JP2014517846A

JP2014517846A - 改善された特性を有するＦｃ含有ポリペプチドの製造方法

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Publication number: JP2014517846A
Application number: JP2014512934A
Authority: JP
Inventors: ジヤア，ドーンシーン
Original assignee: Merck Sharp and Dohme LLC
Current assignee: Merck Sharp and Dohme LLC
Priority date: 2011-05-25
Filing date: 2012-05-22
Publication date: 2014-07-24
Also published as: US20140086916A1; CA2834589A1; EP2714732A1; KR20140028013A; AU2012258907A1; US9328170B2; EP2714732A4; WO2012162277A1; CN103582650A

Abstract

本発明は、Ｆｃ領域の２４３、２６４、２６７および３２８位に突然変異を含むＦｃ含有ポリペプチドの製造のための方法および組成物に関する。
【選択図】図１

Description

本発明は、グリコシル化タンパク質（糖タンパク質）、特に、ヒトまたは動物治療用物質として有用なＦｃ含有ポリペプチドの製造のための方法および組成物に関する。

モノクローナル抗体は、しばしば、２つの結合事象によりその治療利益をもたらす。第１に、抗体の可変ドメインが標的細胞上の特異的タンパク質に結合する。抗体の定常領域（Ｆｃ）に結合し、該抗体が結合した細胞を破壊するエフェクター細胞のリクルートメントが、これに続いて生じる。

抗体（または他の免疫治療用組成物）の効力は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現するエフェクター細胞により媒介されるものを含む複数の作用メカニズムに基づく。Ｆｃ受容体は活性化または抑制性の機能的役割を有し、エフェクター細胞間でそれらの分布において異なる。単球、マクロファージおよび好中球は活性化ＦｃＲおよび抑制性ＦｃＲの両方を発現するが、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は活性化ＦｃＲＩＩＩａを発現するに過ぎない。したがって、抗体（または他の免疫治療用物質）が種々のＦｃ受容体に結合しうる度合が臨床結果に重要である。

抗体Ｆｃドメインのアミノ酸および糖の操作は、抗体および他の免疫治療用物質のエフェクター細胞機能を修飾するための２つの方法である。例えば、Ｃｈｕら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ４５：３９２６−３９３３（２００８）を参照されたい。

改善された特性を有する抗体またはＦｃ融合タンパク質を製造することが望ましいであろう。例えば、Ｆｃガンマ受容体ＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）には結合するがＦｃガンマ受容体ＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）およびＦｃガンマ受容体ＩＩＩＡ（ＣＤ１６Ａ）およびＦｃガンマ受容体Ｉ（ＣＤ６４）には結合しない（または低減したアフィニティで結合する）抗体または他の免疫治療用物質を製造することが望ましいであろう。そのような抗体はエフェクター機能の欠如（または有意な低下）および抗炎症特性の増強により特徴づけられるであろう。

Ｎ−グリコシル化の存在が抗体のエフェクター機能における役割を果たしているだけでなく、Ｎ結合オリゴ糖の個々の組成もその最終的な機能に重要である。例えば、フコースの欠如または二分岐Ｎ−アセチルグルコサミンの存在はＡＤＣＣの強度に正に相関されている（Ｒｏｔｈｍａｎ（１９８９），Ｕｍａｎａら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６−１８０（１９９９），Ｓｈｉｅｌｄｓら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３−２６７４０（２００２）およびＳｈｉｎｋａｗａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３４６６−３４７３（２００３））。Ｆｃ領域におけるシアル酸化が静脈内用免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）の抗炎症特性に対して正に相関するという証拠も存在する。例えば、Ｋａｎｅｋｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１３：６７０−６７３，２００６；ＮｉｍｍｅｒｊａｈｎおよびＲａｖｅｔｃｈ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２０４：１１−１５，２００７を参照されたい。

抗体の機能および効力における特異的Ｎ−グリコシル化の効用を考慮すると、抗体のＮ結合オリゴ糖の組成を修飾するための方法、ならびに抗体および他の免疫治療用物質のエフェクター機能を修飾する方法が望ましいであろう。

酵母および他の真菌宿主は組換えタンパク質の製造のための重要な製造媒体である。酵母は真核生物であり、したがって、分泌経路内で生じる翻訳後修飾の多くを含む、高等真核生物と共通の進化的過程を有する。糖操作における最近の進歩は、ヒトにおけるグリコシル化の過程を模倣した一連の酵素反応を行うことを可能にする遺伝的に修飾されたグリコシル化経路を有する酵母株ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）の細胞系をもたらしている。例えば、ヒト対応物と実質的に同一である下等真核宿主細胞における組換え糖タンパク質の製造方法を記載している米国特許第７，０２９，８７２号、第７，３２６，６８１号および第７，４４９，３０８号を参照されたい。前記方法によりピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）において産生されるものと同様のヒト様シアル酸化二分岐複合体Ｎ結合グリカンは治療用糖タンパク質の製造に関する有用性を示している。したがって、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）のような酵母における抗体の製造を更に修飾または改善するための方法が望ましいであろう。

発明の概括
本発明は、Ｆｃ領域のアミノ酸位置２４３、２６４、２６７および３２８位に突然変異を含むＦｃ含有ポリペプチドに関するものであり、ここで、番号付けはＫａｂａｔにおけるものと同様のＥＵインデックスに準拠している。１つの実施形態においては、２４３位の突然変異は、Ｆ２４３Ａ、Ｆ２４３Ｇ、Ｆ２４３Ｓ、Ｆ２４３Ｔ、Ｆ２４３Ｖ、Ｆ２４３Ｌ、Ｆ２４３Ｉ、Ｆ２４３Ｄ、Ｆ２４３Ｙ、Ｆ２４３Ｅ、Ｆ２４３Ｒ、Ｆ２４３ＷおよびＦ２４３Ｋからなる群から選択され、２６４位の突然変異は、Ｖ２６４Ａ、Ｖ２６４Ｇ、Ｖ２６４Ｓ、Ｖ２６４Ｔ、Ｖ２６４Ｄ、Ｖ２６４Ｅ、Ｖ２６４Ｋ、Ｖ２６４Ｗ、Ｖ２６４Ｈ、Ｖ２６４Ｐ、Ｖ２６４Ｎ、Ｖ２６４ＱおよびＶ２６４Ｌからなる群から選択され、２６７位の突然変異は、Ｓ２６７Ｄ、Ｓ２６７Ｙ、Ｓ２６７Ｔからなる群から選択され、３２８位の突然変異は、Ｌ３２８Ｙ、Ｌ３２８Ｗ、Ｌ３２８Ｈからなる群から選択される。１つの実施形態においては、２４３位および２６４位の突然変異は、Ｆ２４３ＡおよびＶ２６４Ａ、Ｆ２４３ＹおよびＶ２６４Ｇ、Ｆ２４３ＴおよびＶ２６４Ｇ、Ｆ２４３ＬおよびＶ２６４Ａ、Ｆ２４３ＬおよびＶ２６４Ｎ、ならびにＦ２４３ＶおよびＶ２６４Ｇからなる群から選択される。１つの実施形態においては、該突然変異はＦ２４３Ａ、Ｖ２６４Ａ、Ｓ２６７ＥおよびＬ３２８Ｆである。

１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは抗体または抗体フラグメントである。１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、配列番号７、配列番号８または配列番号１７を含む抗体フラグメントである。もう１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、配列番号７、配列番号８または配列番号１７からなる（または実質的になる）抗体フラグメントである。

１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、配列番号４の重鎖アミノ酸配列またはその変異体と配列番号２の軽鎖アミノ酸配列またはその変異体とを含む抗体である。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、配列番号１１の重鎖アミノ酸配列またはその変異体と配列番号１０の軽鎖アミノ酸配列またはその変異体とを含む抗体である。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、配列番号１２の重鎖アミノ酸配列またはその変異体と配列番号１３の軽鎖アミノ酸配列またはその変異体とを含む抗体である。

幾つかの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、シアル酸（ＮＡＮＡ、ＮＧＮＡならびにそれらの類似体および誘導体を含む）を含むＮ−グリカンを含む。１つの実施形態においては、該Ｎグリカンは、ＳＡ_{（１−４）}Ｇａｌ_{（１−４）}ＧｌｃＮＡｃ_{（２−４）}Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２またはＳＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ_２から選択される構造を有する。１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドはα−２，３およびα−２，６結合シアル酸の混合物を含む。もう１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドはα−２，６結合シアル酸のみを含む。１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドはα−２，６結合シアル酸を含み、検出可能なレベルのα−２，３結合シアル酸を含まない。１つの実施形態においては、該シアル酸はＮ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）もしくはＮ−グリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）またはそれらの混合物である。もう１つの実施形態においては、該シアル酸は、シアル酸の９位にアセチル化を含有するＮＡＮＡまたはＮＧＮＡの類似体または誘導体である。１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチド上のＮ−グリカンはＮＡＮＡを含み、ＮＧＮＡを含まない。１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチド上のＮ−グリカンはα−２，６結合ＮＡＮＡを含む（そしてＮＧＮＡを含まない）。１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、ＳＡ_{（１−４）}Ｇａｌ_{（１−４）}ＧｌｃＮＡｃ_{（２−４）}Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２またはＳＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ_２（ここで、該シアル酸残基はα−２，６結合を介して存在する）から選択される構造を含むシアル酸化Ｎ−グリカンを含む抗体または抗体フラグメントである。本発明のＦｃ含有ポリペプチド上のＮ−グリカンは、所望により、フコースを含みうる。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチド上のＮ−グリカンはフコシル化Ｎ−グリカンと非フコシル化Ｎ−グリカンとの混合物を含む。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチド上のＮ−グリカンはフコースを欠く。

１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、親Ｆｃ含有ポリペプチドと比較した場合に以下の特性の１以上を有する：（ｉ）エフェクター機能の低下、（ｉｉ）抗炎症特性の増強、（ｉｉｉ）レクチンへの結合の増強、（ｉｖ）ＦｃγＲＩＩａへの結合の低下、（ｖ）ＦｃγＲＩＩｂへの結合の増強、（ｖｉ）ＦｃγＲＩＩＩａへの結合の低下、および（ｖ）ＦｃγＲＩＩＩｂへの結合の低下。

１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、親Ｆｃ含有ポリペプチドと比較して低下したエフェクター機能を有する。１つの実施形態においては、該エフェクター機能はＡＤＣＣである。もう１つの実施形態においては、該エフェクター機能はＣＤＣである。もう１つの実施形態においては、該エフェクター機能はＡＤＣＰである。

１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、親Ｆｃ含有ポリペプチドと比較して低下したＡＤＣＣ活性を有する。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドはＡＤＣＣ活性における少なくとも１００倍の低下を伴う。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドはＡＤＣＣ活性における少なくとも５００倍の低下を伴う。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドはＡＤＣＣ活性における少なくとも１０００倍の低下を伴う。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、検出可能なＡＤＣＣ活性を有さない。

もう１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、親Ｆｃ含有ポリペプチドと比較して低下したＡＤＣＰ活性を有する。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、検出可能なＡＤＣＰ活性を有さない。

もう１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、親Ｆｃ含有ポリペプチドと比較して低下したＣＤＣ活性を有する。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドはＣＤＣ活性における少なくとも１００倍の低下を伴う。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、検出可能なＣＤＣ活性を有さない。

１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、親Ｆｃ含有ポリペプチドと比較した場合に以下の特性を有する：（ｉ）ＦｃγＲＩＩａへの結合の低下、（ｉｉ）ＦｃγＲＩＩｂへの結合の増強、（ｉｉｉ）ＦｃγＲＩＩＩａへの結合の低下、および（ｉｖ）ＦｃγＲＩＩＩｂへの結合の低下。

１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、親Ｆｃ含有ポリペプチドと比較した場合に以下の特性を有する：（ｉ）ＦｃγＲＩＩａへの結合の低下、（ｉｉ）ＦｃγＲＩＩｂへの結合の増強、および（ｉｉｉ）ＦｃγＲＩＩＩａへの結合の低下。

１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩａまたはＦｃγＲＩＩＩｂへの検出可能な結合を示さない。１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて結合が検出された場合に、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩｂへの検出可能な結合を示さない。

１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、親Ｆｃ含有ポリペプチドと比較して少なくとも２倍増加したアフィニティでＦｃγＲＩＩｂに結合する。１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、親Ｆｃ含有ポリペプチドと比較して少なくとも４倍増加したアフィニティでＦｃγＲＩＩｂに結合する。

１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、親Ｆｃ含有ポリペプチドと比較して増強した抗炎症特性を有する。

１つの実施形態においては、該親Ｆｃ含有ポリペプチドは天然Ｆｃ領域を含む。もう１つの実施形態においては、該親Ｆｃ含有ポリペプチドはＦ２４３Ａ突然変異を含む。もう１つの実施形態においては、該親Ｆｃ含有ポリペプチドはＶ２６４Ａ突然変異を含む。もう１つの実施形態においては、該親Ｆｃ含有ポリペプチドはＦ２４３Ａ突然変異およびＶ２６４Ａ突然変異を含む。

本発明はまた、（ｉ）Ｆｃ含有ポリペプチドを産生するように遺伝的に操作された宿主細胞を準備し（ここで、該宿主細胞は、Ｆｃ領域のアミノ酸位置２４３、２６４、２６７および３２８位に突然変異をコードする核酸を含み、ここで、番号付けはＫａｂａｔにおけるものと同様のＥＵインデックスに準拠している）、（ｉｉ）該Ｆｃ含有ポリペプチドの発現を引き起こす条件下で該宿主細胞を培養し、（ｉｉｉ）該宿主細胞から該Ｆｃ含有ポリペプチドを単離することを含む、宿主細胞におけるＦｃ含有ポリペプチドの製造方法を含む。１つの実施形態においては、該核酸がコードする２４３位の突然変異は、Ｆ２４３Ａ、Ｆ２４３Ｇ、Ｆ２４３Ｓ、Ｆ２４３Ｔ、Ｆ２４３Ｖ、Ｆ２４３Ｌ、Ｆ２４３Ｉ、Ｆ２４３Ｄ、Ｆ２４３Ｙ、Ｆ２４３Ｅ、Ｆ２４３Ｒ、Ｆ２４３ＷおよびＦ２４３Ｋからなる群から選択され、２６４位の突然変異は、Ｖ２６４Ａ、Ｖ２６４Ｇ、Ｖ２６４Ｓ、Ｖ２６４Ｔ、Ｖ２６４Ｄ、Ｖ２６４Ｅ、Ｖ２６４Ｋ、Ｖ２６４Ｗ、Ｖ２６４Ｈ、Ｖ２６４Ｐ、Ｖ２６４Ｎ、Ｖ２６４ＱおよびＶ２６４Ｌからなる群から選択され、２６７位の突然変異は、Ｓ２６７Ｄ、Ｓ２６７Ｙ、Ｓ２６７Ｔからなる群から選択され、３２８位の突然変異は、Ｌ３２８Ｙ、Ｌ３２８Ｗ、Ｌ３２８Ｈからなる群から選択される。１つの実施形態においては、２４３および２６４位の突然変異は、Ｆ２４３ＡおよびＶ２６４Ａ、Ｆ２４３ＹおよびＶ２６４Ｇ、Ｆ２４３ＴおよびＶ２６４Ｇ、Ｆ２４３ＬおよびＶ２６４Ａ、Ｆ２４３ＬおよびＶ２６４Ｎ、ならびにＦ２４３ＶおよびＶ２６４Ｇからなる群から選択される。１つの実施形態においては、該核酸は突然変異Ｆ２４３Ａ、Ｖ２６４Ａ、Ｓ２６７ＥおよびＬ３２８Ｆをコードしている。１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは抗体または抗体フラグメントである。

１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、配列番号７、配列番号８または配列番号１７を含む抗体フラグメントである。もう１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、配列番号７、配列番号８または配列番号１７からなる（または実質的になる）抗体フラグメントである。

１つの実施形態においては、Ｆｃ含有ポリペプチドの製造方法を哺乳類細胞において実施する。もう１つの実施形態においては、Ｆｃ含有ポリペプチドの製造方法を植物細胞において実施する。もう１つの実施形態においては、Ｆｃ含有ポリペプチドの製造方法を細菌において実施する。もう１つの実施形態においては、Ｆｃ含有ポリペプチドの製造方法を昆虫細胞において実施する。もう１つの実施形態においては、Ｆｃ含有ポリペプチドの製造方法を下等真核細胞において実施する。もう１つの実施形態においては、Ｆｃ含有ポリペプチドの製造方法を酵母細胞において実施する。１つの実施形態においては、Ｆｃ含有ポリペプチドの製造方法をピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）において実施する。

１つの実施形態においては、特許請求している方法により製造されるＦｃ含有ポリペプチドは、シアル酸（ＮＡＮＡ、ＮＧＮＡならびにそれらの類似体および誘導体を含む）を含むＮ−グリカンを含む。１つの実施形態においては、特許請求している方法により製造されるＦｃ含有ポリペプチドは、該Ｆｃ含有ポリペプチド上のＮ−グリカンの少なくとも４０モル％、７０モル％または９０モル％がシアル酸化されている（ＳＡ_{（１−４）}Ｇａｌ_{（１−４）}ＧｌｃＮＡｃ_{（２−４）}Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２またはＳＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ_２から選択される構造を有する）、Ｎ−グリカン組成を有する。１つの実施形態においては、特許請求している方法により製造されるＦｃ含有ポリペプチドはα−２，３およびα−２，６結合シアル酸の混合物を含む。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドはα−２，６結合シアル酸のみを含む。１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドはα−２，６結合シアル酸を含み、検出可能なレベルのα−２，３結合シアル酸を含まない。１つの実施形態においては、該シアル酸はＮ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）またはＮ−グリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）またはそれらの混合物である。もう１つの実施形態においては、該シアル酸は、該シアル酸上の９位にアセチル化を含有するＮＡＮＡまたはＮＧＮＡの類似体または誘導体である。１つの実施形態においては、特許請求している方法により製造されるＦｃ含有ポリペプチド上のＮ−グリカンはＮＡＮＡを含み、ＮＧＮＡを含まない。１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチド上のＮ−グリカンはα−２，６結合ＮＡＮＡを含む（そしてＮＧＮＡを含まない）。

１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、ＳＡ_{（１−４）}Ｇａｌ_{（１−４）}ＧｌｃＮＡｃ_{（２−４）}Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２またはＳＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ_２（ここで、該シアル酸残基はα−２，６結合を介して存在する）から選択される構造を含むシアル酸化Ｎ−グリカンを含む抗体または抗体フラグメントである。

特許請求している方法により製造されるＦｃ含有ポリペプチド上のＮ−グリカンは、所望により、フコースを含みうる。１つの実施形態においては、特許請求している方法により製造されるＦｃ含有ポリペプチド上のＮ−グリカンはフコシル化Ｎ−グリカンと非フコシル化Ｎ−グリカンとの混合物を含む。１つの実施形態においては、特許請求している方法により製造されるＦｃ含有ポリペプチド上のＮ−グリカンはフコースを欠く。

１つの実施形態においては、特許請求している方法により製造されるＦｃ含有ポリペプチドは、全シアル酸化Ｎ−グリカンの量および比率が親Ｆｃ含有ポリペプチドと比較して増加している、Ｎ−グリカン組成を有する。

幾つかの実施形態においては、特許請求している方法により製造されるＦｃ含有ポリペプチドは、親Ｆｃ含有ポリペプチドと比較した場合に以下の特性の１以上を有する：（ｉ）エフェクター機能の低下、（ｉｉ）抗炎症特性の増強、（ｉｉｉ）レクチン（例えば、ＣＤ２２（Ｓｉｇｌｅｃ２））への結合の増強、（ｉｖ）ＦｃγＲＩＩａへの結合の低下、（ｖ）ＦｃγＲＩＩｂへの結合の増強、（ｖｉ）ＦｃγＲＩＩＩａへの結合の低下、および（ｖ）ＦｃγＲＩＩＩｂへの結合の低下。

１つの実施形態においては、特許請求している方法により製造されるＦｃ含有ポリペプチドは、親Ｆｃ含有ポリペプチドと比較して低下したエフェクター機能を有する。１つの実施形態においては、該エフェクター機能はＡＤＣＣである。もう１つの実施形態においては、該エフェクター機能はＣＤＣである。もう１つの実施形態においては、該エフェクター機能はＡＤＣＰである。

もう１つの実施形態においては、特許請求している方法により製造されるＦｃ含有ポリペプチドは、親Ｆｃ含有ポリペプチドと比較して低下したＣＤＣ活性を有する。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドはＣＤＣ活性における少なくとも１００倍の低下を伴う。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、検出可能なＣＤＣ活性を有さない。

１つの実施形態においては、特許請求している方法により製造されるＦｃ含有ポリペプチドは、親Ｆｃ含有ポリペプチドと比較した場合に以下の特性を有する：（ｉ）ＦｃγＲＩＩａへの結合の低下、（ｉｉ）ＦｃγＲＩＩｂへの結合の増強、（ｉｉｉ）ＦｃγＲＩＩＩａへの結合の低下、および（ｖ）ＦｃγＲＩＩＩｂへの結合の低下。

１つの実施形態においては、特許請求している方法により製造されるＦｃ含有ポリペプチドは、親Ｆｃ含有ポリペプチドと比較した場合に以下の特性を有する：（ｉ）ＦｃγＲＩＩａへの結合の低下、（ｉｉ）ＦｃγＲＩＩｂへの結合の増強、および（ｉｉｉ）ＦｃγＲＩＩＩａへの結合の低下。

１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩａまたはＦｃγＲＩＩＩｂへの検出可能な結合を示さない。１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて結合が検出された場合に、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩａまたはＦｃγＲＩＩＩｂへの検出可能な結合を示さない。

１つの実施形態においては、特許請求している方法により製造されるＦｃ含有ポリペプチドは、親Ｆｃ含有ポリペプチドと比較して増強した抗炎症特性を有する。

本発明はまた、親Ｆｃ含有ポリペプチドの２４３、２６４、２６７および３２８位（該番号付けはＫａｂａｔにおけるものと同様のＥＵインデックスに準拠している）に突然変異を導入することを含む、Ｆｃ含有ポリペプチドのエフェクター機能を低下させる方法を含み、ここで、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、親Ｆｃ含有ポリペプチドと比較して低下したエフェクター機能を有する。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは突然変異Ｆ２４３Ａ、Ｖ２６４Ａ、Ｓ２６７ＥおよびＬ３２８Ｆを含む。１つの実施形態においては、該エフェクター機能はＡＤＣＣである。もう１つの実施形態においては、該エフェクター機能はＣＤＣである。１つの実施形態においては、該エフェクター機能はＡＤＣＰである。１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは抗体または抗体フラグメントである。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、配列番号７を含む抗体フラグメントである。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、配列番号８を含む抗体フラグメントである。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、配列番号１７を含む抗体フラグメントである。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、配列番号７、配列番号８または配列番号１７からなる（または実質的になる）抗体フラグメントである。１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、ＳＡ_{（１−４）}Ｇａｌ_{（１−４）}ＧｌｃＮＡｃ_{（２−４）}Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２またはＳＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ_２（ここで、該シアル酸残基はα−２，６結合を介して存在する）から選択される構造を含むシアル酸化Ｎ−グリカンを含む。１つの実施形態においては、該親Ｆｃ含有ポリペプチドは天然Ｆｃ領域を含む。もう１つの実施形態においては、該親Ｆｃ含有ポリペプチドはＦ２４３Ａ突然変異を含む。もう１つの実施形態においては、該親Ｆｃ含有ポリペプチドはＶ２６４Ａ突然変異を含む。もう１つの実施形態においては、該親Ｆｃ含有ポリペプチドはＦ２４３Ａ突然変異およびＶ２６４Ａ突然変異を含む。

本発明はまた、親Ｆｃ含有ポリペプチドの２４３、２６４、２６７および３２８位（該番号付けはＫａｂａｔにおけるものと同様のＥＵインデックスに準拠している）に突然変異を導入することを含む、Ｆｃ含有ポリペプチドの抗炎症特性を増強する方法を含み、ここで、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、親Ｆｃ含有ポリペプチドと比較して増強した抗炎症活性を有する。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは突然変異Ｆ２４３Ａ、Ｖ２６４Ａ、Ｓ２６７ＥおよびＬ３２８Ｆを含む。１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは抗体または抗体フラグメントである。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、ＡＰＲＩＬ、ＩＮＦ−α、ＢＡＦＦ（ＢＬｙｓ）、ＣＤ２２、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２３Ｒ、ＩＬ−２５、ＩＬ−２７、ＩＬ−３３、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２０、ＣＤ５２、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ１４７、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＴＳＬＰ、ＴＳＬＰＲ、ＰＤ−１、ＰＤＬ１、ＣＴＬＡ４、ＶＬＡ−４、ＶＥＧＦ、ＰＣＳＫ９、α４β７−インテグリン、Ｅ−セレクチン、ＦａｃｔＩＩ、ＩＣＡＭ−３、ベータ２−インテグリン、ＩＦＮγ、Ｃ５、ＣＢＬ、ＬＣＡＴ、ＣＲ３、ＭＤＬ−１、ＧＩＴＲ、ＡＤＤＬ、ＣＧＲＰ、ＴＲＫＡ、ＩＧＦ１Ｒ、ＲＡＮＫＬ、ＧＴＣまたは前記分子のいずれかに対する受容体からなる群から選択される抗原に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメントである。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドはＴＮＦ−αに結合する。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドはＨｅｒ２に結合する。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドはＰＣＳＫ９に結合する。１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、配列番号７を含む抗体フラグメントである。もう１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、配列番号８を含む抗体フラグメントである。もう１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、配列番号１７を含む抗体フラグメントである。もう１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、配列番号７または配列番号８または配列番号１７からなる（または実質的になる）抗体フラグメントである。１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、ＳＡ_{（１−４）}Ｇａｌ_{（１−４）}ＧｌｃＮＡｃ_{（２−４）}Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２またはＳＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ_２（ここで、該シアル酸残基はα−２，６結合を介して存在する）から選択される構造を含むシアル酸化Ｎ−グリカンを含む抗体または抗体フラグメントである。１つの実施形態においては、該親Ｆｃ含有ポリペプチドは天然Ｆｃ領域を含む。もう１つの実施形態においては、該親Ｆｃ含有ポリペプチドはＦ２４３Ａ突然変異を含む。もう１つの実施形態においては、該親Ｆｃ含有ポリペプチドはＶ２６４Ａ突然変異を含む。もう１つの実施形態においては、該親Ｆｃ含有ポリペプチドはＦ２４３Ａ突然変異およびＶ２６４Ａ突然変異を含む。

本発明はまた、炎症の治療に有用な親Ｆｃ含有ポリペプチド（例えば、炎症に関与する抗原に結合する抗体またはイムノアドヘシン）を選択し、該Ｆｃ領域の２４３、２６４、２６７および３２８位（該番号付けはＫａｂａｔにおけるものと同様のＥＵインデックスに準拠している）に突然変異を導入することを含む、Ｆｃ含有ポリペプチドの抗炎症特性を増強する方法を含み、ここで、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、該親Ｆｃ含有ポリペプチドと比較して増強した抗炎症活性を有する。１つの実施形態においては、該核酸は突然変異Ｆ２４３Ａ、Ｖ２６４Ａ、Ｓ２６７ＥおよびＬ３２８Ｆをコードしている。１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは抗体または抗体フラグメントである。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、ＡＰＲＩＬ、ＩＮＦ−α、ＢＡＦＦ（ＢＬｙｓ）、ＣＤ２２、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２３Ｒ、ＩＬ−２５、ＩＬ−２７、ＩＬ−３３、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２０、ＣＤ５２、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ１４７、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＴＳＬＰ、ＴＳＬＰＲ、ＰＤ−１、ＰＤＬ１、ＣＴＬＡ４、ＶＬＡ−４、ＶＥＧＦ、ＰＣＳＫ９、α４β７−インテグリン、Ｅ−セレクチン、ＦａｃｔＩＩ、ＩＣＡＭ−３、ベータ２−インテグリン、ＩＦＮγ、Ｃ５、ＣＢＬ、ＬＣＡＴ、ＣＲ３、ＭＤＬ−１、ＧＩＴＲ、ＡＤＤＬ、ＣＧＲＰ、ＴＲＫＡ、ＩＧＦ１Ｒ、ＲＡＮＫＬ、ＧＴＣまたは前記分子のいずれかに対する受容体からなる群から選択される抗原に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメントである。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドはＴＮＦ−αに結合する。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドはＨｅｒ２に結合する。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドはＰＣＳＫ９に結合する。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、配列番号７を含む抗体フラグメントである。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、配列番号８を含む抗体フラグメントである。もう１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、配列番号１７を含む抗体フラグメントである。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、配列番号７または配列番号８または配列番号１７からなる（または実質的になる）抗体フラグメントである。１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、ＳＡ_{（１−４）}Ｇａｌ_{（１−４）}ＧｌｃＮＡｃ_{（２−４）}Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２またはＳＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ_２（ここで、該シアル酸残基はα−２，６結合を介して存在する）から選択される構造を含むシアル酸化Ｎ−グリカンを含む抗体または抗体フラグメントである。１つの実施形態においては、該親Ｆｃ含有ポリペプチドは天然Ｆｃ領域を含む。もう１つの実施形態においては、該親Ｆｃ含有ポリペプチドはＦ２４３Ａ突然変異を含む。もう１つの実施形態においては、該親Ｆｃ含有ポリペプチドはＶ２６４Ａ突然変異を含む。もう１つの実施形態においては、該親Ｆｃ含有ポリペプチドはＦ２４３Ａ突然変異およびＶ２６４Ａ突然変異を含む。

本発明はまた、炎症状態の治療を要する対象における炎症状態の治療方法を含み、該方法は、２４３、２６４、２６７および３２８位（該番号付けはＫａｂａｔにおけるものと同様のＥＵインデックスに準拠している）に突然変異を含むＦｃ含有ポリペプチドの治療的有効量を該対象に投与することを含む。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＲＡＮＫＬ、ＴＲＡＰ、ＡＴＰ６ｖ０ｄ２、ＭＤＬ−１、ＤＡＰ１２、ＣＤ１１ｂ、ＴＩＭＰ−１、ＭＭＰ９、ＣＴＳＫ、ＰＵ−１、ＭＣＰ１，ＭＩＰ１α、Ｃｘｃｌ１−Ｇｒｏａ、ＣＸｃｌ２−Ｇｒｏｂ、ＣＤ１８、ＴＮＦ、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃγＲＩＶからなる群から選択される遺伝子の発現を低下させる。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは突然変異Ｆ２４３Ａ、Ｖ２６４Ａ、Ｓ２６７ＥおよびＬ３２８Ｆを含む。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは非経口投与される。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは皮下投与される。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは抗体またはその抗原結合性フラグメントである。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、炎症状態の治療に有用な抗体またはその抗原結合性フラグメントである。１つの実施形態においては、該抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＡＰＲＩＬ、ＩＮＦ−α、ＢＡＦＦ（ＢＬｙｓ）、ＣＤ２２、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２３Ｒ、ＩＬ−２５、ＩＬ−２７、ＩＬ−３３、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２０、ＣＤ５２、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ１４７、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＴＳＬＰ、ＴＳＬＰＲ、ＰＤ−１、ＰＤＬ１、ＣＴＬＡ４、ＶＬＡ−４、ＶＥＧＦ、ＰＣＳＫ９、α４β７−インテグリン、Ｅ−セレクチン、ＦａｃｔＩＩ、ＩＣＡＭ−３、ベータ２−インテグリン、ＩＦＮγ、Ｃ５、ＣＢＬ、ＬＣＡＴ、ＣＲ３、ＭＤＬ−１、ＧＩＴＲ、ＡＤＤＬ、ＣＧＲＰ、ＴＲＫＡ、ＩＧＦ１Ｒ、ＲＡＮＫＬ、ＧＴＣまたは前記分子のいずれかに対する受容体からなる群から選択される抗原に結合する。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドはＴＮＦ−αに結合する。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドはＨｅｒ２に結合する。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドはＰＣＳＫ９に結合する。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、配列番号７を含む抗体フラグメントである。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、配列番号８を含む抗体フラグメントである。もう１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、配列番号１７を含む抗体フラグメントである。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、配列番号７または配列番号８または配列番号１７からなる（または実質的になる）抗体フラグメントである。１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、ＳＡ_{（１−４）}Ｇａｌ_{（１−４）}ＧｌｃＮＡｃ_{（２−４）}Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２またはＳＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ_２（ここで、該シアル酸残基はα−２，６結合を介して存在する）から選択される構造を含むシアル酸化Ｎ−グリカンを含む抗体または抗体フラグメントである。

本明細書に開示するもう１つの発明は、Ｆｃ含有ポリペプチドを含む医薬組成物に関するものであり、ここで、該Ｆｃ含有ポリペプチド上のＮ−グリカンの少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％は、ＳＡ_{（１−４）}Ｇａｌ_{（１−４）}ＧｌｃＮＡｃ_{（２−４）}Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２およびＳＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ_２からなる群から選択されるオリゴ糖構造を含み、該Ｆｃ含有ポリペプチドは該Ｆｃ領域のアミノ酸位置２４３、２６４、２６７および３２８位（該番号付けはＫａｂａｔにおけるものと同様のＥＵインデックスに準拠している）に突然変異を含む。１つの実施形態においては、該突然変異はＦ２４３Ａ、Ｖ２６４Ａ、Ｓ２６７ＥおよびＬ３２８Ｆである。１つの実施形態においては、該シアル酸化Ｎ−グリカンはα−２，３およびα−２，６結合シアル酸の混合物を含む。もう１つの実施形態においては、該シアル酸化Ｎ−グリカンはα−２，６結合シアル酸のみを含む。もう１つの実施形態においては、該シアル酸化Ｎ−グリカンはα−２，６結合シアル酸を含み、検出可能なレベルのα−２，３結合シアル酸を含まない。１つの実施形態においては、該シアル酸はＮ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）もしくはＮ−グリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）またはそれらの混合物である。もう１つの実施形態においては、該シアル酸は、シアル酸の９位にアセチル化を含有するＮＡＮＡまたはＮＧＮＡの類似体または誘導体である。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチド上のＮ−グリカンはＮＡＮＡを含み、ＮＧＮＡを含まない。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、配列番号７を含む抗体フラグメントである。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、配列番号８を含む抗体フラグメントである。もう１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、配列番号１７を含む抗体フラグメントである。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、配列番号７または配列番号８または配列番号１７からなる（または実質的になる）抗体フラグメントである。１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、ＳＡ_{（１−４）}Ｇａｌ_{（１−４）}ＧｌｃＮＡｃ_{（２−４）}Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２またはＳＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ_２（ここで、該シアル酸残基はα−２，６結合を介して存在する）から選択される構造を含むシアル酸化Ｎ−グリカンを含む抗体または抗体フラグメントである。

本明細書に開示するもう１つの発明は、Ｆｃ含有ポリペプチドを含む医薬組成物に関するものであり、ここで、該Ｆｃ含有ポリペプチド上のＮ−グリカンの少なくとも７０％、８０％または９０％は、ＳＡ_{（１−４）}Ｇａｌ_{（１−４）}ＧｌｃＮＡｃ_{（２−４）}Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２およびＳＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ_２からなる群から選択されるオリゴ糖構造を含み、ここで、該シアル酸残基は専らα−２，６結合により結合しており、該Ｎ−グリカンはフコースを欠き、該Ｆｃ含有ポリペプチドは該Ｆｃ領域のアミノ酸位置２４３、２６４、２６７および３２８位（該番号付けはＫａｂａｔにおけるものと同様のＥＵインデックスに準拠している）に突然変異を含む。１つの実施形態においては、該突然変異はＦ２４３Ａ、Ｖ２６４Ａ、Ｓ２６７ＥおよびＬ３２８Ｆである。１つの実施形態においては、該シアル酸化Ｎ−グリカンはα−２，３およびα−２，６結合シアル酸の混合物を含む。もう１つの実施形態においては、該シアル酸化Ｎ−グリカンはα−２，６結合シアル酸のみを含む。もう１つの実施形態においては、該シアル酸化Ｎ−グリカンはα−２，６結合シアル酸を含み、検出可能なレベルのα−２，３結合シアル酸を含まない。１つの実施形態においては、該シアル酸はＮ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）もしくはＮ−グリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）またはそれらの混合物である。もう１つの実施形態においては、該シアル酸は、シアル酸の９位にアセチル化を含有するＮＡＮＡまたはＮＧＮＡの類似体または誘導体である。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチド上のＮ−グリカンはＮＡＮＡを含み、ＮＧＮＡを含まない。１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチド上のＮ−グリカンはα−２，６結合ＮＡＮＡを含む（そしてＮＧＮＡを含まない）。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、配列番号７を含む抗体フラグメントである。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、配列番号８を含む抗体フラグメントである。もう１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、配列番号１７を含む抗体フラグメントである。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、配列番号７または配列番号８または配列番号１７からなる（または実質的になる）抗体フラグメントである。

本発明はまた、重鎖と軽鎖とを含むＦｃ含有ポリペプチドを含み、ここで、該重鎖は配列番号４のアミノ酸配列またはその変異体を含み、該軽鎖は配列番号２のアミノ酸配列またはその変異体を含み、ここで、該変異体は、配列番号１の重鎖アミノ酸配列と配列番号２の軽鎖アミノ酸配列とを含む抗体と比較した場合に以下の特性の１以上を有する：（ｉ）エフェクター機能の低下、（ｉｉ）抗炎症特性の増強、（ｉｉｉ）レクチン（例えば、ＣＤ２２（Ｓｉｇｌｅｃ２））への結合の増強、（ｉｖ）ＦｃγＲＩＩａへの結合の低下、（ｖ）ＦｃγＲＩＩｂへの結合の増強、（ｖｉ）ＦｃγＲＩＩＩａへの結合の低下、および（ｖｉｉ）ＦｃγＲＩＩＩｂへの結合の低下。１つの実施形態においては、該変異体は０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個まで又はそれ以上の保存的または非保存的アミノ酸置換を含む。１つの実施形態においては、該変異体は、特許請求している配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を含む。

本発明はまた、重鎖と軽鎖とを含むＦｃ含有ポリペプチドを含み、ここで、該重鎖は配列番号４のアミノ酸配列またはその変異体を含み、該軽鎖は配列番号２のアミノ酸配列またはその変異体を含み、ここで、該変異体は、配列番号３の重鎖アミノ酸配列と配列番号２の軽鎖アミノ酸配列とを含む抗体と比較した場合に以下の特性の１以上を有する：（ｉ）エフェクター機能の低下、（ｉｉ）抗炎症特性の増強、（ｉｉｉ）レクチン（例えば、ＣＤ２２（Ｓｉｇｌｅｃ２））への結合の増強、（ｉｖ）ＦｃγＲＩＩａへの結合の低下、（ｖ）ＦｃγＲＩＩｂへの結合の増強、（ｖｉ）ＦｃγＲＩＩＩａへの結合の低下、および（ｖｉｉ）ＦｃγＲＩＩＩｂへの結合の低下。１つの実施形態においては、該変異体は０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個まで又はそれ以上の保存的または非保存的アミノ酸置換を含む。１つの実施形態においては、該変異体は、特許請求している配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を含む。

発明の詳細な説明
定義
本明細書中で用いる「Ｇ０」なる語は、ガラクトースもフコースも含有しない複合二分岐オリゴ糖ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２を意味する。

本明細書中で用いる「Ｇ１」なる語は、フコースを含有せず１個のガラクトシル残基を含有する複合二分岐オリゴ糖ＧａｌＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２を意味する。

本明細書中で用いる「Ｇ２」なる語は、フコースを含有せず２個のガラクトシル残基を含有する複合二分岐オリゴ糖Ｇａｌ_２ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２を意味する。

本明細書中で用いる「Ｇ０Ｆ」なる語は、コアフコースを含有しガラクトースを含有しない複合二分岐オリゴ糖ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２Ｆを意味する。

本明細書中で用いる「Ｇ１Ｆ」なる語は、コアフコースおよび１個のガラクトシル残基を含有する複合二分岐オリゴ糖ＧａｌＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２Ｆを意味する。

本明細書中で用いる「Ｇ２Ｆ」なる語は、コアフコースおよび２個のガラクトシル残基を含有する複合二分岐オリゴ糖Ｇａｌ_２ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２Ｆを意味する。

本明細書中で用いる「Ｍａｎ５」なる語は、以下に示すオリゴ糖構造を意味する。

本明細書中で用いる「Ｍ４」なる語はオリゴ糖Ｍａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２を意味する。

本明細書中で用いる「Ｍ５」なる語はオリゴ糖Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を意味する。

本明細書中で用いる「Ａ１」なる語はオリゴ糖ＮＡＮＡ１Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を意味する。

本明細書中で用いる「Ａ１Ｈ」なる語はオリゴ糖ＮＡＮＡ１ＧａｌＭａｎ（３−５）ＧｌｃＮＡｃ２を意味する。

本明細書中で用いる「Ａ２」なる語はオリゴ糖ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を意味する。

本明細書中で用いる「ＧＦＩ５．０」なる語は、Ｇａｌ_２ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２Ｎ−グリカンを主に有する糖タンパク質を産生する糖操作されたピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）株を意味する。

本明細書中で用いる「ＧＦＩ６．０」なる語は、ＮＡＮＡ_２Ｇａｌ_２ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２Ｎ−グリカンを主に有する糖タンパク質を産生する糖操作されたピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）株を意味する。

本明細書中で用いる「ＧＳ５．０」なる語はＮ−グリコシル化構造Ｇａｌ_２ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２を意味する。

本明細書中で用いる「ＧＳ５．５」なる語は、Ｎ−グリコシル化構造ＮＡＮＡＧａｌ_２ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２を意味し、これは、α２，６シアリルトランスフェラーゼが糖操作されているピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）株において産生された場合にはα２，６結合シアル酸を与え、α２，３シアリルトランスフェラーゼが糖操作されているピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）株において産生された場合にはα２，３結合シアル酸を与える。

本明細書中で用いる「ＧＳ６．０」なる語は、Ｎ−グリコシル化構造ＮＡＮＡ_２Ｇａｌ_２ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２を意味し、これは、α２，６シアリルトランスフェラーゼが糖操作されているピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）株において産生された場合にはα２，６結合シアル酸を与え、α２，３シアリルトランスフェラーゼが糖操作されているピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）株において産生された場合にはα２，３結合シアル酸を与える。

ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）株に関して本明細書中で用いる「野生型」または「ｗｔ」なる語は、グリコシル化を制御するための遺伝的修飾に付されていない天然ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）株を意味する。

本明細書中で用いる「抗体」なる語は、免疫グロブリン分子の可変領域内に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を介して特異的抗原に結合しうる免疫グロブリン分子を意味する。本明細書中で用いる該用語は、４つのポリペプチド鎖、すなわち、２つの同一ペアのポリペプチド鎖［各ペアは１つの「軽」鎖（ＬＣ）（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（ＨＣ）（約５０〜７０ｋＤａ）を有する］からなる完全ポリクローナルまたはモノクローナル抗体だけでなく、それらのフラグメント、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、一本鎖（ＳｃＦｖ）、それらの突然変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、および免疫グロブリン分子のいずれかの他の修飾形態（Ｃ_Ｈ２ドメインのＮ結合グリコシル化部位を含む重鎖免疫グロブリン定常領域のＣ_Ｈ２ドメインの少なくとも一部と抗原認識部位とを含むもの）、またはそれらの変異体をも含む。本明細書中で用いる該用語は、それぞれＩｇＧ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥのようないずれかのクラスの抗体を含む。

本明細書中で用いる「Ｃ_Ｈ２のコンセンサス配列」なる語は、種々の抗体のＣ_Ｈ２ドメインにおいて見出される最も共通しているアミノ酸配列に由来するＮ結合グリコシル化部位を含有する重鎖定常領域のＣ_Ｈ２ドメインのアミノ酸配列を意味する。

「Ｆｃ領域」なる語は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を示すために用いられる。「Ｆｃ領域」は天然配列Ｆｃ領域または変異体Ｆｃ領域でありうる。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は様々でありうるが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、Ｃｙｓ２２６位またはＰｒｏ２３０位のアミノ酸残基からそのカルボキシル末端までと定義される。免疫グロブリンのＦｃ領域は２つの定常ドメインＣＨ２およびＣＨ３を含み、所望により、ヒンジ領域を含みうる。１つの実施形態においては、該Ｆｃ領域は配列番号７のアミノ酸配列を含む。１つの実施形態においては、該Ｆｃ領域は配列番号８のアミノ酸配列を含む。もう１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、配列番号１７を含む抗体フラグメントである。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ領域は、３’末端におけるリシン（Ｋ）残基の付加を伴う配列番号７または配列番号８のアミノ酸配列を含む。該Ｆｃ領域は、抗体の完全長重鎖のＡｓｎ２９７部位に対応するＣＨ２ドメインにおける単一のＮ結合グリコシル化部位を含有する。

「Ｆｃ含有ポリペプチド」なる語は、Ｆｃ領域を含む、例えば抗体またはイムノアドヘシンのようなポリぺプチドを意味する。この用語は、Ｆｃ領域を含む又はＦｃ領域からなる（または実質的になる）ポリペプチドを含む。Ｆｃ領域を含むポリペプチドは抗体のパパイン消化または組換えＤＮＡ技術により製造されうる。

本明細書中で用いる「親抗体」、「親免疫グロブリン」または「親Ｆｃ含有ポリペプチド」なる語は、本明細書に開示されているＦｃ領域突然変異を欠く抗体またはＦｃ含有ポリペプチドを意味する。親Ｆｃ含有ポリペプチドは、天然配列Ｆｃ領域、または既存アミノ酸配列修飾を含有するＦｃ領域を含みうる。天然配列Ｆｃ領域は、天然で見出されるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。天然配列Ｆｃ領域は、天然配列ヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域、天然配列ヒトＩｇＧ２Ｆｃ領域、天然配列ヒトＩｇＧ３Ｆｃ領域および天然配列ヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域ならびに天然で見出されるそれらの変異体を含む。親抗体または親Ｆｃ含有ポリペプチドは、比較手段として使用される場合、いずれかの細胞内で発現されうる。１つの実施形態においては、親抗体または親Ｆｃ含有ポリペプチドは本発明のＦｃ含有ポリペプチドと同じ細胞内で発現される。

本明細書中で用いる「イムノアドヘシン」なる語は、免疫グロブリン定常ドメインと異種「アドヘシン」タンパク質（例えば、受容体、リガンドまたは酵素）の「結合ドメイン」とを併せ持つ抗体様分子を示す。構造的には、イムノアドヘシンは、抗体の抗原認識および結合部位（抗原合体部位）以外である（すなわち、「異種」である）所望の結合特異性を有するアドヘシンアミノ酸配列と免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合体を含む。本明細書中で用いる「リガンド結合ドメイン」なる語は、いずれかの天然細胞表面受容体、または対応天然受容体の少なくとも定性的リガンド結合能を保有するそのいずれかの領域もしくは誘導体を意味する。特定の実施形態においては、該受容体は、免疫グロブリンスーパー遺伝子ファミリーのメンバーに相同である細胞外ドメインを有する細胞表面ポリペプチドからのものである。免疫グロブリンスーパー遺伝子ファミリーのメンバーではないが、この定義に尚も明確に含まれる他の受容体としては、サイトカインに対する受容体、特に、チロシンキナーゼ活性を有する受容体（受容体チロシンキナーゼ）、ヘマトポエチンおよび神経成長因子のメンバー（問題の障害に哺乳動物が罹患する素因を与えるもの）が挙げられる。１つの実施形態においては、該障害は癌である。イムノアドヘシンの製造方法は当技術分野でよく知られている。例えば、ＷＯ００／４２０７２を参照されたい。

「１Ｆ１１」と称される抗体は、実施例２に開示されているアミノ酸配列を有するヒト化抗ＰＣＳＫ９抗体を意味する。

「Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）」なる語は、ラスツズマブ（ｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）としても公知の、ＣＨＯ細胞において産生された市販の抗Ｈｅｒ２抗体を意味する。

本明細書中で用いる「Ｆｃ突然変異タンパク質抗体」なる語は、本明細書に記載されている単一Ｆｃ突然変異タンパク質または二重Ｆｃ突然変異タンパク質の１つを含む抗体を意味する。

本明細書中で用いる「Ｆｃ突然変異タンパク質」なる語は、Ｆｃ領域に１以上の点突然変異が施されているＦｃ含有ポリペプチドを意味する。

本明細書中で用いる「Ｆｃ突然変異」なる語は、Ｆｃ含有ポリペプチドのＦｃ領域に施された突然変異を意味する。そのような突然変異の例には、本明細書に記載されているＦ２４３Ａ、Ｖ２６４Ａ、Ｓ２６７ＥまたはＬ３２８Ｆ突然変異が含まれる。

「Ｆ２４３Ａ」なる語は抗体重鎖のＦｃ領域の２４３位におけるＦ（野生型）からＡへの突然変異を意味する。「Ｖ２６４Ａ」なる語は抗体重鎖のＦｃ領域の２６４位におけるＶ（野生型）からＡへの突然変異を意味する。「Ｓ２６７Ｅ」なる語は抗体重鎖のＦｃ領域の２６７位におけるＳ（野生型）からＥへの突然変異を意味する。「Ｌ３２８Ｆ」なる語は抗体重鎖のＦｃ領域の３２８位におけるＬ（野生型）からＦへの突然変異を意味する。２４３、２６４、２６７および３２８位は、ＥＵ番号付け系に基づく、抗体重鎖のＦｃ含有ポリペプチドのＦｃ領域のＣＨ２ドメインにおけるアミノ酸位置を表す。

本明細書中で用いる「二重Ｆｃ突然変異タンパク質」または「ＤＭ」なる語は、Ｆｃ領域の２４３位および２６４位に突然変異を含むＦｃ含有ポリペプチドを意味する。「Ｆ２４３Ａ／Ｖ２６４Ａ」なる語は、２つの特定されている突然変異を含む二重Ｆｃ突然変異タンパク質を意味する。

本明細書中で用いる「四重Ｆｃ突然変異タンパク質」または「ＱＭ」なる語は、抗体重鎖のＦｃ領域の２４３、２６４、２６７および３２８位に突然変異を含むＦｃ含有ポリペプチドを意味する。「Ｆ２４３Ａ／Ｖ２６４Ａ／Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ」なる語は、４つの特定されている突然変異を含む四重Ｆｃ突然変異タンパク質を意味する。

本明細書および特許請求の範囲の全体において、免疫グロブリン重鎖またはＦｃ含有ポリペプチドにおける残基の番号は、Ｋａｂａｔｉら，ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ５ｔｈＥｄ．ＰｕｂｌｉｃＨｅａｌｔｈＳｅｒｖｉｃｅ，ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）（これを参照により明示的に本明細書に組み入れることとする）におけるものと同様のＥＵインデックスのものである。「Ｋａｂａｔにおけるものと同様のＥＵインデックス」はヒトＩｇＧ１ＥＵ抗体の残基番号付けを意味する。

本明細書中で用いる「エフェクター機能」なる語は、Ｆｃ受容体またはリガンドとの抗体Ｆｃ領域の相互作用から生じる生化学的事象を意味する。典型的な「エフェクター機能」には、Ｃｌｑ結合；補体依存性細胞傷害；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）のダウンレギュレーションなどが含まれる。そのようなエフェクター機能は、当技術分野で公知の種々のアッセイを用いて評価されうる。

本明細書中で用いる「糖操作（された）ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）」なる語は、ヒト様Ｎ−グリカンを発現するように遺伝的に改変されているピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）株、例えば前記のＧＦＩ５．０、ＧＦＩ５．５およびＧＦＩ６．０株を意味する。

本明細書中で用いる「Ｎ−グリカン」、「糖タンパク質」および「グリコフォーム（糖形態）」なる語は、Ｎ結合オリゴ糖、例えば、ポリペプチドのアスパラギン残基にアスパラギン−Ｎ−アセチルグルコサミン結合により結合しているＮ結合オリゴ糖を意味する。糖タンパク質上に見出される主な糖としては、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）およびシアル酸（ＳＡ、例えばＮＡＮＡ、ＮＧＮＡならびにそれらの誘導体および類似体、例えばアセチル化ＮＡＮＡまたはアセチル化ＮＧＮＡ）が挙げられる。糖操作ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）においては、シアル酸は専らＮ−アセチル−ノイラミン酸（ＮＡＮＡ）である（Ｈａｍｉｌｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ３１３（５７９２）：１４４１−１４４３（２００６））。Ｎ−グリカンはＭａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２の共通の五糖コアを有し、ここで、「Ｍａｎ」はマンノースを意味し、「Ｇｌｃ」はグルコースを意味し、「ＮＡｃ」はＮ−アセチルを意味し、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンを意味する。Ｎ−グリカンは、「トリマンノースコア」、「五糖コア」または「小（ｐａｕｃｉ）マンノースコア」とも称されるＭａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２（「Ｍａｎ３」）コア構造に付加される周辺糖（例えば、ＧｌｃＮＡｃ、ガラクトース、フコースおよびシアル酸）を含む分岐（アンテナ）の数において異なる。Ｎ−グリカンは、その分岐（分枝）構成成分に従い分類される（例えば、高マンノース、複合またはハイブリッド）。

本明細書中で用いる「シアル酸」または「ＳＡ」なる語は、限定的ではないが以下のものを含むシアル酸ファミリーのいずれかのメンバーを意味する：Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５ＡｃまたはＮＡＮＡ）、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）およびそれらのいずれかの類似体または誘導体（該シアル酸分子上のいずれかの位置におけるアセチル化により生じるものを含む）。シアル酸は、多数の複合糖質の必須成分である約３０個の天然に存在する酸性炭水化物の一群に関する一般名である。Ｓｃｈａｕｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．ＳｏｃｉｅｔｙＴｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ，１１，２７０−２７１（１９８３）。シアル酸は、通常、オリゴ糖の末端残基である。Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）は最も一般的なシアル酸形態であり、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）はそれに続く２番目に一般的な形態である。Ｓｃｈａｕｅｒ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，１，４４９−４５２（１９９１）。ＮＧＮＡは動物界全体に広範囲に広まっており、種および組織に応じて、しばしば、複合糖質結合シアル酸の相当な割合を占める。ある種、例えばニワトリおよびヒトは例外的である。なぜなら、それらは正常組織においてＮＧＮＡを欠くからである。Ｃｏｒｆｉｅｌｄら，ＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙＭｏｎｏｇｒａｐｈｓ，１０，５−５０（１９８２）。ヒト血清サンプルにおいては、ＮＧＮＡの形態のシアル酸の割合は全シアル酸の０．０１％であると報告されている。Ｓｃｈａｕｅｒ，“ＳｉａｌｉｃＡｃｉｄｓａｓＡｎｔｉｇｅｎｉｃＤｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓｏｆＣｏｍｐｌｅｘＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ”［ＴｈｅＭｏｌｅｃｕｌａｒＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙｏｆＣｏｍｐｌｅｘＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ，（ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８８）中に見出される］。

本明細書中で用いる「ヒト様Ｎ−グリカン」なる語は、未操作野生型ヒト細胞により産生されるオリゴ糖に酷似しているＮ結合オリゴ糖を意味する。例えば、野生型ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）および他の下等真核細胞は、典型的に、Ｎ−グリコシル化部位における高マンノシル化タンパク質を産生する。本明細書に記載されている宿主細胞は、高マンノシル化されていないヒト様Ｎ−グリカンを含む糖タンパク質（例えば、抗体）を産生する。幾つかの実施形態においては、本発明の宿主細胞は、ハイブリッドおよび／または複合Ｎ−グリカンを伴うヒト様Ｎ−グリカンを産生しうる。本発明の宿主細胞から産生される個々の糖タンパク質上に存在する個々のタイプの「ヒト様」グリカンは、該宿主細胞において行われる個々の糖操作工程に左右されるであろう。

本明細書中で用いる「高マンノース」型Ｎ−グリカンなる語は、５個以上のマンノース残基を有するＮ−グリカンを意味する。

本明細書中で用いる「複合」型Ｎ−グリカンなる語は、「トリマンノース」コアの１，６マンノースアームに結合した少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃと、１，３マンノースアームに結合した少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃとを有するＮ−グリカンを意味する。複合Ｎ−グリカンは、シアル酸または誘導体（例えば、「ＮＡＮＡ」または「ＮｅｕＡｃ」が挙げられ、ここで、「Ｎｅｕ」はノイラミン酸を意味し、「Ａｃ」はアセチルを意味する）で修飾されることがあるガラクトース（「Ｇａｌ」）またはＮ−アセチルガラクトサミン（「ＧａｌＮＡｃ」）残基をも有しうる。複合Ｎ−グリカンは、コアフコース（「Ｆｕｃ」）および「二分岐（ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ）」ＧｌｃＮＡｃを含む鎖内置換をも有しうる。一例として、Ｎ−グリカンがトリマンノースコア上に二分岐ＧｌｃＮＡｃを含む場合、該構造はＭａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２（ＧｌｃＮＡｃ）またはＭａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_３と表されうる。Ｎ−グリカンが、トリマンノースコアに結合したコアフコースを含む場合、該構造はＭａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２（Ｆｕｃ）と表されうる。複合Ｎ−グリカンはまた、「トリマンノース・コア」上に複数のアンテナを有することが可能であり、これは、しばしば、「多アンテナグリカン」と称される。

本明細書中で用いる「ハイブリッド」Ｎ−グリカンなる語は、トリマンノースコアの１，３マンノースアームの末端における少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃと、トリマンノースコアの１，６マンノースアーム上の０個または２個以上のマンノースとを有するＮ−グリカンを意味する。

糖タンパク質の調製物中に存在するグリカンの「モル％（モル百分率）」に言及する場合、この用語は、該タンパク質調製物をＰＮＧアーゼで処理し、ついで、グリコフォーム組成により影響されない方法（例えば、ＰＮＧアーゼにより遊離したグリカンプールを２−アミノベンズアミドのような蛍光タグで標識し、ついで高速液体クロマトグラフィーまたはキャピラリー電気泳動により分離し、ついで蛍光強度によりグリカンを定量すること）により定量した場合に遊離したＮ結合オリゴ糖のプール内に存在する特定のグリカンのモル％を意味する。例えば、５０モル％のＮＡＮＡ_２Ｇａｌ_２ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２は、遊離したグリカンの５０％がＮＡＮＡ_２Ｇａｌ_２ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２であり、残りの５０％が他のＮ結合オリゴ糖から構成されることを意味する。

本明細書中で用いる「抗炎症抗体」なる語は、炎症を治療するために使用されることが意図される抗体を意味する。Ｆｃ含有ポリペプチドの抗炎症特性は、当技術分野で公知のいずれかの方法を用いて測定されうる。１つの実施形態においては、Ｆｃ含有ポリペプチドの抗炎症特性は、動物モデル、例えば、Ｋａｎｅｋｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ３１３：６７０−６７３（２００６），Ａｎｔｈｏｎｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ３２０：３７３−３７６（２００８）および本明細書中の実施例２０〜２１に記載されているモデルを使用して測定される。もう１つの実施形態においては、Ｆｃ含有ポリペプチドの抗炎症特性は、炎症に関連した生物マーカー（限定的なものではないが以下のものを含む：ＣＲＰ、炎症性サイトカイン、例えば腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−アルファ）、インターフェロン−ガンマ、インターロイキン６（ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ケモカイン、凝血マーカーＤ−二量体、ｓＣＤ１４、腸脂肪酸結合ペプチド（ＩＦＡＢＰ）およびヒアルロン酸）のレベルを決定することにより測定される。１つの実施形態においては、Ｆｃ含有ポリペプチドの抗炎症特性は、当技術分野で公知の方法を用いてＣ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）のレベルを決定することにより測定される。Ｃ−反応性タンパク質のレベルの減少は、該Ｆｃ含有ポリペプチドが抗炎症特性を有することを示している。

「保存的に修飾された変異体」または「保存的置換」は、タンパク質中のアミノ酸が、類似特性（例えば、電荷、側鎖サイズ、疎水性／親水性、バックボーンコンホメーションおよび剛性など）を有する他のアミノ酸により置換されることを意味し、この場合、該変化は、しばしば、該タンパク質の生物活性を変化させずに施されうる。一般に、ポリペプチドの非必須領域における単一アミノ酸置換は生物活性を実質的に変化させない、と当業者は認識している（例えば、Ｗａｔｓｏｎら（１９８７）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙｏｆｔｈｅＧｅｎｅ，ＴｈｅＢｅｎｊａｍｉｎ／ＣｕｍｍｉｎｇｓＰｕｂ．Ｃｏ．，ｐ．２２４（４ｔｈＥｄ．）を参照されたい）。また、構造的または機能的に類似したアミノ酸の置換は、生物活性を損なう可能性が低い。典型的な保存的置換を以下に列挙する。

Ｆｃ領域のＡｓｎ２９７（ＥＵ番号付け系に準拠）における免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のグリコシル化は、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を含むエフェクター経路の最適な認識および活性化に必要であることが示されている。Ｗｒｉｇｈｔ＆Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，ＴｒｅｎｄｓｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５：２６−３１（１９９７），Ｔａｏ＆Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４３（８）：２５９５−２６０１（１９８９）。したがって、ＩｇＧの定常領域におけるグリコシル化操作は治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の開発のための活発な研究の領域になっている。Ａｓｎ２９７におけるＮ結合グリコシル化の存在は、ＡＤＣＣ（Ｒｏｔｈｍａｎ（１９８９），Ｌｉｆｅｌｙら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，５：８１３−８２２（１９９５），Ｕｍａｎａ（１９９９），Ｓｈｉｅｌｄｓ（２００２）およびＳｈｉｎｋａｗａ（２００３））および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）（Ｈｏｄｏｎｉｃｚｋｙら，ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＰｒｏｇ．，２１（６）：１６４４−１６５２（２００５）およびＪｅｆｆｅｒｉｓら，Ｃｈｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６５：１１１−１２８（１９９７））を含む免疫エフェクター機能アッセイにおけるｍＡｂ活性に決定的に重要であることが確認されている。機能に対するこの効果は、グリコシル化Ｆｃドメインがとる特異的コンホメーションによるものであると考えられており、これは、グリコシル化が存在しない場合には欠如しているようである。より詳しくは、ＦｃＣ_Ｈ２ドメインにおけるグリコシル化を欠くＩｇＧは、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩを含むＦｃγＲに結合しない（Ｒｏｔｈｍａｎ（１９８９））。

抗体のエフェクター機能においてはグリコシル化の存在が何らかの役割を果たしているようであるが、それだけではなく、Ｎ結合オリゴ糖の個々の組成も重要である。例えば、フコースの存在はインビトロＦｃγＲＩＩＩａ結合およびインビトロＡＤＣＣに対して顕著な効果を示す（Ｒｏｔｈｍａｎ（１９８９）およびＬｉら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４（２）：２１００−２１５（２００６））。哺乳類細胞培養、例えばＣＨＯまたはＮＳ０により産生される組換え抗体は、主にフコシル化されているＮ結合オリゴ糖を含有する（Ｈｏｓｓｌｅｒら，ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，９５（５）：９４６−９６０（２００６），Ｕｍａｎａ（１９９９）およびＪｅｆｆｅｒｉｓら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２１：１１−１６（２００５））。また、Ｆｃ領域におけるシアル酸化が抗体に抗炎症特性を付与しうるという証拠が存在する。シアル酸化形態を富化するためにレクチンカラムで精製された静脈内用免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）は、シアル酸化Ｆｃフラグメントに限定された顕著な抗炎症効果を示し、抑制性受容体ＦｃγＲＩＩｂの発現の増強に関連づけられた（ＮｉｍｍｅｒｊａｈｎおよびＲａｖｅｔｃｈ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０４：１１−１５（２００７））。

哺乳類細胞系に由来する抗体のＦｃ領域におけるグリコシル化は、典型的に、グリコフォームの異種混合物からなり、主要形態は、典型的に、複合フコシル化グリコフォーム、すなわち、Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆおよびそれらより低い比率のＧ２Ｆから構成される。Ｇ０Ｆ構造への不完全なガラクトース転移を引き起こす考えられうる状態には、限定的なものではないが、非最適化ガラクトース転移装置（例えば、β−１，４ガラクトシルトランスフェラーゼ）、およびゴルジ装置内への劣悪なＵＤＰ−ガラクトース輸送、最適未満の細胞培養およびタンパク質発現条件、ならびに該オリゴ糖に隣接するアミノ酸残基による立体障害が含まれる。これらの状態のそれぞれは末端ガラクトースの最終的な度合を調節しうるが、Ｆｃオリゴ糖への後続のシアル酸転移は、Ｃ_Ｈ２ドメインの、閉じたポケット立体配置により抑制されると考えられている。例えば、図１、Ｊｅｆｆｅｒｉｓ，Ｒ．，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ．，２４（１０）：１２３０−１２３１，２００６を参照されたい。適正な末端単糖、特にガラクトースの非存在下または不十分な末端ガラクトシル化形態の存在下では、治療用タンパク質として作用しうるシアル酸化形態を産生する可能性は、シアリルトランスフェラーゼの存在下で産生された場合であっても、ほとんどない。ヒトＩｇＧ−Ｆｃグリコフォームのタンパク質工学および構造分析は、グリコシル化プロファイルがＦｃコンホメーションにより影響されることを示している。例えば、ＣＨＯ産生ＩｇＧ３由来のオリゴ糖上のガラクトースおよびシアル酸のレベルの増加は、Ｆｃポケットからの特定のアミノ酸が、Ｆ２４１、Ｆ２４３、Ｖ２６４、Ｄ２６５およびＲ３０１を含むアラニンに突然変異した場合に生じうることが見出された（Ｌｕｎｄら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７（１１）；４９６３−４９６９（１９９６））。或る突然変異は細胞媒介性スーパーオキシド生成および補体媒介性赤血球溶解（これらは、それぞれ、ＦｃγＲＩおよびＣ１ｑ結合に関する代替マーカーとして用いられる）に何らかの影響を及ぼすことが更に示された。

高度に均一なグリコシル化を伴う糖タンパク質を分泌しうる宿主株を得るために酵母を遺伝的に操作することが報告されている。Ｃｈｏｉら，ＰＮＡＳ，ＵＳＡ１００（９）：５０２２−５０２７（２００３）は、α１，２マンノシダーゼ触媒ドメインおよびＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメインのライブラリーを、触媒ドメインを分泌経路に局在化する真菌ＩＩ型膜タンパク質リーダー配列のライブラリーと組合せて使用することを記載している。このようにして、均一なＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２またはＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２Ｎ−グリカン構造を有するインビボ糖タンパク質を産生する株が単離された。Ｈａｍｉｌｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ３１３（５７９２）：１４４１−１４４３（２００６）は、主としてビシアル酸化グリカン構造体ＧＳ６．０，ＮＡＮＡ_２Ｇａｌ_２ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２（９０．５％）およびモノシアル酸化体ＧＳ５．５，ＮＡＮＡＧａｌ_２ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２（７．９％）からなるグリカン組成を有するものとしてピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）において産生された糖タンパク質エリスロポエチンの製造を記載している。しかし、類似株において産生される抗体は、それより著しく低いシアル酸化Ｎ−グリカン含量を有するであろう。なぜなら、図４において見られるとおり、該抗体においては末端ガラクトース基質のレベルが相対的に低いからである。また、Ｆｃオリゴ糖のシアル酸化は治療用静脈内用ガンマグロブリンおよびそのＦｃフラグメントに抗炎症特性を付与すること（Ｋａｎｅｋｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ３１３（５７８７）：６７０−６７３（２００６））、ならびに該抗炎症活性はシアル酸のα２，６−結合形態には依存するが、α２，３形態には依存しないこと（Ａｎｔｈｏｎｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２０：３７３−３７６（２００８））が、最近示されている。

宿主生物および細胞系
本発明のＦｃ含有ポリペプチドはいずれかの宿主生物または細胞系において製造されうる。１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、シアル酸化Ｎ−グリカンを産生しうる宿主細胞において製造される。

１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは哺乳類細胞において製造されることが可能であり、この場合、該細胞は、内因的に又は遺伝的もしくはプロセス操作により、末端α２−６およびα２−３シアル酸の混合物または末端α２−６シアル酸のみを含有する糖タンパク質を産生する。培養（組織培養）における哺乳類細胞の増殖は常套手段となっている。有用な哺乳類宿主細胞系の具体例としては、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎ＣＶ１系（ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１）；ヒト胎児腎系（懸濁培養内での増殖のためにサブクローニングされた２９３または２９３細胞）；乳児ハムスター腎細胞（ＢＨＫ，ＡＴＣＣＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４）；サル腎細胞（ＣＶ１ＡＴＣＣＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣＣＣＬ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣＣＣＬ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ，ＡＴＣＣＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣＣＣＬ７５）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２，ＨＢ８０６５）；マウス乳癌（ＭＭＴ０６０５６２，ＡＴＣＣＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；ハイブリドーマ細胞系；ＮＳ０；ＳＰ２／０；およびヒト肝癌系（ＨｅｐＧ２）が挙げられる。

１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、シアル酸化Ｎ−グリカンを産生するように操作された植物細胞において製造されうる。例えば、Ｃｏｘら，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００６）２４，１５９１−１５９７（２００６）およびＣａｓｔｉｌｈｏら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５（２１）：１５９２３−１５９３０（２０１０）を参照されたい。

１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、シアル酸化Ｎ−グリカンを産生するように操作された昆虫細胞において製造されうる。例えば、ＨａｒｒｉｓｏｎおよびＪａｒｖｉｓ，Ａｄｖ．ＶｉｒｕｓＲｅｓ．６８：１５９−９１（２００６）を参照されたい。

１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、シアル酸化Ｎ−グリカンを産生するように操作された細菌細胞において製造されうる。例えば、Ｌｉｚａｋら，ＢｉｏｃｏｎｉｕｅａｔｅＣｈｅｍ．２２：４８８−４９６（２０１１）を参照されたい。

１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは下等真核宿主細胞または生物において製造されうる。最近の進歩は、下等真核宿主生物、酵母および糸状菌、例えばピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）における完全ヒト化治療用物質の製造を可能にしている（Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓら，米国特許第７，０２９，８７２号および米国特許第７，４４９，３０８号（それらの開示を参照により本明細書に組み入れることとする））。Ｊａｃｏｂｓら，ＮａｔｕｒｅＰｒｏｔｏｃｏｌｓ４（１）：５８−７０（２００９）も参照されたい。

ＦｃγＲおよびＣ１ｑ結合の低下に基づけば、親抗体と比較して低下したエフェクター機能を有する組換えグリコシル化抗体を製造するために本明細書に記載の材料および方法が使用可能である。このようにして本発明の方法によりピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）において製造された抗体は、特異的Ｆｃ突然変異を欠く糖操作ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞において又は自らの内在性グリコシル化装置を保有するピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞において製造された抗体と比較して、エフェクター機能の低下を伴って高収率で製造され、末端α２，６結合シアル酸残基を有する糖タンパク質の主要種を有していた。

１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、末端シアル酸を含む主要Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生するように操作された宿主細胞、より好ましくは酵母または糸状菌宿主細胞において製造される。本発明の１つの実施形態においては、該主要Ｎ−グリカンは、いずれのα２，３結合シアル酸をも産生しない、α２，６シアリルトランスフェラーゼで糖操作された株において産生されるＳＡ_２Ｇａｌ_２ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２のα２，６結合形態である。他の実施形態においては、該株は、α２，３シアリルトランスフェラーゼを単独で又はα２，６シアリルトランスフェラーゼと共に発現してα２，３結合シアル酸またはα２，６結合シアル酸とα２，３結合シアル酸との組合せ体を主要Ｎ−グリカンとして産生するように操作される。

本発明のＦｃ含有ポリペプチドを製造するために使用される細胞系は、いずれかの細胞系、例えば、１以上のシアル酸化糖タンパク質を産生する能力を有する細胞系でありうる。本明細書に記載の材料および方法は、本明細書中に一例として記載されているピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）の特定の株には限定されず、例えばＧａｌ_２ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３のような１以上の末端ガラクトースを有するＮ−グリカンを産生するあらゆるピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）株または他の酵母もしくは糸状菌株を含む、と当業者は認識し理解するであろう。該末端ガラクトースはα２，６結合シアル酸の産生のための基質として作用して、Ｎ−グリカン構造ＮＡＮＡ_２Ｇａｌ_２ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２を与える。適当な株の例は米国特許第７，０２９，８７２号、ＵＳ２００６−０２８６６３７およびＨａｍｉｌｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ３１３（５７９２）：１４４１−１４４３（２００６）（それらの記載を、該記載が完全に記載されているのと同様に、本明細書に組み入れることとする）に記載されている。

一般に、タンパク質、特に糖タンパク質の発現には、下等真核生物、例えば酵母が使用される。なぜなら、それらは経済的に培養可能であり、高い収率を与えることが可能であり、適当に修飾された場合には適当なグリコシル化が可能だからである。酵母は特に、迅速な形質転換、試験されたタンパク質局在化方法および簡便な遺伝子ノックアウト技術を可能にする確立された遺伝学を提供する。適当なベクターは、発現制御配列、例えばプロモーター（３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解糖酵素を含む）、および複製起点、終結配列などを、所望により有する。

本明細書においてはメチロトローフ酵母ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）を使用して本発明が実証されているが、他の有用な下等真核宿主細胞には以下のものが含まれる：ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピチア・フィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａｆｉｎｌａｎｄｉｃａ）、ピチア・トレハロフィラ（Ｐｉｃｈｉａｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ピチア・コクラメ（Ｐｉｃｈｉａｋｏｃｌａｍａｅ）、ピチア・メンブラネファシエンス（Ｐｉｃｈｉａｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）、ピチア・ミヌタ（Ｐｉｃｈｉａｍｉｎｕｔａ）（オガタエア・ミヌタ（Ｏｇａｔａｅａｍｉｎｕｔａ）、ピチア・リンドネリ（Ｐｉｃｈｉａｌｉｎｄｎｅｒｉ））、ピチア・オプンチエ（Ｐｉｃｈｉａｏｐｕｎｔｉａｅ）、ピチア・テルモトレランス（Ｐｉｃｈｉａｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ピチア・サリクタリア（Ｐｉｃｈｉａｓａｌｉｃｔａｒｉａ）、ピチア・グエルクウム（Ｐｉｃｈｉａｇｕｅｒｃｕｕｍ）、ピチア・ピエペリ（Ｐｉｃｈｉａｐｉｊｐｅｒｉ）、ピチア・スチプティス（Ｐｉｃｈｉａｓｔｉｐｔｉｓ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピチア属種（Ｐｉｃｈｉａｓｐ．）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス属種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｓｐ．）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クライベロミセス属種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｓｐ．）、クライベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｌａｃｔｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）、トリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）、クリソスポリウム・ルックノウエンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、フザリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｐ．）、フザリウム・グラミネウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｇｒａｍｉｎｅｕｍ）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｖｅｎｅｎａｔｕｍ）およびニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａｃｒａｓｓａ）。種々の酵母、例えばクライベロミセス・ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）およびハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）は細胞培養に特に適している。なぜなら、それらは高い細胞密度まで増殖可能であり、大量の組換えタンパク質を分泌しうるからである。同様に、糸状菌、例えばアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）、フザリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｐ．）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａｃｒａｓｓａ）などは、本発明の糖タンパク質を工業的規模で製造するために使用されうる。

下等真核生物、特に酵母および糸状菌は、グリコシル化パターンがヒト様である又はヒト化されている糖タンパク質をそれらが発現するように遺伝的に修飾されうる。前記のとおり、本明細書中で用いる「ヒト様Ｎ−グリカン」なる語は、未操作野生型ヒト細胞により産生されるオリゴ糖に酷似しているＮ結合オリゴ糖を意味する。本発明の好ましい実施形態においては、本発明の宿主細胞は、ハイブリッドおよび／または複合Ｎ−グリカン、すなわち、「ヒト様Ｎ−グリコシル化」を伴うヒト様糖タンパク質を産生しうる。本発明の宿主細胞から産生される糖タンパク質上に主に存在する個々の「ヒト様」グリカンは、行われる個々の操作工程に左右されるであろう。このように、特定の所望のグリコフォームが組成物において優勢である糖タンパク質組成物が製造されうる。選択された内在性グリコシル化酵素を除去し、および／または宿主細胞を遺伝的に操作し、および／または外因性酵素を供給して、哺乳類グリコシル化経路の全部または一部を模擬することにより（米国特許第７，４４９，３０８号に記載されているとおり）、これは達成されうる。所望により、該糖タンパク質がコアフコシル化を伴って又は伴わずに産生されうるように、該グリコシル化の追加的な遺伝的操作が行われうる。下等真核宿主細胞の使用は更に有利である。なぜなら、これらの細胞は高度に均一な糖タンパク質組成物を産生して、該糖タンパク質の主要グリコフォームが該組成物中の糖タンパク質の３０モル％以上で存在しうるようにするからである。特定の態様においては、該主要グリコフォームは、該組成物中に存在する糖タンパク質の４０モル％、５０モル％、６０モル％、７０モル％以上、最も好ましくは、８０モル％以上で存在しうる。

下等真核生物、特に酵母は、グリコシル化パターンがヒト様である又はヒト化されている糖タンパク質をそれらが発現するように遺伝的に修飾されうる。選択された内在性グリコシル化酵素を除去し、および／または外因性酵素を供給することにより（Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓら，米国特許第７，４４９，３０８号に記載されているとおり）、これは達成されうる。例えば、宿主細胞は、糖タンパク質上のＮ−グリカンにマンノース残基を付加するα１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性が激減するように選択または操作されうる。

１つの実施形態においては、該宿主細胞は更に、α１，２−マンノシダーゼ触媒ドメインを含み、該触媒ドメインは、該触媒ドメインに通常は結合していない細胞標的化シグナルペプチドに融合しており、該シグナルペプチドは、α１，２−マンノシダーゼ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するように選択される。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を通る組換え糖タンパク質の通過は、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質、例えば、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームを主に含む組換え糖タンパク質組成物を産生する。例えば、米国特許第７，０２９，８７２号および米国特許第７，４４９，３０８号ならびに米国公開特許出願第２００５／０１７０４５２号は、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームを含む糖タンパク質を産生しうる下等真核宿主細胞を開示している。

更に詳細な実施形態においては、直前の宿主細胞は更に、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ（ＧｎＴＩ）触媒ドメインを含み、該触媒ドメインは、該触媒ドメインに通常は結合していない細胞標的化シグナルペプチドに融合しており、該シグナルペプチドは、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するように選択される。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を通る該組換え糖タンパク質の通過は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質、例えば、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームを主に含む組換え糖タンパク質組成物を産生する。例えば、米国特許第７，０２９，８７２号および米国特許第７，４４９，３０８号ならびに米国公開特許出願第２００５／０１７０４５２号は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームを含む糖タンパク質を産生しうる下等真核宿主細胞を開示している。前記細胞において産生された糖タンパク質をヘキソサミニダーゼでインビトロで処理して、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質を産生させることが可能である。

更に詳細な実施形態においては、直前の宿主細胞は更に、マンノシダーゼＩＩ触媒ドメインを含み、該触媒ドメインは、該触媒ドメインに通常は結合していない細胞標的化シグナルペプチドに融合しており、該シグナルペプチドは、マンノシダーゼＩＩ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するように選択される。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を通る該組換え糖タンパク質の通過は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質、例えば、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームを主に含む組換え糖タンパク質組成物を産生する。米国特許第７，０２９，８７２号および米国公開特許出願第２００４／０２３００４２号は、マンノシダーゼＩＩ酵素を発現し、ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームを主に有する糖タンパク質を産生しうる下等真核宿主細胞を開示している。前記細胞において産生された糖タンパク質をヘキソサミニダーゼでインビトロで処理して、Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質を産生させることが可能である。

更に詳細な実施形態においては、直前の宿主細胞は更に、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ（ＧｎＴＩＩ）触媒ドメインを含み、該触媒ドメインは、該触媒ドメインに通常は結合していない細胞標的化シグナルペプチドに融合しており、該シグナルペプチドは、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するように選択される。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を通る該組換え糖タンパク質の通過は、ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質、例えば、ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームを主に含む組換え糖タンパク質組成物を産生する。米国特許第７，０２９，８７２号および第７，４４９，３０８号ならびに米国公開特許出願第２００５／０１７０４５２号は、ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームを含む糖タンパク質を産生しうる下等真核宿主細胞を開示している。前記細胞において産生された糖タンパク質をヘキソサミニダーゼでインビトロで処理して、Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質を産生させることが可能である。

更に詳細な実施形態においては、直前の宿主細胞は更に、ガラクトシルトランスフェラーゼ触媒ドメインを含み、該触媒ドメインは、該触媒ドメインに通常は結合していない細胞標的化シグナルペプチドに融合しており、該シグナルペプチドは、ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するように選択される。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を通る該組換え糖タンパク質の通過は、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２もしくはＧａｌ_２ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームまたはそれらの混合物を含む組換え糖タンパク質、例えば、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームもしくはＧａｌ_２ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームまたはそれらの混合物を主に含む組換え糖タンパク質組成物を産生する。米国特許第７，０２９，８７２号および米国公開特許出願第２００６／００４０３５３号は、Ｇａｌ_２ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームを含む糖タンパク質を産生しうる下等真核宿主細胞を開示している。前記細胞において産生された糖タンパク質をガラクトシダーゼでインビトロで処理して、ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質、例えば、ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームを主に含む組換え糖タンパク質組成物を産生させることが可能である。

更に詳細な実施形態においては、直前の宿主細胞は更に、シアリルトランスフェラーゼ触媒ドメインを含み、該触媒ドメインは、該触媒ドメインに通常は結合していない細胞標的化シグナルペプチドに融合しており、該シグナルペプチドは、シアリルトランスフェラーゼ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するように選択される。好ましい実施形態においては、該シアリルトランスフェラーゼはアルファ２，６−シアリルトランスフェラーゼである。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を通る該組換え糖タンパク質の通過は、ＮＡＮＡ_２Ｇａｌ_２ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームもしくはＮＡＮＡＧａｌ_２ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームまたはそれらの混合物を主に含む組換え糖タンパク質を産生する。下等真核宿主細胞、例えば酵母および糸状菌の場合、該宿主細胞が、Ｎ−グリカンへの転移のためのＣＭＰ−シアル酸を供与するための手段を更に含むことが有用である。米国公開特許出願第２００５／０２６０７２９号は、ＣＭＰ−シアル酸合成経路を有するように下等真核生物を遺伝的に操作するための方法を開示しており、米国公開特許出願第２００６／０２８６６３７号は、シアル酸化糖タンパク質を産生するように下等真核生物を遺伝的に操作するための方法を開示している。シアル酸の量を増加させるためには、ＣＭＰ−シアル酸合成経路の２以上のコピーまたはシアリルトランスフェラーゼの２以上のコピーを含むように宿主細胞を構築することが有利でありうる。前記細胞において産生された糖タンパク質をノイラミニダーゼでインビトロで処理して、Ｇａｌ_２ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームもしくはＧａｌＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームまたはそれらの混合物を主に含む組換え糖タンパク質を産生させることが可能である。

前記宿主細胞はいずれも、米国公開特許出願第２００５／０２０８６１７号および第２００７／００３７２４８号に開示されているような二分岐（ｂｉｓｅｃｔｅｄ）（ＧｎＴＩＩＩ）および／または多分岐（ＧｎＴＩＶ、Ｖ、ＶＩおよびＩＸ）Ｎ−グリカン構造を有する糖タンパク質を産生させるためのＧｎＴＩＩＩ、ＧｎＴＩＶ、ＧｎＴＶ、ＧｎＴＶＩおよびＧｎＴＩＸからなる群から選択される１以上のＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼを更に含みうる。更に、前記宿主細胞は、ＳＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（２−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を含む組換え糖タンパク質（例えば、抗体）、例えば、ＮＡＮＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（２−４）Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２、ＮＧＮＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（２−４）Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２またはＮＡＮＡ（ｌ−４）Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（２−４）Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２とＮＧＮＡ（ｌ−４）Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（２−４）Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２との組合せを含む抗体を産生しうる。１つの実施形態においては、該組換え糖タンパク質は、ＳＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（２−４）Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２からなる群から選択される構造を含む、いずれのα２−３結合ＳＡをも欠くＮ−グリカンを含む。

更に詳細な実施形態においては、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２Ｎ−グリカンを主に有する糖タンパク質を産生する宿主細胞は更に、ガラクトシルトランスフェラーゼ触媒ドメインを含み、該触媒ドメインは、該触媒ドメインに通常は結合していない細胞標的化シグナルペプチドに融合しており、該シグナルペプチドは、ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するように選択される。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を通る該組換え糖タンパク質の通過は、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームを主に含む組換え糖タンパク質を産生する。

更に詳細な実施形態においては、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２Ｎ−グリカンを主に有する糖タンパク質を産生した直前の宿主細胞は更に、シアリルトランスフェラーゼ触媒ドメインを含み、該触媒ドメインは、該触媒ドメインに通常は結合していない細胞標的化シグナルペプチドに融合しており、該シグナルペプチドは、シアリルトランスフェラーゼ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するように選択される。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を通る該組換え糖タンパク質の通過は、ＳＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォーム（例えば、ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２もしくはＮＧＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２またはそれらの混合物）を含む組換え糖タンパク質を産生する。

前記宿主細胞はいずれも、更に、１以上の糖輸送体、例えばＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体［例えば、クライベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｌａｃｔｉｓ）およびムス・ムスクルス（Ｍｕｓｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体］、ＵＤＰ−ガラクトース輸送体［例えば、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）ＵＤＰ−ガラクトース輸送体］およびＣＭＰ−シアル酸輸送体（例えば、ヒトシアル酸輸送体）を含みうる。下等真核宿主細胞、例えば酵母および糸状菌は前記輸送体を欠くため、下等真核宿主細胞、例えば酵母および糸状菌は、前記輸送体を含むように遺伝的に操作されることが好ましい。

更に、前記宿主細胞はいずれも、更に、Ｎ−グリカン占拠を増加させるために操作されうる。例えば、Ｇａｕｌｉｔｚｅｋら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎ．１０３：１１６４−１１７５（２００９）；Ｊｏｎｅｓら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｓｐｙｈｓ．Ａｃｔａ１７２６：１２１−１３７（２００５）；ＷＯ２００６／１０７９９０を参照されたい。１つの実施形態においては、前記宿主細胞はいずれも、更に、異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼ（例えば、リーシュマニア属種（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａｓｐ．）ＳＴＴ３Ａタンパク質、ＳＴＴ３Ｂタンパク質、ＳＴＴ３Ｃタンパク質、ＳＴＴ３Ｄタンパク質またはそれらの組合せ）をコードする少なくとも１つの核酸分子、および該異種糖タンパク質をコードする核酸分子を含むように操作されることが可能であり、ここで、該宿主細胞は、内在性ＯＴａｓｅ複合体を含むタンパク質をコードする内在性宿主細胞遺伝子を発現する。１つの実施形態においては、前記宿主細胞はいずれも、更に、リーシュマニア属種（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａｓｐ．）ＳＴＴ３Ｄタンパク質をコードする少なくとも１つの核酸分子、および該異種糖タンパク質をコードする核酸分子を含むように操作されることが可能であり、ここで、該宿主細胞は、内在性ＯＴａｓｅ複合体を含むタンパク質をコードする内在性宿主細胞遺伝子を発現する。

宿主細胞には更に、α−マンノシダーゼ耐性Ｎ−グリカンを有しない糖タンパク質を産生するように遺伝的に操作された下等真核細胞（例えば酵母、例えばピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ））が含まれる。これは、ホスホマンノシルトランスフェラーゼ遺伝子ＰＮＯ１およびＭＮＮ４Ｂ（例えば、米国特許第７，１９８，９２１号および第７，２５９，００７号を参照されたい）の一方または両方を欠失または破壊することによりホスホマンノース残基を有する糖タンパク質を、ならびにβ−マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子（例えば、ＢＭＴ１、ＢＭＴ２、ＢＭＴ３およびＢＭＴ４）（米国公開特許出願第２００６／０２１１０８５号を参照されたい）の１以上を欠失または破壊することにより達成されることが可能であり、更に詳細な態様においては、それはまた、ＭＮＮ４Ａ遺伝子を欠失または破壊することを含みうる。破壊は、特定の酵素をコードするオープンリーディングフレームを破壊すること、または該オープンリーディングフレームの発現を破壊すること、または干渉性ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡなどを使用して、β−マンノシルトランスフェラーゼおよび／またはホスホマンノシルトランスフェラーゼの１以上をコードするＲＮＡの翻訳を阻害することを含む。更に、細胞は、化学的インヒビターの添加または細胞培養条件の修飾によりα−マンノシダーゼ耐性Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生しうる。これらの宿主細胞は、特定のＮ−グリカン構造を産生するように前記のとおりに更に修飾されうる。

宿主細胞には更に、タンパク質Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ［Ｄｏｌ−Ｐ−Ｍａｎ：タンパク質（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子）（ＰＭＴ）（米国特許第５，７１４，３７７号を参照されたい）］の１以上を欠失または破壊することにより糖タンパク質のＯ−グリコシル化を制御するように遺伝的に修飾された、あるいは公開国際出願番号ＷＯ２００７／０６１６３１に開示されているとおりにＰｍｔｐインヒビターおよび／またはα−マンノシダーゼの存在下で増殖された、あるいはそれらの両方に付された下等真核細胞［例えば酵母、例えばピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）］が含まれる。破壊は、Ｐｍｔｐをコードするオープンリーディングフレームを破壊すること、または該オープンリーディングフレームの発現を破壊すること、または干渉性ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡなどを使用して、Ｐｍｔｐの１以上をコードするＲＮＡの翻訳を阻害することを含む。該宿主細胞には更に、特定のＮ−グリカン構造を産生するように修飾された前記宿主細胞のいずれかが含まれうる。

Ｐｍｔｐインヒビターには、ベンジリデンチアゾリジンジオンが含まれるが、これに限定されるものではない。使用されうるベンジリデンチアゾリジンジオンの例としては、５−［［３，４−ビス（フェニルメトキシ）フェニル］メチレン］−４−オキソ−２−チオキソ−３−チアゾリジン酢酸、５−［［３−（１−フェニルエトキシ）−４−（２−フェニルエトキシ）］フェニル］メチレン］−４−オキソ−２−チオキソ−３−チアゾリジン酢酸、および５−［［３−（１−フェニル−２−ヒドロキシ）エトキシ）−４−（２−フェニルエトキシ）］フェニル］メチレン］−４−オキソ−２−チオキソ−３−チアゾリジン酢酸が挙げられる。

特定の実施形態においては、少なくとも１つの内在性ＰＭＴ遺伝子の機能または発現が低減、破壊または欠失される。例えば、特定の実施形態においては、ＰＭＴ１、ＰＭＴ２、ＰＭＴ３およびＰＭＴ４遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの内在性ＰＭＴ遺伝子の機能または発現が低減、破壊または欠失され、あるいは該宿主細胞は１以上のＰＭＴインヒビターの存在下で培養される。更に詳細な実施形態においては、該宿主細胞は１以上のＰＭＴ遺伝子の欠失または破壊を含み、該宿主細胞は１以上のＰｍｔｐインヒビターの存在下で培養される。これらの実施形態の特定の態様においては、該宿主細胞は分泌性α−１，２−マンノシダーゼをも発現する。

ＰＭＴ欠失もしくは破壊および／またはＰｍｔｐインヒビターは、Ｏ−グリコシル化の占拠を低減することにより、すなわち、グリコシル化される糖タンパク質上のＯ−グリコシル化部位の総数を減少させることにより、Ｏ−グリコシル化を制御する。該細胞により分泌されるα−１，２−マンノシダーゼの更なる添加は、該糖タンパク質上に存在するＯ−グリカンのマンノース鎖長を減少させることにより、Ｏ−グリコシル化を制御する。したがって、ＰＭＴ欠失もしくは破壊および／またはＰｍｔｐインヒビターを分泌性α−１，２−マンノシダーゼの発現と組合せることは、占拠および鎖長を減少させることによりＯ−グリコシル化を制御する。個々の状況においては、個々の異種糖タンパク質（例えば、Ｆａｂおよび抗体）は種々の度合の効率で発現されゴルジ装置から輸送される可能性があり、したがって、ＰＭＴ欠失または破壊、Ｐｍｔｐインヒビターおよびα−１，２−マンノシダーゼの特定の組合せを要しうるため、ＰＭＴ欠失または破壊、Ｐｍｔｐインヒビターおよびα−１，２−マンノシダーゼの個々の組合せは実験的に決定される。もう１つの態様においては、１以上の内在性マンノシルトランスフェラーゼ酵素をコードする遺伝子が欠失される。この欠失は分泌性α−１，２−マンノシダーゼおよび／またはＰＭＴインヒビターの供与と組合されることが可能であり、あるいは分泌性α−１，２−マンノシダーゼおよび／またはＰＭＴインヒビターの供与の代わりに行われうる。

したがって、Ｏ−グリコシル化の制御は、より良好な通算収率または適切に構築された糖タンパク質の収率で、本明細書に開示されている宿主細胞において特定の糖タンパク質を製造するのに有用でありうる。Ｏ−グリコシル化の低減または排除は、全抗体およびＦａｂフラグメントが分泌経路を横断し細胞表面へ輸送される際の、該全抗体およびＦａｂフラグメントの構築および輸送に有益な効果をもたらすらしい。したがって、Ｏ−グリコシル化が制御された細胞においては、適切に構築された抗体またはＦａｂフラグメントの収率が、Ｏ−グリコシル化が制御されていない宿主細胞において得られる収率と比較して増加する。

α−マンノシダーゼに耐性である、β−結合マンノース残基を有するＮ−グリカンおよびＯ−グリカンの可能性を減少させ又は排除するために、β−マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子（例えば、ＢＭＴ１、ＢＭＴ２、ＢＭＴ３およびＢＭＴ４）の１以上を欠失または破壊することにより、α−マンノシダーゼ耐性Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を除去するために、組換え糖操作ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞を遺伝的に操作する（米国特許第７，４６５，５７７号および米国特許第７，７１３，７１９号を参照されたい）。また、ＢＭＴ２とＢＭＴ１、ＢＭＴ３およびＢＭＴ４の１以上との欠失または破壊は、宿主細胞タンパク質に対する抗体に対する検出可能な交差反応性を低減または排除する。

糖タンパク質の収率は、幾つかの場合には、哺乳類またはヒトシャペロンタンパク質をコードする核酸分子を過剰発現させることにより、あるいは１以上の内在性シャペロンタンパク質をコードする遺伝子を、１以上の哺乳類またはヒトシャペロンタンパク質をコードする核酸分子で置換することにより改善されうる。また、宿主細胞における哺乳類またはヒトシャペロンタンパク質の発現も該細胞におけるＯ−グリコシル化を制御するらしい。したがって、シャペロンタンパク質をコードする少なくとも１つの内在性遺伝子の機能が低減または排除されており、該シャペロンタンパク質の哺乳類またはヒトホモログの少なくとも１つをコードするベクターが細胞内で発現される、本発明における宿主細胞が更に含まれる。また、該内在性宿主細胞シャペロンおよび該哺乳類またはヒトシャペロンタンパク質が発現される宿主細胞も含まれる。更に詳細な態様においては、下等真核宿主細胞は酵母または糸状菌宿主細胞である。組換えタンパク質の収率の改善およびＯ−グリコシル化の低減または制御のためにヒトシャペロンタンパク質が導入される、宿主細胞のシャペロンの使用の具体例は、公開国際出願番号ＷＯ２００９１０５３５７およびＷＯ２０１００１９４８７（それらの開示を参照により本明細書に組み入れることとする）に開示されている。前記と同様に、該内在性シャペロンタンパク質の１以上をコードする遺伝子を、１以上の哺乳類またはヒトシャペロンタンパク質をコードする核酸分子で置換すること、あるいは前記のとおりに１以上の哺乳類またはヒトシャペロンタンパク質を過剰発現させることに加えて、タンパク質Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）タンパク質をコードする少なくとも１つの内在性遺伝子の機能または発現が低減、破壊または欠失されている、下等真核宿主細胞が更に含まれる。特定の実施形態においては、ＰＭＴ１、ＰＭＴ２、ＰＭＴ３およびＰＭＴ４遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの内在性ＰＭＴ遺伝子の機能が低減、破壊または欠失されている。

また、Ｏ−グリコシル化は、抗体またはＦａｂフラグメントの、抗原に対するアフィニティおよび／またはアビディティに影響を及ぼしうる。抗体またはＦａｂの製造のための最終的な宿主細胞が、該抗体の選択に使用された宿主細胞と同じでない場合に、これは特に重要でありうる。例えば、Ｏ−グリコシル化は、抗体またはＦａｂフラグメントの、抗原に対するアフィニティを阻害し、したがって、該阻害が無ければ抗原に対する高いアフィニティを有しうる抗体またはＦａｂフラグメントは特定されない可能性があるであろう。なぜなら、Ｏ−グリコシル化は、抗体またはＦａｂフラグメントが抗原に結合する能力を阻害しうるからである。他の場合には、Ｏ−グリコシル化は、抗体またはＦａｂフラグメントの、抗原に対するアビディティを阻害するため、抗原に対する高いアビディティを有する抗体またはＦａｂフラグメントは特定されない可能性があるであろう。前記の２つの場合においては、該抗体またはＦａｂフラグメントを特定し選択するための宿主細胞が、別の細胞型のもの、例えば酵母または真菌細胞（例えば、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ））であったため、哺乳類細胞系において産生された場合に特に有効でありうる抗体またはＦａｂフラグメントは特定されない可能性があるであろう。酵母におけるＯ−グリコシル化は哺乳類細胞におけるＯ−グリコシル化と有意に異なりうることがよく知られている。これは、野生型酵母Ｏ−グリコシル化を哺乳類におけるムチン型またはジストログリカン型Ｏ−グリコシル化と比較した場合に特に顕著である。特定の場合には、Ｏ−グリコシル化は、抗原結合を妨げるのではなく、抗体またはＦａｂフラグメントの、抗原に対するアフィニティまたはアビディティを増強しうるであろう。この効果は、抗体またはＦａｂフラグメントを特定し選択するために使用される宿主細胞と製造用宿主細胞が異なることになる（例えば、特定および選択は酵母において行われ、該製造用宿主は哺乳類細胞である）場合には望ましくない。なぜなら、該製造用宿主においては、該Ｏ−グリコシル化は、もはや、該抗原に対するアフィニティまたはアビディティの増強を引き起こしたタイプのものではないからである。したがって、Ｏ−グリコシル化の制御は、特定の抗原に対する特異性を有する抗体またはＦａｂフラグメントを、該抗体またはＦａｂフラグメントの特定および選択が宿主細胞のＯ−グリコシル化系により影響されることなく、該抗体またはＦａｂフラグメントの該抗原に対するアフィニティまたはアビディティに基づいて特定し選択するための、本明細書における材料および方法の使用を可能にしうる。したがって、Ｏ−グリコシル化の制御は更に、哺乳類細胞系において最終的に産生された抗体またはＦａｂフラグメントを特定し選択するための、酵母または真菌宿主細胞の有用性を増大させる。

本明細書に記載されている方法および材料を、特定のＮ−グリカンまたはシアル酸化糖タンパク質を産生するように遺伝的に操作された他のピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）および酵母細胞系、例えば、特定のガラクトシル化またはシアル酸化形態を産生するように遺伝的に操作された前記の宿主生物および細胞系（これらに限定されるものではない）と共に利用する方法を、当業者は更に認識し理解するであろう。例えば、ＵＳ２００６−０２８６６３７（ＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆＳｉａｌｙｌａｔｅｄＮ−ＧｌｙｃａｎｓｉｎＬｏｗｅｒＥｕｋａｒｙｏｔｅｓ）（その記載を、それが完全に記載されている場合と同様に本明細書に組み入れることとする）を参照されたい。それにおいては、炭素源としてのガラクトースの取り込み及び利用のための経路が遺伝的に修飾されている。

また、本明細書における方法は、α２，６シアリルトランスフェラーゼ活性を有さないヒト様およびヒト糖タンパク質を産生するように操作された他の下等真核細胞系において前記の組換えＦｃ含有ポリペプチドを製造するために使用されうる。該方法は、シアル酸化Ｎ−グリカンの産生が固有の特徴である真核細胞系において前記の組換えＦｃ含有ポリペプチドを製造するためにも使用されうる。

該Ｆｃ含有ポリペプチド上のα２，３およびα２，６結合シアル酸のレベルは、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、順相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、およびパルス化電流測定検出を伴う高速アニオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ）を含むよく知られた技術を用いて測定されうる。

Ｆｃ突然変異タンパク質の生物学的特性
多数のＦｃ含有ポリペプチドに関しては、ＦｃγＲおよびＣ１ｑ結合の低下により示される、エフェクター機能の欠如またはその有意な低下（Ｉｄｕｓｏｇｉｅら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１６４（８）：４１７８−８４（２０００）およびＳｈｉｅｌｄｓら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６：６５９１−６６０４（２００１））、ならびに抗炎症特性の増強は、望ましい特性であろう。

本出願人は、前記の所望の特性を有するＦｃ含有ポリペプチドを与える四重Ｆｃ突然変異タンパク質Ｆ２４３Ａ／Ｖ２６４Ａ／Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆを本発明において開発した。本明細書における実施例は、Ｆｃ領域の２４３、２６４、２６７および３２８位に突然変異を含むＦｃ含有ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドベクターで宿主細胞を形質転換し、該形質転換宿主細胞を培養して、該Ｆｃ含有ポリペプチドを得ることを含む。

Ｆｃ含有ポリペプチドの製造
本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、Ｆｃ領域を含むポリペプチドの製造に適した当技術分野で公知のいずれかの方法に従い製造されうる。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、抗体または抗体フラグメント（限定的なものではないが、抗体のＦｃ領域からなる又は実質的になるポリペプチドを含む）である。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドはイムノアドヘシンである。抗体および抗体フラグメントの製造方法は当技術分野でよく知られている。ポリペプチド内への点突然変異の導入方法、例えば部位特異的突然変異誘発も当技術分野でよく知られている。

本明細書に開示されている実施例においては、コンセンサスＣ_Ｈ２配列を含有するＩｇＧ１重鎖および軽鎖ならびに本明細書に記載されているＦｃ二重突然変異体は２つの異なる糖操作ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）株において発現された。後記実施例に記載されているとおり、重鎖および軽鎖遺伝子配列はメタノール誘導プロモーターＡＯＸ１および組込まれたブレオマイシン（ゼオシン）選択マーカーの制御下にあった。この方法は相同ＤＮＡ組換えにより発現カセット全体をＴｒｐ２遺伝子座内に組込む。

プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーおよびそれに続くＳｏｕｒｃｅ３０Ｓカチオン交換精製工程により発酵ブロスから分泌抗体を捕捉した。精製された抗体をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図２）により特徴づけして、適切な構築を評価した。図２から分かるとおり、本明細書における材料および方法により製造された抗体は適切に構築されていた。

本明細書における材料および方法により製造された種々の抗体に対する抗原アフィニティを、Ｂｉａｃｏｅを使用する、細胞に基づくアッセイにより測定した。予想どおり、該Ｆｃ突然変異タンパク質を含む該抗体の全てはＰＣＳＫ９抗原に同等に良好に結合した。

Ｆｃ突然変異タンパク質のＮ−グリカン分析
ある抗体を含む多数の糖タンパク質に関しては、ＩｇＧＦｃ領域の末端Ｎ結合グリカンのシアル酸化は、治療活性をもたらす適正なコンホメーションを有する糖タンパク質および抗体の産生に必須である。例えば、末端シアル酸化がＩＶＩＧ調製物の抗炎症活性と相関されている、Ａｎｔｈｏｎｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２０：３７３−３７６（２００８）を参照されたい。シアル酸化は最後から２番目のガラクトースの存在を要し、それに対してシアリルトランスフェラーゼが作用してシアル酸化グリカンを形成する。したがって、１以上の末端ガラクトースグリコフォームを欠く糖タンパク質は、抗炎症活性を伴うα２，６結合シアル酸組成を有する抗体を産生し得ない。

哺乳類細胞はそのタンパク質上のシアル酸化の完全な能力を有するが、空間的締め付けのため、哺乳類細胞培養、例えばＣＨＯ細胞において産生された抗体は、そのＮ２９７結合グリカンへの不完全なガラクトース転移さえも有する。更に、更なる空間的障害のため、ＣＨＯのような哺乳類細胞からの抗体のシアル酸化のレベルは、通常、そのＮ２９７結合グリカンにおいてシアル酸をほとんど又は全く含有しない。ＣＨＯ細胞での製造の場合、シアル酸が添加されると、それはα２，３結合により連結される。ＣＨＯ細胞は、抗炎症活性に関連づけられている（Ｌｅｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１３８４８−１３８５５（１９８９））シアル酸のα２，６結合形態を産生するのに必要なα２，６シアリルトランスフェラーゼを発現しない。ＣＨＯにおける特定のα２，６シアリルトランスフェラーゼの過剰発現はα２，３結合およびα２，６結合シアル酸の混合物を与えうる（Ｂｒａｇｏｎｚｉら，ＢＢＡ１４７４：２７３−２８２（２０００）；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２８９：２４３−２４９（２００１））。

糖操作ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＦＩ５．０株は高レベルのガラクトシル化非抗体タンパク質、例えばエリスロポエチンを産生することが可能であり（Ｈａｍｉｌｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１３：１４４１−１４４３（２００６））、α２，６結合シアル酸化形態を形成するための作用対象となりうる相対的に低い量の末端ガラクトースを含有する抗体を産生する。そのようなピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）株において産生された抗体は、典型的に、グリコフォームＧ０（６０％）、Ｇ１（１７％）、Ｇ２（４％）およびＭａｎ５（８％）を含む組成を有する。Ｇ０（４３．５％）、Ｇ１（２０．８％）、Ｇ２（２．７％）、ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２（５．５％）およびＮＡＮＡＧａｌ_２ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２（４．９％）を含むグリカン組成を有する、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＦＩ６．０株において産生された抗体でさえも、相対的に低いレベルのα２，６結合シアル酸化形態を有する。したがって、ＧＦＩ５．０および６．０株において産生された抗体は、同じ株において産生された非抗体タンパク質（例えば、エリスロポエチン）と比較して遥かに低いレベルのガラクトシル化およびシアル酸化を有する。

ＧＦＩ５．０株（ＹＧＬＹ２１３５１）からのピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）野生型ＰＣＳＫ−９抗体（１Ｆ１１）はＭ４、Ｇ０、Ｇ１、Ｍ６、Ｇ２グリカンを含んでいた。ＧＦＩ６．０株（ＹＧＬＹ２３２５８）からのピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）二重突然変異タンパク質ＰＣＳＫ−９抗体（１Ｆ１１Ｆ２４３Ａ／Ｖ２６４Ａ）のグリコフォームはＧ０、Ｍ５、Ｇ１、Ｇ２、Ａ１およびＡ２グリカンを含んでいた。ＧＦＩ６．０株からのピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）１Ｆ１１Ｆ２４３Ａ／Ｖ２６４Ａ／Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ）のグリコフォームはＡ１、Ａ１ＨおよびＡ２（ＹＧＬＹ２５２６７）およびＧ２、Ｍａｎ５、Ａ１およびＡ２（ＹＧＬＹ２５２６９）を含んでいた。

Ｆｃ突然変異タンパク質のＦｃγＲ結合
ＥＬＩＳＡに基づくアッセイを用いて、本出願人は、商業的に入手可能なＨｅｒｃｃｅｐｔｉｎ（ヘルセプチン）、野生型抗ＰＣＳＫ９抗体（１Ｆ１１）、Ｆ２４３Ａ／Ｖ２４３Ａ突然変異を有する二重突然変異タンパク質抗ＰＣＳＫ９（１Ｆ１１）抗体、およびＦ２４３Ａ／Ｖ２６４Ａ／Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ突然変異を有する四重突然変異タンパク質抗ＰＣＳＫ９（１Ｆ１１）抗体へのＦｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）結合を比較した。実施例に示されているとおり、Ｆｃ四重突然変異タンパク質は、天然Ｆｃ領域を有する抗体と比較して、またはＦ２４３Ａ／Ｖ２６４Ａ二重突然変異を有する抗体と比較して、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａおよびＦｃγＲＩＩａに対するアフィニティの低下、ならびにＦｃγＲＩＩｂに対するアフィニティの増強を示した。

該二重突然変異タンパク質も該四重突然変異タンパク質もＦｃγＲＩＩａに結合しない。

該二重突然変異タンパク質も該四重突然変異タンパク質もＦｃγＲＩＩＩａ−Ｆ１５８またはＦｃγＲＩＩＩａ−Ｖ１５８に結合しない。

しかし、該四重突然変異タンパク質はＦｃγＲＩＩｂへの結合の増強を示しており、これは驚くべきことである。なぜなら、該二重突然変異タンパク質はこの受容体への最低限度の結合しか示していないからである。

総合すると、該四重Ｆｃ突然変異タンパク質は、マクロファージ、単球およびナチュラルキラー細胞のような免疫細胞を活性化しリクルートする傾向が、該抗体の二重突然変異タンパク質または非突然変異タンパク質（天然）形態と比べて低いことを、これらのデータは示唆している。

生物学的標的
後記実施例においては、抗ＰＣＳＫ９抗体を使用する本発明の材料および方法を本出願人は例示しているが、本発明は、開示されている抗体に限定されないことに注目すべきである。本明細書における材料および方法は、抗炎症活性の増強またはエフェクター機能の低下の特性が望ましい任意のＦｃ含有ポリペプチドを製造するために使用されうる、と当業者は認識し理解するであろう。更に、本発明によりこのようにして製造されるＦｃ含有ポリペプチドまたは抗体のタイプ（型）には何ら制限がないことに注目すべきである。該Ｆｃ含有ポリペプチドのＦｃ領域はＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭからのものでありうる。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドのＦｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４を含むＩｇＧからのものである。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドのＦｃ領域はＩｇＧ１からのものである。特定の実施形態においては、本明細書における材料および方法により製造される抗体または抗体フラグメントはヒト化抗体、キメラ抗体またはヒト抗体でありうる。

幾つかの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、炎症に関与する生物学的標的に結合する。

幾つかの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは炎症性サイトカインに結合する。幾つかの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、以下のものからなる群から選択される分子に結合する：ＡＰＲＩＬ、ＩＮＦ−α、ＢＡＦＦ（ＢＬｙｓ）、ＣＤ２２、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２３Ｒ、ＩＬ−２５、ＩＬ−２７、ＩＬ−３３、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２０、ＣＤ５２、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ１４７、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＴＳＬＰ、ＴＳＬＰＲ、ＰＤ−１、ＰＤＬ１、ＣＴＬＡ４、ＶＬＡ−４、ＶＥＧＦ、ＰＣＳＫ９、α４β７−インテグリン、Ｅ−セレクチン、ＦａｃｔＩＩ、ＩＣＡＭ−３、ベータ２−インテグリン、ＩＦＮγ、Ｃ５、ＣＢＬ、ＬＣＡＴ、ＣＲ３、ＭＤＬ−１、ＧＩＴＲ、ＡＤＤＬ、ＣＧＲＰ、ＴＲＫＡ、ＩＧＦ１Ｒ、ＲＡＮＫＬ、ＧＴＣ、αＢＬｙｓまたは前記分子のいずれかに対する受容体。１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドはＴＮＦ−αに結合する。もう１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドはＨｅｒ２に結合する。もう１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドはＰＣＳＫ９に結合する。もう１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドはＴＮＦＲに結合する。もう１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドはＬＣＡＴに結合する。もう１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドはＴＳＬＰに結合する。もう１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドはＰＤ−１に結合する。もう１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドはＩＬ−２３に結合する。

幾つかの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、自己免疫抗原、アレルゲン、ＭＨＣ分子またはリーザス因子Ｄ抗原から選択される抗原に特異的である。例えば、ＷＯ２０１０／１０９１０（これを参照により本明細書に組み入れることとする）の表１に挙げられている抗原を参照されたい。

抗炎症特性を増強させる又はエフェクター機能／細胞傷害性を低下させる方法
本発明はまた、炎症状態の治療に有用な親Ｆｃ含有ポリペプチド（例えば、炎症に関与する抗原に結合する抗体またはイムノアドヘシン）を選択し、該Ｆｃ含有ポリペプチドの２４３、２６４、２６７および３２８位（該番号付けはＫａｂａｔにおけるものと同様のＥＵインデックスに準拠している）に突然変異を導入することを含む、Ｆｃ含有ポリペプチドの抗炎症特性を増強する方法を含み、ここで、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、該親Ｆｃ含有ポリペプチドと比較して増強した抗炎症活性を有する。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは突然変異Ｆ２４３Ａ、Ｖ２６４Ａ、Ｓ２６７ＥおよびＬ３２８Ｆを含む。１つの実施形態においては、該親Ｆｃ含有ポリペプチドは、炎症に関与する抗原に結合する抗体、抗体フラグメントまたはイムノアドヘシンである。１つの実施形態においては、該親Ｆｃ含有ポリペプチドは、炎症状態の治療のために既に市販されている又は開発中である抗体、抗体フラグメントまたはイムノアドヘシンである。もう１つの実施形態においては、該親Ｆｃ含有ポリペプチドは、以下のものからなる群から選択される抗体である：ムロモナブ（Ｍｕｒｏｍｏｎａｂ）−ＣＤ３（抗ＣＤ３受容体抗体）、アブシキシマブ（Ａｂｃｉｘｉｍａｂ）（抗ＣＤ４１７Ｅ３抗体）、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）（抗ＣＤ２０抗体）、ダクリズマブ（Ｄａｃｌｉｚｕｍａｂ）（抗ＣＤ２５抗体）、バシリキシマブ（Ｂａｓｉｌｉｘｉｍａｂ）（抗ＣＤ２５抗体）、パリビズマブ（Ｐａｌｉｖｉｚｕｍａｂ）（抗ＲＳＶ（呼吸器性シンシチウムウイルス）抗体）、インフリキシマブ（Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）（抗ＴＮＦα抗体）、トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）（抗Ｈｅｒ２抗体）、ゲムツズマブオゾガマイシン（Ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ）（抗ＣＤ３３抗体）、アレムツズマブ（Ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ）（抗ＣＤ５２抗体）、イブリツモマブチウキセテン（Ｉｂｒｉｔｕｍｏｍａｂｔｉｕｘｅｔｅｎ）（抗ＣＤ２０抗体）、アダリムマブ（Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ）（抗ＴＮＦα抗体）、オマリズマブ（Ｏｍａｌｉｚｕｍａｂ）（抗ＩｇＥ抗体）、トシツモマブ（Ｔｏｓｉｔｕｍｏｍａｂ）−^１３１Ｉ（抗ＣＤ２０抗体のヨウ素化誘導体）、エファリズマブ（Ｅｆａｌｉｚｕｍａｂ）（抗ＣＤ１１ａ抗体）、セツキシマブ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）（抗ＥＧＦ受容体抗体）、ゴリムマブ（Ｇｏｌｉｍｕｍａｂ）（抗ＴＮＦα抗体）、ベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）（抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体）、ナタリズマブ（Ｎａｔａｌｉｚｕｍａｂ）（抗α４インテグリン）、エファリズマブ（Ｅｆａｌｉｚｕｍａｂ）（抗ＣＤ１１ａ）、セトリズマブ（Ｃｅｔｏｌｉｚｕｍａｂ）（抗ＴＮＦα抗体）、トシリズマブ（Ｔｏｃｉｌｉｚｕｍａｂ）（抗ＩＬ−６Ｒ）、ウステンキヌマブ（Ｕｓｔｅｎｋｉｎｕｍａｂ）（抗ＩＬ−１２／２３）、アレムツズマブ（ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ）（抗ＣＤ５２）およびナタリズマブ（ｎａｔａｌｉｚｕｍａｂ）（抗α４インテグリン）ならびにそれらの変異体。もう１つの実施形態においては、該親Ｆｃ含有ポリペプチドは、以下のものからなる群から選択されるＦｃ融合タンパク質である：アルカリスト／リロナセプト（Ａｒｃａｌｙｓｔ／ｒｉｌｏｎａｃｅｐｔ）（ＩＬ１Ｒ−Ｆｃ融合体）、オレニシア／アバタセプト（Ｏｒｅｎｃｉａ／ａｂａｔａｃｅｐｔ）（ＣＴＬＡ−４−Ｆｃ融合体）、アメビベ／アレファセプト（Ａｍｅｖｉｖｅ／ａｌｅｆａｃｅｐｔ）（ＬＦＡ−３−Ｆｃ融合体）、アナキンラ（Ａｎａｋｉｎｒａ）−Ｆｃ融合体（ＩＬ−１Ｒａ−Ｆｃ融合タンパク質）、エタネルセプト（ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）（ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質）、ＦＧＦ−２１−Ｆｃ融合タンパク質、ＧＬＰ−１−Ｆｃ融合タンパク質、ＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合タンパク質、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質、グルカゴン−Ｆｃ融合タンパク質、オキシントモジュリン（ｏｘｙｎｔｏｍｏｄｕｌｉｎ）−Ｆｃ−融合タンパク質、ＧＭ−ＣＳＦ−Ｆｃ融合タンパク質、ＥＰＯ−Ｆｃ融合タンパク質、インスリン−Ｆｃ融合タンパク質、プロインスリン−Ｆｃ融合タンパク質およびインスリン前駆体−Ｆｃ融合タンパク質ならびにそれらの類似体および変異体。

本発明はまた、親Ｆｃ含有ポリペプチドの２４３、２６４、２６７および３２８位（該番号付けはＫａｂａｔにおけるものと同様のＥＵインデックスに準拠している）に突然変異を導入することを含む、Ｆｃ含有ポリペプチドのエフェクター機能を低下させる方法を含み、ここで、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、該親Ｆｃ含有ポリペプチドと比較して低下したエフェクター機能を有する。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは突然変異Ｆ２４３Ａ、Ｖ２６４Ａ、Ｓ２６７ＥおよびＬ３２８Ｆを含む。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは抗体またはその抗原結合性フラグメントである。１つの実施形態においては、該エフェクター機能はＡＤＣＣである。もう１つの実施形態においては、該エフェクター機能はＣＤＣである。

本発明はまた、炎症状態の治療に有用な親Ｆｃ含有ポリペプチド（例えば、炎症に関与する抗原に結合する抗体またはイムノアドヘシン）を選択し、該Ｆｃ含有ポリペプチドの２４３、２６４、２６７および３２８位（該番号付けはＫａｂａｔにおけるものと同様のＥＵインデックスに準拠している）に突然変異を導入することを含む、Ｆｃ含有ポリペプチドの細胞傷害性を低下させる方法を含み、ここで、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、該親Ｆｃ含有ポリペプチドと比較して低下した細胞傷害性を有する。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは突然変異Ｆ２４３Ａ、Ｖ２６４Ａ、Ｓ２６７ＥおよびＬ３２８Ｆを含む。

１つの実施形態においては、該親Ｆｃ含有ポリペプチドは天然Ｆｃ領域を含む。もう１つの実施形態においては、該親Ｆｃ含有ポリペプチドは突然変異Ｆ２４３Ａ突然変異を含む。もう１つの実施形態においては、該親Ｆｃ含有ポリペプチドは突然変異Ｖ２６４Ａ突然変異を含む。もう１つの実施形態においては、該親Ｆｃ含有ポリペプチドはＦ２４３Ａ／Ｖ２６４Ａ突然変異を含む。

治療方法
本発明はまた、炎症状態の治療を要する対象における炎症状態の治療方法を含み、該方法は、２４３、２６４、２６７および３２８位（該番号付けはＫａｂａｔにおけるものと同様のＥＵインデックスに準拠している）に突然変異を含むＦｃ含有ポリペプチドの治療的有効量を該対象に投与することを含む。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは突然変異Ｆ２４３Ａ、Ｖ２６４Ａ、Ｓ２６７ＥおよびＬ３２８Ｆを含む。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、配列番号７を含む抗体フラグメントである。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、配列番号８を含む抗体フラグメントである。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、配列番号１７を含む抗体フラグメントである。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、配列番号７または配列番号８または配列番号１７からなる（または実質的になる）抗体フラグメントである。本発明のＦｃ含有ポリペプチドは任意の経路により投与されうる。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは非経口投与される。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは皮下投与される。

１つの実施形態においては、該炎症状態は望ましくない炎症免疫反応である。

１つの実施形態においては、該炎症状態は自己免疫疾患である。１つの実施形態においては、該炎症状態は多発性硬化症である。１つの実施形態においては、該炎症状態は全身性エリテマトーデスである。１つの実施形態においては、該炎症状態はＩ型糖尿病である。

１つの実施形態においては、該炎症状態は、先天性ガンマグロブリン欠乏血症および低ガンマグロブリン血症、尋常性多様性免疫不全、重症複合性免疫不全またはウィスコット・アルドリッチ症候群を含む原発性免疫不全症候群である。

１つの実施形態においては、該炎症状態は、Ｂ細胞リンパ球性白血病、ＨＩＶ感染または同種骨髄移植を含む続発性免疫不全症候群である。

１つの実施形態においては、該炎症状態は特発性血小板減少性紫斑病である。

１つの実施形態においては、該炎症状態は多発性骨髄腫である。

１つの実施形態においては、該炎症状態はギラン−バレー症候群である。

１つの実施形態においては、該炎症状態は川崎病である。

１つの実施形態においては、該炎症状態は慢性脱髄性ニューロパチー（ＣＩＤＰ）である。

１つの実施形態においては、該炎症状態は自己免疫性好中球減少症である。

１つの実施形態においては、該炎症状態は溶血性貧血である。

１つの実施形態においては、該炎症状態は抗因子ＶＩＩＩ自己免疫疾患である。

１つの実施形態においては、該炎症状態は多巣性ニューロパチーである。

１つの実施形態においては、該炎症状態は全身性脈管炎（ＡＮＣＡ陽性）である。

１つの実施形態においては、該炎症状態は多発性筋炎である。

１つの実施形態においては、該炎症状態は皮膚筋炎である。

１つの実施形態においては、該炎症状態は抗リン脂質症候群である。

１つの実施形態においては、該炎症状態は敗血症症候群である。

１つの実施形態においては、該炎症状態は移植片対宿主疾患である。

１つの実施形態においては、該炎症状態はアレルギーである。

１つの実施形態においては、該炎症状態は抗リーザス因子Ｄ反応である。

１つの実施形態においては、該炎症状態は全身性エリテマトーデスである。

１つの実施形態においては、該炎症状態は心血管系の炎症状態である。本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、アテローム性動脈硬化症、アテローム血栓症、冠状動脈高血圧、急性冠状動脈症候群および心不全（これらの全ては炎症に関連している）を治療するために使用されうる。

１つの実施形態においては、該炎症状態は中枢神経系の炎症状態である。もう１つの実施形態においては、該炎症状態は末梢神経系の炎症状態である。例えば、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、例えばアルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（別名ＡＬＳ、ルー・ゲーリック病）、虚血性脳損傷、プリオン病およびＨＩＶ関連痴呆の治療に使用されうる。

１つの実施形態においては、該炎症状態は胃腸管の炎症状態である。例えば、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、炎症性腸障害、例えばクローン病、潰瘍性大腸炎、セリアック病および過敏性腸症候群を治療するために使用されうる。

１つの実施形態においては、該炎症状態は乾癬、アトピー性皮膚炎、関節炎、例えば慢性関節リウマチ、変形性関節症および乾癬性関節炎である。

１つの実施形態においては、該炎症状態はステロイド依存性アトピー性皮膚炎である。

１つの実施形態においては、該炎症状態は悪液質である。

本発明のＦｃ含有ポリペプチドを使用して治療されうる炎症障害の例には以下のものも含まれる：尋常性ざ瘡、喘息、自己免疫疾患、慢性前立腺炎、糸球体腎炎、過敏症、骨盤内炎症性疾患、再灌流損傷、サルコイドーシス、移植拒絶、脈管炎、間質性膀胱炎およびミオパチー。

１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは１〜１００ミリグラム／ｋｇ体重の用量で投与される。１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは０．００１〜１０ミリグラム／ｋｇ体重の用量で投与される。１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは０．００１〜０．１ミリグラム／ｋｇ体重の用量で投与される。１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは０．００１〜０．０１ミリグラム／ｋｇ体重の用量で投与される。

医薬製剤
本発明はまた、本発明のＦｃ含有ポリペプチドと医薬上許容される担体とを含む医薬製剤を含む。

１つの実施形態においては、本発明は、Ｆｃ含有ポリペプチドを含む医薬組成物に関するものであり、ここで、該Ｆｃ含有ポリペプチド上のＮ−グリカンの少なくとも７０％は、ＮＡＮＡ_{（１−４）}Ｇａｌ_{（１−４）}ＧｌｃＮＡｃ_{（２−４）}Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２からなる群から選択されるオリゴ糖構造を含み、該Ｆｃ含有ポリペプチドは該Ｆｃ領域のアミノ酸位置２４３、２６４、２６７および３２８位（該番号付けはＫａｂａｔにおけるものと同様のＥＵインデックスに準拠している）に突然変異を含む。１つの実施形態においては、該突然変異はＦ２４３Ａ／Ｖ２６４Ａ／Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆである。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、配列番号７を含む抗体フラグメントである。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、配列番号８を含む抗体フラグメントである。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、配列番号１７を含む抗体フラグメントである。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、配列番号７または配列番号８または配列番号１７からなる（または実質的になる）抗体フラグメントである。１つの実施形態においては、該Ｎ−グリカンの少なくとも４７モル％が構造ＮＡＮＡ_２Ｇａｌ_２ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２を有する。１つの実施形態においては、該シアル酸化Ｎ−グリカンにおけるシアル酸残基はα−２，６結合により結合している。１つの実施形態においては、該シアル酸化Ｎ−グリカンにおけるシアル酸残基はα−２，６結合により結合しており、検出可能なレベルのα−２，３結合シアル酸は存在しない。１つの実施形態においては、該シアル酸化Ｎ−グリカンはＮ−グリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）を含まない。

本明細書中で用いる「医薬上許容される」なる語は、動物、より詳しくはヒトにおける使用に関して連邦もしくは州政府の規制機関により承認されている又は米国薬局方もしくは他の一般に認識されている薬局方に収載されている、有効成分の生物活性の有効性を妨げない無毒性物質に関するものである。「担体」なる語は、治療用物質と共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルを意味し、水および油のような無菌液を包含するが、これらに限定されるものではない。該担体の特性は投与経路に左右される。

治療用および診断用物質の医薬製剤は、例えば凍結乾燥粉末、スラリー、水性の溶液または懸濁液の形態で、許容される担体、賦形剤または安定剤と混合することにより製造されうる（例えば、Ｈａｒｄｍａｎら（２００１）ＧｏｏｄｍａｎａｎｄＧｉｌｍａｎ’ｓＴｈｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢａｓｉｓｏｆＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹ；Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＷｉｌｋｉｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹ；Ａｖｉｓら（編）（１９９３）ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＤｏｓａｇｅＦｏｒｍｓ：ＰａｒｅｎｔｅｒａｌＭｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ，ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら（編）（１９９０）ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＤｏｓａｇｅＦｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ，ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら（編）（１９９０）ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＤｏｓａｇｅＦｏｒｍｓ：ＤｉｓｐｅｒｓｅＳｙｓｔｅｍｓ，ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，ＮＹ；ＷｅｉｎｅｒおよびＫｏｔｋｏｓｋｉｅ（２０００）ＥｘｃｉｐｉｅｎｔＴｏｘｉｃｉｔｙａｎｄＳａｆｅｔｙ，ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹを参照されたい）。

投与方法は様々でありうる。適当な投与経路には、経口、直腸、経粘膜、腸、非経口；筋肉内、皮下、皮内、脊髄内、鞘内、直接心室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、眼内、吸入、通気、局所、皮膚、経皮または動脈内が含まれる。

ある実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、侵襲的経路、例えば注射（前記を参照されたい）により投与されうる。本発明の幾つかの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドまたはその医薬組成物は静脈内、皮下、筋肉内、動脈内、関節内（例えば、関節炎関節）、腫瘍内に、または吸入、エアゾール運搬により投与される。非侵襲的経路（例えば経口、例えば丸剤、カプセル剤または錠剤によるもの）による投与も本発明の範囲内である。

組成物は、当技術分野で公知の医学的装置を使用して投与されうる。例えば、本発明の医薬組成物は、例えば予め充填されたシリンジまたは自動注射装置を含む皮下針を使用する注射により投与されうる。

本発明の医薬組成物はまた、無針皮下注射装置、例えば、米国特許第６，６２０，１３５号、第６，０９６，００２号、第５，３９９，１６３号、第５，３８３，８５１号、第５，３１２，３３５号、第５，０６４，４１３号、第４，９４１，８８０号、第４，７９０，８２４号または第４，５９６，５５６号に開示されている装置を使用して投与されうる。

本発明の医薬組成物はまた、注入により投与されうる。医薬組成物を投与する良く知られたインプラントおよびモジュール形態の例には以下のものが含まれる：米国特許第４，４８７，６０３号に開示されている、制御された速度で薬物を投薬するための移植可能な微量注入ポンプ；米国特許第４，４４７，２３３号に開示されている、正確な注入速度で薬物を運搬するための薬物注入ポンプ；米国特許第４，４４７，２２４号に開示されている、連続的薬物運搬のための種々の流動移植可能注入装置；米国特許第４，４３９，１９６号に開示されている、多室コンパートメントを有する浸透薬物運搬系。多数の他のそのようなインプラント、運搬系およびモジュールが当業者に良く知られている。

あるいは、全身的ではなく局所的に、例えば、多くの場合にはデポー剤または徐放製剤で、関節炎関節内に直接的に該抗体を注射することにより、該抗体を投与することが可能である。更に、例えば、免疫病理により特徴づけられる病原体誘発病変または関節炎関節を標的化する標的化薬物運搬系で、例えば、組織特異的抗体で被覆されたリポソームで、該抗体を投与することが可能である。該リポソームは罹患組織に標的化され、罹患組織により、選択的に取り込まれる。

投与計画は、該治療用抗体の血清または組織代謝回転速度、症状の程度、該治療用抗体の免疫原性、および生物学的マトリックスにおける標的細胞の利用可能性を含む幾つかの要因に左右される。好ましくは、投与計画は、望ましくない副作用を最小にすると同時に標的病態における改善をもたらすのに十分な治療用抗体を運搬する。したがって、運搬される生物学的物質の量は、１つには、個々の治療用抗体、および治療される状態の重症度に左右される。治療用抗体の適当な用量を選択する際の指針が利用可能である（例えば、Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａｋ（１９９６）ＡｎｔｉｂｏｄｙＴｈｅｒａｐｙ，ＢｉｏｓＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｕｂ．Ｌｔｄ，Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，ＵＫ；Ｋｒｅｓｉｎａ（編）（１９９１）ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＣｙｔｏｋｉｎｅｓａｎｄＡｒｔｈｒｉｔｉｓ，ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹ；Ｂａｃｈ（編）（１９９３）ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｎｄＰｅｐｔｉｄｅＴｈｅｒａｐｙｉｎＡｕｔｏｉｍｍｕｎｅＤｉｓｅａｓｅｓ，ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹ；Ｂａｅｒｔら，（２００３）ＮｅｗＥｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８：６０１−６０８；Ｍｉｌｇｒｏｍら，（１９９９）ＮｅｗＥｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４１：１９６６−１９７３：Ｓｌａｍｏｎら（２００１）ＮｅｗＥｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４４：７８３−７９２；Ｂｅｎｉａｍｉｎｏｖｉｔｚら（２０００）ＮｅｗＥｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４２：６１３−６１９；Ｇｈｏｓｈら（２００３）ＮｅｗＥｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８：２４−３２；Ｌｉｐｓｋｙら（２０００）ＮｅｗＥｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４３：１５９４−１６０２を参照されたい）。

適当な用量の決定は、例えば、治療に影響を及ぼすことが当技術分野において知られている又は疑われているパラメータまたは因子を用いて、臨床家により行われる。一般に、投与は、最適用量より幾分少ない量から開始し、ついで、いずれかの負の副作用との比較において所望の又は最適な効果が得られるまで、小さな増加量でそれを増加させる。重要な診断尺度には、例えば炎症の症状の尺度、または産生される炎症性サイトカインのレベルが含まれる。好ましくは、使用される生物学的物質は、治療の標的となる動物と同じ種から誘導され、それにより、該物質に対する免疫応答を最小に抑える。ヒト対象の場合、例えば、キメラ、ヒト化および完全ヒトＦｃ含有ポリペプチドが好ましい。

Ｆｃ含有ポリペプチドは、連続的注入により、または例えば毎日、週１〜７回、毎週、隔週、毎月、隔月、年４回、年２回、毎年などで投与される複数の用量により供与されうる。用量は、例えば静脈内、皮下、局所、経口、鼻腔内、直腸内、筋肉内、大脳内、髄腔内に、または吸入により投与されうる。毎週の合計用量は、一般には少なくとも０．０５μｇ／ｋｇ体重、より一般には少なくとも０．２μｇ／ｋｇ、０．５μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上である（例えば、Ｙａｎｇら，ＮｅｗＥｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４９：４２７−４３４（２００３）；Ｈｅｒｏｌｄら，ＮｅｗＥｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４６：１６９２−１６９８（２００２）；Ｌｉｕら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．Ｐｓｙｃｈ．６７：４５１−４５６（１９９９）；Ｐｏｒｔｉｅｌｊｉら，ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５２：１３３−１４４（２００３）を参照されたい）。他の実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、毎週、隔週、「４週ごとに」、毎月、隔月または年４回、１０、２０、５０、８０、１００、２００、５００、１０００または２５００ｍｇ／対象で、皮下または静脈内投与される。

本明細書中で用いる「治療的有効量」、「治療的有効用量」および「有効量」なる語は、単独で又は追加的な治療用物質と共に細胞、組織または対象に投与された場合に、疾患もしくは状態の症状の１以上またはそのような疾患もしくは状態の進行における測定可能な改善を引き起こすのに有効である、本発明のＦｃ含有ポリペプチドの量を意味する。治療的有効量は更に、症状の少なくとも部分的な改善、例えば、関連医学的状態の治療、治癒、予防もしくは改善、またはそのような状態の治療、治癒、予防もしくは改善の率における増加をもたらすのに十分なＦｃ含有ポリペプチドの量を意味する。治療的有効量は、単独で投与される個々の有効成分に適用される場合には、その成分のみに関するものである。治療的有効量は、組合せ体に適用される場合には、連続投与または同時投与のいずれで組合せ投与されるかにかかわらず、治療効果をもたらす、有効成分の組合された量を意味する。治療用物質の有効量は、少なくとも１０％、通常は少なくとも２０％、好ましくは少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも４０％、最も好ましくは少なくとも５０％の、診断尺度またはパラメータの改善をもたらす。有効量はまた、疾患の重症度を評価するために主観的尺度が用いられる場合には、主観的尺度における改善をもたらしうる。

図１は、抗体１Ｆ１１Ｆ２４３Ａ／Ｖ２６４Ａ／Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆのための発現プラスミドであるｐＧＬＹ８０６８を図示する。重鎖および軽鎖は共に、メタノール誘導性プロモーターＡＯＸ１の制御下にあった。ＰｐＴｒｐ２遺伝子は、カセット全体を組込むために適用された遺伝子座であった。発現プラスミド構造は重鎖上の突然変異以外は野生型と同じであり、二重突然変異タンパク質（Ｆ２４３Ａ／Ｖ２６４Ａ）および四重突然変異タンパク質（Ｆ２４３Ａ／Ｖ２６４Ａ／Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ）ＩＦ１１発現プラスミドであった。図２は、本発明における材料および方法により製造された非還元型（ＮＲ）および還元型（Ｒ）抗体を特徴づけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析からのゲルを示す。レーン１は、株ＹＧＬＹ２５２６５において産生された抗体を含有する。レーン２は、株ＹＧＬＹ２５２６６において産生された抗体を含有する。レーン３は、株ＹＧＬＹ２５２６７において産生された抗体を含有する。レーン４は、株ＹＧＬＹ２５２６８において産生された抗体を含有する。レーン５は、株ＹＧＬＹ２５２６９において産生された抗体を含有する。レーン６は、株ＹＧＬＹ２３２５８において産生された抗体を含有する。レーン７は、株ＧＬＹ２１３５１において産生された抗体を含有する。図３〜８は本発明のＦｃ含有ポリペプチドのＦｃγＲ結合特性を図示する。図３〜８は本発明のＦｃ含有ポリペプチドのＦｃγＲ結合特性を図示する。図３〜８は本発明のＦｃ含有ポリペプチドのＦｃγＲ結合特性を図示する。図３〜８は本発明のＦｃ含有ポリペプチドのＦｃγＲ結合特性を図示する。図３〜８は本発明のＦｃ含有ポリペプチドのＦｃγＲ結合特性を図示する。図３〜８は本発明のＦｃ含有ポリペプチドのＦｃγＲ結合特性を図示する。図９はマウスＩＴＰモデルにおける本発明のＦｃポリペプチドの幾つかの効果を示す。実施例１株および試薬大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）株ＴＯＰ１０またはＤＨ５α（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）を組換えＤＮＡ研究に使用した。制限エンドヌクレアーゼ、ＤＮＡ修飾酵素およびＰＮＧアーゼＦをＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡから入手した。オリゴヌクレオチドをＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡから取り寄せた。

実施例２
ＩｇＧ１Ｆｃ突然変異タンパク質およびピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）組換え発現ベクターの構築
ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）における１Ｆ１１ＩｇＧ１モノクローナル抗体の二重および四重Ｆｃ突然変異タンパク質の製造を、後記に挙げる配列およびプロトコールを用いて行った。

Ａ．重鎖および軽鎖
野生型（親）１Ｆ１１モノクローナルＩｇＧ１抗体の製造に使用した重鎖および軽鎖配列（それぞれ、配列番号１および２）は後記に記載されている。１Ｆ１１二重突然変異抗体の製造に使用した重鎖配列は配列番号３に示されている。１Ｆ１１四重突然変異タンパク質抗体の製造に使用した重鎖配列は配列番号４に示されている。全ての抗体の全ての軽鎖配列は同一であった。該重鎖および軽鎖はピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）コドン使用頻度に従い最適化され、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔＵＳＡＩｎｃ．８６０ＣｅｎｔｅｎｎｉａｌＡｖｅ．Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ０８８５４により合成された。

Ｂ．シグナル配列
α−接合因子プレドメインのシグナル配列を、ＰＣＲ融合により、軽鎖または重鎖の５’末端にインフレームで融合させた。該配列を前記のとおりにコドン最適化した。コザック配列ＡＡＡＣＧをメチオニンの５’末端に付加し、クローニング目的のためにＥｃｏＲＩ部位を該コザック配列の前に付加した。ＤＮＡ配列（配列番号５）およびアミノ酸（配列番号６）の翻訳は後記に示されているとおりである。

Ｃ．ＩｇＧ１およびＩｇＧ１Ｆｃ突然変異タンパク質の発現のための組換えプラスミド
ＩｇＧ１およびその突然変異タンパク質の融合シグナル配列を有する重鎖および軽鎖を、それぞれ、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＯＸ１プロモーター下およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｃｙｃターミネーターの前にクローニングした。その完成した重鎖および軽鎖の発現カセットを最終的な発現ベクターへと合体させた。ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）内へのゲノム挿入を、Ｓｐｅ１での該ベクターの線状化およびＴｒｐ２部位内への標的化組込みにより行った。

本明細書中で使用されているプラスミドの要約を以下の表１に示す。１Ｆ１１四重
Ｆｃ突然変異タンパク質のための最終的な発現プラスミドの図示を図１に示す。

実施例３
１Ｆ１１およびそのＦｃ突然変異タンパク質を製造するための糖操作ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）ＧＦＩ５．０およびＧＦＩ６．０宿主
２つの異なる糖操作ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）宿主、すなわち、ＧＦＩ５．０およびＧＦＩ６．０を、本発明において適用した。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，ＵＳ７，０２９，８７２およびＧｅｒｎｇｒｏｓｓ，ＵＳ７，４４９，３０８に開示されている方法に従い、所望のＮ−グリコフォームを主要種として有する所望のポリペプチドを発現しうるように下等真核宿主細胞を遺伝的に操作するのに有用であるベクターを構築することが可能である。Ｈａｍｉｌｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１３：１４４１−１４４３（２００６）およびＨａｍｉｌｔｏｎＵＳ２００６／０２８６６３７に記載されている方法に従い、ＮＲＲＬ１１４３０（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ１５４９，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ２０１０８，ＵＳＡ）からＧＦＩ５．０およびＧＦＩ６．０株を操作した。操作されたピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＧＦＩ５．０は、末端ガラクトースを伴う二分岐Ｎ−グリカン構造を有するタンパク質を産生しうる。本明細書において使用されているＧＦＩ５．０株ＹＧＬＹ１７１０８の遺伝子型は以下のとおりである：ｕｒａ５Δ：：ＳｃＳＵＣ２ｏｃｈ１Δ：：ｌａｃＺｂｍｔ２Δ：：ｌａｃＺ／ＫｌＭＮＮ２−２ｍｎｎ４Ｌ１Δ：：ｌａｃＺ／ＭｍＳＬＣ３５Ａ３ｐｎｏ１Δ：：ｌａｃＺＡＤＥ１：：ｌａｃＺ／ＦＢ８／ＮＡ１０／ＭｍＳＬＣ３５Ａ３ｈｉｓ１：：ｌａｃＺ−ＵＲＡ５−ｌａｃＺ／ＸＢ３３／ＳｐＧＡＬＥ／ＤｍＵＧＴａｒｇ１：：ＨＩＳ１／ＫＤ５３／ＴＣ５４ＰＲ０１：：ＡＲＧ１／ＡＯＸ１−ＳｃＭＦｐｒｅＴｒＭＮＳ１ＵＲＡ６−ＬｍＳＴＴ３ｄ。操作されたピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＧＦＩ６．０であるＹＧＬＹ１７１５９の遺伝子型は以下のとおりである：ｕｒａ５Δ：：ＳｃＳＵＣ２ｏｃｈ１Δ：：ｌａｃＺ，ｂｍｔ２Δ：：ｌａｃＺ／ＫｌＭＮＮ２−２ｍｎｎ４Ｌ１Δ：：ｌａｃＺ／ＭｍＳＬＣ３５Ａ３ｐｎｏ１Δ ｍｎｎ４Δ：：ｌａｃＺＡＤＥ１：：ｌａｃＺ／ＮＡ１０／ＭｍＳＬＣ３５Ａ３／ＦＢ８ｈｉｓ１Δ：：ｌａｃＺ／ＳｃＧＡＬ１０／ＸＢ３３／ＤｍＵＧＴａｒｇ１Δ：：ＨＩＳ１／ＫＤ５３／ＴＣ５４ｂｍｔ４Δ：：ｌａｃＺｂｍｔ１Δ：：ｌａｃＺｂｍｔ３Δ：：ｌａｃＺＴＲＰ２：ＡＲＧ１／ＭｍＣＳＴ／ＨｓＧＮＥ／ＨｓＣＳＳ／ＨｓＳＰＳ／ＭｍＳＴ６−３３ｓｔｅ１３Δ：：ｌａｃＺ／ＴｒＭＤＳ１ｄａｐ２Δ：：Ｎａｔ^ＲＴＲＰ５：Ｈｙｇ^ＲＭｍＣＳＴ／ＨｓＧＮＥ／ＨｓＣＳＳ／ＨｓＳＰＳ／ＭｍＳＴ６−３３Ｖｐｓ１０−１Δ：：ＡＯＸ１ｐＬｍＳＴＴ３ｄｐＧＡＰＤＨ−ｍＰｏｍＧｎＴｌ−５６。ＹＧＬＹ１７１５９は、末端α２，６結合シアル酸がガラクトースに結合した二分岐Ｎ−グリカン構造を有するタンパク質を産生しうる。

遺伝子型を示すために用いられる略語は一般に公知であり、当業者に理解されており、以下の略語を含む。
ＳｃＳＵＣ２：サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）インベルターゼ；
ＯＣＨ１：アルファ−１，６−マンノシルトランスフェラーゼ；
ＫｌＭＮＮ２−２：クライベロミセス・ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体；
ＢＭＴ１：ベータ−マンノース−転移（ベータ−マンノース除去）；
ＢＭＴ２：ベータ−マンノース−転移（ベータ−マンノース除去）；
ＢＭＴ３：ベータ−マンノース−転移（ベータ−マンノース除去）；
ＢＭＴ４：ベータ−マンノース−転移（ベータ−マンノース除去）；
ＭＮＮ４Ｌ１：ＭＮＮ４様１（電荷除去）；
ＭｍＳＬＣ３５Ａ３：ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体のマウスホモログ；
ＰＮＯ１：Ｎ−グリカンのホスホマンノシル化（電荷除去）；
ＭＮＮ４：マンノシルトランスフェラーゼ（電荷除去）；
ＳｃＧＡＬ１０：ＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼ；
ＸＢ３３：ＳｃＫＲＥ２リーダーに融合したトランケート化ＨｓＧａｌＴ１；
ＤｍＵＧＴ：ＵＤＰ−ガラクトース輸送体；
ＫＤ５３：ＳｃＭＮＮ２リーダーに融合したトランケート化ＤｍＭＮＳＩＩ；
ＴＣ５４：ＳｃＭＮＮ２リーダーに融合したトランケート化ＲｎＧＮＴＩＩ；
ＮＡ１０：ＰｐＳＥＣ１２リーダーに融合したトランケート化ＨｓＧＮＴＩ；
ＦＢ８：ＳｃＳＥＣ１２リーダーに融合したトランケート化ＭｍＭＮＳ１Ａ；
ＴｒＭＤＳ１：分泌トリコデルマ・レーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＭＮＳ１；
ＡＤＥ１：Ｎ−スクシニル−５−アミノイミダゾール−４−カルボキサミドリボチド（ＳＡＩＣＡＲ）シンテターゼ；
ＭｍＣＳＴ：マウスＣＭＰ−シアル酸輸送体；
ＨｓＧＮＥ：ヒトＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ；
ＨｓＣＳＳ：ヒトＣＭＰ−シアル酸シンターゼ；
ＨｓＳＰＳ：ヒトＮ−アセチルノイラミナート−９−ホスファートシンターゼ；
ＭｍＳＴ６−３３：ＳｃＫＲＥ２リーダーに融合したトランケート化マウスアルファ−２，６−シアリルトランスフェラーゼ；
ＬｍＳＴＴ３ｄ：リーシュマニア・メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａｍａｊｏｒ）からのオリゴサッカリルトランスフェラーゼ触媒サブユニット。

実施例４
酵母の形質転換およびスクリーニング
糖操作ＧＦＩ５．０およびＧＳ６．０株を、ＹＰＤに富む培地（酵母エキス１％、ペプトン２％および２％デキストロース）内で増殖させ、対数増殖期に遠心分離により集め、氷冷１Ｍソルビトールで３回洗浄した。１〜５μｇのＳｐｅ１消化プラスミドをコンピテント酵母細胞と混合し、Ｂｉｏ−ＲａｄＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒＸｃｅｌｌ（商標）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，２０００ＡｌｆｒｅｄＮｏｂｅｌＤｒｉｖｅ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ９４５４７）プリセットピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）エレクトロポレーションプログラムを使用してエレクトロポレーションした。２４℃の回収用豊富（ｒｉｃｈ）培地内で１時間の後、該細胞を、３００μｇ／ｍｌゼオシンを含有する最少デキストロース培地（１．３４％ＹＮＢ、０．０００４％ビオチン、２％デキストロース、１．５％寒天）上でプレーティングし、該形質転換体が出現するまで２４℃でインキュベートした。

高力価株に関してスクリーニングするために、９６個の形質転換体を緩衝化グリセロール複合培地（ＢＭＧＹ）に接種し、７２時間増殖させ、ついで緩衝化メタノール複合培地（ＢＭＭＹ）内で２４時間の誘導を行った。以下のとおりにプロテインＡビーズアッセイにより抗体の分泌を評価した。９６ウェルプレート培養からの５０マイクロリットルの上清を非結合性９６ウェルアッセイプレート内で５０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８．５）で１：１に希釈した。各９６ウェルプレートに関して、２ｍｌの磁性ＢｉｏＭａｇＰｒｏｔｅｉｎＡ懸濁液ビーズ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を磁性ラック内に保持されたチューブ内に配置した。２〜３分後、該ビーズが該チューブの側面に集められ、該バッファーをデカントした。該ビーズを、元の容量（１００ｍＭＴｒｉｓ、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．０）に等しい容量の洗浄バッファーで３回洗浄し、同じ洗浄バッファーに再懸濁させた。２０μｌのビーズを、希釈サンプルを含有するアッセイプレートの各ウェルに加えた。該プレートを覆い、穏やかにボルテックスし、ついで、１５分ごとにボルテックスしながら室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後、該ビーズが各ウェルの片側に集まるように誘導する磁性プレート上に該サンプルプレートを配置した。ＢｉｏｍｅｋＮＸＬｉｑｕｉｄＨａｎｄｌｅｒ（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）で、該プレートからの上清を廃棄物容器へと除去した。ついで該サンプルプレートを該磁石から取り出し、該ビーズを１００μｌの洗浄バッファーで洗浄した。該プレートを該磁石上に再び配置した後、該洗浄バッファーを吸引により除去した。２０μｌのローディングバッファー（２５ｍＭＮＥＭ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を含有するＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＥ−ＰＡＧＥゲルローディングバッファー）を各ウェルに加え、該プレートを手短にボルテックスした。ＢｅｃｋｍａｎＡｌｌｅｇｒａ６遠心機上の５００ｒｐｍでの遠心分離の後、該サンプルを９９℃で５分間インキュベートし、ついでＥ−ＰＡＧＥハイスループット・プレキャストゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）上で泳動させた。ゲルをゲル染色溶液（０．５ｇクーマシーＧ２５０ブリリアントブルー、４０％ＭｅＯＨ、７．５％酢酸）で覆い、電子レンジ内で３５秒間加熱し、ついで室温で３０分間インキュベートした。該ゲルを蒸留水中で一晩にわたって脱染した。高力価コロニーを、実施例５に詳細に記載されている更なるＳｉｘｆｏｒｓ発酵スクリーニングのために選択した。ＩｇＧ１野生型およびＦｃ突然変異タンパク質産生株の要約を以下の表２に示す。

実施例５
振とうフラスコにおける抗体の製造
該株を、２４℃で３日間振とうされる３００ｍｌの２％ＢＭＧＹ培地を含有する５００ｍｌの振とうフラスコ内で培養した。

振とうフラスコの誘導のためのプロトコール：各培養の全容量（３００ｍｌ）をファルコンチューブ内に集め、２５００ｒｐｍで５分間遠心する。上清を移し、細胞ペレットを１５０ｍｌの２％ＢＭＭＹおよび３６０μｌのＰＭＴｉ４（ストック濃度０．６５ｍｇ／ｍｌ）の最終容量に再懸濁させる。新鮮な５００ｍｌ振とうフラスコに移し、２４℃で２日間振とうする。該誘導培養物を遠心沈降させ、上清を新鮮なファルコンチューブ内に集める。

ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥｒＰｒｏｔｅｉｎＡ（カタログ番号１７−１２８１−０１）およびＢｉｏＲａｄポリ−プレップ（ｐｏｌｙｐｒｅｐ）クロマトグラフィーカラム（１０ｍｌ）（カタログ番号７３１−１５５０）を使用するプロテインＡカラムにより、該分泌抗体を精製した。以下のバッファーを使用した。
・洗浄バッファー＃１：２０ｍＭＴｒｉｓｐＨ７．０，１ＭＮａＣｌ
・洗浄バッファー＃２：２０ｍＭｔりｓｐＨ７．０
・中和バッファー：１ＭＴｒｉｓｐＨ８．０〜ｐＨ９．０
・溶出バッファー：１００ｍＭまたは５０ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ３．０
・クリーニング溶液：水中の６Ｍ尿素
精製プロトコールは以下のとおりである。
・５００μｌのＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥｒＰｒｏｔｅｉｎＡビーズを各ＢｉｏＲａカラムに加える。該ビーズは２０％エタノール中に存在するべきである。該ビーズスラリーの組成は５０％ビーズ、５０％液体であるべきである。
・該プロテインＡビーズが該カラム内に入ったら、それらを５ｍｌの洗浄バッファー＃２で洗浄すべきである（フロースルーは廃棄する）。
・１０ｍｌの上清をＢｉｏＲａｄカラムに加える。この工程中に、該抗体はプロテインＡビーズに結合するであろう（フロースルーは廃棄する）。
・５ｍｌの洗浄バッファー＃１を該カラムに加えることにより、望ましくない過剰のタンパク質を洗い落とす（フロースルーは廃棄する）。
・５ｍｌの洗浄バッファー＃２を加えることにより、該カラムを再び洗浄する（フロースルーは廃棄する）。
・１ｍｌの中和バッファーを１５ｍｌタンパク質収集チューブに加える。
・ＢｉｏＲａｄカラムを該１５ｍｌ収集チューブ内に配置する。
・３ｍｌの溶出バッファーをＢｉｏＲａｄカラムに加える。これは所望の抗体をプロテインＡビーズから除去するであろう。
・溶出タンパク質を該１５ｍｌタンパク質収集チューブ内に集める。
・ブラッドフォードアッセイ（１０μｌのタンパク質をブラッドフォードアッセイに使用する）により該溶出タンパク質の濃度を決定する。

実施例６
ＨＰＬＣによるＮ結合グリカン分析
各グリコフォームの相対量を定量するために、Ｎ−グリコシダーゼＦ遊離グリカンを２−アミノベンジジン（２−ＡＢ）で標識し、ＨＰＬＣにより分析した（Ｃｈｏｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１００：５０２２−５０２７（２００３）およびＨａｍｉｌｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ３１３：１４４１−１４４３（２００６）に記載されているとおりに行った）。表２は、ＧＦＩ６．０宿主における二重突然変異タンパク質および四重突然変異タンパク質発現ならびにＧＦＩ５．０宿主における１Ｆ１１ＩｇＧ１のグリカンプロファイルを示す。これらの株を振とうフラスコ内で培養した。結果を表２に示す。

実施例７
ＦｃγＲ結合アッセイ
Ｓｈｉｅｌｄｓら（２００１），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１−６６０４に記載されている方法を若干変更した方法により、Ｆｃγ受容体結合アッセイを行った。高タンパク質結合９６ウェルプレート（ＣｏｒｎｉｎｇＣｏｓｔａｒ）をＰＢＳ中の以下の濃度の１００μｌ／ウェルのＦｃγ受容体溶液でコートした：ＦｃγＲＩ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）およびＦｃγＲＩＩａ（ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）産生体）は共に１μｇ／ｍＬ、ＦｃγＲＩＩｂ（ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）産生体）は２μｇ／ｍＬ、ＦｃγＲＩＩＩａ−Ｆ１５８は０．８μｇ／ｍＬ、ならびにＦｃγＲＩＩＩａ−Ｖ１５８は０．４μｇ／ｍＬならびに（共にＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ産生体）は０．４μｇ／ｍＬ。全てのピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）により産生された受容体は、記載されているとおりに（Ｌｉら（２００６），ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２４：２１０−２１５）、発現され、精製された。ＦｃγＲＩプレートに加えられた単量体抗体サンプルをアッセイ希釈剤（１×ＰＢＳ、１％ＢＳＡおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）中で系列希釈し、１００μＬ／ウェルを該プレートに加えた。残りの受容体のために調製された抗体サンプルは、検出のためにアルカリホスファターゼに結合された半モル比のヤギ抗ヒトＩｇＧＦ（ａｂ’）２Ｆ（ａｂ’）２を使用する１時間の二量体化工程を要する。また、これらの二量体化Ｆ（ａｂ’）２／抗体複合体を系列希釈し、１００μＬ／ウェルを残りの受容体プレートに加え、全てのプレートを室温で１時間インキュベートした。同じヤギ抗ヒトＩｇＧＦ（ａｂ’）２アルカリホスファターゼ結合Ｆ（ａｂ’）２を使用して、ＦｃγＲＩ結合サンプル抗体を検出した。ＳｕｐｅｒＰｈｏｓ、４−ＭＵＰＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＡＰＳｕｂｓｔｒａｔｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（Ｖｉｒｏｌａｂｓ）の存在下の１８時間のインキュベーションの後、３４０ｎｍにおける励起および４６５ｎｍにおける発光を測定することにより、サンプル抗体結合を定量した。

結果を表３〜７に示す。各表は個々の実験の結果を表す。表３に記載されているデータのグラフ表示は図３に示されている。表４に記載されているデータのグラフ表示は図４に示されている。表５に記載されているデータのグラフ表示は図５に示されている。表６に記載されているデータのグラフ表示は図６に示されている。表７に記載されているデータのグラフ表示は図７に示されている。

表８は、ＧＳ５．０において産生された野生型親抗体と比較した場合の、種々の受容体への結合の相対的減少を要約している。このデータは図８にも示されている。

実施例８
抗原アフィニティアッセイ
ランニングバッファーとしての１×ＨＢＳ−ＥＰ＋（１０ｍＭＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭＮａＣｌ、３ｍＭＥＤＴＡおよび０．０５％ＳｕｒｆａｃｔａｎｔＰ２０）およびカルボキシメチル化デキストラン（ＣＭ５，ｃａｔ＃ＢＲ−１００６−６８）チップを使用して、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体の結合アフィニティを、ＢｉａｃｏｒｅＴ１００装置で測定した。ＢｉａｃｏｒｅＨｕｍａｎＡｎｔｉｂｏｄｙＣａｐｔｕｒｅＫｉｔ（Ｃａｔ＃ＢＲ−１００８−３９）により、〜７０００ＲＵまで、ＣＭ５チップを全フローセル上にマウス抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）で固定化した。抗ＰＣＳＫ９抗体を該チップ上で〜５００ＲＵまで捕捉し、ついで６４．１ｎＭ〜２．０ｎＭの野生型ヒトＰＣＳＫ９の分析用注入を行った。３ＭＭｇＣｌの１０μＬ／分での４０秒間のそれぞれの分析用の注入と注入との間に各フローセルを再生させた。少なくとも５ポイントの濃度範囲のセンソグラム（ｓｅｎｓｏｇｒａｍ）を使用し、１：１結合モデルを用いて、ＢｉａｃｏｒｅＴ１００ＥｖａｌｕａｔｉｏｎＳｏｆｔｗａｒｅでデータを分析した。

表９に示されているとおり、この場合に該材料および方法により調製された種々の抗ＰＣＳＫ９抗体に対する抗原アフィニティは類似している。

実施例９
追加的ＩｇＧ１Ｆｃ突然変異タンパク質の構築、発現および特徴づけ
実施例２の方法により、追加的Ｆｃ突然変異タンパク質（表１０）を構築した。

表１０に記載されているＦｃ突然変異タンパク質を含有する発現ベクターを、アルファ２，６シアル酸を二分岐ガラクトシル化グリカン（Ｇ２）上に付加しうる糖操作ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＹＧＬＹ２２８３４（ＧＦＩ６．０）内に形質転換した。用いたＹＧＬＹ２２８３４株の遺伝子型は以下のとおりである：ｕｒａ５Δ：：ＳｃＳＵＣ２ｏｃｈｌΔ：：ｌａｃＺｂｍｔ２Δ：：ｌａｃＺ／ＫｌＭＮＮ２−２；ｍｎｎ４Ｌ１Δ：：ｌａｃＺ／ＭｍＳＬＣ３５Ａ３ｐｎｏ１Δ ｍｎｎ４Δ：：ｌａｃＺ；ＡＤＥ１：：ｌａｃＺ／ＮＡ１０／ＭｍＳＬＣ３５Ａ３／ＦＢ８；ｈｉｓ１Δ：：ｌａｃＺ／ＳｃＧＡＬ１０／ＸＢ３３／ＤｍＵＧＴ；ａｒｇ１Δ：：ＨＩＳ１／ＫＤ５３／ＴＣ５４；ｂｍｔ４Δ：：ｌａｃＺｂｍｔ１Δ：：ｌａｃＺｂｍｔ３Δ：：ｌａｃＺ；ＴＰＰ２：：ＡＲＧ１／ＭｍＣＳＴ／ＨｓＧＮＥ／ＨｓＣＳＳ／ＨｓＳＰＳ／ＭｍＳＴ６−３３；ｓｔｅ１３Δ：：ｌａｃＺ−ＵＲＡ５−ｌａｃＺ／ＴｒＭＤＳ１ｄａｐ２Δ：：ＮａｔＲ；ＴＲＰ５：：ＨｙｇＲＭｍＣＳＴ／ＨｓＧＮＥ／ＨｓＣＳＳ／ＨｓＳＰＳ／ＭｍＳＴ６−３３；ｖｐｓ１０−１：：ｐＡＯＸ１−ＬｍＳＴＴ３ｄ。

実施例４〜５に示されているとおりに、Ｆｃ突然変異タンパク質抗体を製造し、精製した。

ここで製造されたＦｃ突然変異タンパク質のグリコシル化を、実施例６に記載されているとおりにＨＰＬＣにより定量した。その結果を表１１に示す。

種々のＦｃγＲに対するこれらのＦｃ突然変異タンパク質のアフィニティを、実施例７に記載されているとおりに測定した。その結果を表１２および１３に示す。

「抗ＴＮＦＩｇＧ１ＧＳ５」と表示されているサンプルは、組換えピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＧＦＩ５．０において産生された、配列番号１５の重鎖と配列番号１３の軽鎖とを含む抗体を意味する。

「１Ｆ１１ＩｇＧ１ＧＳ５．０」と表示されているサンプルは、組換えピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＧＦＩ５．０において産生された、配列番号１の重鎖と配列番号２の軽鎖とを含む抗体を意味する。

「抗ＴＮＦＤＭ」と表示されているサンプルは、組換えピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＹＧＬＹ２２８３４（ＧＦＩ６．０）において産生された、配列番号１６の重鎖と配列番号１３の軽鎖とを含む抗体を意味する。

「１Ｆ１１ＤＭ」と表示されているサンプルは、組換えピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＹＧＬＹ２２８３４（ＧＦＩ６．０）において産生された、配列番号３の重鎖と配列番号２の軽鎖とを含む抗体を意味する。

「ヒトＩｇＧＦｃＤＭ」または「ｈＦＣＤＭ」と表示されているサンプルは、前記方法により組換えピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＹＧＬＹ２２８３４（ＧＦＩ６．０）において産生された、配列番号１４のアミノ酸配列を含むポリペプチドを意味する。

実施例１０
免疫血小板減少症（「ＩＴＰ」）のモデルにおけるＦｃ突然変異タンパク質の効果
動物：タコニック・ファームズ（ＴａｃｏｎｉｃＦａｒｍｓ）から１４週齢のＣ５７ＢＬ／６雌マウスを得た。

モデル誘発：表１４に挙げられている試薬を静脈内（ｉｖ）注入により、第０日に該マウスに投与する。２４時間後、ＢＤＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓから得た抗ＣＤ４１抗体（ＭＷＲｅｇ３０）の２μｇのｉｖ用量でＩＴＰを誘発させる。ＩＴＰ誘発の２４時間後、Ｈｅｍａｖｅｔ赤血球分析装置を使用して、全血サンプルに関して血小板の計数を行う

材料
「シアル酸化ｈＦＣＤＭ」と表示されているサンプルは、組換えピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＹＧＬＹ２２８３４（ＧＦＩ６．０）において産生された、配列番号１４のアミノ酸配列を含むポリペプチドを意味する。

「非シアル酸化ｈＦＣＤＭ」と表示されているサンプルは、組換えピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＹＧＬＹ２２８３４（ＧＦＩ６．０）において産生された、配列番号１４のアミノ酸配列を含むポリペプチドを意味し、これは次いで、ノイラミニダーゼでインビトロで処理されて、末端ガラクトースを有するタンパク質の非シアル酸化形態を与えた。

「ｈＦＣＱＭシアル酸化」と表示されているサンプルは、組換えピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＹＧＬＹ２２８３４（ＧＦＩ６．０）において産生された、配列番号８のアミノ酸配列を含むポリペプチドを意味する。

「非シアル酸化ｈＦＣＱＭ」と表示されているサンプルは、組換えピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＹＧＬＹ２２８３４（ＧＦＩ６．０）において産生された、配列番号８のアミノ酸配列を含むポリペプチドを意味し、これは次いで、ノイラミニダーゼでインビトロで処理されて、末端ガラクトースを有するタンパク質の非シアル酸化形態を与えた。

全ての場合において、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）株の培養を１５Ｌガラスバイオリアクター内で行った。簡潔に説明すると、５００ｍＬのＢＳＧＹ培地（４％グリセロール、１％酵母エキス、２％ソイトン、１００ｍＭリン酸カリウムバッファー，ｐＨ６．５、１００ｍＭＤ−ソルビトール、１．３４％酵母窒素原基礎培地および４×１０〜５％ビオチン）を含有する２つの３Ｌバッフル付き種フラスコに、寒天プレートで増殖する酵母パッチを接種した。該フラスコを、２４℃、１８０ｒｐｍで４８時間インキュベートして対数増殖を確保し、それが達成されたら、該細胞を、ＢＳＧＹ培地を１０％の容量比率で含有するバイオリアクターに移した。温度を２４℃に制御し、ｐＨを２８％水酸化アンモニウムで６．５に制御し、気流速度を０．７に固定し、撹拌をカスケード（ｃａｓｃａｄｅ）することにより、溶存酸素（ＤＯ）を大気圧および２４℃で２０％飽和に維持した。最初の４０ｇＬ^−１のグリセロールの消失が酸素取り込み速度（ｍｍｏｌＬ^−１ｈ^−１単位のＯＵＲ）の急速な低下により検出された。ついで、５．３ｇＬ^−１ｈ^−１から開始する指数関数的な５０％グリセロールの供給を行い、それを０．０８ｈ^−１の割合で指数関数的に増加させた。８時間のグリセロールフェッドバッチ相の後、酸素限定環境中のメタノール誘導を開始した。該ＤＯカスケードを停止し、撹拌を４６０ｒｐｍの設定点に設定して、２０〜２５ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈのＯＵＲを得た。ＤＯが１％未満に減少した後、１００％メタノールの最初の１％（ｗ／ｖ）ボーラス供給を行った。全ての後続のメタノール１％（ｗ／ｖ）ボーラス供給は、メタノール消失を示すＤＯの急増により誘発された。

該サンプル（「シアル酸化ｈＦＣＤＭ」、「非シアル酸化ｈＦＣＤＭ」、「シアル酸化ｈＦＣＱＭ」および「シアル酸化ｈＦＣＱＭ」）を、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して精製した。

「シアル酸化ｈＦＣＤＭ」および「シアル酸化ｈＦＣＱＭ」サンプルのＮ−グリカンをＨＰＬＣにより決定した。それは以下のＮ−グリカンの特徴を有していた。

ＧＡＭＭＡＧＡＲＤは、ＢａｘｔｅｒＨｅａｌｔｈｃａｒｅから入手した。

ＧＡＭＭＵＮＥＸは、ＴａｌｅｃｒｉｓＢｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓＩｎｃから入手した。

サンプル「ＩＴＰ対照」は、抗ＣＤ４１抗体（ＭＷＲｅｇ３０）であった。

結果
得られた血小板値は表１５に一覧されており（Ｋ／μＬ）、図９にプロットされている。シアル酸化ｈＦｃＤＭおよびシアル酸化ｈＦｃＱＭは、一元配置分散分析により、ＩＴＰからの統計的に有意な防御を示した。

本発明は、例示されている実施形態に関して本明細書に記載されているが、本発明はそれらに限定されないと理解されるべきである。当業者および本明細書における教示を利用する者は本発明の範囲内の追加的な修飾および実施形態を認識するであろう。

Claims

Ｆｃ領域のアミノ酸位置２４３、２６４、２６７および３２８位（ここで、番号付けはＫａｂａｔにおけるものと同様のＥＵインデックスに準拠している）に突然変異を含むＦｃ含有ポリペプチド。
該突然変異がＦ２４３Ａ、Ｖ２６４Ａ、Ｓ２６７ＥおよびＬ３２８Ｆである、請求項１記載のＦｃ含有ポリペプチド。
配列番号７、配列番号８または配列番号１７のアミノ酸配列を含む、請求項１記載のＦｃ含有ポリペプチド。
該Ｆｃ含有ポリペプチドが、シアル酸化Ｎ−グリカンを含む抗体または抗体フラグメントであり、該シアル酸化Ｎ−グリカンにおけるシアル酸残基がα−２，６結合により結合している、請求項１記載のＦｃ含有ポリペプチド。
該Ｆｃ含有ポリペプチドが、ＳＡ_{（１−４）}Ｇａｌ_{（１−４）}ＧｌｃＮＡｃ_{（２−４）}Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２またはＳＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ_２（ここで、該シアル酸残基はα−２，６結合により結合している）から選択される構造を含むシアル酸化Ｎ−グリカンを含む抗体または抗体フラグメントである、請求項１記載のＦｃ含有ポリペプチド。
該Ｆｃ含有ポリペプチドが、親Ｆｃ含有ポリペプチドと比較した場合に以下の特性：
ａ）エフェクター機能の低下、
ｂ）抗炎症特性の増強、
ｃ）レクチン（例えば、ＣＤ２２（Ｓｉｇｌｅｃ２））への結合の増強、
ｄ）ＦｃγＲＩＩａへの結合の低下、
ｅ）ＦｃγＲＩＩｂへの結合の増強、
ｆ）ＦｃγＲＩＩＩａへの結合の低下、および
ｇ）ＦｃγＲＩＩＩｂへの結合の低下
の１以上を有する、請求項１記載のＦｃ含有ポリペプチド。
ａ）Ｆｃ含有ポリペプチドを産生するように遺伝的に操作された細胞を準備し（ここで、該宿主細胞は、Ｆｃ領域のアミノ酸位置２４３、２６４、２６７および３２８位に突然変異をコードする核酸を含み、ここで、番号付けはＫａｂａｔにおけるものと同様のＥＵインデックスに準拠している）、
ｂ）該Ｆｃ含有ポリペプチドの発現を引き起こす条件下で該宿主細胞を培養し、
ｃ）該宿主細胞から該Ｆｃ含有ポリペプチドを単離することを含む、宿主細胞におけるＦｃ含有ポリペプチドの製造方法。
該核酸が突然変異Ｆ２４３Ａ、Ｖ２６４Ａ、Ｓ２６７ＥおよびＬ３２８Ｆをコードしている、請求項７記載の製造方法。
該Ｆｃ含有ポリペプチドが配列番号７、配列番号８または配列番号１７のアミノ酸配列を含む、請求項７記載の製造方法。
該Ｆｃ含有ポリペプチドが、シアル酸化Ｎ−グリカンを含む抗体または抗体フラグメントであり、該シアル酸化Ｎ−グリカンがα−２，６結合により結合している、請求項７記載の製造方法。
全シアル酸化Ｎ−グリカンの量および比率が親Ｆｃ含有ポリペプチドと比較して増加しているＮ−グリカン組成を該Ｆｃ含有ポリペプチドが有する。請求項１０記載の製造方法。
該Ｆｃ含有ポリペプチドが、ＳＡ_{（１−４）}Ｇａｌ_{（１−４）}ＧｌｃＮＡｃ_{（２−４）}Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２またはＳＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ_２（ここで、該シアル酸残基はα−２，６結合により結合している）から選択される構造を含むシアル酸化Ｎ−グリカンを含む抗体または抗体フラグメントである、請求項７記載の製造方法。
該Ｆｃ含有ポリペプチドが、親Ｆｃ含有ポリペプチドと比較した場合に以下の特性：
ａ）エフェクター機能の低下、
ｂ）抗炎症特性の増強、
ｃ）レクチン（例えば、ＣＤ２２（Ｓｉｇｌｅｃ２））への結合の増強、
ｄ）ＦｃγＲＩＩａへの結合の低下、
ｅ）ＦｃγＲＩＩｂへの結合の増強、
ｆ）ＦｃγＲＩＩＩａへの結合の低下、および
ｇ）ＦｃγＲＩＩＩｂへの結合の低下
の少なくとも１つを有する、請求項７記載の製造方法。
Ｆｃ領域の２４３、２６４、２６７および３２８位（該番号付けはＫａｂａｔにおけるものと同様のＥＵインデックスに準拠している）に突然変異を導入することを含む、Ｆｃ含有ポリペプチドの抗炎症特性を増強する又は細胞傷害性を低下させる方法であって、該Ｆｃ含有ポリペプチドが、親Ｆｃ含有ポリペプチドと比較して増強した抗炎症特性または低下した細胞傷害性を有する、方法。
該突然変異がＦ２４３Ａ、Ｖ２６４Ａ、Ｓ２６７ＥおよびＬ３２８Ｆである、請求項１４記載の方法。
該Ｆｃ含有ポリペプチドが配列番号７、配列番号８または配列番号１７のアミノ酸配列を含む、請求項１４記載の方法。
該Ｆｃ含有ポリペプチドが、ＳＡ_{（１−４）}Ｇａｌ_{（１−４）}ＧｌｃＮＡｃ_{（２−４）}Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２またはＳＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ_２（ここで、該シアル酸残基はα−２，６結合により結合している）から選択される構造を含むシアル酸化Ｎ−グリカンを含む抗体または抗体フラグメントである、請求項１４記載の方法。
炎症状態の治療を要する対象における炎症状態の治療方法であって、Ｆｃ領域の２４３位および２６４位（該番号付けはＫａｂａｔにおけるものと同様のＥＵインデックスに準拠している）に突然変異を含むＦｃ含有ポリペプチドの治療的有効量を該対象に投与することを含む方法。
該突然変異がＦ２４３Ａ、Ｖ２６４Ａ、Ｓ２６７ＥおよびＬ３２８Ｆである、請求項１８記載の方法。
該Ｆｃ含有ポリペプチドが配列番号７、配列番号８または配列番号１７のアミノ酸配列を含む、請求項１８記載の方法。
該Ｆｃ含有ポリペプチドが、ＳＡ_{（１−４）}Ｇａｌ_{（１−４）}ＧｌｃＮＡｃ_{（２−４）}Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２またはＳＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ_２（ここで、該シアル酸残基はα−２，６結合により結合している）から選択される構造を含むシアル酸化Ｎ−グリカンを含む抗体または抗体フラグメントである、請求項１８記載の方法。