JP2023542104A - 抗体のＦａｂシアリル化 - Google Patents
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Abstract
本開示は、Ｆａｂシアリル化、及びいくつかの態様では、非フコシル化Ｆｃと組み合わせたＦａｂシアリル化を有するモノクローナル抗体（例えば、抗ＴＮＦα抗体）を提供する。そのような抗体は、改善された免疫原性プロファイル及び関連する利点を有する。そのようなグリカン修飾は、現在の治療を改善し、患者にとってより良好な生活の質を可能にするであろう。したがって、そのようなモノクローナル抗体は、様々な疾患を治療及び予防するために有用である。【選択図】なし
Description
本出願は、２０２０年９月１４日に出願された、米国仮出願第６３／０７８，２１８号の優先権を主張し、その全体は、参照によって本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、参照によってその全体で配列表のコンピュータ可読フォーマット（ＣＲＦ）をＡＳＣＩＩテキストフォーマットで組み込む。配列表テキストファイルは、「１４１９７－０１３－２２８＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５」と題され、２０２１年９月１０日に作成され、サイズは１１，６３２バイトである。
本出願は、参照によってその全体で配列表のコンピュータ可読フォーマット（ＣＲＦ）をＡＳＣＩＩテキストフォーマットで組み込む。配列表テキストファイルは、「１４１９７－０１３－２２８＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５」と題され、２０２１年９月１０日に作成され、サイズは１１，６３２バイトである。
本発明は、概して、抗体のＦａｂ領域のシアリル化を有する抗体、及びいくつかの態様では、非フコシル化Ｆｃと組み合わせたＦａｂシアリル化に関する。
バイオ医薬品で治療された患者のかなりの割合は、治療に有害であり得る薬物に対する望ましくない免疫反応を起こす。抗薬物抗体（ＡＤＡ）の開発は、現在の生物学的療法の持続的有効性における最大の課題の１つである。モノクローナル抗体は、市販されている生物学的療法の大部分を占める。標的結合に加えて、抗体はまた、免疫細胞上の受容体と相互作用し、それによって免疫調節に寄与する。これらのエフェクター機能の調節は、抗体のＦｃ部分上の保存されたＮ結合グリカンのセットによって部分的に指示される。
追加的に、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の文脈では、抗ＴＮＦαに対するＡＤＡの形態での望ましくない免疫反応のために、患者の最大３８％が治療応答を喪失する（Ｖｅｒｍｅｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅｒａｐ Ａｄｖ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，２０１８；１１：１７５６２８３Ｘ１７７５０３５５，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ２０１８ Ｊａｎ ２１，ｄｏｉ：１０．１１７７／１７５６２８３Ｘ１７７５０３５５）。ＡＤＡ応答の低減は、患者のケア及び生活の質を明らかに改善するであろう。
本明細書で提供される組成物及び方法は、ＩＢＤなどの抗ＴＮＦαで治療される様々な疾患に罹患している患者の満たされていない医療上の必要性に対処し、関連する利点を提供する。
本開示は、抗体のＦａｂ領域のシアリル化を有するモノクローナル抗体を提供する。したがって、いくつかの実施形態では、そのような抗体は、ヒト血清中に見られる抗体またはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株によって産生されるモノクローナル抗体などの、対照抗体と比較して、モノクローナル抗体のＦａｂ領域により多量のシアル酸を有する。本開示はまた、抗体のＦｃ領域のシアリル化を有するモノクローナル抗体を提供する。したがって、いくつかの実施形態では、そのような抗体は、ヒト血清中に見られる抗体またはＣＨＯ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体などの、対照抗体と比較して、モノクローナル抗体のＦａｂ領域により多量のシアル酸及び／またはＦｃ領域により多量のシアル酸を有する。
本開示はまた、抗体のＦｃ領域に非フコシル化グリカンを有するモノクローナル抗体を提供する。したがって、いくつかの実施形態では、そのような抗体は、ヒト血清中に見られる抗体またはＣＨＯ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体などの、対照抗体と比較して、モノクローナル抗体のＦａｂ領域により多量のシアル酸及び／またはＦｃ領域により多量の非フコシル化グリカンを有する。
本開示はまた、抗体のＦｃ領域にＧ０グリカンを有するモノクローナル抗体を提供する。したがって、いくつかの実施形態では、そのような抗体は、ヒト血清中に見られる抗体またはＣＨＯ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体などの、対照抗体と比較して、モノクローナル抗体のＦａｂ領域により多量のシアル酸及び／またはＦｃ領域により多量のＧ０グリカンを有する。
本明細書で提供されるモノクローナル抗体はまた、グリコシル化のための部位を提供するように操作された抗体（例えば、既知の抗体のバリアント）であり得る。したがって、いくつかの実施形態では、そのような抗体は、モノクローナル抗体の重鎖及び／または軽鎖の可変ドメインに１つ以上の点変異でシアリル化グリカン及び／またはモノクローナル抗体の重鎖の可変ドメインのフレームワーク領域にＮ－グリコシル化部位をもたらす１つ以上の挿入もしくは変異されたアミノ酸でシアリル化グリカンを有し、一方、そのような抗体は、それらの抗原に結合するそれらの能力を保持する。
本開示はまた、本明細書において、そのようなモノクローナル抗体の産生のための宿主細胞、及びそのようなモノクローナル抗体を作製する方法を提供する。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書において、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｔａｒｅｎｔｏｌａｅなどの、リーシュマニア宿主細胞が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書において、リーシュマニア宿主細胞を培養し、モノクローナル抗体を単離することによって本明細書で提供されるモノクローナル抗体を作製する方法が提供される。
本開示はまた、疾患を治療または予防するために本明細書で提供されるモノクローナル抗体を使用する薬学的組成物及び方法を提供する。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書において、本明細書に記載されるモノクローナル抗体及び薬学的に許容される担体を有する薬学的組成物が提供される。また本明細書において、いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体の単一剤形が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書において、患者に、本明細書に記載されるモノクローナル抗体または本明細書に記載される薬学的組成物を投与することを含む、患者において疾患を治療または予防する方法が提供される。本明細書に記載される方法を使用して治療または予防することができる疾患は、炎症性腸疾患、例えば、クローン病、小児クローン病、潰瘍性大腸炎、顕微鏡的大腸炎、憩室症関連大腸炎、膠原線維性大腸炎、リンパ球性大腸炎、もしくはベーチェット病、または他の炎症性疾患、例えば、リウマチ性関節炎、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、慢性乾癬、化膿性汗腺炎、成人ぶどう膜炎、小児ぶどう膜炎、尋常性乾癬、もしくは若年性特発性関節炎を含む。
本明細書において、対照抗体（例えば、アダリムマブ）と比較して改善された機能性を有するモノクローナル抗体（例えば、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体）である。本明細書に例示されるように、アダリムマブタンパク質配列は、抗体のＦａｂ領域におけるＮ－グリコシル化部位の導入によって操作され、ＡＤＡ応答を最小限に抑えるか、またはさらには防止し、それによって持続的な治療応答を増加させる操作されたグリコシル化プロファイルをもたらす。Ｎ－グリカン部位をカスタマイズすることによって、本明細書に記載される操作されたアダリムマブバリアントは、１）一次Ｔ細胞に対するＭ２マクロファージ及びＡＤＣＣの誘導を通して増加した一次治療応答を提供することが予想されるＩｇＧ１の重鎖の保存されたＮ２９７で非フコシル化Ｆｃ Ｎ－グリカン、及び／または２）免疫応答の減衰に関連してＡＤＡの低減をもたらすシアル酸結合受容体と係合することが予想されるＦａｂグリコサイトで二分枝シアル化グリカン（「Ｇ２Ｓ２」）を有する。
理論によって縛られることなく、本明細書に記載される抗ＴＮＦα抗体（例えば、アダリムマブ）のＦａｂドメインにおける末端シアリル化グリカンは、ＩＢＤ及び関連療法におけるＡＤＡ発生を低減することが予想される。また、ＩｇＧ１の重鎖の保存されたＮ２９７での非フコシル化Ｎ－グリカンは、一次Ｔ細胞に対するＭ２マクロファージ及びＡＤＣＣの誘導を通して増加した一次治療応答を提供することが予想される。ＨＣもしくはＬＣのいずれかまたはその組み合わせ上の、Ｆａｂドメインのフレームワーク領域（ＦＲ）に導入されたグリコサイトでのＮ－グリカン上の曝露されたシアル酸はまた、望ましくない免疫応答の減衰に関連するシアル酸結合受容体と係合することが予想される。また、アダリムマブのＦａｂドメインにおける曝露されたシアル酸を有するいくつかのグリコサイトは、抗炎症及び抗免疫原性効果をさらに増強するであろう。
追加的に、現在、組換えモノクローナル抗体に対する効率的かつカスタマイズされたグリコシル化の可能性は限られている。本明細書に記載されるＣＧＰ発現及び糖鎖工学は、ＩｇＧ１のＦａｂドメイン上に位置する曝露されたＮ－グリコサイト上の増強したエフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣ）のための完全非フコシル化Ｆｃグリカン及び高度アルファ２，６シアリル化グリカンの生成を可能にする。Ｆｃ－非フコシル化及び高Ｆａｂシアリル化の組み合わせは、本明細書に例示されるように、ＩＢＤ治療における患者ケアを改善することを可能にする、前例のない作用様式（ＭｏＡ）の組み合わせを可能にする。
「抗原結合性フラグメント」または「Ｆａｂ」という用語は、抗体（例えば、モノクローナル抗体）の領域に関して使用される場合、標的抗原に結合し、重鎖及び軽鎖の各々の１つの定常ドメイン及び１つの可変ドメインを含む抗体の領域を指す。
「結晶性フラグメント」または「Ｆｃ」という用語は、抗体（例えば、モノクローナル抗体）の領域に関して使用される場合、細胞表面受容体（Ｆｃ受容体）及び補体系のタンパク質と相互作用する抗体の領域を指し、これは、ＩｇＧフォーマット形式では２つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ２及びＣＤ３）で構成され、ＩｇＭ及びＩｇＥフォーマットでは３つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ４）で構成される。
「約」という用語は、数値と併せて使用される場合、参照される数値の±１、±５、または±１０％以内の任意の数値を指す。
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、動物（例えば、鳥類、爬虫類、及び哺乳動物）を指す。別の実施形態では、対象は、非霊長類（例えば、ラクダ、ロバ、シマウマ、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ラット、及びマウス）及び霊長類（例えば、サル、チンパンジー、及びヒト）を含む哺乳動物である。いくつかの実施形態では、対象は、非ヒト動物である。いくつかの実施形態では、対象は、家畜またはペット（例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ロバ、またはニワトリ）である。特定の実施形態では、対象は、ヒトである。「対象」及び「患者」という用語は、本明細書において交換可能に使用され得る。
「α［数字］」、「α［数字］，［数字］」、「β［数字］」、または「β［数字］，［数字］」という略語は、炭水化物残基を別の基に結合する共有結合であるグリコシド結合（ｂｏｎｄ）またはグリコシド結合（ｌｉｎｋａｇｅ）を指す。α－グリコシド結合は、両方の炭素が同じ立体化学を有するときに形成されるが、β－グリコシド結合は、２つの炭素が異なる立体化学を有するときに発生する。
本明細書で使用される場合、大文字の薬物名、例えば、ＨＵＭＩＲＡ、ＡＭＪＥＶＩＴＡ、ＣＹＬＴＥＺＯ、ＲＥＭＩＣＡＤＥ、ＳＩＭＰＯＮＩ、ＣＩＭＺＩＡ、及びＥＮＢＲＥＬは、商標下で販売されるブランド名薬物中の抗体及びその任意のバイオシミラー中の抗体を表す。例えば、ＨＵＭＩＲＡは、ＨＵＭＩＲＡの商標下で販売される薬物中の抗体アダリムマブ及びその任意のバイオシミラー中の抗体を表す。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」という用語は、動物における、及びより具体的にはヒトにおける使用について連邦もしくは州政府の規制機関によって承認されているか、または米国薬局方もしくは他の一般的に認識されている薬局方において列挙されていることを意味する。
薬学的に許容される担体の文脈において本明細書で使用される「担体」という用語は、薬学的組成物がそれとともに投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。生理食塩水ならびに水性デキストロース及びグリセロール溶液はまた、液体担体として、特に注射可能な溶液に使用することができる。好適な賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどを含む。好適な薬学的担体の例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。
いくつかの実施形態では、本明細書において、ヒト血清中に見られる抗体またはＣＨＯ細胞株によって産生される対照モノクローナル抗体と比較して、モノクローナル抗体のＦａｂ領域により多量のシアル酸を含む、モノクローナル抗体が提供される。
いくつかの実施形態では、本明細書において、ヒト血清中に見られる抗体またはＣＨＯ細胞株によって産生される対照モノクローナル抗体と比較して、モノクローナル抗体のＦａｂ領域により多量のシアル酸及び／またはＦｃ領域により多量のシアル酸を含む、モノクローナル抗体が提供される。
いくつかの実施形態では、本明細書において、ヒト血清中に見られる抗体またはＣＨＯ細胞株によって産生される対照モノクローナル抗体と比較して、モノクローナル抗体のＦａｂ領域により多量のシアル酸及び／またはＦｃ領域により多量の非フコシル化グリカンを含む、モノクローナル抗体が提供される。
いくつかの実施形態では、本明細書において、ヒト血清中に見られる抗体またはＣＨＯ細胞株によって産生される対照モノクローナル抗体と比較して、モノクローナル抗体のＦａｂ領域により多量のシアル酸及び／またはＦｃ領域により多量のＧ０グリカンを含む、モノクローナル抗体が提供される。
いくつかの実施形態では、本明細書において、モノクローナル抗体の重鎖及び／または軽鎖の可変ドメインに１つ以上の点変異でシアリル化グリカンを含む、モノクローナル抗体が提供される。
いくつかの実施形態では、本明細書において、モノクローナル抗体の重鎖の可変ドメインのフレームワーク領域にＮ－グリコシル化部位をもたらす１つ以上の挿入または変異されたアミノ酸でシアリル化グリカンを含み、モノクローナル抗体が、その抗原に結合するその能力を保持する、モノクローナル抗体が提供される。
いくつかの実施形態では、本明細書において、モノクローナル抗体の軽鎖の可変ドメインのフレームワーク領域にＮ－グリコシル化部位をもたらす１つ以上の挿入または変異されたアミノ酸でシアリル化グリカンを含み、モノクローナル抗体が、その抗原に結合するその能力を保持する、モノクローナル抗体が提供される。
いくつかの実施形態では、本明細書において、重鎖の可変ドメインのフレームワーク領域にＮ－グリコシル化部位をもたらす１つ以上の挿入または変異されたアミノ酸でのシアリル化グリカン、及び軽鎖の可変ドメイン上のフレームワーク領域にＮ－グリコシル化部位をもたらす１つ以上の挿入または変異されたアミノ酸でのシアリル化グリカンを含み、モノクローナル抗体が、その抗原に結合するその能力を保持する、モノクローナル抗体が提供される。
いくつかの実施形態では、本明細書において、モノクローナル抗体のＦｃ領域で非フコシル化グリカン構造を含むモノクローナル抗体が提供される。
いくつかの実施形態では、本明細書において、保存されたＦｃグリコサイトＮ２９７で非フコシル化グリカン構造を含むモノクローナル抗体が提供される。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるモノクローナル抗体は、抗ＴＮＦα抗体である。当該技術分野で知られている任意の抗ＴＮＦα抗体は、本明細書に記載されるモノクローナル抗体として使用することができる。特定の実施形態では、抗ＴＮＦα抗体は、ホモサピエンスの抗ＴＮＦα抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＴＮＦα抗体は、全長抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｓｃｆｖ、またはｓｄＡｂである。特定の実施形態では、抗ＴＮＦα抗体は、ホモサピエンスの全長抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｓｃｆｖ、またはｓｄＡｂである。他の実施形態では、抗ＴＮＦα抗体は、アダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ）、インフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ）、ゴリムマブ（ＳＩＭＰＯＮＩ）のアミノ酸配列、またはセルトリズマブペゴル（ＣＩＭＺＩＡ）などの抗体フォーマット、またはエタネルセプト（ＥＮＢＲＥＬ）などの循環受容体融合タンパク質を有するものを含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＮＦα抗体は、ＡＭＪＥＶＩＴＡ、ＣＹＬＴＥＺＯ、ＨＵＭＩＲＡ、またはそのバイオシミラーのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、アダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ）の全長抗体、Ｆａｂ、またはＦ（ａｂ’）２、インフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ）、及びゴリムマブ（ＳＩＭＰＯＮＩ）のアミノ酸配列、またはセルトリズマブペゴル（ＣＩＭＺＩＡ）などの抗体フォーマット、またはエタネルセプト（ＥＮＢＲＥＬ）、ＡＭＪＥＶＩＴＡ、ＣＹＬＴＥＺＯ、もしくはそのバイオシミラーなどの循環受容体融合タンパク質を有するものを含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＮＦα抗体は、全長抗体、Ｆａｂ、またはＦ（ａｂ’）２のアミノ酸配列、ＴＮＦαまたはＴＮＦα経路を標的とする任意の承認された薬物（例えば、ＴＮＦα受容体）を含む。
そのような抗ＴＮＦα抗体は、いくつかの実施形態では、アダリムマブのバリアントである。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書において、モノクローナル抗体の重鎖の可変ドメイン上にＮＨ８４でシアリル化グリカンを含む、モノクローナル抗体が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書において、モノクローナル抗体の軽鎖の可変ドメイン上にＮＬ８６でシアリル化グリカンを含む、モノクローナル抗体が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書において、モノクローナル抗体の重鎖の可変ドメイン上にＮＨ８４でシアリル化グリカン及び軽鎖の可変ドメイン上にＮＬ８６でシアリル化グリカンを含む、モノクローナル抗体が提供される。
いくつかの実施形態では、本明細書において、以下の構造のうちの１つ以上を含むモノクローナル抗体が提供され、
ダイヤは、シアル酸残基を表し、空白の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は、Ｎ－アセチルグルコサミン残基を表し、黒縞の丸は、マンノース残基を表し、Ａｓｎは、モノクローナル抗体の可変ドメインにおけるＮ結合グリコシル化コンセンサス配列のＡｓｎである。
いくつかの実施形態では、本明細書において、以下の構造のうちの１つ以上を含むモノクローナル抗体が提供され、
ダイヤは、シアル酸残基を表し、空白の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は、Ｎ－アセチルグルコサミン残基を表し、黒縞の丸は、マンノース残基を表し、Ａｓｎは、モノクローナル抗体の可変ドメインにおけるＮ結合グリコシル化コンセンサス配列のＡｓｎである。
いくつかの実施形態では、本明細書において、以下の構造のうちの１つ以上を含むモノクローナル抗体が提供され、
ダイヤは、シアル酸残基を表し、空白の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は、Ｎ－アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し、還元末端は、モノクローナル抗体におけるＮ結合グリコシル化コンセンサス配列のＡｓｎ上にある。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるモノクローナル抗体は、異なるグリコシル化プロファイルを有する同じ抗ＴＮＦα抗体のものよりも、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１２倍、１５倍、１８倍、２０倍、２５倍、または３０倍高い、抗体依存的細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）活性を有する抗ＴＮＦα抗体である。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるモノクローナル抗体は、異なるグリコシル化プロファイルを有する同じ抗ＴＮＦα抗体のものよりも、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１２倍、１５倍、１８倍、２０倍、２５倍、または３０倍高い、一次炎症標的細胞に対するＡＤＣＣ活性を有する、抗ＴＮＦα抗体である。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるモノクローナル抗体は、異なるグリコシル化プロファイルを有する同じ抗ＴＮＦα抗体のものよりも、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１２倍、１５倍、１８倍、２０倍、２５倍、または３０倍低い、低減した（より低い）免疫原性を有する抗ＴＮＦα抗体である。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるモノクローナル抗体は、異なるグリコシル化プロファイルを有する同じ抗ＴＮＦα抗体のものよりも、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１２倍、１５倍、１８倍、２０倍、２５倍、または３０倍高い、創傷治癒Ｍ２マクロファージ誘導活性を有する抗ＴＮＦ抗体である。
本明細書で提供されるモノクローナル抗体を生成する方法は、当該技術分野で周知である。本明細書で提供されるモノクローナル抗体を生成する例示的な方法は、国際特許出願公開第２０１７／０９３２９１、同第ＷＯ２０１９／００２５１２号、及び同第ＷＯ２０１９／２３４０２１号に記載され、これらは、参照によってそれらの全体が本明細書に組み込まれ、本明細書において例示され、これらのいずれか１つを使用して、本明細書で提供されるモノクローナル抗体を生成することができる。例えば、当業者は、既知のタンパク質（例えば、モノクローナル抗体）、及び新たに特定されたタンパク質（例えば、モノクローナル抗体）の核酸配列が、当該技術分野で既知の方法を使用して容易に推論され得ることを容易に理解し、よって、任意のモノクローナル抗体をコードする核酸を本明細書で提供される宿主細胞に（例えば、発現ベクター、例えば、プラスミド、例えば、相同組換えによる部位特異的組み込みを介して）導入することは、十分に当業者の能力の範囲内であろう。
いくつかの実施形態では、本明細書において、本明細書に記載されるモノクローナル抗体を含むリーシュマニア宿主細胞である。そのような宿主細胞は、いくつかの実施形態では、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｔａｒｅｎｔｏｌａｅである。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ａｅｔｈｉｏｐｉｃａ細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ａｅｔｈｉｏｐｉｃａ種複合体の一部である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ａｒｉｓｔｉｄｅｓｉ細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｅａｎｅｉ細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｏｎｏｖａｎｉ種複合体の一部である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｏｎｏｖａｎｉ細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｃｈａｇａｓｉ細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｉｎｆａｎｔｕｍ細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｈｅｒｔｉｇｉ細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ種複合体の一部である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｒｔｉｎｉｑｕｅｎｓｉｓ細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍｅｘｉｃａｎａ種複合体の一部である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍｅｘｉｃａｎａ細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｐｉｆａｎｏｉ細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｔｒｏｐｉｃａ種複合体の一部である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｔｒｏｐｉｃａ細胞である。
いくつかの実施形態では、本明細書において、本明細書に記載されるリーシュマニア宿主細胞を培養し、モノクローナル抗体を単離することによってモノクローナル抗体を作製するための方法が提供される。
いくつかの実施形態では、本明細書において、本明細書に記載される方法によって産生されるモノクローナル抗体が提供される。
リーシュマニア宿主細胞を産生し、そのような宿主細胞を使用してモノクローナル抗体を産生する方法は、当該技術分野で周知である。例示的な方法は、国際特許出願公開第２０１７／０９３２９１号、同第ＷＯ２０１９／００２５１２号、及び同第ＷＯ２０１９／２３４０２１号に記載され、これらは、参照によってそれらの全体が本明細書に組み込まれ、本明細書において例示され、これらのいずれか１つを使用して、リーシュマニア宿主細胞を生成し、本明細書で提供されるモノクローナル抗体を産生することができる。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載される宿主細胞は、全て５μｇ／ｍｌのヘミンを含有する、ブレインハートインフュージョン、トリプチケースソイブロス、または酵母エキスのような富栄養培地中での増殖が挙げられるが、これに限定されない、当該技術分野で既知の標準的な培養技法のいずれかを使用して培養される。追加的に、インキュベーションは、２～３日にわたって静置または振盪培養物として暗所において２６℃で行うことができる。いくつかの実施形態では、宿主細胞の培養物は、適切な選択的薬剤を含有する。
いくつかの実施形態では、本明細書において、本明細書に記載されるモノクローナル抗体及び薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物が提供される。
いくつかの実施形態では、本明細書において、患者に、本明細書に記載されるモノクローナル抗体または本明細書に記載される薬学的組成物を投与することを含む、患者において疾患を治療または予防する方法が提供される。いくつかの実施形態では、疾患は、炎症性腸疾患、例えば、クローン病、小児クローン病、潰瘍性大腸炎、顕微鏡的大腸炎、憩室症関連大腸炎、膠原線維性大腸炎、リンパ球性大腸炎、またはベーチェット病である。いくつかの実施形態では、疾患は、炎症性疾患、例えば、リウマチ性関節炎、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、慢性乾癬、化膿性汗腺炎、成人ぶどう膜炎、小児ぶどう膜炎、尋常性乾癬、及び若年性特発性関節炎から選択される炎症性疾患である。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される疾患を治療または予防する方法は、本明細書に記載されるモノクローナル抗体または本明細書に記載される薬学的組成物の静脈内注射、腹腔内注射、皮下注射、経皮注射、または筋肉内注射を含む投与ステップを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される疾患を治療または予防する方法は、異なるグリコシル化プロファイルを有する同じ抗体と比較して同じ効果を達成するために、より低い用量及び／またはより低い投与頻度を必要とし、及び／または長期間（少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは少なくとも１２ヶ月、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは少なくとも１０年）にわたって投与することができ、及び／または患者においてモノクローナル抗体に対する免疫応答を誘発しない。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される薬学的組成物は、単一剤形、例えば、本明細書に記載されるモノクローナル抗体の単一剤形で投与することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される疾患を治療または予防する方法は、コルチコステロイド、シクロホスファミド、タクロリムス、アザチオプリン、シクロスポリン、またはトファシチニブなどの、より低い免疫抑制剤共投薬を必要とする。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるモノクローナル抗体の好適な用量は、治療効果をもたらすのに有効な最低用量に対応する量である。例えば、抗ＴＮＦα抗体の有効量は、有害なＴＮＦα活性である疾患に罹患している対象におけるＴＮＦα活性を阻害する量であり得る。
いくつかの実施形態では、患者に投与される本明細書に記載されるモノクローナル抗体の量は、本明細書に記載されるモノクローナル抗体のものとは異なるグリコシル化プロファイルを有する同じモノクローナル抗体の医薬製品のラベルに列挙される量以下であり得る。例えば、患者に投与される本明細書において産生されるアダリムマブの量は、ＨＵＭＩＲＡ医薬製品のラベルに列挙される量以下であり得る。いくつかの実施形態では、患者に投与される本明細書に記載されるモノクローナル抗体の投与の頻度は、本明細書に記載されるモノクローナル抗体のものとは異なるグリコシル化プロファイルを有する同じモノクローナル抗体の医薬製品のラベルに列挙される頻度以下であり得る。例えば、患者に投与される本明細書において産生されるアダリムマブの投与の頻度は、ＨＵＭＩＲＡ医薬製品のラベルに列挙される頻度以下であり得る。
いくつかの実施形態では、ある期間にわたって患者に投与される本明細書に記載されるモノクローナル抗体の蓄積量は、本明細書に記載されるモノクローナル抗体のものとは異なるグリコシル化プロファイルを有する同じモノクローナル抗体の医薬製品のラベルに示される蓄積量以下であり得る。いくつかの実施形態では、低減した蓄積量は、低減した頻度で低減した用量で投与され得る。いくつかの実施形態では、低減した蓄積量は、低減した頻度で標識中の用量と同じまたはそれよりも高い１つ以上の用量で投与され得る。いくつかの実施形態では、低減した蓄積量は、標識中の頻度と同じまたはそれよりも高い頻度で１つ以上の低減した用量で投与され得る。いくつかの実施形態では、低減した蓄積量は、治療または予防において同じレベルの効果を達成する医薬製品についての期間よりも短い期間にわたって投与され得る。
いくつかの実施形態では、患者に投与される単回用量中の本明細書に記載されるモノクローナル抗体の量は、約１～１５０ｍｇ、約５～１４５ｍｇ、約１０～１４０ｍｇ、約１５～１３５ｍｇ、約２０～１３０ｍｇ、約２５～１２５ｍｇ、約３０～１２０ｍｇ、約３５～１１５ｍｇ、約４０～１１０ｍｇ、約４５～１０５ｍｇ、約５０～１００ｍｇ、約５５～９５ｍｇ、約６０～９０ｍｇ、約６５～５ｍｇ、約７０～８０ｍｇ、または約７５ｍｇであり得る。いくつかの実施形態では、患者に投与される単回用量中の本明細書に記載されるモノクローナル抗体の量は、約５～約８０ｍｇであり得る。いくつかの実施形態では、患者に投与される単回用量中の本明細書に記載されるモノクローナル抗体の量は、約２５～約５０ｍｇであり得る。いくつかの実施形態では、患者に投与される単回用量中の本明細書に記載されるモノクローナル抗体の量は、約１５ｍｇ～約３５ｍｇであり得る。
いくつかの実施形態では、患者に投与される単回用量中の本明細書に記載されるモノクローナル抗体の量は、４０ｍｇ以下、例えば、４０ｍｇ、３５ｍｇ、３０ｍｇ、２５ｍｇ、２０ｍｇ、１８ｍｇ、１５ｍｇ、１２ｍｇ、１０ｍｇ、７ｍｇ、５ｍｇ、及び２ｍｇであり得る。いくつかの実施形態では、患者に投与される単回用量中の本明細書に記載されるモノクローナル抗体の量は、８０ｍｇ以下、例えば、８０ｍｇ、７５ｍｇ、７０ｍｇ、６５ｍｇ、６０ｍｇ、５５ｍｇ、５０ｍｇ、４５ｍｇ、４０ｍｇ、３５ｍｇ、３０ｍｇ、２０ｍｇ、１５ｍｇ、１０ｍｇ、５ｍｇ、及び２ｍｇであり得る。いくつかの実施形態では、患者に投与される単回用量中の本明細書に記載されるモノクローナル抗体の量は、１６０ｍｇ以下、例えば、１５０ｍｇ、１４０ｍｇ、１３０ｍｇ、１２０ｍｇ、１１０ｍｇ、１００ｍｇ、９０ｍｇ、８０ｍｇ、７５ｍｇ、７０ｍｇ、６５ｍｇ、６０ｍｇ、５５ｍｇ、５０ｍｇ、４５ｍｇ、４０ｍｇ、３５ｍｇ、３０ｍｇ、２０ｍｇ、１５ｍｇ、１０ｍｇ、５ｍｇ、及び２ｍｇであり得る。いくつかの実施形態では、患者に投与される単回用量中の本明細書に記載されるモノクローナル抗体の量は、１６０ｍｇ以上、例えば、１７０ｍｇ、１８０ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、及び３００ｍｇであり得る。
いくつかの実施形態では、本開示のモノクローナル抗体は、１週間おき、すなわち、１４日毎である頻度で投与することができる。いくつかの実施形態では、本開示のモノクローナル抗体は、１４日毎、例えば、半月毎、２１日毎、毎月、８週間毎、隔月、１２週間毎、３ヶ月毎、４ヶ月毎、５ヶ月毎、または６ヶ月毎よりも低い頻度で投与することができる。いくつかの実施形態では、本開示のモノクローナル抗体は、１週間おき、すなわち、１４日毎例えば、１４日毎、１０日毎、７日毎、５日毎、１日おき、または毎日と同じまたはそれよりも高い頻度で投与することができる。
いくつかの実施形態では、本開示のモノクローナル抗体の投与は、以下の用量、例えば、以下の維持用量よりも高い誘導用量を含むことができる。いくつかの実施形態では、本開示のモノクローナル抗体の投与は、誘導用量よりも低くかつ以下の維持用量よりも高い第２の用量を含むことができる。いくつかの実施形態では、本開示のモノクローナル抗体の投与は、治療期間全体を通して全ての用量で同じ量のモノクローナル抗体を含むことができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される疾患を治療または予防する方法は、疾患が、リウマチ性関節炎、乾癬性関節炎、または強直性脊椎炎であることを含み、方法は、１週間おき以下の投与頻度で４０ｍｇ以下の本明細書に記載される抗ＴＮＦα抗体を患者に投与することを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される疾患を治療または予防する方法は、疾患が、クローン病または潰瘍性大腸炎であることを含み、方法は、患者に、１日目に１６０ｍｇ以下の本明細書に記載される抗ＴＮＦα抗体、１５日目に８０ｍｇ以下の本明細書に記載される抗ＴＮＦα抗体、及び２９日目に開始する１週間おき以下の投与頻度で４０ｍｇ以下の本明細書に記載される抗ＴＮＦα抗体を投与することを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される疾患を治療または予防する方法は、疾患が、小児クローン病であることを含み、方法は、患者に：１７ｋｇ～４０ｋｇの体重を有する患者において１日目に８０ｍｇ以下の本明細書に記載される抗ＴＮＦα抗体、１５日目に４０ｍｇ以下の本明細書に記載される抗ＴＮＦα抗体、及び２９日目に開始する１週間おき以下の投与頻度で２０ｍｇ以下の本明細書に記載される抗ＴＮＦα抗体、または４０ｋｇ以上の体重を有する患者において１日目に１６０ｍｇ以下の本明細書に記載される抗ＴＮＦα抗体、１５日目に８０ｍｇ以下の本明細書に記載される抗ＴＮＦα抗体、及び２９日目に開始する１週間おき以下の投与頻度で４０ｍｇ以下の本明細書に記載される抗ＴＮＦα抗体を投与することを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される疾患を治療または予防する方法は、疾患が、若年性特発性関節炎または小児ぶどう膜炎であることを含み、方法は、患者に：１０ｋｇ～１５ｋｇの体重を有する患者において１週間おき以下の投与頻度で１０ｍｇ以下の本明細書に記載される抗ＴＮＦα抗体、１５ｋｇ～３０ｋｇの体重を有する患者において１週間おき以下の投与頻度で２０ｍｇ以下の本明細書に記載される抗ＴＮＦα抗体、または３０ｋｇ以上の体重を有する患者において１週間おき以下の投与頻度で４０ｍｇ以下の本明細書に記載される抗ＴＮＦα抗体を投与することを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される疾患を治療または予防する方法は、疾患が、尋常性乾癬または成人ぶどう膜炎であることを含み、方法は、患者に１日目に８０ｍｇ以下、及び８日目に開始する１週間おき以下の投与頻度で４０ｍｇ以下の本明細書に記載される抗ＴＮＦα抗体を投与することを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される疾患を治療または予防する方法は、疾患が、化膿性汗腺炎であることを含み、方法は、患者に：３０ｋｇ～６０ｋｇの体重を有する１２歳以上である青年期患者において１日目に８０ｍｇ以下の本明細書に記載される抗ＴＮＦα抗体、及び８日目に開始する１週間おき以下の投与頻度で４０ｍｇ以下の本明細書に記載される抗ＴＮＦα抗体、または６０ｋｇ以上の体重を有する１２歳以上である青年期患者もしくは成人患者において１日目に１６０ｍｇ以下の本明細書に記載される抗ＴＮＦα抗体、及び１５日目に８０ｍｇ以下の本明細書に記載される抗ＴＮＦα抗体、及び２９日目に開始する１週間おき以下の投与頻度で４０ｍｇ以下の本明細書に記載される抗ＴＮＦα抗体を投与することを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書において、本明細書に記載されるモノクローナル抗体の単一剤形が提供される。いくつかの実施形態では、単一剤形は、約２ｍｇ、約５ｍｇ、約７ｍｇ、約１０ｍｇ、約１２ｍｇ、約１５ｍｇ、約１８ｍｇ、約２０ｍｇ、約２５ｍｇ、約３０ｍｇ、約３５ｍｇ、約４０ｍｇ、約４５ｍｇ、約５０ｍｇ、約５５ｍｇ、約６０ｍｇ、約６５ｍｇ、約７０ｍｇ、約７５ｍｇ、または約８０ｍｇの本明細書に記載されるモノクローナル抗体（例えば、抗ＴＮＦα抗体）からなる。そのような単一剤形は、いくつかの実施形態では、予め充填されたシリンジ、注射ペン、バイアル、錠剤、またはカプセルであり得る。追加的に、そのような単一剤形は、本明細書に記載されるモノクローナル抗体（例えば、抗ＴＮＦα抗体）を凍結乾燥形態でまたは液体溶液中で含むことができる。
本発明の様々な実施形態の活性に実質的に影響を及ぼさない修飾はまた、本明細書で提供される本発明の定義内で提供されることが理解される。したがって、以下の例は、本発明を例示することを意図しているが、本発明を限定するものではない。
実施例Ｉ
糖鎖工学的に操作されたアダリムマブバリアントの産生
糖鎖工学的に操作されたアダリムマブバリアント（Ａ－８４ＳまたはＡ８４８６Ｓ）を、標準プロトコルを使用して異なるＣＧＰ細胞株を使用して生成した。ＣＧＰ細胞株は、参照によって本明細書に組み込まれる、国際特許出願公開第ＷＯ２０１９／００２５１２号及び同第ＷＯ２０１９／２３４０２１号に記載されるものなどの糖鎖工学要素を含有する。細胞株Ｓｔ１９２２４及びＳｔ１９２２６は、Ｐｆｒ遺伝子座におけるｄｒＭＧＡＴ１、ｄｒＭＧＡＴ２、ｒｎＭＧＡＴ１、ｈｓＢ４ＧａｌＴ１、ＮｅｕＣ、ｃｇＮａｌ、ＮｅｕＢ、ｈｓＳＴ６、ｒｎＭＧＡＴ２、ｈｓＭＧＡＴ１、ｈｓＭＧＡＴ２、及びＮｅｕＡ、ｓｓｕリボソームＤＮＡ遺伝子座におけるｍｍＳＴ６、ＣＭＡＳ、及びＣＳＴの特にオープンなリーディングフレームを含有し、Ｓｔ１９２２４におけるアダリムマブＫ８４Ｎ（重鎖）またはＳｔ１９２２６におけるＫ８４Ｎ（重鎖）＿Ｄ８６Ｎ（軽鎖）のいずれかを含有する。細胞株Ｓｔ１９７８８及びＳ１９７９０はともに、Ｐｆｒ遺伝子座においてｄｒＭＧＡＴ１、ｄｒＭＧＡＴ２、ｒｎＭＧＡＴ１、ｈｓＢ４ＧａｌＴ１、ＮｅｕＣ、ＣｇＮａｌ、ＮｅｕＢ、ｈｓＳＴ６、ＮｅｕＡ、ｒｎＭＧＡＴ２、ｈｓＭＧＡＴ１、ｈｓＭＧＡＴ２、及びｈｓＢ４ＧａｌＴ１の、第２のＰｆｒ遺伝子座においてｈｓＢ４ＧＡＬＴ１、ｒｎＭＧＡＴ２、ｇｊＭＧＡＴ１、及びａｇＭＧＡＴ１、ならびにｓｓｕ－ＰｏｌＩリボソームＤＮＡ遺伝子座においてｓｆＧＮＴＩ、ｄｒＭＧＡＴ１Ｂ、ｒｎＭＧＡＴ２、ｍｍＳＴ６、ＣＭＡＳ、ｈｓＣＳＴ、ｒｎＭＧＡＴ１、ｈｓＭＧＡＴ１、ｇｊＭＧＡＴ１、及びａｇＭＧＡＴ１のオープンなリーディングフレームを含有する。Ｓｔ１９７８８は、アダリムマブＫ８４Ｎ（重鎖）をコードし、Ｓｔ１９７９０は、Ｋ８４Ｎ（重鎖）＿Ｄ８６Ｎ（軽鎖）をコードする。そのような糖鎖工学的に操作されたアダリムマブバリアントは、以下の実施例に記載されるように分析した。表１は、これらの糖鎖工学的に操作されたアダリムマブバリアントの品質管理パラメータを提供する。
糖鎖工学的に操作されたアダリムマブバリアントの産生
糖鎖工学的に操作されたアダリムマブバリアント（Ａ－８４ＳまたはＡ８４８６Ｓ）を、標準プロトコルを使用して異なるＣＧＰ細胞株を使用して生成した。ＣＧＰ細胞株は、参照によって本明細書に組み込まれる、国際特許出願公開第ＷＯ２０１９／００２５１２号及び同第ＷＯ２０１９／２３４０２１号に記載されるものなどの糖鎖工学要素を含有する。細胞株Ｓｔ１９２２４及びＳｔ１９２２６は、Ｐｆｒ遺伝子座におけるｄｒＭＧＡＴ１、ｄｒＭＧＡＴ２、ｒｎＭＧＡＴ１、ｈｓＢ４ＧａｌＴ１、ＮｅｕＣ、ｃｇＮａｌ、ＮｅｕＢ、ｈｓＳＴ６、ｒｎＭＧＡＴ２、ｈｓＭＧＡＴ１、ｈｓＭＧＡＴ２、及びＮｅｕＡ、ｓｓｕリボソームＤＮＡ遺伝子座におけるｍｍＳＴ６、ＣＭＡＳ、及びＣＳＴの特にオープンなリーディングフレームを含有し、Ｓｔ１９２２４におけるアダリムマブＫ８４Ｎ（重鎖）またはＳｔ１９２２６におけるＫ８４Ｎ（重鎖）＿Ｄ８６Ｎ（軽鎖）のいずれかを含有する。細胞株Ｓｔ１９７８８及びＳ１９７９０はともに、Ｐｆｒ遺伝子座においてｄｒＭＧＡＴ１、ｄｒＭＧＡＴ２、ｒｎＭＧＡＴ１、ｈｓＢ４ＧａｌＴ１、ＮｅｕＣ、ＣｇＮａｌ、ＮｅｕＢ、ｈｓＳＴ６、ＮｅｕＡ、ｒｎＭＧＡＴ２、ｈｓＭＧＡＴ１、ｈｓＭＧＡＴ２、及びｈｓＢ４ＧａｌＴ１の、第２のＰｆｒ遺伝子座においてｈｓＢ４ＧＡＬＴ１、ｒｎＭＧＡＴ２、ｇｊＭＧＡＴ１、及びａｇＭＧＡＴ１、ならびにｓｓｕ－ＰｏｌＩリボソームＤＮＡ遺伝子座においてｓｆＧＮＴＩ、ｄｒＭＧＡＴ１Ｂ、ｒｎＭＧＡＴ２、ｍｍＳＴ６、ＣＭＡＳ、ｈｓＣＳＴ、ｒｎＭＧＡＴ１、ｈｓＭＧＡＴ１、ｇｊＭＧＡＴ１、及びａｇＭＧＡＴ１のオープンなリーディングフレームを含有する。Ｓｔ１９７８８は、アダリムマブＫ８４Ｎ（重鎖）をコードし、Ｓｔ１９７９０は、Ｋ８４Ｎ（重鎖）＿Ｄ８６Ｎ（軽鎖）をコードする。そのような糖鎖工学的に操作されたアダリムマブバリアントは、以下の実施例に記載されるように分析した。表１は、これらの糖鎖工学的に操作されたアダリムマブバリアントの品質管理パラメータを提供する。
実施例ＩＩ
ＣＧＰ細胞株Ｓｔ１９７８８における発現後のＦａｂグリコシル化
アダリムマブＫ８４Ｎ（Ａ－８４Ｓ）を、プロテインＡ、ＣａｐｔｏＡｄｈｅｒｅ、及びＣａｐｔｏＳＰで細胞培養上清から精製し、ＰＢＳバッファーｐＨ６．４中で製剤化した。グリカン分析のために、モノクローナル抗体を、ＩｄｅＺでＦ（ａｂ’）２及びＦｃ／２（左パネル、概略図）に切断し、ＳＤＳ ＰＡＧＥ上で分離し、バンドを切除し、モノクローナル抗体からのＮ－グリカンの酵素放出を、ＰＮＧａｓｅ Ｆを使用して行った。放出後、グリカンをプロカインアミド（ＰＣ）で直接標識した。ＰＣ標識されたＮ－グリカンを、質量分析計に結合した蛍光検出でＨＩＬＩＣ－ＵＰＬＣ－ＭＳによって分析した。グリカンを、Ａｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ Ａｍｉｄｅカラムを使用して分離した。データ処理及び分析は、Ｕｎｉｆｉを使用して行った。グルコース単位を、プロカインアミド標識デキストランラダーの保持時間に割り当てた。グリカン構造を、そのｍ／ｚ値及びその保持時間に基づいて割り当てた。グリカン形態及び相対パーセンテージを、ピーク面積に基づいて計算した。図１に示されるように、アダリムマブＫ８４ＮのＦａｂグリコシル化部位のＮ－グリカンは、高存在量のアルファ２，６二分枝シアリル化及びＳｔ１９７８８における発現後のＦｃ部分に保存されたＮ－グリコース２９７のＮ－グリカンを示す。
ＣＧＰ細胞株Ｓｔ１９７８８における発現後のＦａｂグリコシル化
アダリムマブＫ８４Ｎ（Ａ－８４Ｓ）を、プロテインＡ、ＣａｐｔｏＡｄｈｅｒｅ、及びＣａｐｔｏＳＰで細胞培養上清から精製し、ＰＢＳバッファーｐＨ６．４中で製剤化した。グリカン分析のために、モノクローナル抗体を、ＩｄｅＺでＦ（ａｂ’）２及びＦｃ／２（左パネル、概略図）に切断し、ＳＤＳ ＰＡＧＥ上で分離し、バンドを切除し、モノクローナル抗体からのＮ－グリカンの酵素放出を、ＰＮＧａｓｅ Ｆを使用して行った。放出後、グリカンをプロカインアミド（ＰＣ）で直接標識した。ＰＣ標識されたＮ－グリカンを、質量分析計に結合した蛍光検出でＨＩＬＩＣ－ＵＰＬＣ－ＭＳによって分析した。グリカンを、Ａｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ Ａｍｉｄｅカラムを使用して分離した。データ処理及び分析は、Ｕｎｉｆｉを使用して行った。グルコース単位を、プロカインアミド標識デキストランラダーの保持時間に割り当てた。グリカン構造を、そのｍ／ｚ値及びその保持時間に基づいて割り当てた。グリカン形態及び相対パーセンテージを、ピーク面積に基づいて計算した。図１に示されるように、アダリムマブＫ８４ＮのＦａｂグリコシル化部位のＮ－グリカンは、高存在量のアルファ２，６二分枝シアリル化及びＳｔ１９７８８における発現後のＦｃ部分に保存されたＮ－グリコース２９７のＮ－グリカンを示す。
実施例ＩＩＩ
ＣＧＰ細胞株Ｓｔ１９７９０における発現後のＦａｂグリコシル化
アダリムマブＫ８４Ｎ－Ｄ８６Ｎ（Ａ－８４８６Ｓ）を、プロテインＡ、ＣａｐｔｏＡｄｈｅｒｅ、及びＣａｐｔｏＳＰで細胞培養上清から精製し、ＰＢＳバッファーｐＨ６．４中で製剤化した。グリカン分析のために、モノクローナル抗体を、ＩｄｅＺでＦ（ａｂ’）２及びＦｃ／２（左パネル、概略図）に切断し、ＳＤＳ ＰＡＧＥ上で分離し、バンドを切除し、モノクローナル抗体からのＮ－グリカンの酵素放出を、ＰＮＧａｓｅ Ｆを使用して行った。放出後、グリカンをプロカインアミド（ＰＣ）で直接標識した。ＰＣ標識されたＮ－グリカンを、質量分析計に結合した蛍光検出でＨＩＬＩＣ－ＵＰＬＣ－ＭＳによって分析した。グリカンを、Ａｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ Ａｍｉｄｅカラムを使用して分離した。データ処理及び分析は、Ｕｎｉｆｉを使用して行った。グルコース単位を、プロカインアミド標識デキストランラダーの保持時間に割り当てた。グリカン構造を、そのｍ／ｚ値及びその保持時間に基づいて割り当てた。グリカン形態及び相対パーセンテージを、ピーク面積に基づいて計算した。図２に示されるように、アダリムマブＫ８４Ｎ－Ｄ８６ＮのＦａｂグリコシル化部位のＮ－グリカンは、高存在量のアルファ２，６二分枝シアリル化、及びＳｔ１９７９０における発現後のＦｃ部分に保存されたＮ－グリコース２９７のＮ－グリカンを示す。
ＣＧＰ細胞株Ｓｔ１９７９０における発現後のＦａｂグリコシル化
アダリムマブＫ８４Ｎ－Ｄ８６Ｎ（Ａ－８４８６Ｓ）を、プロテインＡ、ＣａｐｔｏＡｄｈｅｒｅ、及びＣａｐｔｏＳＰで細胞培養上清から精製し、ＰＢＳバッファーｐＨ６．４中で製剤化した。グリカン分析のために、モノクローナル抗体を、ＩｄｅＺでＦ（ａｂ’）２及びＦｃ／２（左パネル、概略図）に切断し、ＳＤＳ ＰＡＧＥ上で分離し、バンドを切除し、モノクローナル抗体からのＮ－グリカンの酵素放出を、ＰＮＧａｓｅ Ｆを使用して行った。放出後、グリカンをプロカインアミド（ＰＣ）で直接標識した。ＰＣ標識されたＮ－グリカンを、質量分析計に結合した蛍光検出でＨＩＬＩＣ－ＵＰＬＣ－ＭＳによって分析した。グリカンを、Ａｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ Ａｍｉｄｅカラムを使用して分離した。データ処理及び分析は、Ｕｎｉｆｉを使用して行った。グルコース単位を、プロカインアミド標識デキストランラダーの保持時間に割り当てた。グリカン構造を、そのｍ／ｚ値及びその保持時間に基づいて割り当てた。グリカン形態及び相対パーセンテージを、ピーク面積に基づいて計算した。図２に示されるように、アダリムマブＫ８４Ｎ－Ｄ８６ＮのＦａｂグリコシル化部位のＮ－グリカンは、高存在量のアルファ２，６二分枝シアリル化、及びＳｔ１９７９０における発現後のＦｃ部分に保存されたＮ－グリコース２９７のＮ－グリカンを示す。
実施例ＩＶ
Ｎ－グリカン存在量
異なるＣＧＰ細胞株バックグラウンドにおいて発現した抗体上のＮ－グリカンの相対存在量を、標準プロトコルを使用して決定した。図３の上パネルは、Ｆａｂグリコサイト（それぞれ、Ａ－８４ＳまたはＡ－８４８６ＳからのＫ８４ＮまたはＫ８４Ｎ－Ｄ８６Ｎ）から放出されたグリコフォームの相対定量化を示す。図３の下パネルは、ＩｄｅＺ切断による分離後、保存されたＦｃグリコサイトを示す。命名法及びグリカンアノテーションは、表２に見られる。
Ｎ－グリカン存在量
異なるＣＧＰ細胞株バックグラウンドにおいて発現した抗体上のＮ－グリカンの相対存在量を、標準プロトコルを使用して決定した。図３の上パネルは、Ｆａｂグリコサイト（それぞれ、Ａ－８４ＳまたはＡ－８４８６ＳからのＫ８４ＮまたはＫ８４Ｎ－Ｄ８６Ｎ）から放出されたグリコフォームの相対定量化を示す。図３の下パネルは、ＩｄｅＺ切断による分離後、保存されたＦｃグリコサイトを示す。命名法及びグリカンアノテーションは、表２に見られる。
実施例Ｖ
Ｆａｂシアリル化グリカンアクセス及び認識
図４Ａ及び４Ｂに示されるように、Ｆａｂシアリル化グリカンは、Ｆｃシアリル化グリカンとは対照的に、ＳＮＡレクチンによってアクセス可能であり、認識される。ＥＬＩＳＡアッセイを、図４Ａに示されるように実施した。図４Ｂは、各条件の吸光度値の二重の測定値の平均±ＳＤを示す。図４Ｂ内では、以下を見ることができる：Ｆａｂは、コーティングされた抗体が、Ｆａｂ領域及びＦｃ（カノニカルＮ－２９７位）にＮ－グリカンを含有したことを示し、Ｆｃは、コーティングされた抗体が、Ｆｃ（カノニカルＮ－２９７位）のみにＮ－グリカンを含有したことを示し、Ａ－８４Ｓは、可変重鎖の８４位にシアリル化Ｎ－グリカンを有するアダリムマブバリアントを示し、Ａ－８６Ｓは、可変軽鎖の８６位にシアリル化Ｎ－グリカンを有するアダリムマブバリアントを示し、Ａ－８４８６Ｓは、可変軽鎖の８６位及び可変重鎖の８４位にシアリル化Ｎ－グリカンを有するアダリムマブバリアントを示し、Ａ－８４Ｇ２は、可変重鎖の８４位にガラクトシル化Ｎ－グリカンを有するアダリムマブバリアントを示し、Ｆｃ＿Ａ－Ｓは、Ｆｃ Ｎ－グリカン（Ｎ－２９７位）がシアリル化されるアダリムマブを示し、このバリアントは、Ｆａｂ Ｎ－グリカンを含有せず、Ｆｃ＿Ａ－Ｇ０は、Ｆｃ Ｎ－グリカン（Ｎ－２９７位）がＧ０であるアダリムマブを示し、このバリアントは、Ｆａｂ Ｎ－グリカンを含有しない。このデータは、Ｆａｂ部分におけるシアリル化Ｎ－グリカンを有するバリアントのみがＳＮＡレクチンによって認識されることを示す。
Ｆａｂシアリル化グリカンアクセス及び認識
図４Ａ及び４Ｂに示されるように、Ｆａｂシアリル化グリカンは、Ｆｃシアリル化グリカンとは対照的に、ＳＮＡレクチンによってアクセス可能であり、認識される。ＥＬＩＳＡアッセイを、図４Ａに示されるように実施した。図４Ｂは、各条件の吸光度値の二重の測定値の平均±ＳＤを示す。図４Ｂ内では、以下を見ることができる：Ｆａｂは、コーティングされた抗体が、Ｆａｂ領域及びＦｃ（カノニカルＮ－２９７位）にＮ－グリカンを含有したことを示し、Ｆｃは、コーティングされた抗体が、Ｆｃ（カノニカルＮ－２９７位）のみにＮ－グリカンを含有したことを示し、Ａ－８４Ｓは、可変重鎖の８４位にシアリル化Ｎ－グリカンを有するアダリムマブバリアントを示し、Ａ－８６Ｓは、可変軽鎖の８６位にシアリル化Ｎ－グリカンを有するアダリムマブバリアントを示し、Ａ－８４８６Ｓは、可変軽鎖の８６位及び可変重鎖の８４位にシアリル化Ｎ－グリカンを有するアダリムマブバリアントを示し、Ａ－８４Ｇ２は、可変重鎖の８４位にガラクトシル化Ｎ－グリカンを有するアダリムマブバリアントを示し、Ｆｃ＿Ａ－Ｓは、Ｆｃ Ｎ－グリカン（Ｎ－２９７位）がシアリル化されるアダリムマブを示し、このバリアントは、Ｆａｂ Ｎ－グリカンを含有せず、Ｆｃ＿Ａ－Ｇ０は、Ｆｃ Ｎ－グリカン（Ｎ－２９７位）がＧ０であるアダリムマブを示し、このバリアントは、Ｆａｂ Ｎ－グリカンを含有しない。このデータは、Ｆａｂ部分におけるシアリル化Ｎ－グリカンを有するバリアントのみがＳＮＡレクチンによって認識されることを示す。
Ｆａｂシアリル化Ｎ－グリカンのみがレクチンによって認識されるようにアクセス可能であるというこの観察は、Ｂリンパ球上に発現した主シアル酸結合レクチンであるＳｉｇｌｅｃ－２（ＣＤ２２）上で拡張された。ヒトＣＤ２２（ＣＨＯ－ｈＣＤ２２）（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１０）を安定して発現するＣＨＯ細胞及び親ＣＨＯ－Ｋ１細胞を、安定なグルタミン、１０％ＦＢＳ、及びペニシリン－ストレプトマイシン、ならびに０．５ｍｇ／ｍｌのハイグロマイシン（ＣＨＯ－ｈＣＤ２２のみ）で補足されたハムＦ１２培地中で増殖させた。細胞を、加湿されたインキュベーターにおいて３７℃、５％ＣＯ２で増殖させた。細胞を、結合実験の前に、非組織培養処理プレート上で増殖させた。細胞を、インキュベーターから取り出し、５ｍＭのＥＤＴＡを補足したリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄し、次いでＰＢＳ－５ｍＭのＥＤＴＡ及び激しいピペッティングで分離した。細胞を、１５０ｇで遠心分離し、次いでＰＢＳ中での再懸濁及び１５０ｇでの遠心分離によって２回洗浄した。細胞を、室温で１０分間Ｚｏｍｂｉｅ Ｇｒｅｅｎ色素で染色し、０．５％ＢＳＡで補足されたＰＢＳ中で１回洗浄した。細胞を、ＰＢＳ－０．５％ＢＳＡ－０．１％アジ化ナトリウム中に再懸濁した。５０μｌの最終体積中アッセイ点当たり約４×１０５個の細胞を使用した。抗体－ＴＮＦ免疫複合体（ＩＣ）を以下のように予め形成した：製造業者の指示に従って１ｍｇ／ｍｌで再構築されたヒトＴＮＦ－アルファ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ＡＦ－３００－０１Ａ）、及び抗体（Ｈｕｍｉｒａまたはアダリムマブグリコバリアント、１ｍｇ／ｍｌでのストック）を混合した。３μｌのＴＮＦストック＋１４μｌの抗体＋１０μｌの１倍ＰＢＳ ｐＨ７．４をピペッティングによって穏やかに混合し、室温で３０分間インキュベートした。溶液は、０．５ｍｇ／ｍｌのＩＣであると考えられた。ＩＣ溶液を次の３０分以内に染色のために使用した。抗体－ＴＮＦ ＩＣをＣＨＯ細胞上に１０μｇ／ｍｌの最終濃度まで添加し、氷上で４５分間インキュベートした。細胞を、８００μｌのＰＢＳ－０．５％ＢＳＡ－０．１％のアジ化ナトリウムで１回洗浄し、次いで、ＢＤ Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６フローサイトメーターでの分析前に、ＡＰＣ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体で染色した。データを、ＦＣＳ Ｅｘｐｒｅｓｓ ６（Ｄｅ Ｎｏｖｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して分析した。中央蛍光強度（ＭＦＩ）を決定し、特異的ＣＨＯ－ＣＤ２２染色強度をＭＦＩ ＣＨＯ－ｈＣＤ２２－ＭＦＩ ＣＨＯ－Ｋ１として計算した。
図１７は、Ｆｃフラグメントのみ（Ｆｃ＿Ａ－Ｓ）におけるシアリル化Ｎ－グリカンを有するバリアントではなく、Ａ－８４Ｓ及びＡ－８４８６Ｓバリアントのみが、ＣＤ２２への結合を示す、ＣＨＯ－ｈＣＤ２２細胞に特異的に結合することができることを示す。対照として、非シアリル化Ｆｃ Ｎ－グリカンを示すＨｕｍｉｒａも、ＣＨＯ－ＣＤ２２に結合しなかった。興味深いことに、Ａ－８４８６Ｓバリアントは、シアル酸負荷の半分を有するＡ－８４ＳバリアントよりもＣＤ２２への著しくより高い結合を示し、Ｆａｂ部分上に示されるシアル酸の量が、ＣＤ２２によるより良好な認識を駆動するために重要であることを示す。図１７内では、以下を見ることができる：グラフのＸ軸は、示される抗体の特異的ＣＨＯ－ＣＤ２２染色強度を示す。Ａ－８４Ｓは、可変重鎖の８４位にシアリル化Ｎ－グリカンを有するアダリムマブバリアントを示し、Ａ－８６Ｓは、可変軽鎖の８６位にシアリル化Ｎ－グリカンを有するアダリムマブバリアントを示し、Ａ－８４８６Ｓは、可変軽鎖の８６位及び可変重鎖の８４位にシアリル化Ｎ－グリカンを有するアダリムマブバリアントを示し、Ｆｃ＿Ａ－Ｓは、Ｆｃ Ｎ－グリカン（Ｎ－２９７位）がシアリル化されるアダリムマブを示し、このバリアントは、Ｆａｂ Ｎ－グリカンを含有しない。
ＣＤ２２は、Ｂリンパ球活性化を阻害し、Ｂリンパ球アポトーシスを駆動することが示されている重要なシアル酸特異的受容体である。したがって、これらのデータは、Ａ－８４８６ＳなどのアダリムマブのＦａｂシアリル化フォーマットが、Ｂリンパ球上でＣＤ２２と効率的に係合し、Ｂリンパ球活性化、特にＢ細胞受容体シグナル伝達に由来する活性化を調節するであろうという仮説を支持する。したがって、アダリムマブなどの薬物抗体に特異的なＢＣＲを保有するＢリンパ球は、ＣＤ２２がＡ－８４８６ＳなどのアダリムマブのＦａｂシアリル化バージョンによって共係合される場合、あまり活性化されないかまたはアポトーシスに入るであろう。これは、ＣＤ２２と係合しない親アダリムマブ抗体と比較して、Ａ－８４８６Ｓ抗体のより低い免疫原性をもたらすであろう。
実施例ＶＩ
Ｆａｂ－シアリル化対Ｆｃ－シアリル化の免疫原性
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、５ｍｇ／ｋｇのＨＵＭＩＲＡまたはＨＵＭＩＲＡのグリコシル化バリアントを静脈内注射した。抗アダリムマブ抗体を、標準的なＥＬＩＳＡ法を使用して動物の血清において示される日数で測定した。図５Ａ及び５Ｂのグラフは、個々の動物吸光度レベル、平均±９５％信頼区間を示す。図５Ａ及び５Ｂにおける星は、ダン補正を伴うノンパラメトリッククラスカル－ウォリス検定によって統計的有意性（ｐ＜０．０５）を示す。図５Ａは、Ｆｃフラグメントのみ（Ｆｃ－Ｓｉａ－Ａｄａ）におけるシアリル化Ｎ－グリカンを有するアダリムマブバリアントでの実験の結果を示す。図５Ｂは、可変重鎖（Ａ－８４Ｓ）の８４位にシアリル化Ｎ－グリカンを有するアダリムマブバリアントでの実験からの結果を示す。ＨＵＭＩＲＡは、アダリムマブである。このデータは、Ｆａｂ部分におけるシアリル化Ｎ－グリカンを有するアダリムマブバリアントＡ－８４Ｓが、アダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ）と比較して低減した免疫原性を示し、一方、Ｆｃ－シアリル化アダリムマブが、一貫して低減した免疫原性を示さないことを示す。
Ｆａｂ－シアリル化対Ｆｃ－シアリル化の免疫原性
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、５ｍｇ／ｋｇのＨＵＭＩＲＡまたはＨＵＭＩＲＡのグリコシル化バリアントを静脈内注射した。抗アダリムマブ抗体を、標準的なＥＬＩＳＡ法を使用して動物の血清において示される日数で測定した。図５Ａ及び５Ｂのグラフは、個々の動物吸光度レベル、平均±９５％信頼区間を示す。図５Ａ及び５Ｂにおける星は、ダン補正を伴うノンパラメトリッククラスカル－ウォリス検定によって統計的有意性（ｐ＜０．０５）を示す。図５Ａは、Ｆｃフラグメントのみ（Ｆｃ－Ｓｉａ－Ａｄａ）におけるシアリル化Ｎ－グリカンを有するアダリムマブバリアントでの実験の結果を示す。図５Ｂは、可変重鎖（Ａ－８４Ｓ）の８４位にシアリル化Ｎ－グリカンを有するアダリムマブバリアントでの実験からの結果を示す。ＨＵＭＩＲＡは、アダリムマブである。このデータは、Ｆａｂ部分におけるシアリル化Ｎ－グリカンを有するアダリムマブバリアントＡ－８４Ｓが、アダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ）と比較して低減した免疫原性を示し、一方、Ｆｃ－シアリル化アダリムマブが、一貫して低減した免疫原性を示さないことを示す。
実施例ＶＩＩ
Ｍ２マクロファージ誘導
混合リンパ球反応を、２人の異なるヒトドナーからのヒトＰＢＭＣを混合することによって誘導した。合計５つの異なるＭＬＲペアを実施した。抗体を０．２μｇ／ｍｌで培養物に添加した。ＭＬＲの７日後、試料を、ＣＤ１４、ＣＤ２０６、及びＣＤ１６３について染色し、フローサイトメーターで取得した。ＣＤ１４は、骨髄マーカーであり、ＣＤ２０６及びＣＤ１６３は、Ｍ２マクロファージ表現型のマーカーである。ＭＬＲ中のＭ２マクロファージの％を、生存細胞中のＣＤ１４＋ＣＤ２０６＋集団をゲーティングすることによって決定した。図６のグラフは、ＭＬＲ培養の終了時のＭ２マクロファージの％の四重の値±ＳＥＭの平均を示す。図６内では、以下を見ることができる：ＭＬＲは、抗体添加を含まない条件であり、ＩｇＧは、ＩｇＧ１対照抗体の添加であり、Ａ－８４Ｓは、可変重鎖の８４位にシアリル化Ｎ－グリカンを有するアダリムマブバリアントを示し、Ａ－８４８６Ｓは、可変軽鎖の８６位及び可変重鎖の８４位にシアリル化Ｎ－グリカンを有するアダリムマブバリアントを示す。このデータは、Ｆａｂ－シアリル化アダリムマブバリアントが、試験された５つのドナーペアのうちの３つにおいてＭ２マクロファージの形成が増加する傾向を示すことを示す。Ｍ２マクロファージは、ＩＢＤ患者における粘膜治癒において重要な機能を有する。
Ｍ２マクロファージ誘導
混合リンパ球反応を、２人の異なるヒトドナーからのヒトＰＢＭＣを混合することによって誘導した。合計５つの異なるＭＬＲペアを実施した。抗体を０．２μｇ／ｍｌで培養物に添加した。ＭＬＲの７日後、試料を、ＣＤ１４、ＣＤ２０６、及びＣＤ１６３について染色し、フローサイトメーターで取得した。ＣＤ１４は、骨髄マーカーであり、ＣＤ２０６及びＣＤ１６３は、Ｍ２マクロファージ表現型のマーカーである。ＭＬＲ中のＭ２マクロファージの％を、生存細胞中のＣＤ１４＋ＣＤ２０６＋集団をゲーティングすることによって決定した。図６のグラフは、ＭＬＲ培養の終了時のＭ２マクロファージの％の四重の値±ＳＥＭの平均を示す。図６内では、以下を見ることができる：ＭＬＲは、抗体添加を含まない条件であり、ＩｇＧは、ＩｇＧ１対照抗体の添加であり、Ａ－８４Ｓは、可変重鎖の８４位にシアリル化Ｎ－グリカンを有するアダリムマブバリアントを示し、Ａ－８４８６Ｓは、可変軽鎖の８６位及び可変重鎖の８４位にシアリル化Ｎ－グリカンを有するアダリムマブバリアントを示す。このデータは、Ｆａｂ－シアリル化アダリムマブバリアントが、試験された５つのドナーペアのうちの３つにおいてＭ２マクロファージの形成が増加する傾向を示すことを示す。Ｍ２マクロファージは、ＩＢＤ患者における粘膜治癒において重要な機能を有する。
実施例ＶＩＩＩ
抗体依存的細胞傷害性（ＡＤＣＣ）
１人のドナーからの精製されたヒトＮＫ細胞（Ｅ）を、切断不可能な膜ＴＮＦを発現するＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－ＤＧ４４／ｍＴＮＦ、Ｔ）と、５のＥ：Ｔ比で混合した。ＮＫ細胞の純度は、ＣＤ５６及びＣＤ３についてのフローサイトメトリー染色によって確認され、９０％を超えていた。ＮＫ及びＣＨＯ－ＤＧ４４／ｍＴＮＦ細胞を、抗体の示された用量応答で３７℃で６時間インキュベートした。標的細胞殺滅をＬＤＨ放出によって測定した。図７Ａのグラフは、示された条件についての用量応答殺滅曲線を示す。目標はアダリムマブグリコバリアント及びアダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ）を比較することであったため、ＨＵＭＩＲＡ条件は各プレートで実施した。殺滅のＥＣ５０値を、対数（アゴニスト）対応答、可変勾配（４パラメータ）非線形フィッティングを使用して、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアで計算した。ＨＵＭＩＲＡは、アダリムマブである。図７Ａ内では、以下を見ることができる：Ａ－８４Ｓは、可変重鎖の８４位にシアリル化Ｎ－グリカンを有するアダリムマブバリアントを示し、Ａ－８４８６Ｓは、可変軽鎖の８６位及び可変重鎖の８４位にシアリル化Ｎ－グリカンを有するアダリムマブバリアントを示し、Ａ－Ｇは、Ｆｃ Ｎ－グリカン（Ｎ－２９７位）がＧ０であるアダリムマブを示し、このバリアントは、Ｆａｂ Ｎ－グリカンを含有しない。図７Ｂのグラフは、各アダリムマブバリアントについてのＨＵＭＩＲＡ ＥＣ５０に対するＥＣ５０値の比を示す。このデータは、Ａ－８４Ｓ及びＡ－８４８６Ｓ Ｆａｂ－シアリル化アダリムマブバリアントが、Ｆｃのみにおける非フコシル化バリアントと同様に、ＨＵＭＩＲＡと比較して４～５倍増強したＡＤＣＣを示すことを示す。したがって、Ｆａｂシアリル化グリカンは、それらの非フコシル化Ｆｃ－グリカンによって駆動されるＡＤＣＣ活性を損なわない。
抗体依存的細胞傷害性（ＡＤＣＣ）
１人のドナーからの精製されたヒトＮＫ細胞（Ｅ）を、切断不可能な膜ＴＮＦを発現するＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－ＤＧ４４／ｍＴＮＦ、Ｔ）と、５のＥ：Ｔ比で混合した。ＮＫ細胞の純度は、ＣＤ５６及びＣＤ３についてのフローサイトメトリー染色によって確認され、９０％を超えていた。ＮＫ及びＣＨＯ－ＤＧ４４／ｍＴＮＦ細胞を、抗体の示された用量応答で３７℃で６時間インキュベートした。標的細胞殺滅をＬＤＨ放出によって測定した。図７Ａのグラフは、示された条件についての用量応答殺滅曲線を示す。目標はアダリムマブグリコバリアント及びアダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ）を比較することであったため、ＨＵＭＩＲＡ条件は各プレートで実施した。殺滅のＥＣ５０値を、対数（アゴニスト）対応答、可変勾配（４パラメータ）非線形フィッティングを使用して、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアで計算した。ＨＵＭＩＲＡは、アダリムマブである。図７Ａ内では、以下を見ることができる：Ａ－８４Ｓは、可変重鎖の８４位にシアリル化Ｎ－グリカンを有するアダリムマブバリアントを示し、Ａ－８４８６Ｓは、可変軽鎖の８６位及び可変重鎖の８４位にシアリル化Ｎ－グリカンを有するアダリムマブバリアントを示し、Ａ－Ｇは、Ｆｃ Ｎ－グリカン（Ｎ－２９７位）がＧ０であるアダリムマブを示し、このバリアントは、Ｆａｂ Ｎ－グリカンを含有しない。図７Ｂのグラフは、各アダリムマブバリアントについてのＨＵＭＩＲＡ ＥＣ５０に対するＥＣ５０値の比を示す。このデータは、Ａ－８４Ｓ及びＡ－８４８６Ｓ Ｆａｂ－シアリル化アダリムマブバリアントが、Ｆｃのみにおける非フコシル化バリアントと同様に、ＨＵＭＩＲＡと比較して４～５倍増強したＡＤＣＣを示すことを示す。したがって、Ｆａｂシアリル化グリカンは、それらの非フコシル化Ｆｃ－グリカンによって駆動されるＡＤＣＣ活性を損なわない。
別の実験では、２人の個々のヒトドナーからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、１０％ＦＢＳで補足されたＲＰＭＩ－１６４０中、１５０Ｕ／ｍｌのＩＬ－２の存在下、３７℃、５％ＣＯ２で約２０時間インキュベートした。次いで、２×１０６個のＰＢＭＣを各アッセイ点に分配し、アダリムマブの異なるグリコバリアント、またはアダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ）、及び脱顆粒ＮＫ細胞の検出のための抗ＣＤ１０７ａ抗体の存在下で、ＴｒａｎｓＡｃｔ ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（１：１００）及びＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）を添加することによって活性化した。試料を３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。試料を生存性色素ならびに抗ＣＤ５６、抗ＣＤ４、及び抗ＣＤ８で染色してＮＫ細胞を特定し、試料をフローサイトメトリーによって取得した。データを、ＦＣＳ Ｅｘｐｒｅｓｓ ６（Ｄｅ Ｎｏｖｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して分析した。脱顆粒ＮＫ細胞の割合を、生きた単細胞、リンパ球、及び最終的にはＮＫ細胞上でのゲーティングを通して決定した。試料間の比較を、オーバートンヒストグラム減算によって行った。ＮＫ細胞脱顆粒は、標的細胞のＮＫ細胞媒介性殺滅についての信頼性の高いリードアウトである。図８のグラフは、三重の平均±ＳＤを示す。図８内では、以下を見ることができる：Ａ－８４Ｓは、可変重鎖の８４位にシアリル化Ｎ－グリカンを有するアダリムマブバリアントを示し、Ａ－８４８６Ｓは、可変軽鎖の８６位及び可変重鎖の８４位にシアリル化Ｎ－グリカンを有するアダリムマブバリアントを示し、活性化がないことは、ＬＰＳ及びトランザクトが添加されず、したがって最小限のＴＮＦ産生が継続していたこと示し、ＩＶＩＧは、Ｆｃ受容体と競合するために培養において１ｍｇ／ｍｌのプールされたヒトＩｇが添加された条件を示す（この条件は、生理学的条件に最も近いものを表す）。抗体を、ＩＶＩＧとともに３０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、及び５００ｎｇ／ｍｌで使用した。このデータは、ＨＵＭＩＲＡが、非常に低いＡＤＣＣ、及び競合するヒトＩｇの存在下で検出不可能なＡＤＣＣ活性を有することを示す。対照的に、Ａ－８４Ｓ及びＡ－８４８６Ｓバリアントの両方は、競合するＩｇの存在下を含む、明確なＡＤＣＣ活性を示した。
本出願を通して、様々な刊行物が参照されてきた。これらの刊行物のその全体での開示は、本発明が関連する最新技術をより完全に説明するために、参照によって本出願に組み込まれる。本発明は、上記に提供される例を参照して説明されてきたが、本発明の趣旨から逸脱することなく、様々な修飾を行うことができることを理解されたい。
実施例ＩＸ
細胞株Ｓｔ１９８６６に発現したアダリムマブＡ－８４８６Ｓの産生及び品質管理
Ａ－８４８６Ｓ Ｆａｂ－シアリル化アダリムマブを、ＣｕｓｔｏｍＧｌｙｃａｎ細胞株Ｓｔ１９８６６を使用して産生した。材料を、標準的な生化学的及び高分解能質量分析法でＨＵＭＩＲＡと比較した産生物品質について分析した。設計当たりのＮ－グリコシル化プロファイルは、ＨＵＭＩＲＡとＡ－８４８６Ｓとの間で有意に異なるが、両方の抗体の生化学的特性は、非常に匹敵するべきであり、Ａ－８４８６Ｓの品質は、モノクローナル抗体の典型的な仕様制限及び市販製品の品質レベルと一致するべきである。
細胞株Ｓｔ１９８６６に発現したアダリムマブＡ－８４８６Ｓの産生及び品質管理
Ａ－８４８６Ｓ Ｆａｂ－シアリル化アダリムマブを、ＣｕｓｔｏｍＧｌｙｃａｎ細胞株Ｓｔ１９８６６を使用して産生した。材料を、標準的な生化学的及び高分解能質量分析法でＨＵＭＩＲＡと比較した産生物品質について分析した。設計当たりのＮ－グリコシル化プロファイルは、ＨＵＭＩＲＡとＡ－８４８６Ｓとの間で有意に異なるが、両方の抗体の生化学的特性は、非常に匹敵するべきであり、Ａ－８４８６Ｓの品質は、モノクローナル抗体の典型的な仕様制限及び市販製品の品質レベルと一致するべきである。
Ａ－８４８６Ｓ（バッチＰ１６－１６５８）を、標準プロトコルの適用によって細胞株Ｓｔ１９８６６を使用して生成した。細胞株は、参照によって本明細書に組み込まれる、国際特許出願公開第ＷＯ２０１９／００２５１２号及び同第ＷＯ２０１９／２３４０２１号に記載されるものなどの糖鎖工学要素を含有する。具体的には、Ｓｔ１９８６６は、１つのＰｆｒ遺伝子座において、ｄｒＭＧＡＴ１Ｂ、ｄｒＭＧＡＴ２、ｒｎＭＧＡＴ１、ｈｓＢ４ＧａｌＴ１、ＮｅｕＣ、ＣｇＮａｌ、ＮｅｕＢ、ｈｓＳＴ６、ＮｅｕＡ、ｒｎＭＧＡＴ２、ｈｓＭＧＡＴ１、及びｈｓＭＧＡＴ２の、ならびに第２のＰｆｒ遺伝子座において、ｈｓＢ４ＧＡＬＴ１、ｒｎＭＧＡＴ２、ｇｊＭＧＡＴ１、及びａｇＭＧＡＴ１のオープンなリーディングフレームを含有する。ｓｓｕ－ＰｏｌＩリボソームＤＮＡ遺伝子座において、Ｓｔ１９８６６は、ｓｆＧＮＴＩ、ｄｒＭＧＡＴ１Ｂ、ｒｎＭＧＡＴ２、ｍｍＳＴ６、ＣＭＡＳ、ｈｓＣＳＴを含む１つの構築物、ｒｎＭＧＡＴ１、ｈｓＭＧＡＴ１、ｇｊＭＧＡＴ１、及びａｇＭＧＡＴ１を含む別の構築物、ならびにアダリムマブＫ８４Ｎ（重鎖）／Ｄ８６Ｎ（軽鎖）を含有する。追加的に、細胞株は、参照によって本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０２１／１４０１４３に記載される３つのＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）転移酵素のノックアウトによるＯ結合型ＧｌｃＮＡｃの形成を防止するように修飾される。表３は、ＨＵＭＩＲＡと比較したＡ－８４８６Ｓ（バッチＰ１６－１６５８）の品質管理パラメータを提供する。
Ａ－８４８６Ｓ（バッチＰ１６－１６５８）及びＨＵＭＩＲＡのＮ－グリコシル化プロファイルを定量的に評価するために、Ｎ－グリカンを、ＰＮＧａｓｅ Ｆを用いて酵素的に放出し、プロカインアミドで蛍光標識し、エレクトロスプレー質量分析計に結合したＨＩＬＩＣ－ＵＰＬＣによって分離した。Ａ－８４８６Ｓの場合、グリカン放出及び標識前のＩｄｅＺ消化及びＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いて、Ｆａｂ Ｎ－グリカン（Ｋ８４Ｎ及びＤ８６Ｎ）及びＦｃ Ｎ－グリカンの個々のプロファイルを得た。ＨＵＭＩＲＡは、保存されたＦｃ Ｎ－グリコシル化部位のみを含有する。図９及び表４で見ることができるように、Ａ－８４８６Ｓ（バッチＰ１６－１６５８）のＦａｂ Ｎ－グリコシル化は、シアリル化Ｎ－グリカン（８６％）によって占められ、Ａ２Ｇ２Ｓ２が最も豊富なグリカン構造（４８％）である。Ａ－８４８６Ｓ（バッチＰ１６－１６５８）のＦｃ Ｎ－グリコシル化部位に存在する最も豊富なＮ－グリカンは、Ａ２（５２％）である。Ａ－８４８６ＳのＮ－グリカンは、設計上フコースを含まないが、ＨＵＭＩＲＡ Ｆｃグリコシル化部位のプロファイルは、フコシル化Ｎ－グリカンによって主に占められている（合計９２％）。
Ａ－８４８６Ｓ（Ｐ１６－１６５８）上の３つの個々のグリコシル化部位、すなわち、Ｆｃ Ｎ２９７（ＨＣ）、Ｆａｂ Ｎ８４（ＨＣ）、及びＦａｂ Ｎ８６（ＬＣ）上のＮ－グリコシル化占有率を、重水（Ｈ２Ｏ１８）中のトリプシン抗体消化調製物のＰＮＧａｓｅ Ｆを用いた脱グリコシル化を行うことによって評価した。簡潔には、これは、ＡｓｎがＡｓｐに変換される、脱グリコシル化の部位上のＯ１８の組み込みにつながる。よって、未占有、脱アミド化（＋１Ｄａ）、及び脱グリコシル化（＋３Ｄａ）Ｎ－グリコシル化部位を区別することが可能である。試料を、ＬＣ－ＥＳＩ ＭＳによって分析し、データを、手動で、及びＢｙｏｓ（Ｐｒｏｔｅｉｎｍｅｔｒｉｃｓ）を使用して評価した。相対存在量は、ＬＣ－ＥＳＩ ＭＳによって得られた非修飾及び脱グリコシル化ペプチドについて抽出されたイオンクロマトグラムの面積の比によって計算した。列挙されたＮ－グリコシル化部位のいずれについても、脱アミド化ペプチドは観察されなかった。表５に見ることができるように、部位占有率は、全ての部位上で非常に高い。Ｆａｂ重鎖上のＮ８４部位は、最も低い観察された占有率（９４％）を有するものである。
関連するＦｃ受容体のパネルへの結合をＳＰＲによって分析した。ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃＲｎについてのＫＤ値及びそれぞれの相対結合親和性（計算されたＫＤ（ＨＵＭＩＲＡ）／ＫＤ（Ａ－８４８６Ｓ）＊１００）、ならびに倍率変化（計算されたＫＤ（ＨＵＭＩＲＡ）／ＫＤ（Ａ－８４８６Ｓ））を、定常状態モデルを用いて推定し、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、及びＦｃγＲＩＩＩＢについて不均一リガンドモデルを仮定した。後者は、２つのＫＤ値をもたらし、最初の値はより意味のある値であった。Ａ－８４８６Ｓ（Ｐ１６－１６５８）のＦｃγＲＩＩＩ受容体への結合親和性は、ＨＵＭＩＲＡと比較すると、１１～３０倍高い（図１０／表６を参照されたい）。
実施例Ｘ
改善されたＦａｂシアリル化細胞株ＳｔＣＧＰ０２８２４及びＳｔＣＧＰ０２８２６
細胞株ＳｔＣＧＰ０２８２４及びＳｔＣＧＰ０２８２６を作製して、改善されたＦｃ Ｎ－グリカン変換及びＦａｂシアリル化を提供した。それらは、参照によって本明細書に組み込まれる、国際特許出願公開第２０１９／００２５１２号及び同第ＷＯ２０１９／２３４０２１号に記載されるものなどの糖鎖工学要素を含有する。具体的には、ＳｔＣＧＰ０２８２４は、１つのＰｆｒ遺伝子座において、ｄｒＭＧＡＴ１Ｂ、ｄｒＭＧＡＴ２、ｒｎＭＧＡＴ１、ｈｓＢ４ＧａｌＴ１、ＮｅｕＣ、ＣｇＮａｌ、ＮｅｕＢ、ｈｓＳＴ６、ＮｅｕＡ、ｒｎＭＧＡＴ２、ｈｓＭＧＡＴ１、及びｈｓＭＧＡＴ２の、第２のＰｆｒ遺伝子座において、ｈｓＢ４ＧＡＬＴ１、ｒｎＭＧＡＴ２、ｇｊＭＧＡＴ１、及びａｇＭＧＡＴ１のオープンなリーディングフレームを含有する。ｓｓｕ－ＰｏｌＩリボソームＤＮＡ遺伝子座において、ＳｔＣＧＰ０２８２４は、ｓｆＧＮＴＩ、ｄｒＭＧＡＴ１Ｂ、ｒｎＭＧＡＴ２、ｍｍＳＴ６、ＣＭＡＳ、及びｈｓＣＳＴ、ならびにアダリムマブＫ８４Ｎ（重鎖）／Ｄ８６Ｎ（軽鎖）を含有する。追加的に、細胞株は、参照によって本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０２１／１４０１４３に記載される３つのＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）転移酵素のノックアウトによるＯ結合型ＧｌｃＮＡｃの形成を防止するように修飾される。ＳｔＣＧＰ０２８２６は、１つのＰｆｒ遺伝子座において、ｄｒＭＧＡＴ１Ｂ、ｄｒＭＧＡＴ２、ｒｎＭＧＡＴ１、ｈｓＢ４ＧａｌＴ１、ＮｅｕＣ、ＣｇＮａｌ、ＮｅｕＢ、ｈｓＳＴ６、ＮｅｕＡ、ｒｎＭＧＡＴ２、ｈｓＭＧＡＴ１、及びｈｓＭＧＡＴ２の、第２のＰｆｒ遺伝子座において、ｈｓＢ４ＧＡＬＴ１、ｒｎＭＧＡＴ２、ｇｊＭＧＡＴ１、及びａｇＭＧＡＴ１のオープンなリーディングフレームを含有する。ｓｓｕ－ＰｏｌＩリボソームＤＮＡ遺伝子座において、ＳｔＣＧＰ０２８２６は、ｓｆＧＮＴＩ、ｄｒＭＧＡＴ１Ｂ、ｒｎＭＧＡＴ２、ｍｍＳＴ６、ＣＭＡＳ、ｈｓＣＳＴ、及びｈｓＮＧＴ、ならびにアダリムマブＫ８４Ｎ（重鎖）／Ｄ８６Ｎ（軽鎖）を含有する。追加的に、ＳｔＣＧＰ０２８２６について、細胞株は、３つのＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）転移酵素のノックアウトによるＯ結合型ＧｌｃＮＡｃの形成を防止するように修飾される。
改善されたＦａｂシアリル化細胞株ＳｔＣＧＰ０２８２４及びＳｔＣＧＰ０２８２６
細胞株ＳｔＣＧＰ０２８２４及びＳｔＣＧＰ０２８２６を作製して、改善されたＦｃ Ｎ－グリカン変換及びＦａｂシアリル化を提供した。それらは、参照によって本明細書に組み込まれる、国際特許出願公開第２０１９／００２５１２号及び同第ＷＯ２０１９／２３４０２１号に記載されるものなどの糖鎖工学要素を含有する。具体的には、ＳｔＣＧＰ０２８２４は、１つのＰｆｒ遺伝子座において、ｄｒＭＧＡＴ１Ｂ、ｄｒＭＧＡＴ２、ｒｎＭＧＡＴ１、ｈｓＢ４ＧａｌＴ１、ＮｅｕＣ、ＣｇＮａｌ、ＮｅｕＢ、ｈｓＳＴ６、ＮｅｕＡ、ｒｎＭＧＡＴ２、ｈｓＭＧＡＴ１、及びｈｓＭＧＡＴ２の、第２のＰｆｒ遺伝子座において、ｈｓＢ４ＧＡＬＴ１、ｒｎＭＧＡＴ２、ｇｊＭＧＡＴ１、及びａｇＭＧＡＴ１のオープンなリーディングフレームを含有する。ｓｓｕ－ＰｏｌＩリボソームＤＮＡ遺伝子座において、ＳｔＣＧＰ０２８２４は、ｓｆＧＮＴＩ、ｄｒＭＧＡＴ１Ｂ、ｒｎＭＧＡＴ２、ｍｍＳＴ６、ＣＭＡＳ、及びｈｓＣＳＴ、ならびにアダリムマブＫ８４Ｎ（重鎖）／Ｄ８６Ｎ（軽鎖）を含有する。追加的に、細胞株は、参照によって本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０２１／１４０１４３に記載される３つのＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）転移酵素のノックアウトによるＯ結合型ＧｌｃＮＡｃの形成を防止するように修飾される。ＳｔＣＧＰ０２８２６は、１つのＰｆｒ遺伝子座において、ｄｒＭＧＡＴ１Ｂ、ｄｒＭＧＡＴ２、ｒｎＭＧＡＴ１、ｈｓＢ４ＧａｌＴ１、ＮｅｕＣ、ＣｇＮａｌ、ＮｅｕＢ、ｈｓＳＴ６、ＮｅｕＡ、ｒｎＭＧＡＴ２、ｈｓＭＧＡＴ１、及びｈｓＭＧＡＴ２の、第２のＰｆｒ遺伝子座において、ｈｓＢ４ＧＡＬＴ１、ｒｎＭＧＡＴ２、ｇｊＭＧＡＴ１、及びａｇＭＧＡＴ１のオープンなリーディングフレームを含有する。ｓｓｕ－ＰｏｌＩリボソームＤＮＡ遺伝子座において、ＳｔＣＧＰ０２８２６は、ｓｆＧＮＴＩ、ｄｒＭＧＡＴ１Ｂ、ｒｎＭＧＡＴ２、ｍｍＳＴ６、ＣＭＡＳ、ｈｓＣＳＴ、及びｈｓＮＧＴ、ならびにアダリムマブＫ８４Ｎ（重鎖）／Ｄ８６Ｎ（軽鎖）を含有する。追加的に、ＳｔＣＧＰ０２８２６について、細胞株は、３つのＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）転移酵素のノックアウトによるＯ結合型ＧｌｃＮＡｃの形成を防止するように修飾される。
アダリムマブＫ８４Ｎ－Ｄ８６Ｎを、振盪フラスコ由来の細胞培養上清からのプロテインＡによって精製した。ＳｔＣＧＰ０２８２４及びＳｔＣＧＰ０２８２６において発現した抗体上のＮ－グリカンの相対存在量を、実施例２に記載されるプロトコルを用いて決定した。図１１に示されるように、アダリムマブＫ８４Ｎ－Ｄ８６ＮのＦａｂグリコシル化部位のＮ－グリカンは、アルファ２，６二分枝シアリル化の非常に高い存在量を示し、ＳｔＣＧＰ０２８２４における発現後のＦｃ部分における保存されたＮ－グリコサイト２９７のＮ－グリカンは、少量のみの天然Ｍ３グリコフォームを示し、ほとんどのＮ－グリカンはＡ２に変換されている。図１２は、ＳｔＣＧＰ０２８２６に由来するアダリムマブＫ８４Ｎ－Ｄ８６Ｎについての同様のＮ－グリカンプロファイルを示す。図１３の上パネルは、それぞれ、ＳｔＣＧＰ０２８２４またはＳｔＣＧＰ０２８２６において発現したアダリムマブのＦａｂグリコサイト（Ｋ８４Ｎ－Ｄ８６Ｎ）から放出されるグリコフォームの相対定量化を示す。図１３の下パネルは、ＩｄｅＺ切断による分離後、対応する保存されたＦｃグリコサイトを示す。命名法及びグリカンアノテーションは、表２に見られる。６０．８％及び７０．９％では、両方の細胞株は、実施例ＩＶに示されるデータと比較して、アダリムマブＫ８４Ｎ－Ｄ８６ＮのＦａｂグリコサイト上のアルファ２，６二分枝シアリル化の有意に高い存在量、及びＦｃグリコサイト上のＭ３グリコフォームの強く改善された変換（３．７及び４．６％残存）を示す。
糖鎖工学株の安定性を評価するために、アダリムマブを、４（Ｐ４）及び９（Ｐ９）継代後の２つの細胞株からのプロテインＡによって精製した。それぞれのＦａｂ及びＦｃグリコサイトから放出されたＮ－グリカンは、細胞株の長期維持後にほぼ同一のプロファイルを示す（図１４）。
ＳｔＣＧＰ０２８２４及びＳｔＣＧＰ０２８２６を、酵母エキスベースの培地を使用してＤＡＳｂｏｘミニバイオリアクターシステムにおいてフェドバッチ発酵に供した。両株とも安定した増殖を示し、発酵の終了時に３６及び３７の最大ＯＤに達した。細胞培養上清から精製されたアダリムマブ（Ａ－８４８６Ｓ）をプロテインＡによって単離し、０．８３μｇ／ＯＤ及び１．０５μｇ／ＯＤの比収率を決定した。それぞれのＦａｂ及びＦｃグリコサイトのＮ－グリカンプロファイルは、振盪フラスコ中の同じ株の増殖時に得られたもの（図１５）と比較され、Ｆａｂグリコサイト上のアルファ２，６二分枝シアリル化のさらに高い存在量、及びＦｃグリコサイト上のＡ２の増加した存在量を示す。
株ＳｔＣＧＰ０２８２４及びＳｔＣＧＰ０２８２６の糖鎖工学的能力を評価するために、アダリムマブＫ８４Ｎ－Ｄ８６Ｎの追加の遺伝子コピーを、これらの株のｓｓｕ－ＰｏｌＩリボソームＤＮＡ遺伝子座に組み込み、それぞれ、株ＳｔＣＧＰ０２９４４株及びＳｔＣＧＰ０２９４６株を作製した。これらの株のアダリムマブ収率は、０．７１μｇ／ＯＤ（ＳｔＣＧＰ０２８２４）から２．５３μｇ／ＯＤ（ＳｔＣＧＰ０２９４４）に、及び０．９３μｇ／ＯＤ（ＳｔＣＧＰ０２８２６）から２．３４μｇ／ＯＤ（ＳｔＣＧＰ０２９４６）に増加した。アダリムマブを、振盪フラスコ中で増殖した新たな細胞株からのプロテインＡによって精製し、それぞれのＦａｂ及びＦｃグリコサイトから放出されたＮ－グリカンを、親株から得られたものと比較した（図１６）。Ｎ－グリカンプロファイルは、収率増加後、Ｆａｂグリコサイト上のアルファ２，６シアリル化の存在量にほとんど変化がなく、Ｆｃ Ｎ－グリカンの変換における、１３．１％及び１２．４％のＭ３が残存する、小さな低下のみで、非常に類似したままである。
実施例ＸＩ
非ヒト霊長類試験は、Ａ－８４８６Ｓの安全性及び低減した免疫原性の傾向を実証する
次に、Ｓｔ１９８６６において産生された、Ａ－８４８６Ｓは、非ＧＬＰ薬理学試験において非ヒト霊長類（ＮＨＰ）カニクイザルで試験した。ＮＨＰ試験において使用されるＡ－８４８６Ｓの品質属性は、実施例ＩＸに記載されている。この試験の目的は、３ｍｇ／ｋｇの用量レベルで静脈内（ボーラス）注射を介して３回（１日目、８日目、１５日目）雌カニクイザルに投与されるとき、Ａ－８４８６Ｓの薬物動態、薬力学、安全性、及び忍容性を特徴分析することであった。観察された効果を、３ｍｇ／ｋｇの同じ用量レベルでの、参照項目、Ｈｕｍｉｒａ（ＡｂｂＶｉｅ）の効果と比較した。ＩＢＤ患者に与えられたＨｕｍｉｒａ負荷用量（１６０ｍｇ）に相当するため、３ｍｇ／ｋｇの用量を選択した。この目的のために、１２匹の雌カニクイザルを、各々６匹の動物の、２つの実験群に分配した。群Ａは、参照項目（Ｈｕｍｉｒａ）を受け、群Ｂは、試験項目（Ａ－８４８６Ｓ）を受けた。安全性評価は、投与を開始する前に、及び試験を通して異なる時点で行われた臨床病理学決定の評価、ならびに全試験中の全ての動物の観察された死亡、臨床徴候、体温、血圧、体重、及び食物摂取量に依存した。加えて、試験項目の薬物動態プロファイルを評価するために、ならびに抗薬物抗体（ＡＤＡ）分析及びサイトカイン分析を行うために、試験全体を通して異なる試料を採取した。
非ヒト霊長類試験は、Ａ－８４８６Ｓの安全性及び低減した免疫原性の傾向を実証する
次に、Ｓｔ１９８６６において産生された、Ａ－８４８６Ｓは、非ＧＬＰ薬理学試験において非ヒト霊長類（ＮＨＰ）カニクイザルで試験した。ＮＨＰ試験において使用されるＡ－８４８６Ｓの品質属性は、実施例ＩＸに記載されている。この試験の目的は、３ｍｇ／ｋｇの用量レベルで静脈内（ボーラス）注射を介して３回（１日目、８日目、１５日目）雌カニクイザルに投与されるとき、Ａ－８４８６Ｓの薬物動態、薬力学、安全性、及び忍容性を特徴分析することであった。観察された効果を、３ｍｇ／ｋｇの同じ用量レベルでの、参照項目、Ｈｕｍｉｒａ（ＡｂｂＶｉｅ）の効果と比較した。ＩＢＤ患者に与えられたＨｕｍｉｒａ負荷用量（１６０ｍｇ）に相当するため、３ｍｇ／ｋｇの用量を選択した。この目的のために、１２匹の雌カニクイザルを、各々６匹の動物の、２つの実験群に分配した。群Ａは、参照項目（Ｈｕｍｉｒａ）を受け、群Ｂは、試験項目（Ａ－８４８６Ｓ）を受けた。安全性評価は、投与を開始する前に、及び試験を通して異なる時点で行われた臨床病理学決定の評価、ならびに全試験中の全ての動物の観察された死亡、臨床徴候、体温、血圧、体重、及び食物摂取量に依存した。加えて、試験項目の薬物動態プロファイルを評価するために、ならびに抗薬物抗体（ＡＤＡ）分析及びサイトカイン分析を行うために、試験全体を通して異なる試料を採取した。
Ａ－８４８６Ｓ及びＨｕｍｉｒａヒュミラでの処理は、全ての動物による忍容性が良好であった。試験にわたって死亡は観察されず、糞便稠度の一時的な変化のみが散発的に観察された。いずれの実験群においても、体重（表１０）、直腸温度（表８）、血圧（表９）、及び食物摂取量（図示せず）に対する処理関連効果は観察されなかった。
Ａ－８４８６Ｓ及びＨｕｍｉｒａの反復投与は、絶対好酸球数、絶対好塩基球数、及び網状赤血球数の増加を促進した。観察された変化は、表１１に示されるように、Ａ－８４８６Ｓ及びＨｕｍｉｒａ処理動物において非常に類似していた。これらの変化は、抗ＴＮＦ抗体の記載された薬理学的効果に対応する。プロトロンビン時間及び活性化部分トロンボプラスチン時間によって測定された凝固パラメータは、Ａ－８４８６ＳまたはＨｕｍｉｒａ投与によって影響を受けなかった（表１２）。
血液生化学パラメータは、ＨｕｍｉｒａまたはＡ－８４８６Ｓの反復投与によって影響されなかった。以下の血液生化学パラメータを測定した：アルブミン、総タンパク質、グロブリン、コレステロール、トリグリセリド、グルコース、尿素、総ビリルビン、クレアチニン、アルカリホスファターゼ、アラニンアミノ基転移酵素、アスパラギン酸アミノ基転移酵素、ガンマグルタミル基転移酵素、電解質（Ｃａ２＋、Ｃｌ－、ＰＯ４３－、Ｋ＋、Ｎａ＋）。
末梢血清中の以下のサイトカインを、製造業者の指示に従って市販のキットを使用してＥＬＩＳＡによって分析した：ＩＬ－２（Ｍｙｂｉｏｓｏｕｒｃｅ参照番号ＭＢＳ７６１８７８）、ＩＬ－６（Ａｂｃａｍ参照番号Ａｂ２４２２３３）、ＴＮＦ－α（Ａｂｃａｍ参照番号Ａｂ２５２３５４）、ＩＦＮ－γ（Ａｂｃａｍ参照番号Ａｂ２７０８９５）、ＩＬ－８（Ａｂｃａｍ参照番号Ａｂ２４２２３２）、ＩＬ－１０（Ｍｙｂｉｏｓｏｕｒｃｅ参照番号ＭＢＳ２５０１８８８）。加えて、キットが適切に機能したことを確認するために、陽性対照（活性化された血液から採取された血漿）を産生して各分析に含めた。陽性対照は、以下のように産生した。全血は、サービスプロバイダーコロニー（試験に参加していない動物）に属する１匹のカニクイザル雌から採取した。凝固を防止するために、約６ｍＬの血液をナトリウムヘパリンチューブに収集した。この全血を、５０～１００ｒｐｍでのプレートシェーカー上の３７℃、５％ＣＯ２の２４ウェルプレートにおいて２４時間、マイトジェン溶液（１μｇ／ｍｌ最終のＬＰＳ及び１００μｇ／ｍｌ最終のフィトヘマグルチニン）とインキュベートした。インキュベーション時間後、各ウェルの内容物を１５ｍＬのファルコンチューブに注ぎ、５℃で１０分間２０００ｇで遠心分離して細胞をペレット化し、血漿を採取し、アリコートし、分析されるまで－８０℃で保存した。サイトカインは、以下の時点で分析した：週－１（投与前ベースライン）、１日目１回目投与の６時間後、８日目（投与前＝１回目投与の７日後）、１５日目（投与前）、１５日目（投与後６時間）。分析されたサイトカインのいずれも、Ａ－８４８６Ｓが測定可能なサイトカイン放出を誘導しなかったことを示す任意の時点での投与前レベルと比較して有意な上昇を示さなかった。表１３、１４、及び１５は、それぞれ、ＩＬ－６、ＩＬ－８、及びＴＮＦαの値を示す。
末梢血中のＡ－８４８６Ｓ及びＨｕｍｉｒａレベルの薬物動態分析を異なる時点で実施した。凝固活性化剤チューブに収集された血液試料を、周囲温度で少なくとも５分間凝固させた。次いで、チューブを４℃で１０分間２０００ｇで遠心分離した。遠心分離後、チューブを血清分離まで氷浴で保存した。血清試料をアリコートし、分析まで－８０℃で凍結保存した。ＰＫ試料の生物分析は、電気化学発光ベース（ＥＣＬ、Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ））サンドイッチアッセイを使用した。簡潔には、ＭＳＤストレプトアビジンコーティングされた電極プレートを３％ＢＳＡ（ブロッキングバッファー）で少なくとも１．５時間ブロックした。１μｇ／ｍｌのビオチン化抗アダリムマブ抗体（ＨＣＡ２０２、Ｂｉｏｒａｄ）捕捉溶液を各ウェルに添加した。方法開発中にＨＣＡ２０２はＨｕｍｉｒａ及びＡ－８４８６Ｓを等しく捕捉することが検証された。キャリブレーター曲線セット、品質管理試料（ＱＣ）、試験試料、及びブランク試料を１％マトリックス中でそれぞれのプレートウェルにロードした。ＳＵＬＦＯタグ付き抗アダリムマブ抗体（ＨＣＡ２０４、Ｂｉｏｒａｄ）検出溶液（２μｇ／ｍｌ）を各ウェルに添加した。ＭＳＤリードバッファーを各ウェルに添加し、ＭＳＤ Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒを使用してＥＣＬシグナルを取得した。重要なことに、Ｈｕｍｉｒａ及びＡ－８４８６Ｓの定量化には別個の較正曲線を使用した（すなわち、Ｈｕｍｉｒａ較正曲線を試料中のＨｕｍｉｒａの定量化に使用し、Ａ－８４８６Ｓ較正曲線を試料中のＡ－８４８６Ｓの定量化に使用した）。毒物動態パラメータは、検証済みアプリケーションＰｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（登録商標）バージョン６．２．１１を使用して計算した。モデル血漿（２００－２０２）－ＩＶボーラスを使用したノンコンパートメント分析を適用した。１回目及び３回目投与後、Ａ－８４８６Ｓ及びＨｕｍｉｒａのＰＫパラメータは、表９に示されるように、非常に同等であった。これらのデータは、Ａ－８４８６ＳのＦａｂシアリル化が、そのＰＫプロファイルを不利に改変しなかったことを示す。
Ｈｕｍｉｒａ及びＡ－８４８６Ｓに対する、抗薬物抗体（ＡＤＡ）レベルを、電気化学発光ベースの架橋アッセイ（ＥＣＬ、Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を使用して測定した。簡潔には、ＭＳＤ電極プレートを、ＨｕｍｉｒａまたはＡ－８４８６Ｓで、１倍ＰＢＳ中０．５μｇ／ｍｌで４℃で一晩コーティングした。プレートを３％ＢＳＡ（ブロッキングバッファー）を用いて少なくとも１．５時間ブロックした。キャリブレーター試料、品質管理試料（ＱＣ）、試験試料、及びブランク試料を、１％マトリックス中でそれぞれのプレートウェルにロードした。ＳＵＬＦＯ－Ｔａｇ共役ＨｕｍｉｒａまたはＡ－８４８６Ｓ（１μｇ／ｍｌの検出溶液）を全てのウェルに添加した。ＭＳＤ Ｒｅａｄ Ｂｕｆｆｅｒを全てのウェルに添加した。ＭＳＤ Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒを使用してＥＣＬシグナルを取得した。較正曲線内のＥＣＬシグナルを、Ｈｕｍｉｒａ及びＡ－８４８６Ｓに対するＡＤＡ応答の半定量的表現として直接使用した。全ての決定は、各試料（すなわち、２つのウェル）の二重の分析に基づいた。変動係数パーセンテージ（ＣＶ％）を、２つのウェルのシグナル間で計算した。ＣＶ％は、試料当たりの二重のウェル間で２０％以下である必要があった。
図１８は、試験の３６日目及び６４日目（終了）のＡＤＡデータを示す。ＡＤＡレベルは、３６日目にＨｕｍｉｒａ群と比較してＡ－８４８６Ｓ群において５０％低減した。差異は、データ点の数が低く、ＡＤＡ応答の変動性が高いため、（ウェルチ補正を伴う対応のないｔ検定によって決定されるように）統計学的に有意ではなかった。Ａ－８４８６Ｓに対する低減したＡＤＡ形成の傾向は、６４日目に確認されたが、統計学的にも有意ではなかった。図１８内では、以下を見ることができる：左のグラフは、３６日目のＡＤＡレベルを示し、右のグラフは、試験終了時（６４日目）のＡＤＡレベルを示す。ＲＬＵは、相対発光単位（ＥＣＬシグナル）を表す。各点は、１つの動物におけるＡＤＡレベルを表す（黒丸Ｈｕｍｉｒａ及び白四角Ａ－８４８６Ｓ）。各群の平均±ＳＥＭは、横線及び縦線によって表される。これらのデータは、Ａ－８４８６ＳのＦａｂシアリル化がサルにおけるより低いＡＤＡ応答をもたらすという仮説を支持する。
全体的な安全性データは、ＰＫデータ及び免疫原性データと組み合わせて、Ａ－８４８６Ｓが、３ｍｇ／ｋｇの３つの週に１回の用量で注射されたときにカニクイザルにおいて良好な忍容性を示したが、同じ用量で注射されたＨｕｍｉｒａと同様の曝露を示した。これらのデータは、増強したＡＤＣＣ効力及び増強したＭ２マクロファージ形成をもたらすＡ－８４８６Ｓ及びその非フコシル化Ｆｃ－グリカン、ならびにＨｕｍｉｒａと比較して低減した免疫原性をもたらす、そのＦａｂグリカンの高いシアリル化が、Ｈｕｍｉｒａと同様の安全性プロファイルを示し、ヒト患者においてより高い有効性を提供するであろうという仮定を支持する。
Claims (44)
- モノクローナル抗体であって、ヒト血清中に見られる抗体またはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株によって産生される対照モノクローナル抗体と比較して、前記モノクローナル抗体のＦａｂ領域により多量のシアル酸を含む、前記モノクローナル抗体。
- モノクローナル抗体であって、ヒト血清中に見られる抗体またはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株によって産生される対照モノクローナル抗体と比較して、前記モノクローナル抗体のＦａｂ領域により多量のシアル酸及び／またはＦｃ領域により多量のシアル酸を含む、前記モノクローナル抗体。
- モノクローナル抗体であって、ヒト血清中に見られる抗体またはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株によって産生される対照モノクローナル抗体と比較して、前記モノクローナル抗体のＦａｂ領域により多量のシアル酸及び／またはＦｃ領域により多量の非フコシル化グリカンを含む、前記モノクローナル抗体。
- モノクローナル抗体であって、ヒト血清中に見られる抗体またはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株によって産生される対照モノクローナル抗体と比較して、前記モノクローナル抗体のＦａｂ領域により多量のシアル酸及び／またはＦｃ領域により多量のＧ０グリカンを含む、前記モノクローナル抗体。
- 前記モノクローナル抗体の重鎖及び／または軽鎖の可変ドメインに１つ以上の点変異でシアリル化グリカンを含む、請求項１～４のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
- 前記モノクローナル抗体の前記重鎖の前記可変ドメインのフレームワーク領域にＮ－グリコシル化部位をもたらす１つ以上の挿入または変異されたアミノ酸でシアリル化グリカンを含み、前記モノクローナル抗体が、その抗原に結合するその能力を保持する、請求項１～５のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
- 前記モノクローナル抗体の前記軽鎖の前記可変ドメインのフレームワーク領域にＮ－グリコシル化部位をもたらす１つ以上の挿入または変異されたアミノ酸でシアリル化グリカンを含み、前記モノクローナル抗体が、その抗原に結合するその能力を保持する、請求項１～５のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
- 前記重鎖の前記可変ドメインのフレームワーク領域にＮ－グリコシル化部位をもたらす１つ以上の挿入または変異されたアミノ酸でのシアリル化グリカン、及び前記軽鎖の前記可変ドメイン上のフレームワーク領域にＮ－グリコシル化部位をもたらす１つ以上の挿入または変異されたアミノ酸でのシアリル化グリカンを含み、前記モノクローナル抗体が、その抗原に結合するその能力を保持する、請求項１～５のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
- 前記モノクローナル抗体の前記Ｆｃ領域に非フコシル化グリカン構造を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
- 保存されたＦｃグリコサイトＮ２９７（ＩＭＧＴデータベース及びＥｕナンバリングによる）に非フコシル化グリカン構造を含む、請求項１～９のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
- 前記モノクローナル抗体が、抗ＴＮＦα抗体である、請求項１～１０のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
- 前記抗ＴＮＦα抗体が、アダリムマブのバリアントである、請求項１１に記載のモノクローナル抗体。
- 前記モノクローナル抗体の前記重鎖の前記可変ドメイン上のＮ８４（ＩＭＧＴデータベースナンバリングによる）でシアリル化グリカンを含む、請求項１２に記載のモノクローナル抗体。
- 前記モノクローナル抗体の前記軽鎖の前記可変ドメイン上のＮ８６（ＩＭＧＴデータベースナンバリングによる）でシアリル化グリカンを含む、請求項１２に記載のモノクローナル抗体。
- 前記重鎖の前記可変ドメイン上のＮ８４（ＩＭＧＴデータベースナンバリングによる）でシアリル化グリカン及び前記モノクローナル抗体の前記軽鎖の前記可変ドメイン上のＮ８６でシアリル化グリカンを含む、請求項１２に記載のモノクローナル抗体。
- 以下の構造のうちの１つ以上を含み、
- 以下の構造のうちの１つ以上を含み、
- 以下の構造のうちの１つ以上を含み、
ダイヤが、シアル酸残基を表し、空白の丸が、ガラクトース残基を表し、四角が、Ｎ－アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸が、マンノース残基を表し、還元末端が、前記モノクローナル抗体におけるＮ結合グリコシル化コンセンサス配列のＡｓｎ上にある、請求項１～１７のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
- 前記抗ＴＮＦα抗体が、異なるグリコシル化プロファイルを有する同じ抗ＴＮＦα抗体のものよりも、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１２倍、１５倍、１８倍、２０倍、２５倍、または３０倍高い抗体依存的細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）活性を有する、請求項１１に記載のモノクローナル抗体。
- 前記抗ＴＮＦα抗体が、異なるグリコシル化プロファイルを有する同じ抗ＴＮＦα抗体のものよりも、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１２倍、１５倍、１８倍、２０倍、２５倍、または３０倍高い一次炎症標的細胞に対する抗体依存的細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）活性を有する、請求項１１に記載のモノクローナル抗体。
- 前記抗ＴＮＦα抗体が、異なるグリコシル化プロファイルを有する同じ抗ＴＮＦα抗体のものよりも、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１２倍、１５倍、１８倍、２０倍、２５倍、または３０倍低い低減した（より低い）免疫原性を有する、請求項１１に記載のモノクローナル抗体。
- 前記抗ＴＮＦ抗体が、異なるグリコシル化プロファイルを有する同じ抗ＴＮＦα抗体のものよりも、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１２倍、１５倍、１８倍、２０倍、２５倍、または３０倍高い増加した創傷治癒Ｍ２マクロファージ誘導活性を有する、請求項１１に記載のモノクローナル抗体。
- 請求項１～２２のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を含む、実施例Ｘに記載されるように遺伝子操作された、リーシュマニア宿主細胞。
- 前記リーシュマニア宿主細胞が、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｔａｒｅｎｔｏｌａｅである、請求項２３に記載のリーシュマニア宿主細胞。
- 請求項２３または２４に記載のリーシュマニア宿主細胞を培養し、前記モノクローナル抗体を単離することを含む、モノクローナル抗体を作製するための方法。
- 請求項２５に記載の方法によって産生される、モノクローナル抗体。
- 請求項１～２２のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体と、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物。
- 患者において疾患を治療または予防する方法であって、前記患者に、請求項１～２２のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体、または請求項２７に記載の薬学的組成物を投与することを含む、前記方法。
- 前記疾患が、炎症性腸疾患である、請求項２８に記載の方法。
- 前記炎症性腸疾患が、クローン病、小児クローン病、潰瘍性大腸炎、顕微鏡的大腸炎、憩室症関連大腸炎、膠原線維性大腸炎、リンパ球性大腸炎、及びベーチェット病から選択される、請求項２９に記載の方法。
- 前記疾患が、リウマチ性関節炎、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、慢性乾癬、化膿性汗腺炎、成人ぶどう膜炎、小児ぶどう膜炎、尋常性乾癬、及び若年性特発性関節炎から選択される、請求項２８に記載の方法。
- 前記投与ステップが、静脈内注射、腹腔内注射、皮下注射、経皮注射、または筋肉内注射を含む、請求項２８に記載の方法。
- 前記方法が、
ａ．異なるグリコシル化プロファイルを有する同じ抗体と比較して同じ効果を達成するためにより低い用量及び／またはより低い投与頻度を必要とする、及び／または
ｂ．長期間（少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは少なくとも１２ヶ月、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは少なくとも１０年）にわたって投与することができ、及び／または
ｃ．前記患者における前記モノクローナル抗体に対する免疫応答を誘発しない、請求項２８～３２のいずれか１項に記載の方法。 - より低い免疫抑制剤の共投薬を必要とする、請求項２８～３３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記免疫抑制剤が、コルチコステロイド、シクロホスファミド、タクロリムス、アザチオプリン、シクロスポリン、及びトファシチニブから選択される、請求項３４に記載の方法。
- 前記疾患が、リウマチ性関節炎、乾癬性関節炎、または強直性脊椎炎であり、前記方法が、前記患者に、１週間おき以下の投与頻度で４０ｍｇ以下の前記抗ＴＮＦα抗体を投与することを含む、請求項２８に記載の方法。
- 前記疾患が、クローン病または潰瘍性大腸炎であり、前記方法が、前記患者に、１日目に１６０ｍｇ以下の前記抗ＴＮＦα抗体、１５日目に８０ｍｇ以下の前記抗ＴＮＦα抗体、及び２９日目に開始する１週間おき以下の投与頻度で４０ｍｇ以下の前記抗ＴＮＦα抗体を投与することを含む、請求項２８に記載の方法。
- 前記疾患が、小児クローン病であり、前記方法が、前記患者に、
ａ．１７ｋｇ～４０ｋｇの体重を有する患者において１日目に８０ｍｇ以下の前記抗ＴＮＦα抗体、１５日目に４０ｍｇ以下の前記抗ＴＮＦα抗体、及び２９日目に開始する１週間おき以下の投与頻度で２０ｍｇ以下の前記抗ＴＮＦα抗体、または
ｂ．４０ｋｇ以上の体重を有する患者において１日目に１６０ｍｇ以下の前記抗ＴＮＦα抗体、１５日目に８０ｍｇ以下の前記抗ＴＮＦα抗体、及び２９日目に開始する１週間おき以下の投与頻度で４０ｍｇ以下の前記抗ＴＮＦα抗体を投与すること、を含む、請求項２８に記載の方法。 - 前記疾患が、若年性特発性関節炎または小児ぶどう膜炎であり、前記方法が、前記患者に、
ａ．１０ｋｇ～１５ｋｇの体重を有する患者において１週間おき以下の投与頻度で１０ｍｇ以下の前記抗ＴＮＦα抗体、
ｂ．１５ｋｇ～３０ｋｇの体重を有する患者において１週間おき以下の投与頻度で２０ｍｇ以下の前記抗ＴＮＦα抗体、または
ｃ．３０ｋｇ以上の体重を有する患者において１週間おき以下の投与頻度で４０ｍｇ以下の前記抗ＴＮＦα抗体を投与することを含む、請求項２８に記載の方法。 - 前記疾患が、尋常性乾癬または成人ぶどう膜炎であり、前記方法が、前記患者に、１日目に８０ｍｇ以下の前記抗ＴＮＦα抗体、及び８日目に開始する１週間おき以下の投与頻度で４０ｍｇ以下を投与することを含む、請求項２８に記載の方法。
- 前記疾患が、化膿性汗腺炎であり、前記方法が、前記患者に、
ａ．３０ｋｇ～６０ｋｇの体重を有する１２歳以上である青年期患者において１日目に８０ｍｇ以下の前記抗ＴＮＦα抗体、及び８日目に開始する１週間おき以下の投与頻度で４０ｍｇ以下の前記抗ＴＮＦα抗体、または
ｂ．６０ｋｇ以上の体重を有する１２歳以上である青年期患者もしくは成人患者において１日目に１６０ｍｇ以下の前記抗ＴＮＦα抗体、１５日目に８０ｍｇ以下の前記抗ＴＮＦα抗体、及び２９日目に開始する１週間おき以下の投与頻度で４０ｍｇ以下の前記抗ＴＮＦα抗体を投与することを含む、請求項２８に記載の方法。 - 請求項１～２２のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体の単一剤形であって、前記単一剤形が、約２ｍｇ、約５ｍｇ、約７ｍｇ、約１０ｍｇ、約１２ｍｇ、約１５ｍｇ、約１８ｍｇ、約２０ｍｇ、約２５ｍｇ、約３０ｍｇ、約３５ｍｇ、約４０ｍｇ、約４５ｍｇ、約５０ｍｇ、約５５ｍｇ、約６０ｍｇ、約６５ｍｇ、約７０ｍｇ、約７５ｍｇ、または約８０ｍｇの前記抗ＴＮＦα抗体からなる、前記単一剤形。
- 前記単一剤形が、予め充填されたシリンジ、注射ペン、バイアル、錠剤、またはカプセルである、請求項４２に記載の単一剤形。
- 前記単一剤形が、前記抗ＴＮＦα抗体を凍結乾燥形態でまたは液体溶液中で含む、請求項４２に記載の単一剤形。
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