RU2016103373A - Клетки нитчатых грибов с дефицитом о-маннозилтрансферазы и способы их применения - Google Patents

Claims (55)

1. Клетка нитчатых грибов с дефицитом PMT, содержащая:

a) первую мутацию, которая снижает или устраняет активность эндогенных протеаз по сравнению с родительской клеткой нитчатых грибов, которая не имеет указанной первой мутации, и

b) вторую мутацию в гене PMT, которая снижает активность эндогенной O-маннозилтрансферазы по сравнению с родительской клеткой нитчатых грибов, которая не имеет указанной второй мутации,

где указанная клетка нитчатых грибов выбрана из группы, состоящей из клетки Trichoderma, Neurospora, Myceliophthora и Chrysosporium.

2. Клетка нитчатых грибов с дефицитом PMT по п.1, где указанная вторая мутация, которая снижает активность эндогенной O-маннозилтрансферазы, представляет собой делецию или разрушение гена PMT, кодирующего активность эндогенной O-маннозилтрансферазы белков.

3. Клетка нитчатых грибов с дефицитом PMT по п.1 или 2, где указанная вторая мутация в гене представляет собой мутацию в любом из:

a) ген PMT1, содержащий полинуклеотид SEQ ID NO: 1,

b) функциональный ген, гомологичный гену PMT1, причем этот функциональный ген способен восстанавливать исходный уровень O-маннозилирования путем функциональной комплементации при введении в штамм T. reesei, имеющий разрушение указанного гена PMT1, или

с) полинуклеотид, кодирующий полипептид, обладающий по меньшей мере 50% идентичностью с SEQ ID NO: 2, причем указанный полипептид обладает активностью O-маннозилтрансферазы.

4. Клетка нитчатых грибов с дефицитом PMT по п.1, где указанная клетка имеет третью мутацию, которая снижает уровень или устраняет экспрессию гена ALG3 по сравнению с уровнем экспрессии в родительской клетке, которая не имеет такую третью мутацию.

5. Клетка нитчатых грибов с дефицитом PMT по п.4, дополнительно содержащая первый полинуклеотид, кодирующий каталитический домен N-ацетилглюкозаминилтрансферазы I, и второй полинуклеотид, кодирующий каталитический домен N-ацетилглюкозаминилтрансферазы II.

6. Клетка нитчатых грибов с дефицитом PMT по п.1, дополнительно содержащая один или несколько полинуклеотидов, кодирующих полипептид, выбранный из группы, состоящей из:

a) α1,2-маннозидазы,

b) каталитического домена N-ацетилглюкозаминилтрансферазы I,

c) α-маннозидазы II,

d) каталитического домена N-ацетилглюкозаминилтрансферазы II.

e) β1,4-галактозилтрансферазы; и

f) фукозилтрансферазы.

7. Клетка нитчатых грибов с дефицитом PMT по п. 1, где указанная клетка представляет собой клетку Trichoderma, содержащую мутацию, которая снижает или устраняет активность O-маннозилтрансферазы белков pmt1 Trichoderma.

8. Клетка нитчатых грибов с дефицитом PMT по п.1, где указанная клетка представляет собой клетку Trichoderma, например Trichoderma reesei, и указанная клетка содержит мутации, которые снижают или устраняют активность

a) трех эндогенных протеаз pep1, tsp1 и slp1,

b) трех эндогенных протеаз gap1, slp1 и pep1,

c) трех эндогенных протеаз, выбранных из группы, состоящей из pep1, pep2, pep3, pep4, pep5, pep8, pep11, pep12, tsp1, slp1, slp2, slp3, slp7, gap1 и gap2,

d) от трех до шести протеаз, выбранных из группы, состоящей из pep1, pep2, pep3, pep4, pep5, tsp1, slp1, slp2, slp3, gap1 и gap2, или

e) от семи до десяти протеаз, выбранных из группы, состоящей из pep1, pep2, pep3, pep4, pep5, pep7, pep8, tsp1, slp1, slp2, slp3, slp5, slp6, slp7, slp8, tpp1, gap1 и gap2.

9. Способ получения белка, имеющего сниженное O-маннозилирование, включающий:

a) предоставление клетки нитчатых грибов с дефицитом PMT, имеющей мутацию в гене PMT, которая снижает активность эндогенной O-маннозилтрансферазы по сравнению с родительским штаммом, который не имеет такой мутации, и дополнительно содержащей полинуклеотид, кодирующий белок с остатком серина или треонина,

b) культивирование указанной клетки нитчатых грибов с дефицитом PMT для продуцирования указанного белка со сниженным O-маннозилированием,

где указанная клетка нитчатых грибов выбрана из группы, состоящей из клетки Trichoderma, Neurospora, Myceliophthora и Chrysosporium.

10. Способ по п.9, где указанная мутация в гене PMT представляет собой мутацию в любом из:

a) ген PMT1, содержащий полинуклеотид SEQ ID NO: 1,

b) функциональный ген, гомологичный гену PMT1, причем этот ген способен восстанавливать исходный уровень O-маннозилирования путем функциональной комплементации при введении в штамм T. reesei, имеющий разрушение указанного гена PMT1, или

с) полинуклеотид, кодирующий полипептид, обладающий по меньшей мере 50% идентичностью с SEQ ID NO: 2, причем указанный полипептид обладает активностью O-маннозилтрансферазы.

11. Способ по п.9 или 10, где указанная клетка нитчатых грибов экспрессирует функциональный эндогенный белок-шаперон, такой как протеиндисульфидизомераза (PDI).

12. Способ по п.9, где указанная клетка нитчатых грибов с дефицитом PMT выбрана из клеток по любому из пп.1-8.

13. Способ по п.9, где указанный продуцируемый белок представляет собой гетерологичный белок млекопитающих, выбранный из группы, состоящей из

a) иммуноглобулина, такого как IgG,

b) легкой цепи или тяжелой цепи иммуноглобулина,

c) тяжелой цепи или легкой цепи антитела,

d) одноцепочечного антитела,

e) антитела животного семейства верблюжьих,

f) мономерного или мультимерного однодоменного антитела,

g) FAb-фрагмента, FAb2-фрагмента, и

h) их антигенсвязывающих фрагментов.

14. Способ получения антитела, имеющего сниженное O-маннозилирование, включающий:

a) предоставление клетки нитчатых грибов с дефицитом PMT, имеющей

i. мутацию, которая снижает активность эндогенной O-маннозилтрансферазы белков по сравнению с родительским штаммом, который не имеет такой мутации, и

ii. полинуклеотид, кодирующий легкую цепь антитела, и полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь антитела,

b) культивирование клетки для продуцирования указанного антитела, состоящего из тяжелой и легкой цепей, имеющих сниженное O-маннозилирование,

где указанная клетка нитчатых грибов выбрана из группы, состоящей из клетки Trichoderma, Neurospora, Myceliophthora и Chrysosporium.

15. Композиция белка или антитела, получаемая способом по п.9.

16. Композиция белка или антитела композиция по п.15, где указанный белок или антитело содержит в качестве основной гликоформы любую из

a) Manα3[Manα6(Manα3)Manα6]Manβ4GlcNAβ4GlcNAc (гликоформа Man5);

b) Manα6(Manα3)Manβ4GlcNAβ4GlcNAc (гликоформа Man3);

c) N-гликаны гибридного или комплексного типа, такие как гликоформы, выбранные из подгруппы, состоящий из GlcNAcMan3, G0 или гибридного гликана GlcNAcMan5, и галактозилированных производных, таких как GalGlcNAcMan3, G1, G2; и гликоформы GalGlcNAcMan5.