的核酸，(c)编码催化向所述葡萄糖添加单糖的糖基转移酶的核酸；(d)编码涎酸转移酶的核酸；(e)编码多聚涎酸转移酶(polyST)的核酸；和(f)编码CMP-Neu5Ac合成酶的核酸。在具体的实施方式中，所述目标蛋白，所述NGT，所述涎酸转移酶，所述polyST，所述CMP-Neu5Ac合成酶和催化向所述葡萄糖添加单糖的所述糖基转移酶中的1、2、3、4、5个或全部对所述宿主细胞是异源的。在另一个具体的实施方式中，所述宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)。在另一个具体的实施方式中，所述NGT是胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)的NGT。在另一个具体的实施方式中，编码催化单糖向存在于本文所提供的宿主细胞中的所述葡萄糖添加的糖基转移酶的所述核酸编码半乳糖基转移酶，例如，脑膜炎奈氏球菌(N.meningitidis)的LgtB。在另一个具体的实施方式中，所述涎酸转移酶是空肠弯曲菌(C.jejuni)的CstII。在另一个具体的实施方式中，所述polyST是脑膜炎奈氏球菌(N.meningitidis)的polyST(例如，脑膜炎奈氏球菌(N.meningitidis)血清群B的polyST)。在另一个具体的实施方式中，所述CMP-Neu5Ac合成酶是脑膜炎奈氏球菌(N.meningitidis)的SynB。
在某些实施方式中，当将本文所提供的宿主细胞用于产生唾液酸化和/或多聚唾液酸化的蛋白质时，在添加有Neu5Ac的培养基中培养所述宿主细胞。
在某些实施方式中，通过所提供的宿主细胞产生的目标蛋白是治疗性蛋白，即在疾病或病症的治疗中使用的蛋白。例如，通过本文所提供的宿主细胞产生的目标蛋白可以是酶、细胞因子或抗体，其中所述目标蛋白已糖基化，例如，唾液酸化。在以下部分5.4中提供了目标蛋白的非限制性列表。
5.4目标蛋白
根据本文所述的方法，本领域中已知的任何蛋白质(或者对应于所述蛋白质的肽/多肽)可以用作目标蛋白。本领域技术人员将容易地理解使用本领域中已知的方法，可以容易地推断出已知蛋白以及新鉴别的蛋白的核酸序列，并因此将编码任何所关心的蛋白的核酸引入至本文所提供的宿主细胞(例如，通过表达载体，例如，质粒)将在本领域技术人员的能力范围内。本领域技术人员还将认识到使用本文所述的方法糖基化的目标蛋白，例如，使用本文所提供的宿主细胞体内或体外糖基化的目标蛋白具有治疗益处(例如，由于药代动力学改善)，并因此可以在将受益于所述糖基化(例如，多聚唾液酸化)目标蛋白的治疗的患有疾病/病症的对象的治疗中使用。具体地，可以使用通过本文所述的方法产生的糖基化(例如，多聚唾液酸化)目标蛋白治疗或预防由对象中目标蛋白的缺陷形式的存在、对象中目标蛋白的不存在、对象中目标蛋白表达的减弱所引起的疾病和病症。另外，可以使用通过本文所述的方法产生的糖基化(例如，多聚唾液酸化)目标蛋白治疗使用本文所述的方法产生的目标蛋白所结合的受体介导的疾病或者通过使用本文所述的方法产生的目标蛋白所结合的配体所介导的疾病(例如，其中所述目标蛋白是所述配体的受体)。
在具体的实施方式中，根据本文所述的方法和宿主细胞使用的目标蛋白是治疗性蛋白。示例性治疗性蛋白包括酶、细胞因子、激素、生长因子、抑制剂蛋白、蛋白受体、结合蛋白受体的配体和抗体。
在具体的实施方式中，根据本文所述的方法和宿主细胞使用的目标蛋白是酶或抑制剂。可以用作目标蛋白的示例性酶和抑制剂无限制地包括因子VII、因子VIII、因子IX、凝血因子X、因子XIII、因子VIIa、抗凝血酶III(AT-III)、蛋白质C、组织凝血酶原激活剂(tPA)和tPA变体、尿激酶、水蛭素、链激酶、葡糖脑苷脂酶、阿葡糖苷酶-α、拉罗尼酶(Laronidase)(α-L-艾杜糖醛酸酶)，艾杜硫酶(Idursulphase)(艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶)、加硫酶(Galsulphase)、阿加糖酶(Agalsidase)-β(人α-半乳糖苷酶A)、肉毒毒素、胶原酶、人DNA酶-I、玻璃酸酶、木瓜蛋白酶、L-天冬酰胺酶、尿酸酶(尿酸氧化酶)、谷氨酸羧肽酶(谷卡匹酶(glucarpidase))、α1蛋白酶抑制剂(α1抗胰蛋白酶)、乳糖酶、胰酶(脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶)和腺苷脱氨酶。
在具体的实施方式中，根据本文所述的方法和宿主细胞使用的目标蛋白是细胞因子。可以用作目标蛋白的示例性细胞因子无限制地包括干扰素-α(INF-α)、干扰素-β(INF-β)、干扰素-γ(INF-γ)、白细胞介素-2(IL2)、嵌合白喉毒素-IL-2(地尼白介素-毒素连接物(denileukin diftitox))、白介素-1(IL1)、IL1B、IL3、IL4、IL11、IL21、IL22、IL1受体拮抗剂(阿那白滞素)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)。
在具体的实施方式中，根据本文所述的方法和宿主细胞使用的目标蛋白是激素或生长因子。可以用作目标蛋白的示例性激素和生长因子无限制地包括胰岛素、普兰林肽、生长激素(GH)、胰岛素样生长因子(IGF1)、人甲状旁腺激素、降钙素、高血糖素-样肽-1激动剂(GLP-1)、高血糖素、生长激素-释放激素(GHRH)、胰泌素、促甲状腺激素(TSH)、人骨塑型蛋白2(hBMP2)、人骨塑型蛋白7(hBMP7)、促性腺激素释放激素(GnRH)、角化细胞生长因子(KGF)、血小板源性生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子7(FGF7)、成纤维细胞生长因子20(FGF20)、成纤维细胞生长因子21(FGF21)、表皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、神经营养蛋白-3、促生育素(FSH)、人绒毛膜促性腺激素(HCG)、促黄体素-α、促红细胞生成素、粒性白细胞集落刺激因子(G-CSF)和粒性白细胞-巨噬细胞集落-刺激因子(GM-CSF)。
在具体的实施方式中，根据本文所述的方法和宿主细胞使用的目标蛋白是抗体。可以用作目标蛋白的示例性抗体无限制地包括结合TNF-α的抗体，例如，阿达木单抗(Humira)和类克(Remicade)(英利昔单抗)；ReoPro(阿昔单抗)；Rituxan(利妥昔单抗)；Simulect(巴利昔单抗)；Synagis(帕利珠单抗)；赫塞汀(曲妥珠单抗)；麦罗塔(吉妥珠单抗奥唑米星)；Campath(阿仑珠单抗)；Zevalin(替伊莫单抗替坦(tiuxetan))；Xolair(奥马珠单抗)；Bexxar(托西莫单抗-I-131)；爱必妥(西妥昔单抗)；安维汀(贝伐单抗)；Tysabri(那他珠单抗)；Actemra(托珠单抗)；Vectibix(帕尼单抗)；Lucentis(兰尼单抗(ranibizumab))；Soliris(依库珠单抗)；Cimzia(聚乙二醇结合赛妥珠单抗(Certolizumabpegol))；Simponi(戈利木单抗)；Ilaris(卡那津单抗)；Stelara(优特克单抗)；Arzerra(奥法木单抗)；Prolia(地诺单抗)；Numax(莫维珠单抗)；ABThrax(瑞西巴库单抗)；Benlysta(贝利木单抗)；Yervoy(普利木单抗)；Adcetris(贝伦妥单抗(Brentuximab Vedotin))；Perjeta(帕妥珠单抗)；Kadcyla(曲妥珠单抗-美坦新偶联物(Ado-trastuzumabemtansine))；和Gazyva(奥比妥珠单抗)。
在具体的实施方式中，根据本文所述的方法和宿主细胞使用的目标蛋白是受体。可以用作目标蛋白的示例性受体无限制地包括人CTLA4胞外域(例如，融合至Fc)和可溶性TNF受体(例如，融合至Fc)。
5.5组合物
包含宿主细胞的组合物
在一个方面，本文提供了包含本文所述的宿主细胞(参见部分5.1)的组合物。这些组合物可以在用于产生本文所述的糖基化目标蛋白(参见部分5.4)的方法中使用，例如，可以在适合于产生蛋白的条件下培养所述包含宿主细胞的组合物。随后，可以使用本领域中已知的方法从包含宿主细胞的组合物中分离糖基化目标蛋白。
本文所提供的包含所述宿主细胞的组合物可以包含适合于本文所述的宿主细胞的维持和存活的其它组分，并且还可以包含对通过所述宿主细胞的蛋白产生需要或有益的其它组分，例如，诱导型启动子的诱导剂，如阿拉伯糖、IPTG。
包含糖基化目标蛋白的组合物
在另一个方面，本文提供了包含一种或多种本文所述的糖基化目标蛋白(参见部分5.4)的组合物(例如，药物组合物)。本文所述的组合物在对象(例如，人对象)中的疾病/病症的治疗和/或预防中是有用的。参见部分5.6。
在具体的实施方式中，本文提供了包含使用本文所述的宿主细胞产生的糖基化目标蛋白的组合物，其中存在于所述蛋白质中的所述N-糖基化共有序列的至少80％、85％、90％、95％或99％包含连接至存在于所述N-糖基化共有序列中的Asn残基(或者其它相关残基)的葡萄糖。
在另一个具体的实施方式中，本文提供了包含使用本文所述的宿主细胞产生的糖基化目标蛋白的组合物，其中存在于所述蛋白质中的所述N-糖基化共有序列的至少80％、85％、90％、95％或99％包含连接至存在于所述N-糖基化共有序列中的Asn残基(或者其它相关残基)的相同的连接的多糖。
在另一个具体的实施方式中，本文提供了包含使用本文所述的宿主细胞产生的糖基化目标蛋白的组合物，其中在所述组合物中至少80％、85％、90％、95％或99％的蛋白已通过所述宿主细胞的NGT，例如，通过存在于所述宿主细胞中的异源核酸编码的NGT N-糖基化。在具体的实施方式中，存在于所述组合物中的每个蛋白中存在的N-糖基化共有序列的至少80％、85％、90％、95％或99％包含连接至存在于所述N-糖基化共有序列中的Asn残基(或者其它相关残基)的葡萄糖。在另一个具体的实施方式中，存在于所述组合物中的每个蛋白中存在的N-糖基化共有序列的至少80％、85％、90％、95％或99％包含连接至存在于所述N-糖基化共有序列中的Asn残基(或者其它相关残基)的相同的连接的多糖。
在另一个具体的实施方式中，本文提供了包含使用本文所述的宿主细胞产生的唾液酸化的蛋白质。在具体的实施方式中，在所述组合物中所述蛋白质的至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％是唾液酸化的或多聚唾液酸化的。在另一个具体的实施方式中，所述组合物中100％的所述蛋白质是唾液酸化的或多聚唾液酸化的。在另一个具体的实施方式中，在存在于所述组合物中的每个蛋白中存在的N-糖基化共有序列的至少80％、85％、90％、95％或99％在存在于所述N-糖基化共有序列中的Asn残基(或者其它相关残基)处包含相同的唾液酸化类型。
在某些实施方式中，除包含本文所述的糖基化目标蛋白(参见部分5.4)之外，本文所述的组合物(例如，药物组合物)包含药物可用的载体。如本文所使用的，术语“药物可用的”是指已被联邦或州政府的管理机构批准，或者在美国药典或其它普遍认可的药典中列举的用于动物，并且更具体地用于人的。在药物可用的载体的背景中，如本文所使用的术语“载体”是指药物组合物与之一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。盐溶液以及葡萄糖和甘油水溶液也可以用作液体载体，具体地用于可注射溶液。适合的赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇、乙二醇、水、乙醇等。在E.W.Martin的“Remington'sPharmaceutical Sciences”中描述了适合的药物载体的实例。
在某些实施方式中，将本文所述的组合物配制以适合于向对象的预定施用途径。例如，可以配制本文所述的组合物以适合于皮下、肠胃外、口服、皮内、透皮、结直肠、腹膜内和直肠施用。在具体的实施方式中，可以将所述药物组合物配置用于静脉内、口服、腹膜内、鼻内、气管内、皮下、肌内、局部、皮内、透皮或肺部施用。
在某些实施方式中，本文所述的组合物还包含一种或多种缓冲液，例如，磷酸盐缓冲液和蔗糖-磷酸-谷氨酸缓冲液。在其它实施方式中，本文所述的组合物不包含缓冲液。
在某些实施方式中，本文所述的组合物还包含一种或多种盐，例如，氯化钠、氯化钙、磷酸钠、谷氨酸单钠和铝盐(例如，氢氧化铝、磷酸铝、明矾(硫酸铝钾)或这些铝盐的混合物)。在其它实施方式中，本文所述的组合物不包含盐。
本文所述的组合物可以与施用说明一起包含在试剂盒、容器、包装或分散器中。
在使用前，可以储存本文所述的组合物，例如，可以将所述组合物冷冻储存(例如，在约-20℃或在约-70℃)；在冷藏条件(例如，在约4℃)下储存；或者在室温下储存。
5.6预防和治疗性使用
在一个方面，本文提供了治疗对象中疾病或病症的方法，其包括向所述对象施用本文所述的糖基化目标蛋白(参见部分5.4)或其组合物(参见部分5.5)。在另一个方面，本文提供了预防对象中疾病或病症的方法，其包括向所述对象施用本文所述的糖基化目标蛋白(参见部分5.4)或其组合物(参见部分5.5)。在具体的实施方式中，本文提供了治疗或预防对象中疾病或病症的方法，其包括向所述对象施用根据本文所述的方法产生的多聚唾液酸化的目标蛋白。
6.实施例
6.1材料和方法
质粒设计和构建。产生了质粒，其整合了宿主细胞中NGT-介导的蛋白质糖基化所需的多种成分。具体地，构建了质粒，所述质粒具有胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)ngt(ApNGT)、脑膜炎奈氏球菌(Neisseria meningitidis)的lgtB、空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)(OH4382/84株，含有C末端32-氨基酸缺失和I53S突变，(参见Chiu C.P.等人,Nat Struct Mol Biol.2004Feb；11(2):163-70))的cstII，单独的siaB(或者synB，CMP-Neu5Ac合酶)或另外与siaA(或者synX，UDP-N-乙酰葡萄糖胺2-表异构酶)和siaC(或者synC，唾液酸合酶)一起，其均来自脑膜炎奈氏球菌(Neisseriameningitidis)(MC58)和/或来自脑膜炎奈氏球菌(Neisseria meningitidis)血清群B的polyST(F116-polySTF460T，参见Keys T.G.等人,Nat Chem Biol.2014Jun；10(6):437-42，具有N末端Strep-标签)或者来自溶血曼海姆氏菌(Mannheimia haemolytica)的polyST(N末端20个氨基酸缺失，参见Lindhout等人,PLoS One 2013 8(7):e69888.doi:10.1371/journal.pone.0069888)。产生不同组合以评价N-糖基化的效率。参见表1和下文。
在GENEius网站使用GENEius服务器将所述途径中每种蛋白质的氨基酸序列回译，并使用设计用于提供非常近似于DNA2.0所公开的Freq-A、-B和-C的平均值(参见Welch等人,PLoS ONE 4,e7002(2009))的密码子偏性的密码子使用并避免常见的限制酶切位点和延长的单碱基重复来进行密码子优化(参见表2)。将唾液乳糖途径中的基因组织成假操纵子结构(参见Xu P.等人,ACS Synth.Biol.1,256-266(2012)，Xu P.等人,Nat.Commun.4,1409(2013)和He W.等人,Metab.Eng.27 92-100(2015))，其中每个基因置于lacUV5启动子的控制下，包括lac操纵子(参见Deuschle等人,EMBO J.5,2987-2994(1986))和通过SalisLab RBS计算器在Salis Lab网站上以约50,000a.u.的目标翻译起始速率设计的常规核糖体结合位点(参见Espah Borujeni A等人,Nucleic Acid Res 42(4),2646-59(2014)和Farasat I等人,Mol Syst Biol,10,731(2014))。siaABC基因作为编码脑膜炎奈氏球菌(Neisseria meningitidis)血清群B中聚唾液酸荚膜生物合成的多顺反子操纵子的一部分存在。这些基因与它们的天然RBS一起作为区块并置于lacUV5启动子，包括lac操纵子的控制下。所述操纵子之后是单一翻译终止位点。将留下互补突出端的两组同尾酶限制酶切位点用于将每个基因侧接以使得能够容易地修饰所述途径，包括基因缺失和调控元件的交换。合成了编码NGT-介导的蛋白质糖基化途径的构建体(GENEWIZ Inc.)并将其引入pUC57载体或者pACYC-Duet载体(Novagen)或者pCDF-Duet载体(Novagen)。使用标准分子生物学技术进行进一步的质粒操纵，包括亚克隆至不同的质粒主链以及基因和标签的插入和缺失。对所有构建体测序以确认所期望的修饰。
菌株和生长条件。将大肠杆菌(E.coli)DH5α株用于维持和扩增质粒DNA。将大肠杆菌(E.coli)K12来源的JM107ΔnanA::kan株(参见Priem等人,Glycobiology.12,235-240(2002))用作糖基化实验的宿主菌株。除非另作说明，否则细菌在摇瓶中的Luria-Bertani(LB)培养基中或者在含有1.5％(w/v)琼脂的LB板上生长。在适当情况下，以下列浓度：100μg/ml氨苄西林，35μg/ml氯霉素，50μg/ml大观霉素和50μg/ml甲氧苄啶向培养基中添加抗生素。对于使用仅表达SiaB的菌株，即使用用于CMP-Neu5Ac生物合成的清除途径(参见图1)的(多聚)唾液酸化的蛋白质的产生，培养基中添加了5mM Neu5Ac。将培养物在37℃生长至OD600约1.0(或者对于蛋白质的多聚唾液酸化，1.8-2.0)，并通过添加1mM IPTG和0.4％L-阿拉伯糖诱导表达。将培养物在存在诱导剂的情况下在28℃另外生长20-24小时。通过离心收获细胞颗粒，用PBS清洗一次，然后在-20℃储存直至进一步处理。
将大肠杆菌(E.coli)K12来源的W3110ΔlacZΔnanAΔnanK用作糖基化实验的宿主，其中途径构建体编码CMP-Neu5Ac从头合成的基因，siaABC(pLMTB4250)。参见图1。除非另作说明，否则如上所述培养细菌，然而，培养基不添加Neu5Ac，并且当培养物生长至OD600约0.6-1.0时诱导表达。
用于糖基化分析的蛋白质的小规模制备和富集。将来自10ml表达培养的细胞颗粒在约650μl添加有1mg/ml溶菌酶和20μg/ml DNA酶I的裂解缓冲液(60mM Tris pH 8.0，1mMMgCl2)中再悬浮。通过三次冻融-超声循环使细胞裂解，所述循环包括i)在液氮中速冻，ii)在室温下，在超声浴中融化5min和iii)在室温下保持15min。以20,000g使细胞碎片成粒，并直接分析上清液(无细胞提取物)或者如下所述，通过NiNTA珠和/或StrepTactinSepharose富集所关心的蛋白。
对于scAtaC的富集，将上清液中添加蛋白酶抑制剂混合物(Sigma)，并调节至最终体积2ml的20mM Tris pH 8.0，300mM NaCl和6M脲(结合缓冲液)中。将6×His标记的AtaC样品分批结合至NiNTA珠，然后加载至小柱，用30mM咪唑在结合缓冲液中的溶液清洗，并用200mM咪唑在结合缓冲液中的溶液洗脱。使用离心浓缩机(Amicon)，以30kDa的截留分子量，将洗脱液浓缩至约200μl。
对于GFP构建体的富集，细胞裂解液添加了蛋白酶抑制剂混合物(Sigma)，并以分批形式直接结合至NiNTA珠上。将珠加载至小柱，用30mM咪唑在60mM Tris pH 8.0中的溶液清洗，用250mM咪唑在60mM Tris pH 8.0中的溶液洗脱。将洗脱液直接加载至预平衡的StrepTactin Sepharose珠，用60mM Tris pH 8.0清洗，并用2.5mM脱硫生物素洗脱。将样品浓缩并将缓冲液交换成PBS用于储存。
通过SDS-PAGE，然后通过使用抗-His4抗体(Qiagen)，N-己糖反应性人血清MS14(参见Naegeli等人,J.Biol.Chem.289,2170-2179(2014)；和Lolli等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.102,10273-10278(2005))和抗聚唾液酸单克隆抗体735(Absolute Antibody)的免疫印迹法分析样品，或者通过胰蛋白酶消化，然后通过nano-LC-ESI-MS/MS分析样品。
多聚唾液酸化的GFP的纯化。将来自1升表达培养的细胞颗粒(约13g湿重)在35ml裂解缓冲液(20mM Tris pH 7.0，2mMβ-巯基乙醇，1mM MgCl2，100μg/ml DNA酶I，蛋白酶抑制剂混合物)中再悬浮。通过三次通过法式挤压破碎器使细胞裂解，并通过在4℃以20,000g离心30min澄清。将上清液通过NiNTA柱，用20mM咪唑在20mM Tris pH 7.0，2mMβ-巯基乙醇中的溶液清洗，并用250mM咪唑在相同缓冲液中的溶液洗脱。将洗脱液浓缩，并直接加载至用缓冲液A(20mM Tris pH 7.0，2mMβ-巯基乙醇)预平衡的2ml MonoQ柱上，清洗15min，然后以0-100％的缓冲液B(1M NaCl，20mM Tris pH 7.0，2mMβ-巯基乙醇)的梯度，以1ml/min的流速，在70min内洗脱。在线监测280nm的UV吸光度，并且通过使用微量滴定板荧光分光计测量每个部分的荧光(Ex.485nm/Em.520nm)鉴别含有GFP的部分。将三个含有GFP的部分(低、中和高盐)混合，交换至储存缓冲液(60mM Tris pH 7.0，100mM NaCl，2mMβ-巯基乙醇和10％甘油)，浓缩并冷冻用于进一步分析。通过BCA测定(Pierce)和GFP荧光测量确定蛋白质浓度。
多聚唾液酸化的VEGF-A-拮抗设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)的纯化。将对应于OD600为500,000的生物量在3000ml结合缓冲液(10mM咪唑，30mM Tris pH 7.0，500mMNaCl)中再悬浮。通过以20,000PSI通过一次微射流机LM20使细胞裂解，并在4℃以10,000g离心1h澄清。将上清液以10ml/min的流速加载至装填了Toyopearl AF-Chelate-650M(Tosoh)树脂的200ml XK50/20柱(GE)上。用40倍柱体积(CV)的内毒素去除缓冲液(10mM咪唑，30mM Tris pH 8.0，500mM NaCl，0.1％Triton X-114)，然后用40CV的清洗缓冲液(10mM咪唑，30mM Tris pH 7.0，500mM NaCl)清洗所述柱，最后以10ml/min的流速，以10mM至500mM咪唑在30mM Tris pH 7.0，100mM NaCl中的溶液的梯度洗脱15CV。将含有多聚唾液酸化的DARPin的部分混合并加载至装填了Source15Q树脂(GE)的30ml X16HiScale柱(GE)上。随后，用5CV的清洗缓冲液(30mM Tris pH 7.0，100mM NaCl)清洗柱，并用100mM至350mMNaCl在30mM Tris pH 7.0中的溶液的梯度洗脱40CV。将三个含有DARPin的部分(对应于低、中和高盐)混合，浓缩并以2.5ml/min的流速，在1×PBS pH 7.5中加载至318mlSuperdex200 26/60prep级柱。将来自最终尺寸排阻色谱步骤的含有DARPin的部分浓缩至2mg/ml(通过BCA测定(Pierce)确定)，添加蛋白酶抑制剂混合物(Roche)，通过过滤灭菌，然后冷冻用于进一步分析。
分析型阴离子交换色谱法。将纯化的糖蛋白在20mM Tris pH 7.0中稀释至1mg/ml。将约4μg蛋白直接加载至ProPac SAX柱(Dionex)，并以1.2ml/min的流速，以50至600mMNaCl在20mM Tris pH 7.0中的溶液的梯度分离15min。在线监测280nm的吸光度和GFP荧光(Ex.485nm/Em520nm)。
分析型尺寸排阻色谱。将纯化的蛋白在1×PBS pH 7.5中稀释至100μg/ml。将约5μg的蛋白质直接加载至Agilent Bio SEC-5柱。将样品以0.6ml/min的流速，在1×PBS pH7.5中等度运行。在线监控215nm的吸光度。使用Bio-Rad的凝胶过滤标准品(产品号#151-1901)。
表面等离子共振光谱。使用Biacore T200仪，在25℃测量VEGF-结合剂的动力学参数。将饵配体(重组人VEGF165，Acro Biosystems)以三个不同的密度共价固定在传感器芯片C1表面上。在10mM HEPES pH 7.4，150mM NaCl，3mM EDTA，0.05％吐温20中，以50μl/min的流速，使用多循环动力学分析捕获的分析物(不同的DARPins或作为阳性对照，重组人VEGF-R1(Acro Biosystems))。
Nano-LC-ESI-MS/MS分析。使用过滤器辅助法(参见Wisniewski等人,Nat.Methods6,359-362(2009))将样品准备用于质谱分析，并将肽浓缩并用C18ZipTip(Millipore)脱盐。用与Nano-HPLC(Eksigent Technologies)连接的校准的LTQ-Orbitrap Velos质谱仪(ThermoFischer Scientific)进行样品分析。将肽在2.5％乙腈，0.1％甲酸(FA)中再悬浮，加载至装填有反相C18材料(ReproSil-Pur 120C18-AQ,1.9μm,Dr.Maisch GmbH,Germany)的自制烧结柱(75μm×150mm)上，使用三个线性梯度步骤：3％至30％乙腈22min，30％至50％乙腈25min和50％至97％乙腈27min，其中具有恒定的0.1％的甲酸，以300nl/min的流速洗脱。一个扫描循环包含全扫描MS全扫谱图(survey spectrum)，然后是对高于2000阈值的最强信号的10个顺序HCD MS/MS。以分辨率60,000，m/z 400，在FT-Orbitrap中采集全扫描MS谱图(500-2000m/z)。以分辨率15,000，m/z 400，在Orbitrap(目标值1e5，碰撞能35V)中记录HCD MS/MS谱图。对于全FTMS扫描，自动增益控制(AGC)目标值为1×106，对于HCDMS/MS扫描，为1×105。对于全部实验，以一次重复计数，15-s重复持续时间和60-s排除持续时间使用动态排除。
数据库分析和修饰残基的鉴别。考虑Cys的脲基甲基化，Met的氧化和Asn的1/2个己糖，通过Mascot引擎(2.4版)，对Swissprot数据库(201504版)搜索MS和MS/MS数据。对于碎片离子，以8ppm的肽误差和0.25Da的MS/MS误差搜索2+的单同位素分子量或更多带电的肽。对于NeuAc(292.10)和NeuAc-H2O(274.09)，将MS/MS光谱中氧鎓离子的存在用于搜索一次LC运行中的唾液酸化的糖肽。手动进行肽的测序。
表1：所使用的菌株和质粒
表2：ApNGT序列
6.2实施例1：能够胞质蛋白糖基化的宿主细胞的产生
最近，在γ-变形菌的几个种中阐明了胞质N-糖基化系统(Grass等人,PLoSPathogen 6,e1000919(2010)和Choi等人,PLoS ONE 5,e15888(2010))。在这些细菌中，胞质N-糖基转移酶(NGT)修饰Asn-X-Ser(Thr)序列子中的天门冬酰胺残基，并且它使用简单的核苷酸糖UDP-葡萄糖(UDP-Glc)作为供体底物来完成。所得的Glcβ1-Asn修饰是真核N-聚糖核心结构的简单分子模拟(Schwarz等人,J.Biol.Chem.286,35267-35274(2011))。先前已表明来自胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)的NGT(ApNGT)可以用于修饰大肠杆菌(E.coli)细胞质中的异源蛋白质(Naegeli等人,J.Biol.Chem.289,2170-2179(2014))。在本实施例中，显示了ApNGT使目标蛋白葡糖基化的能力，其中N-连接的葡萄糖可以用于提供新型N-连接的聚糖在细菌细胞质中直接自下而上合成的位点特异的柄(例如，引物)。具体地，显示了使用N-连接的葡萄糖作为多聚唾液酸化的引物在大肠杆菌(E.coli)胞液中产生多聚唾液酸化的蛋白的能力。
α2,8-连接的多聚唾液酸(polySia)是具有不同生物学功能和广泛生物技术潜力的直链均聚物。在人中枢神经系统中，polySia连接至特异性蛋白的N-聚糖，在此它通过其抗粘附性促进了可塑性(参见Rutishauser等人,Nat Rev Neurosci 9,26-35(2008)和Hildebrandt等人,Top.Curr.Chem.(2013).Doi:10.1007/128_2013_446)。另外，脂质锚定的polySia形成了神经侵袭性细菌性病原体的一些菌株的胞外荚膜。细菌α2,8-连接的多糖在化学和免疫学上与人polySia相同并且用作分子模拟物，从而掩盖了抗原富集的细菌表面并且有利于免疫逃避(参见Troy F.A.等人Glycobiology 2,5-23(1992))。与这些生物学功能一致，polySia具有一些生物技术应用。值得注意地，从蛋白治疗剂多聚唾液酸化降低了免疫原性和蛋白水解降解，并且提高了循环半衰期，并因此作为蛋白治疗剂PEG化(化学连接聚乙二醇链)的天然和生物可降解替代具有巨大潜力(参见Constantinou等人,Bioconjug.Chem.19,643-650(2008)和Lindhout等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.108,7397-7402(2011))。然而，可用的蛋白质多聚唾液酸化的策略限制于已有N-聚糖的化学酶延伸(参见Lindhout等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.108,7397-7402(2011))或者与纯化和官能化的多糖的化学缀合(Smirnov等人,Glyco-Engineering(Castilho,A.主编)389-404(Springer New York,2015))。由于真核多聚涎酸转移酶(polyST)仅对少数蛋白靶标显示出特异性，因此生物合成是不可能的(参见Mühlenhoff等人,Neurochem.Res.1-10doi:10.1007/s11064-013-0979-2)。通过Kallolimath等(Kallolimath等人,Proc.Natl.Acad.Sci.(2016).doi:10.1073/pnas.1604371113)近期在植物糖工程中的研究突出了这一点。他们显示可以将单个α2,3-和α2,6-连接的唾液酸残基添加至不同的治疗性蛋白，然而仅可能将polySia添加至天然多聚唾液酸化蛋白，神经细胞粘合分子(NCAM)的域。
如图1所示，在本实施例中使用的生物合成途径包括四个原核糖基转移酶，其顺序作用以在细菌细胞质中的蛋白靶标上构建polySia。选择所述途径中的糖基转移酶用于他们在游离寡糖体内和体外合成中的应用以及用于它们受体底物宽泛性。将所选的半乳糖基转移酶，脑膜炎奈氏球菌(N.meningitidis)的LgtB(MC58)用于N-连接的葡萄糖的初始延伸以形成N-连接的乳糖(通过将半乳糖连接至所述N-连接的葡萄糖)。已知LgtB将半乳糖转移至不同的糖苷上(参见Lau等人,Chem.Commun.46,6066-6068(2010))但是从未使用蛋白质-或肽-连接的受体进行测试。将所述N-连接的乳糖用作来自空肠弯曲菌(Campylobacterjejuni)的双功能α2,3/α2,8低聚涎酸转移酶CstII的底物，其能够在多达三个α2,8连接的Neu5Ac残基之后添加α2,3(参见，例如，Antoine等人,Angew.Chem.117,1374–1376(2005)；Blixt等人,Carbohydr.Res.340,1963–1972(2005)；和Gilbert等人,J.Biol.Chem.275,3896–3906(2000))。此外，所述双功能涎酸转移酶CstII作为用于引发乳糖苷通过细菌多聚涎酸转移酶进行延伸的所选的酶是很好确立的(Lindhout,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.108,7397-7402(2011)和Antoine等人,Angew.Chem.117,1374-1376(2005))。所使用的特异性CstII为来自空肠弯曲菌(C.jejuni)的CstIIΔ32I53S(OH4382/84)，与野生型蛋白相比，其具有提高的溶解度、稳定性和α2,8活性(参见Chiu等人,Nat.Struct.Mol.Biol.11,163–170(2004))。
可以通过多聚涎酸转移酶(polyST)使二涎酸乳糖延伸。脑膜炎奈氏球菌(N.meningitidis)血清群B的polyST可以将二涎酸乳糖延伸超过100个α2,8-连接的Neu5Ac残基(参见Lindhout等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.108,7397–7402(2011)；Lindhout等人,PLoS ONE 8,e69888(2013)；和Freiberger等人,Mol.Microbiol.65,1258–1275(2007))。在本实施例中所产生的途径中使用的特异性polyST为来自脑膜炎奈氏球菌(N.meningitidis)血清群B的F116-polySTF460T，其包括总计14个突变，25个氨基酸的N末端截短和N末端Strep-标签，它们共同提高了polyST的溶解度和稳定性并导致对短寡聚唾液酸受体的活性提高(参见Keys等人,Nat.Chem.Biol.10,437–442(2014)；和Keys等人,Anal.Biochem.427,60–68(2012))。
将在本实施例中产生的生物合成途径的每个组分引入大肠杆菌(E.coli)宿主细胞，从而导致产生了包含参与蛋白质(多聚)唾液酸化的蛋白(糖基转移酶)所必需的相关基因的大肠杆菌(E.coli)宿主细胞。为了使蛋白唾液酸化，双功能涎酸转移酶CstII和polySTs两者均需要激活的供体糖CMP-Neu5Ac。为了确保通过宿主细胞产生了该底物，将CMP-Neu5Ac合成酶，脑膜炎奈氏球菌(N.meningitidis)的SiaB(MC58)引入宿主细胞并且培养基中添加通过固有补救途径(resident salvage pathway)吸收的Neu5Ac(参见AntoineT等人ChemBioChem 4,406-412(2003))。
所使用的特异性大肠杆菌(E.coli)背景为大肠杆菌(E.coli)K12JM107ΔnanA::kan株(参见Priem等人,Glycobiology 12,235-240(2002))，其缺少β-半乳糖苷酶(LacZ)和唾液酸醛缩酶(NanA)活性，它们分别可以降解乳糖和唾液酸。为了平衡所述途径酶的表达并降低宿主菌株的代谢负担，对编码ApNGT、LgtB、CstII polyST和SiaB的基因进行密码子优化(参见Welch等人,PLoS ONE 4,e7002(2009))，并将ApNGT、LgtB、CstII和SiaB组织成假操纵子(参见Xu P.等人,ACS Synth.Biol.1,256-266(2012)，Xu P.等人,Nat.Commun.4,1409(2013)和He W.等人,Metab.Eng.27 92-100(2015))，其中通过设计以指导以中等速率起始翻译的诱导型lacUV5启动子(参见Deuschle等人,EMBO J.5 2987-2994(1986))和定制的核糖体结合位点(参见Salis,H.M.，Methods in Enzymology(Voigt C.主编)498,19-42(Academic Press,2011))控制每个基因的表达。参见表1，构建体pMA991。将polyST置于T5启动子和强核糖体结合位点的控制下。参见表1，构建体pMA1059。
将选择在宿主细胞中(多聚)唾液酸化的含有Asn-X-Ser/Thr位点的目标蛋白置于pBAD启动子的控制下。参见表1，构建体pMA885、pMA1045和pLMTB3724。
6.3实施例2：同源蛋白质的糖基化：多聚唾液酸化的scAtaC
在本实施例中，选择scAtaC作为目标蛋白。在胞质中保留scAtaC，它是来自胸膜肺炎放线杆菌(A.pleuropneumoniae)的自转运蛋白粘附素的可溶性片段，它是ApNGT的天然底物并且含有高密度的Asn-X-Ser(Thr)位点(参见Naegeli等人,J.Biol.Chem.289,2170–2179(2014))。
为了测试工程设计的糖基化途径中的每个步骤，产生了编码参与中间体聚糖结构合成的糖基转移酶的一系列构建体。然后，将这些途径构建体与His6标签的scAtaC共表达。在培养之后，富集并通过SDS-PAGE和免疫印迹法分析修饰的目标蛋白。参见图2。向所述途径中连续添加ApNGT、LgtB和CstII导致目标蛋白表观分子质量的连续提高，从而表明唾液乳糖向所述目标蛋白的添加。
为了确认半乳糖和Neu5Ac转移至N-连接的葡萄糖，使用了检测Glcβ1-Asn表位的人血清MS14。当仅ApNGT与目标蛋白共表达时，在MS14印迹中观察到了明显的条带。参见图2，泳道3。下游糖基转移酶LgtB和CstII的添加导致显著掩盖了该表位，表明N-连接的葡萄糖是连续半乳糖和Neu5Ac转移的底物。
尽管ApNGT和LgtB向所述途径的添加分别导致目标蛋白表观尺寸的小幅升高，但是CstII的添加导致表观分子量大幅升高并使分子量范围扩宽。参见图2，泳道5。宽分子量范围是糖蛋白的典型特征并且表示存在不同的糖基化形式。不同的糖基化形式可能由不同的位点占据所造成，并且可能由通过添加多至三个α2,8连接的Neu5Ac残基的CstII的唾液酸化的不同量所造成(参见Blixt等人,Carbohydr.Res.340,1963–1972(2005))。重要地，ApNGT从所述途径的缺失消除了目标蛋白的修饰，表明半乳糖和Neu5Ac残基依次转移至引物N-连接的葡萄糖上。参见图2，泳道2。
为了验证目标蛋白上唾液乳糖的存在，对富集和胰蛋白酶化的scAtaC样品实施LC-MS/MS。观察到9个scAtaC肽的修饰，其中7个含有典型的Asn-X-Ser/Thr位点，而2个似乎是在替代序列子处修饰。9个位点中的8个被单-、二-或三-唾液乳糖修饰。在大部分位点处，观察到糖基化中间体的存在。图3显示了对于从N-连接的葡萄糖至三涎酸乳糖的每个中间体的1个肽的萃取离子色谱图和相应的MS/MS光谱。
在单独的实验中，观察到了polyST(pMA1059)结合唾液乳糖途径剩余部分(pMA991)的表达，聚唾液酸的合成。参见图4，泳道3。相反，在不存在polyST表达的情况下(即，当仅pMA991表达时)，检测不到聚唾液酸。参见图4，泳道2。此外，当包含LgtB、CstII和SiaB，但不包含ApNGT的质粒pMA1075与polyST(pMA1059)一起表达时，聚唾液酸的量显著降低。参见图4，泳道1。
为了确认目标蛋白scAtaC被多聚唾液酸化，直接对聚唾液酸阳性无细胞提取物实施LC-MS/MS分析。结果表明在scAtaC上存在多达DP20的聚唾液酸链。所观察到的m/z物质表明未修饰的聚唾液酸至多达DP9的存在以及具有多达DP20的彻底分子内内酯化的聚唾液酸链的存在。内酯化是在用于LC-MS分析的低pH下发生的聚唾液酸的可逆修饰，并且预期在中性pH下不存在。除内酯化之外，可以预期聚唾液酸在低pH下彻底水解，并因此在该分析中观察到的多糖的长度可能显著低估了在scAtaC上合成的链长。尽管如此，scAtaC的多聚唾液酸化是非常明显的。
表3：多聚唾液酸化的scAtaC肽的LC-MS/MS分析
肽：K.GNLSTAADVTDK.N(y9＝907.43)
6.4实施例3：异源蛋白质的糖基化：多聚唾液酸化的sfGFP
在本实施例中，显示了异源目标蛋白的糖基化。利用短Asn-X-Ser(Thr)序列子，产生了两种超折叠绿色荧光蛋白(GFP)(Pedelacq等人,Nat.Biotechnol.20,927-932(2002))构建体，其具有单一工程设计的糖基化位点。作为C末端标签或在环中(在残基194-195之间)添加糖基化位点以分别产生“糖基化标签-”和“糖基化环-”构建体。参见图5a。首先，使用N-Glc特异性血清通过免疫印迹法检测葡糖基化。参见图5b。结果确认当与ApNGT共表达时，两种GFP均葡糖基化。定量MS分析分别表明了糖基化环-和糖基化标签-位点约86％和97％的糖基化占据。相反，未修饰缺少糖基化位点的GFP构建体。通过肽LC-MS/MS还表明LgtB和CstII能够延伸N-连接的葡萄糖，从而在糖基化环-GFP上组装唾液乳糖引物。参见图6。
在以下实验中，将修饰的构建体糖基化标签-GFP用于测试蛋白多聚唾液酸化。细菌polyST需要最少的二涎酸乳糖以引起多糖合成(Lindhout等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.108,7397-7402(2002))。为了测试聚合酶是否可以延伸蛋白质-连接的唾液乳糖引物，我们将整个多聚唾液酸化途径(pMA991和pMA1059)与糖基化标签-GFP构建体(pMA1045)一起在JM107ΔnanA::kan细胞中共表达。开始，我们仅观察到少量polySia，但是振荡摇瓶培养条件优化显著改善了得率并且导致GFP向较高MW拖尾，表明GFP被多糖修饰。参见图7。为了确认多聚唾液酸化，通过NiNTA亲和色谱纯化总GFP并且通过制备型阴离子交换色谱分离不同的糖基化形式。参见图8)。由于每个唾液酸单元所携带的负电荷，预期多聚唾液酸化的GFP保留在所述柱上。与这些预期一致，总GFP可以分成在低、中和高盐条件下洗脱的三个部分，其分别对应于无、低聚和多聚唾液酸修饰的GFP。参见图5c和d(在本发明中polySia定义为>10个残基的链)。通过完整糖蛋白的分析型阴离子交换色谱确定添加至GFP的聚合物的精确长度和分布。用包含长度约10至80个唾液酸残基的聚合物修饰多聚唾液酸化的GFP部分，其中较短的链是最丰富的。通过测试修饰对内切唾液酸酶NF消化的敏感性来确认聚合物的α2,8-键(Stummeyer等人,Nat.Struct.Mol.Biol.12,90-96(2005))。在未进行进一步优化的情况下，生物合成途径从1升LB培养基中获得了3mg的多聚唾液酸化的GFP，占总GFP的5-10％。通过平衡所述途径元件的表达和改善CMP-Neu5Ac的供应，将实现得率的进一步改善。
6.5实施例4：异源蛋白质的糖基化：多聚唾液酸化的DARPin
在本实施例中，测试了第二异源目标蛋白的多聚唾液酸化。与以上实施例类似，作为C末端标签添加短Asn-X-Ser(Thr)序列子至有效的VEGF-A-拮抗设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)(Stahl等人,Angiogenesis16,101-111(2013))以产生糖基化标签-DARPin构建体(pLMTB3724)。
将整个多聚唾液酸化途径(pMA991和pMA1059)与糖基化标签-DARPin构建体(pLMTB3724)一起在JM107ΔnanA::kan细胞中共表达。
通过NiNTA亲和色谱纯化总DARPin并且通过制备型阴离子交换色谱分离不同的糖基化形式。由于每个唾液酸单元所携带的负电荷，预期多聚唾液酸化的DARPin保留在所述柱上。与这些预期一致，总DARPin可以分成在低、中和高盐条件下洗脱的三个部分，其分别对应于短、中和长polySia链修饰的DARPin。参见图9a。
使用高效尺寸排阻色谱(HPSEC)分析纯化的蛋白质。图9b显示了在缺少蛋白糖基化机制的JM107ΔnanA::kan细胞中产生的未糖基化的DARPin和不同的多聚唾液酸化的DARPin制备物的色谱图。使用凝胶过滤标准品，确定多聚唾液酸化物质的分子量(MW)。与使用SDS-PAGE的蛋白尺寸估计相比，通过HPSEC确定的糖蛋白的MW显著更高，这主要是由于polySia链的多聚阴离子性质显著提高了糖蛋白的流体动力学体积。参见表4。
在表面等离子共振(SPR)研究中，分析了不同DARPin制备物与VEGF165的相互作用的结合性质和动力学并与VEGF受体(重组人VEGF-R1)与VEGF165的相互作用相比较。为了确定动力学参数，使用BCA测定(Pierce)测量探针浓度并且通过在饱和条件测量的SPR信号(Rmax)确定分子量。对于通过SPR确定的MW，参见表4。在传感器表面上，以三个不同的共价键固定的重组人VEGF165的密度对每个探针测量两次。表5中总结了测量的动力学常数。rhVEGF-R1的KD处于两位数纳摩尔范围。未修饰的DARPin对人VEGF165具有一位数皮摩尔的亲合力，如Stahl等人所报道的(Angiogenesis 16,101-111(2013))。重要地，由于所有DARPin制备物具有类似的KD值，因此聚唾液酸的修饰不会降低DARPin对VEGF的亲合力。
表4：通过SDS-PAGE、HPSEC和SPR对未糖基化和多聚唾液酸化的DARPin制备物的分子量确定
表5：结合至VEGF165的VEGF结合蛋白(DARPin和VEGF受体)的动力学常数
6.6实施例5：能够胞质蛋白糖基化的宿主细胞的产生：工程设计用于CMP-Neu5Ac的从头生物合成的途径
在以上实施例中，使用CMP-Neu5Ac生物合成的内源清除途径以产生目标蛋白糖基化的前体。该途径利用以下事实：大肠杆菌(E.coli)能够分解代谢Neu5Ac并且具有唾液酸渗透酶NanT。然而，由于细菌polyST对于CMP-Neu5Ac的KM相对较高，在1-5mM的范围内，因此需要多达100当量的CMP-Neu5Ac来使单一蛋白质多聚唾液酸化(Lindhout等人PLos One82013doi:10.1371/journal.pone.0069888)。因此，供体分子CMP-Neu5Ac可以是多聚唾液酸化蛋白质生物合成的限制试剂。
在本实施例中，将CMP-Neu5Ac合成的从头合成途径引入大肠杆菌(E.coli)K12来源的W3110以促使供体分子CMP-Neu5Ac的内源汇集(endogenous pool)。所使用的策略包括基因组编码的Neu5Ac分解代谢酶(nanAK)的缺失和来自脑膜炎奈氏球菌(Neisseriameningitidis)血清群B的CMP-Neu5Ac生物合成酶siaABC的异源表达(参见图1，Keys等人Anal Biochem.427,60-68(2012)；Fierfort and Semain J Biotechnol.134,261-5(2008)；和Richard等人.Glycobiology.26,723-31(2016))。siaABC基因作为编码脑膜炎奈氏球菌(Neisseria meningitidis)血清群B中聚唾液酸荚膜生物合成的多顺反子操纵子的一部分存在。这些基因与它们的天然RBS一起作为区块，置于诱导型启动子(lacUV5)之后，并引入产生pLMTB4250的“唾液乳糖途径”构建体。参见表1。
为了测试CMP-Neu5Ac生物合成的从头途径是否是功能性的，将糖基化途径构建体与糖基化标签-GFP构建体(pMA1045)一起在StLMTB10758(W3110ΔlacZΔnanAΔnanK)中共表达。通过NiNTA珠富集总GFP，并通过SDS-PAGE，然后通过考马斯亮蓝染色分析样品。参见图10.使用polySia特异性单克隆抗体，通过免疫印迹检测多聚唾液酸化。结果确认当与pLMTB4250共表达，即表达包括用于CMP-Neu5Ac从头合成的脑膜炎奈氏球菌(N.meningitidis)血清群B基因(siaABC)和polyST(pMA1059)的唾液乳糖途径时，GFP为多聚唾液酸化的。参见图10，泳道2。在使用CMP-Neu5Ac生物合成的清除途径在宿主细胞中产生的富集的GFP样品中，即在添加了Neu5Ac并且仅表达siaB的细胞培养物中，检测到较弱的polySia信号。参见图10，泳道4。与pLMTB4250共表达导致糖基化标签-GFP的表观分子量增加，表明唾液乳糖添加至目标蛋白。参见图10，泳道1。如所期望的，当从不表达糖基化途径的宿主细胞中纯化糖基化标签-GFP时，未检测到polySia。参见图10，泳道3。
6.7实施例6：能够胞质蛋白糖基化的宿主细胞的产生：使用polyST同源物的目标蛋白的体内多聚唾液酸化
在以上实施例中，将来自脑膜炎奈氏球菌(N.meningitidis)血清群B的polyST用于目标蛋白的体内多聚唾液酸化。所使用的特定变体F116-polySTF460T包括总计14个突变，25个氨基酸的N末端截短和N末端Strep-标签。总的来说，这些修饰提高了polyST的溶解度和稳定性并导致对短寡聚唾液酸受体的活性提高(参见Keys等人,Nat.Chem.Biol.10,437–442(2014)；和Keys等人,Anal.Biochem.427,60–68(2012))。本实施例表明在蛋白质多聚唾液酸化的工程设计的途径中，polyST同源物可以替代F116-polySTF460T。最近，描述了来自溶血曼海姆氏菌(Mannheimia haemolytica)的新型polyST，其组合了一些有利的生物化学性质(参见Lindhout等人,PLoS One 2013 8(7):e69888.doi:10.1371/journal.pone.0069888)。根据以上实施例，在使用或不使用N末端麦芽糖-结合-蛋白融合的情况下，将来自溶血曼海姆氏菌(Mannheimia haemolytica)的含有20个氨基酸N末端缺失的polyST(Δ20polySTMh)克隆至pCDF-DUET表达质粒。分别参见表1中的pLMTB3961和pLMTB3962。为了测试Δ20polySTMh变体是否可以延伸蛋白质-连接的唾液乳糖引物，将整个多聚唾液酸化途径与糖基化标签-GFP构建体(pMA1045)一起在StLMTB10758(W3110ΔlacZΔnanAΔnanK)中共表达。通过NiNTA珠富集总GFP，并通过SDS-PAGE，然后通过使用抗-polySia特异性单克隆抗体的免疫印迹法分析样品。参见图11a。结果确认当与Δ20polySTMh构建体(pLMTB3961或pLMTB3962)以及pLMTB4250一起共表达时，糖基化标签-GFP是多聚唾液酸化的。参见图11a，泳道3和4。如所期望的，在不表达糖基化途径的宿主细胞中生产的富集的GFP样品中，未检测到polySia信号。参见图11a，泳道1。与唾液乳糖途径(pLMTB4250)共表达导致糖基化标签-GFP的表观分子量增加，表明唾液乳糖添加至目标蛋白。参见图11a，泳道2。通过完整糖蛋白的分析型阴离子交换色谱确定添加至GFP的聚合物的精确长度和分布。参见图11b。与唾液乳糖途径(pLMTB4250)共表达导致长达DP4的短唾液酸的组装，这与所报道的CstII活性一致(参见Blixt等人,Carbohydr.Res.340,1963–1972(2005))。一旦整个多聚唾液酸化途径(pLMTB4250和pLMTB3961/pLMTB3962)共表达，则检测到多聚唾液酸化的GFP。无需进一步优化，包括Δ20polySTMh构建体(pLMTB3961)的生物合成途径导致聚唾液酸(定义为DP≥10)对20-25％的总GFP的修饰。
6.8结论
这些实施例表明大肠杆菌(E.coli)胞液中共表达的糖基转移酶能够使用N-连接的葡萄糖作为蛋白糖基化的引物。具体地，这些实施例表明当在大肠杆菌(E.coli)中表达时，可以产生导致目标蛋白多聚唾液酸化的合成多聚唾液酸化途径。该发现是极其重要的，因为它允许使用宿主细胞(如大肠杆菌(E.coli))产生多聚唾液酸化的蛋白质(如治疗性蛋白)，从而使其相对于它们非多聚唾液酸化的对应物，具有延长的半衰期。
本发明未受限于本文所述的具体实施方式的范围。的确，除所述那些以外，通过上述说明和附图对本文所提供主题的多种改变将对本领域技术人员是显而易见的。这些改变旨在处于所附权利要求的范围内。
在本文中引用了多个出版物、专利和专利申请，以上出版物、专利和专利申请的公开内容以其全部内容作为参考并入。
序列表
<110> 利玛泰克生物制品公司
苏黎世联邦理工学院
<120> 产生糖基化蛋白的方法
<130> 14197-004-228
<140> TBA
<141> On even date herewith
<150> US 62/260,725
<151> 2015-11-30
<150> US 62/416,853
<151> 2016-11-03
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 620
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ApNGT序列
<400> 1
Met Glu Asn Glu Asn Lys Pro Asn Val Ala Asn Phe Glu Ala Ala Val
1 5 10 15
Ala Val Lys Asp Tyr Glu Lys Ala Cys Ser Glu Leu Leu Leu Ile Leu
20 25 30
Ser Gln Leu Asp Ser Asn Phe Gly Gly Ile Gln Glu Ile Glu Phe Glu
35 40 45
Tyr Pro Val Gln Leu Gln Asp Leu Glu Gln Glu Lys Ile Val Tyr Phe
50 55 60
Cys Thr Arg Met Ala Thr Ala Ile Thr Thr Leu Phe Ser Asp Pro Val
65 70 75 80
Leu Glu Ile Ser Asp Leu Gly Val Gln Arg Phe Leu Val Tyr Gln Arg
85 90 95
Trp Leu Ala Leu Ile Phe Ala Ser Ser Pro Phe Val Asn Ala Asp His
100 105 110
Ile Leu Gln Thr Tyr Asn Arg Glu Pro Asn Arg Lys Asn Ser Leu Glu
115 120 125
Ile His Leu Asp Ser Ser Lys Ser Ser Leu Ile Lys Phe Cys Ile Leu
130 135 140
Tyr Leu Pro Glu Ser Asn Val Asn Leu Asn Leu Asp Val Met Trp Asn
145 150 155 160
Ile Ser Pro Glu Leu Cys Ala Ser Leu Cys Phe Ala Leu Gln Ser Pro
165 170 175
Arg Phe Ile Gly Thr Ser Thr Ala Phe Asn Lys Arg Ala Thr Ile Leu
180 185 190
Gln Trp Phe Pro Arg His Leu Asp Gln Leu Lys Asn Leu Asn Asn Ile
195 200 205
Pro Ser Ala Ile Ser His Asp Val Tyr Met His Cys Ser Tyr Asp Thr
210 215 220
Ser Val Asn Lys His Asp Val Lys Arg Ala Leu Asn His Val Ile Arg
225 230 235 240
Arg His Ile Glu Ser Glu Tyr Gly Trp Lys Asp Arg Tyr Val Ala His
245 250 255
Ile Gly Tyr Arg Asn Asn Lys Pro Val Met Val Val Leu Leu Glu His
260 265 270
Phe His Ser Ala His Ser Ile Tyr Arg Thr His Ser Thr Ser Met Ile
275 280 285
Ala Ala Arg Glu His Phe Tyr Leu Ile Gly Leu Gly Ser Pro Ser Val
290 295 300
Asp Gln Ala Gly Gln Glu Val Phe Asp Glu Phe His Leu Val Ala Gly
305 310 315 320
Asp Asn Met Lys Gln Lys Leu Glu Phe Ile Arg Ser Val Cys Glu Ser
325 330 335
Asn Gly Ala Ala Ile Phe Tyr Met Pro Ser Ile Gly Met Asp Met Thr
340 345 350
Thr Ile Phe Ala Ser Asn Thr Arg Leu Ala Pro Ile Gln Ala Ile Ala
355 360 365
Leu Gly His Pro Ala Thr Thr His Ser Asp Phe Ile Glu Tyr Val Ile
370 375 380
Val Glu Asp Asp Tyr Val Gly Ser Glu Ala Cys Phe Ser Glu Thr Leu
385 390 395 400
Leu Arg Leu Pro Lys Asp Ala Leu Pro Tyr Val Pro Ser Ala Leu Ala
405 410 415
Pro Glu Lys Val Asp Tyr Leu Leu Arg Glu Asn Pro Glu Val Val Asn
420 425 430
Ile Gly Ile Ala Ser Thr Thr Met Lys Leu Asn Pro Tyr Phe Leu Glu
435 440 445
Ala Leu Lys Ala Ile Arg Asp Arg Ala Lys Val Lys Val His Phe His
450 455 460
Phe Ala Leu Gly Gln Ser Asn Gly Ile Thr His Pro Tyr Val Glu Arg
465 470 475 480
Phe Ile Lys Ser Tyr Leu Gly Asp Ser Ala Thr Ala His Pro His Ser
485 490 495
Pro Tyr His Gln Tyr Leu Arg Ile Leu His Asn Cys Asp Met Met Val
500 505 510
Asn Pro Phe Pro Phe Gly Asn Thr Asn Gly Ile Ile Asp Met Val Thr
515 520 525
Leu Gly Leu Val Gly Val Cys Lys Thr Gly Ala Glu Val His Glu His
530 535 540
Ile Asp Glu Gly Leu Phe Lys Arg Leu Gly Leu Pro Glu Trp Leu Ile
545 550 555 560
Ala Asn Thr Val Asp Glu Tyr Val Glu Arg Ala Val Arg Leu Ala Glu
565 570 575
Asn His Gln Glu Arg Leu Glu Leu Arg Arg Tyr Ile Ile Glu Asn Asn
580 585 590
Gly Leu Asn Thr Leu Phe Thr Gly Asp Pro Arg Pro Met Gly Gln Val
595 600 605
Phe Leu Glu Lys Leu Asn Ala Phe Leu Lys Glu Asn
610 615 620
<210> 2
<211> 1863
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 野生型ApNGT
<400> 2
atggaaaacg aaaataaacc gaatgtagct aattttgaag cggcggttgc ggttaaagat 60
tatgaaaaag cttgctccga attactttta attttgagtc agttagacag taactttggt 120
ggtattcagg agattgagtt tgaatatccg gtgcagcttc aggatttaga acaagaaaaa 180
atagtttatt tttgtacgcg tatggcaacg gcgattacta cgttgttttc cgatcctgtc 240
ttagaaatct ccgatttagg cgttcagaga tttttggttt atcaacgttg gttagcgtta 300
atctttgcca gttcaccgtt tgtgaatgcg gatcatatat tacaaacata taacagagag 360
ccgaatcgta agaatagttt agagattcat ttagattctt caaaatcgtc attaattaaa 420
ttctgtatcc tgtatttacc ggaatctaac gtaaatttga atctggatgt aatgtggaat 480
atttcacctg aattatgcgc ttctttatgt tttgctttgc aatcgcctcg ttttatcggt 540
acatcaactg cgtttaataa acgagcgacc attttgcaat ggtttccacg acatttggat 600
caacttaaaa acctgaataa tattcctagt gccatttcgc atgacgtata tatgcattgt 660
agttatgata cgtcagtaaa taaacatgat gtgaaaaggg cgttaaatca tgttattcgt 720
cgccatatcg aaagtgaata cggttggaaa gatcgatatg tcgctcatat cggttatcgt 780
aataataaac cggttatggt cgtattactg gaacatttcc attcggccca ttctatttac 840
cgtacgcatt ccacatctat gattgcggcg cgtgaacatt tctatttaat cggtttaggt 900
agtccgtcgg ttgatcaagc gggtcaagag gtttttgatg agttccactt ggttgccggc 960
gataatatga agcagaagtt agaatttatc cgctcagttt gtgagagcaa cggtgccgca 1020
atattttata tgccgagtat cggtatggat atgacgacga ttttcgcaag taatacgcgc 1080
cttgctccga tacaagcgat cgcattgggg catccggcaa caacacattc ggacttcatt 1140
gaatatgtga ttgtggaaga cgattatgtc ggctcggaag cgtgttttag tgaaacatta 1200
ttgcgcttac cgaaagacgc attaccttat gttccgtcag cattagcacc tgagaaggtg 1260
gattatttat tacgtgaaaa tccggaagtg gtaaatatcg gtatagcttc aaccacgatg 1320
aagctaaatc cgtatttctt agaagcgtta aaagcgattc gtgatcgtgc caaagtgaaa 1380
gtgcatttcc attttgcatt ggggcaatca aacggtatta ctcacccgta tgtagaacgc 1440
tttattaaat cttatttagg tgattcggcc actgcgcacc ctcattctcc ttatcatcaa 1500
tatctccgta ttttgcataa ttgcgatatg atggtaaacc cgttcccatt cgggaatacg 1560
aacggaatta tcgatatggt cactttaggc ttagttggtg tgtgtaagac aggagccgaa 1620
gttcatgagc atattgatga agggctgttt aaacgtttag gcttacccga gtggctgata 1680
gcaaatacgg tagatgaata tgttgaacgg gcggttcgct tagcggaaaa tcatcaggag 1740
cgtttagagt tacgtcgata tattattgaa aataacggat tgaacacatt gtttaccggg 1800
gatcctagac cgatgggaca agtattttta gaaaaattaa atgcgttcct aaaagaaaat 1860
taa 1863
<210> 3
<211> 1863
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子优化的ApNGT
<400> 3
atggagaacg agaataagcc taatgttgca aactttgagg cggcagttgc tgtcaaagac 60
tacgagaagg cttgctccga gctgttgctg atcttgtctc agctggatag caactttggc 120
ggtattcaag aaatcgagtt cgagtacccg gttcaactcc aggacctcga acaagagaaa 180
attgtatact tctgcacccg catggcgacc gcgatcacga ccttgttttc cgaccctgtt 240
ctggagatca gcgacctggg tgttcagcgt ttcctggttt accaacgttg gctcgcattg 300
atctttgcat cgtccccgtt tgttaacgcg gatcatattc tgcaaaccta taaccgcgaa 360
ccgaaccgta aaaactcttt ggaaatccat ctggactcta gcaaatccag cctcatcaaa 420
ttttgcattt tatacttgcc ggagtccaac gtcaacctga acttggacgt gatgtggaac 480
attagcccgg agttgtgcgc cagcctgtgc ttcgcactgc agtcgccgcg cttcatcggc 540
acctctaccg cgttcaacaa gcgtgcgact attttacaat ggtttccacg tcacctggac 600
cagctgaaaa atttgaacaa cattccgagc gcgatttccc acgacgtcta tatgcattgc 660
tcttacgaca cctccgtgaa caagcatgat gtcaaacgtg cgctgaacca tgtgattcgc 720
cgtcatatcg agtccgaata cggctggaaa gaccgttacg tggcgcacat cggctaccgt 780
aacaacaagc cggtgatggt tgttctgctg gagcactttc actctgcaca ctccatctat 840
cgtacccact cgacctccat gattgcggcc cgcgagcact tttacctgat cggtttgggt 900
agcccgagcg ttgatcaagc gggccaagag gtttttgacg agtttcatct cgttgcgggt 960
gataatatga agcagaagct ggagttcatt cgttcggtgt gcgagtctaa cggtgccgcc 1020
atcttctaca tgccgtccat tggcatggat atgaccacca tcttcgcttc gaatactcgc 1080
cttgcgccta tccaggcgat cgcactgggc caccctgcca ccacccacag cgactttatc 1140
gagtacgtca tcgttgagga cgattacgtg ggctccgagg catgctttag cgaaacgttg 1200
ctgagactgc cgaaggacgc gctgccgtat gtcccgtccg ccttggcccc ggagaaagtt 1260
gattatcttt tgcgtgagaa tccagaggtc gttaatattg gcattgcgag caccaccatg 1320
aagctgaacc cttatttctt ggaagcgctg aaggcgatcc gtgatcgtgc taaagtcaaa 1380
gttcacttcc attttgcgct gggccaaagc aacggtatta cccatccata cgttgagcgt 1440
ttcattaagt cctacctggg tgatagcgcg accgctcacc cacattcccc gtatcaccaa 1500
tacttgcgca tcttgcataa ttgcgacatg atggttaacc cgttcccgtt tggtaacacg 1560
aatggcatca ttgatatggt gaccctcggt ctggttggtg tttgcaaaac cggtgcagag 1620
gtccacgaac acatcgacga gggcttgttt aagcgtctgg gcttgccgga atggctgatt 1680
gccaacaccg ttgacgaata tgtggagcgt gcggtgcgtt tggcggaaaa ccaccaggaa 1740
cgcttggagc tgcgccgcta tattatcgag aataatggct tgaatacgct gtttaccggt 1800
gacccgcgtc cgatgggtca ggtttttctg gaaaaattga acgctttctt gaaggagaac 1860
taa 1863
<210> 4
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自scAtaC的胰蛋白酶肽 (图3)
<400> 4
Gly Asn Leu Ser Thr Ala Ala Asp Val Thr Asp Lys
1 5 10
<210> 5
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Glyco-Tag-GFP
<400> 5
Lys Thr Ser Ala His Ala Thr Ala Ser Gly Ala His Ala Thr Ala Gly
1 5 10 15
Ser Ala Asn Ala Thr Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
20 25 30
<210> 6
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Glyco-Loop-GFP
<400> 6
Leu Ser Gly Ser Gly Ala Asn Ala Thr Ala Thr Gly Ser Gly Leu
1 5 10 15
<210> 7
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰蛋白酶肽
<400> 7
Asp Gly Pro Val Leu Ser Gly Ser Gly Ala Asn Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Ser Gly Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Val Leu Ser
20 25 30
Lys

Claims (72)

1.宿主细胞，其包含(i)编码包含N-糖基化共有序列的目标蛋白的核酸；(ii)编码将葡萄糖添加至存在于所述N-糖基化共有序列中的氨基酸残基的N-糖基转移酶(NGT)的核酸，和(iii)编码催化向所述葡萄糖添加单糖的糖基转移酶的核酸。
2.根据权利要求1所述的宿主细胞，其中所述目标蛋白对所述宿主细胞是异源的。
3.根据权利要求1所述的宿主细胞，其中所述NGT对所述宿主细胞是异源的。
4.根据权利要求1所述的宿主细胞，其中催化向所述葡萄糖添加单糖的所述糖基转移酶对所述宿主细胞是异源的。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的宿主细胞，其中所述NGT是胸膜肺炎放线杆菌的NGT、嗜血菌属的种的NGT、曼海姆氏菌的种的NGT、巴氏杆菌的种的NGT或耶尔森氏菌属的种的NGT。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的宿主细胞，其中催化向所述葡萄糖添加单糖的所述糖基转移酶是半乳糖基转移酶。
7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其中所述半乳糖基转移酶是脑膜炎奈氏球菌的LgtB、淋病奈氏球菌的LgtB、脑膜炎奈氏球菌的LgtE、空肠弯曲菌的CgtB、大肠杆菌的WaaX、幽门螺杆菌的HP0826或真核β4Gal-T1。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的宿主细胞，还包含编码涎酸转移酶的核酸。
9.根据权利要求8所述的宿主细胞，其中所述涎酸转移酶将一个或多个唾液酸残基添加至所述半乳糖。
10.根据权利要求8或9所述的宿主细胞，其中所述涎酸转移酶对所述宿主细胞是异源的。
11.根据权利要求8-10中任一项所述的宿主细胞，其中所述涎酸转移酶是空肠弯曲菌的CstII、空肠弯曲菌的CstI、脑膜炎奈氏球菌的Lst或淋病奈氏球菌的Lst。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的宿主细胞，还包含编码多聚涎酸转移酶(polyST)的核酸。
13.根据权利要求12所述的宿主细胞，其中所述polyST合成聚唾液酸。
14.根据权利要求13所述的宿主细胞，其中所述聚唾液酸包含至少10个、至少25个、至少50个、至少75个或至少100个唾液酸残基。
15.根据权利要求12-14中任一项所述的宿主细胞，其中所述polyST对所述宿主细胞是异源的。
16.根据权利要求12-15中任一项所述的宿主细胞，其中所述polyST是脑膜炎奈氏球菌、大肠杆菌K1、溶血曼海姆氏菌或Moraxella nonliquifacien的polyST或其同源物。
17.根据权利要求16所述的宿主细胞，其中所述polyST是脑膜炎奈氏球菌血清群B的polyST或其同源物。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的宿主细胞，还包含编码CMP-Neu5Ac合成酶的核酸。
19.根据权利要求18所述的宿主细胞，其中所述CMP-Neu5Ac合成酶对所述宿主细胞是异源的。
20.根据权利要求18或19所述的宿主细胞，其中所述CMP-Neu5Ac合成酶是脑膜炎奈氏球菌的SynB。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是原核宿主细胞。
22.根据权利要求21所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。
23.根据权利要求21所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是埃希氏菌属的种、志贺氏菌属的种、克雷伯氏菌属的种、黄单胞菌属的种、沙门氏菌属的种、耶尔森氏菌属的种、乳球菌属的种、乳杆菌属的种、假单胞菌属的种、棒状杆菌的种、链霉菌属的种、链球菌属的种、葡萄球菌属的种、芽孢杆菌属的种和梭状芽胞杆菌的种。
24.根据权利要求1-20中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是真核宿主细胞。
25.根据权利要求24所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞、动质体目细胞或哺乳动物细胞。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的宿主细胞，其中所述目标蛋白是细菌蛋白。
27.根据权利要求1-25中任一项所述的宿主细胞，其中所述目标蛋白是真核蛋白。
28.根据权利要求1-27中任一项所述的宿主细胞，其中所述目标蛋白是治疗性蛋白。
29.根据权利要求28所述的宿主细胞，其中所述治疗性蛋白是酶、细胞因子、激素、生长因子、抑制剂蛋白、蛋白质受体、结合蛋白质受体的配体或抗体。
30.根据权利要求29所述的宿主细胞，其中所述酶或抑制剂是因子VII、因子VIII、因子IX、凝血因子X、因子XIII、因子VIIa、抗凝血酶III(AT-III)、蛋白质C、组织凝血酶原激活剂(tPA)和tPA变体、尿激酶、水蛭素、链激酶、葡糖脑苷脂酶、阿葡糖苷酶-α、拉罗尼酶(α-L-艾杜糖醛酸酶)，艾杜硫酶(艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶)、加硫酶、阿加糖酶-β(人α-半乳糖苷酶A)、肉毒毒素、胶原酶、人DNA酶-I、玻璃酸酶、木瓜蛋白酶、L-天冬酰胺酶、尿酸酶(尿酸氧化酶)、谷氨酸羧肽酶(谷卡匹酶)、α1蛋白酶抑制剂(α1抗胰蛋白酶)、乳糖酶、胰酶(脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶)或腺苷脱氨酶。
31.根据权利要求29所述的宿主细胞，其中所述细胞因子是干扰素-α(INF-α)、干扰素-β(INF-β)、干扰素-γ(INF-γ)、白细胞介素-2(IL2)、嵌合白喉毒素-IL-2(地尼白介素-毒素连接物)、白介素-1(IL1)、IL1B、IL3、IL4、IL11、IL21、IL22、IL1受体拮抗剂(阿那白滞素)或肿瘤坏死因子α(TNF-α)。
32.根据权利要求29所述的宿主细胞，其中所述抗体是阿达木单抗(Humira)和类克(英利昔单抗)；ReoPro(阿昔单抗)；Rituxan(利妥昔单抗)；Simulect(巴利昔单抗)；Synagis(帕利珠单抗)；赫塞汀(曲妥珠单抗)；麦罗塔(吉妥珠单抗奥唑米星)；Campath(阿仑珠单抗)；Zevalin(替伊莫单抗替坦)；Xolair(奥马珠单抗)；Bexxar(托西莫单抗-I-131)；爱必妥(西妥昔单抗)；安维汀(贝伐单抗)；Tysabri(那他珠单抗)；Actemra(托珠单抗)；Vectibix(帕尼单抗)；Lucentis(兰尼单抗)；Soliris(依库珠单抗)；Cimzia(聚乙二醇结合赛妥珠单抗)；Simponi(戈利木单抗)；Ilaris(卡那津单抗)；Stelara(优特克单抗)；Arzerra(奥法木单抗)；Prolia(地诺单抗)；Numax(莫维珠单抗)；ABThrax(瑞西巴库单抗)；Benlysta(贝利木单抗)；Yervoy(普利木单抗)；Adcetris(贝伦妥单抗)；Perjeta(帕妥珠单抗)；Kadcyla(曲妥珠单抗-美坦新偶联物)；或Gazyva(奥比妥珠单抗)。
33.根据权利要求29所述的宿主细胞，其中所述激素或生长因子是胰岛素、普兰林肽、生长激素(GH)、胰岛素样生长因子(IGF1)、人甲状旁腺激素、降钙素、高血糖素-样肽-1激动剂(GLP-1)、高血糖素、生长激素-释放激素(GHRH)、胰泌素、促甲状腺激素(TSH)、人骨塑型蛋白2(hBMP2)、人骨塑型蛋白7(hBMP7)、促性腺激素释放激素(GnRH)、角化细胞生长因子(KGF)、血小板源性生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子7(FGF7)、成纤维细胞生长因子20(FGF20)、成纤维细胞生长因子21(FGF21)、表皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、神经营养蛋白-3、促生育素(FSH)、人绒毛膜促性腺激素(HCG)、促黄体素-α、促红细胞生成素、粒性白细胞集落刺激因子(G-CSF)或粒性白细胞-巨噬细胞集落-刺激因子(GM-CSF)。
34.根据权利要求1-33中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞不包含寡糖转移酶(OST)。
35.用于产生包含在存在于N-糖基化共有序列中的氨基酸残基处组装的葡萄糖的糖基化目标蛋白的方法；其中所述葡萄糖连接至单糖，所述方法包括(i)在适合于蛋白质产生的条件下培育根据权利要求1-34中任一项所述的宿主细胞和(ii)分离所述目标蛋白。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述糖基化目标蛋白是N-糖基化的。
37.用于产生唾液酸化的目标蛋白的方法，其包括(i)在适合于蛋白质产生的条件下培养根据权利要求8-36中任一项所述的宿主细胞和(ii)分离所述唾液酸化的目标蛋白。
38.用于产生多聚唾液酸化的目标蛋白的方法，其包括(i)在适合于蛋白质产生的条件下培养根据权利要求12-36中任一项所述的宿主细胞和(ii)分离所述多聚唾液酸化的目标蛋白。
39.根据权利要求37或38所述的方法，其中在添加有Neu5Ac的培养基中培养所述宿主细胞。
40.包含通过根据权利要求37-39中任一项所述的方法产生的蛋白的组合物，其中所述组合物中所述至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的所述蛋白是唾液酸化的或多聚唾液酸化的。
41.通过根据权利要求35-39中任一项所述的方法产生的蛋白，其中存在于所述蛋白中的至少80％、85％、90％、95％或99％的所述N-糖基化共有序列包含连接的葡萄糖。
42.通过根据权利要求35-39中任一项所述的方法产生的蛋白，其中存在于所述蛋白中的至少80％、85％、90％、95％或99％的所述N-糖基化共有序列包含相同的连接的多糖。
43.包含通过根据权利要求35-39中任一项所述的方法产生的蛋白的组合物，其中所述组合物中至少80％、85％、90％、95％或99％的所述蛋白已通过所述NGT N-糖基化。
44.根据权利要求43所述的组合物，其中在存在于所述组合物中的每种蛋白质中存在的至少80％、85％、90％、95％或99％的所述N-糖基化共有序列包含连接的葡萄糖。
45.根据权利要求43或44所述的组合物，其中在存在于所述组合物中的每种蛋白质中存在的至少80％、85％、90％、95％或99％的所述N-糖基化共有序列包含相同的连接的多糖。
46.包含N-糖基化共有序列的N-糖基化蛋白；其中葡萄糖连接至存在于所述N-糖基化共有序列中的氨基酸残基，所述蛋白质通过以下方法产生：
(i)在适合于蛋白质产生的条件下培养宿主细胞，其中所述宿主细胞包含(a)编码包含N-糖基化共有序列的目标蛋白的核酸；(b)编码将葡萄糖添加至存在于所述N-糖基化共有序列中的氨基酸残基的N-糖基转移酶(NGT)的核酸，和(c)编码催化向所述葡萄糖添加单糖的糖基转移酶的核酸；和
(ii)分离通过所述宿主细胞产生的N-糖基化蛋白。
47.根据权利要求46所述的N-糖基化蛋白，其中所述蛋白质包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少10个或至少20个所述N-糖基化共有序列。
48.根据权利要求47所述的N-糖基化蛋白，其中至少80％、85％、90％、95％或99％的所述N-糖基化共有序列包含与存在于所述N-糖基化共有序列中的Asn残基连接的葡萄糖。
49.根据权利要求47或48所述的N-糖基化蛋白，其中存在于所述蛋白质中的至少80％、85％、90％、95％或99％的所述N-糖基化共有序列包含相同的连接的多糖。
50.包含根据权利要求41、42或46-49中任一项所述的蛋白质的药物组合物。
51.根据权利要求37-39中任一项所述的方法，其中相对于处于其非糖基化状态的所述目标蛋白，所产生的目标蛋白具有改善的药代动力学。
52.根据权利要求40、43-45或50中任一项所述的组合物，其中相对于处于其非糖基化状态的所述目标蛋白，所述组合物中的所述目标蛋白具有改善的药代动力学。
53.根据权利要求41、42或46-49中任一项所述的蛋白质，其中相对于处于其非糖基化状态的所述目标蛋白，所述目标蛋白具有改善的药代动力学。
54.治疗对其有需要的对象中疾病或病症的方法，其包括施用根据权利要求40、43-45、50或52中任一项所述的组合物。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述疾病或病症是由所述目标蛋白的缺陷形式在所述对象中的存在，所述目标蛋白在所述对象中的不存在、所述目标蛋白在所述对象中表达减弱、通过所述目标蛋白结合的受体或通过所述目标蛋白结合的配体所引起的。
56.根据权利要求54或55所述的方法，其中所述对象是人。
57.包含根据权利要求1-34中任一项所述的宿主细胞的试剂盒。
58.包含根据权利要求40、43-45或50中任一项所述的组合物的试剂盒。
59.包含根据权利要求41、42或46-49中任一项所述的蛋白质的试剂盒。
60.根据权利要求1-59中任一项所述的宿主细胞、方法、蛋白质、组合物或试剂盒，其中所述N-糖基化共有序列是天门冬酰胺(Asn)-X-丝氨酸(Ser)/苏氨酸(Thr)，其中X可以是除脯氨酸(Pro)之外的任何氨基酸。
61.根据权利要求1-59中任一项所述的宿主细胞、方法、蛋白质、组合物或试剂盒，其中所述N-糖基化共有序列是Y-X-Z，其中Y可以是天门冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)或丝氨酸(Ser)，X可以是除Pro之外的任何氨基酸，并且Z可以是任何氨基酸。
62.根据权利要求61所述的宿主细胞、方法、蛋白质、组合物或试剂盒，其中Y是Asn。
63.根据权利要求61所述的宿主细胞、方法、蛋白质、组合物或试剂盒，其中Y是Gln。
64.根据权利要求61所述的宿主细胞、方法、蛋白质、组合物或试剂盒，其中Y是Ser。
65.根据权利要求61-64中任一项所述的宿主细胞、方法、蛋白质、组合物或试剂盒，其中Z是Ser、Thr、甘氨酸(Gly)、缬氨酸(Val)、丙氨酸(Ala)或天冬氨酸(Asp)。
66.用于在宿主细胞中产生糖基化重组目标蛋白的方法，其中所述方法不包含在所述细胞中使用寡糖转移酶(OST)或化学偶联。
67.用于在宿主细胞中产生糖基化重组目标蛋白的方法，其中所述方法包含在所述细胞中培养目标蛋白和N-糖基转移酶(NGT)。
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述目标蛋白包含至少一种末端糖基化标签。
69.根据权利要求67所述的方法，其中所述目标蛋白包含至少一种包埋的糖基化标签。
70.根据权利要求67所述的方法，其中所述目标蛋白包含至少一种末端糖基化标签和至少一种包埋的糖基化标签。
71.根据权利要求68或70所述的方法，其中所述末端糖基化标签包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少10个或至少20个N-糖基化共有序列。
72.根据权利要求69或70所述的方法，其中所述包埋的糖基化标签包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少10个或至少20个N-糖基化共有序列。
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