CN110885810B

CN110885810B - 一种利用真核发酵制备得到的抑菌蛋白酶CmYC1及其应用

Info

Publication number: CN110885810B
Application number: CN201911295621.6A
Authority: CN
Inventors: 杨龙; 王永春; 余涵; 李国庆; 吴明德; 张静
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2019-12-16
Filing date: 2019-12-16
Publication date: 2021-03-23
Anticipated expiration: 2039-12-16
Also published as: CN110885810A

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用真核发酵制备得到的抑菌蛋白酶CmYC1及其应用。本发明开发一种新的抑菌蛋白酶CmYC1，该蛋白能抑制核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）、灰霉菌（Botrytis cinerea），小核盘菌（Sclerotinia minor）、毛霉（Mucor hiemails）、立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）、禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、瓜果腐霉（Pythium apanidermatum）的生长，且能抑制核盘菌子囊孢子在油菜叶片上的侵染，具有良好的开发成抑菌剂的潜力。

Description

一种利用真核发酵制备得到的抑菌蛋白酶CmYC1及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用真核发酵制备得到的抑菌蛋白酶CmYC1及其应用。

背景技术

核盘菌[Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary]是一种重要的植物病原真菌，可以引起多种作物的菌核病。在实际生产中防治菌核病主要采取农业措施为主，药剂防治为辅的综合防治策略(侯明生和黄俊斌，2006)。小核盘菌(Sclerotinia minor)是一种世界范围内的重要植物病原真菌，它能造成植物的基部腐烂，从而导致严重的经济损失(Subbarao,1998)。灰霉菌(Botrytis cinerea)可以危害1400余种植物，其中包括水果、蔬菜和园艺作物等多种经济作物(Elad et al.,2016)。危害部位几乎包括植物的所有部位，包括种子、幼苗、茎秆、叶片、花朵和果实，并引起茎腐、叶疫、花腐、果腐等症状。在植物生长期和贮藏期，灰霉病均可造成严重的经济损失。据统计，每年全球用于灰霉病防治的经济投入超过11亿美元(Dean et al.,2012)。立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)可引起水稻，玉米，小麦等多种作物的纹枯病。毛霉(Mucor hiemails)广泛分布于自然界，为腐生性真菌，具有较强的分解蛋白质能力，常引起食物霉变。禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)能引起小麦赤霉病，在世界范围内均有发生。我国长江中下游地区是小麦赤霉病的高发地区(Yuet al.,2007)。赤霉病会造成作物减产，谷物品质下降，降低种子的萌发率，造成严重的经济损失。赤霉病还会产生镰刀菌毒素，危害人畜健康。尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)是一种世界性分布的土传病原真菌，寄主范围广泛，可引起瓜类、茄科、香蕉、棉、豆科及花卉等100多种植物枯萎病的发生。瓜果腐霉(Pythium apanidermatum)能引起多种农作物的猝倒病和瓜果腐烂病，寄主范围很广，可以侵染玉米引起茎腐(王晓鸣，1994)，侵染黄瓜、番茄等引起猝倒病、果腐，在苗期发病尤为严重，常造成大量死苗(郭世保，2015；潘金菊，2008)。病菌侵入果实种皮后，在运输、贮存的过程中，遇到合适的温度、湿度条件时，可以通过伤口深入果实内部，最终导致果实腐烂溃败，失去产品价值(张旭，2012)。

植物病害是影响农业生产的自然灾害之一。目前，农业生产中病原菌的防治仍以化学防治为主。近年来，随着人们对食品安全和环境污染的关注，一些化学杀菌剂在很多发达国家和地区受到严重限制。人们开始寻找一种对人类和环境无害的植物病害防治策略，并且具有良好的防治效果。在食品安全问题日益受到关注的今天，对环境无污染也不会有农药残留的生物防治无疑是替代化学防治的最优手段。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种抑菌蛋白酶CmYC1，所述蛋白酶的氨基酸序列为SEQI D NO.2所示。

本发明的另一个目的在于提供了抑菌蛋白酶CmYC1在制备成广谱抑菌剂中的应用。为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种抑菌蛋白酶CmYC1，所述蛋白酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

以上所述的蛋白酶可用本领域的常规方式合成或制备得到，包括直接合成，真核表达等；在本发明中采取真核表达的方式获得抑菌蛋白酶CmYC1，是将含有SEQ ID NO.1的真核表达载体pPIC9转到酵母表达菌株GS115中，诱导表达得到。

抑菌蛋白酶CmYC1在制备成广谱抑菌剂中的应用，所述的抑菌剂可抑制的植物病原真菌包括核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)、灰霉菌(Botrytis cinerea)，小核盘菌(Sclerotini a minor)、毛霉(Mucor hiemails)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、禾谷镰刀菌(Fusar ium graminearum)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、瓜果腐霉(Pythiumapanidermatu m)；

以上所述的抑菌蛋白酶CmYC1还可作为核盘菌防护剂，抑制核盘菌子囊孢子侵染油菜叶片。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

在生产过程中，主要采用化学农药来防治作物病害，化学农药的使用会造成环境污染等状况，因此生物防治成为替代农药防治的最优手段。本发明开发一种新的抑菌蛋白酶CmY C1，该蛋白能抑制核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)、灰霉菌(Botrytiscinerea)，小核盘菌(Sclerotinia minor)、毛霉(Mucor hiemails)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、瓜果腐霉(Pythium ap anidermatum)的生长，且能抑制核盘菌子囊孢子在油菜叶片上的侵染。

附图说明

图1为明胶平板实验。

图2为蛋白酶CmYC1对核盘菌子囊孢子侵染油菜叶片效果示意图。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方式；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

实施例1：

一种利用真核发酵制备得到抑菌蛋白酶CmYC1的方法：

人工合成SEQ ID NO.1所示核苷酸序列，以SEQ ID NO.1所示序列为模板(引物F：atcgaattcATGGCTCCCGTTGTCACTCCT，R：aaatatgcggccgcTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTGCGCCGTTGCCGTTGTAGA)，扩增序列，构建到真核表达载体pPIC9上。将测序正确的质粒转到酵母表达菌株GS115中，用MD培养基(1％酵母提取物，2％蛋白胨，1×YNB，2％葡萄糖，1％琼脂)筛选阳性转化子，即得到可表达抑菌蛋白酶CmYC1的工程菌。

使用BMGY培养基(1％酵母提取物，2％蛋白胨，1×YNB，1％甘油，0.0002％生物素，pH＝7)将抑菌蛋白酶CmYC1的工程菌扩大摇培，离心收集菌体，将菌体用BMMY(1％酵母提取物，2％蛋白胨，1×YNB，1％甲醇，0.0002％生物素，pH＝7)重悬浮至OD600＝1，28℃，180rpm诱导表达60小时(此时酶浓度为15.12Uml^-1)，收集发酵液。

利用6×HIS标签镍柱纯化蛋白酶CmYC1，最终获得蛋白酶CmYC1，所述蛋白酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

蛋白酶CmYC1明胶平板定性检测蛋白酶活性实验：

1)每个培养皿加入明胶琼脂培养基(GA)10ml，在平板中央打孔(5mm)。

2)将待测的蛋白酶标准品取100μl加入中央孔中。将培养皿封口，置于37℃下放置3d，使蛋白酶降解明胶。

3)向培养皿中倒入酸性升汞(称2.3g升汞，加入12ml蒸馏水和3ml浓盐酸溶解)15ml，在常温下静静放置1min。明胶的主要成分为蛋白质，升汞与明胶结合，会产生白色混浊物。而当明胶被蛋白酶分解后，混浊消失，会出现透明圈。透明圈的大小与蛋白酶的活性成正相关(Maccheroni et al.,2004)。

明胶平板有透明圈产生，证明CmYC1有蛋白酶活性(图1)

实施例2：

蛋白酶CmYC1酶学特性分析实验。

1)蛋白酶活力定义：1mL酶液在40℃pH 7.2条件下1min反应产生1微克酪氨酸所需要的酶量为1个酶活力单位(1U)。

2)标准曲线的绘制。用蒸馏水分别配置含有10、20、30、40、50、60、70、80、90、100μg/mL酪氨酸溶液，吸取上述不同浓度的酪氨酸溶液1mL各加入0.55mol/L碳酸钠溶液5mL，再各加入已稀释的福林试剂1mL。摇匀置于水浴锅中，40℃保温发色15min，冷却后以1号管为空白，于分光光度计波长660nm处测定吸光度，做3次平行，取平均值。以酪氨酸的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

3)用福林酚法测定蛋白酶酶活力(U/m L)：取甲、乙两试管各吸取0.2mL上清，加入0.8mL pH7.5的磷酸缓冲液稀释，乙管先加入10％三氯乙酸3mL(即空白管)，置于40℃水浴中预热3-5min，再各加入经同样预热的磷酸缓冲液(pH7.5)溶解的0.5％酪蛋白溶液2m L，继续精确水浴保温15min后，取出两管并立即在甲管加入10％三氯乙酸3mL，将甲乙两管离心或过滤除去沉淀，取上清液1mL加入0.55mol/L碳酸钠溶液5mL和Folin试剂1mL摇匀，于40℃保温发色15min后，在680nm波长处测定吸光度，以空白管进行调零。

4)结果计算：样品蛋白酶活力单位(U/m L)＝A/15×6式中：A-由样品测得OD值对应标准曲线得到的相当的酪氨酸微克数；6-反应液取出1mL测定(即6倍)：15-反应15m in。

5)蛋白酶CmYC1最适反应温度测定：将取200lμl CmYC1(0.22U/ml)与酪蛋白装入离心管中分别放在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃的水浴锅中反应60min，按照上述福林酚法测定各个处理的酶液反应后OD660值，每个处理重复3次,残余活性＝处理酶活/最适温度酶活*100％。

实验结果分析：蛋白酶CmYC1最适反应温度为35℃，在30-45℃时，能有较高的活性。随着反应温度的升高，CmYC1的活性降低，温度超过65℃，CmYC1基本失去活性。

6)蛋白酶CmYC1最适反应pH测定：调节底物酪蛋白的pH至4/5(0.1M磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液)、6(0.1M磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液)、7(0.1M Tris-HCl)、8(0.1M Tris-HCl)、9(0.1M甘氨酸-NaOH)、10(0.1M甘氨酸-NaOH)、11(0.1M甘氨酸-NaOH)、12(0.1M甘氨酸-NaOH)。在40℃，加入CmYC1(0.23U/ml)反应60min，通过福林酚法测定各个处理蛋白酶酶活，每个处理重复3次，残余活性＝处理酶活/最适pH酶活*100％

实验结果分析：蛋白酶CmYC1最适反应pH为7，在pH6-8时，CmYC1能保证其较高的活性。在pH高于9时，CmYC1基本失去活性。

7)不同金属离子对蛋白酶CmYC1活性影响测定：分别将5mM的MgSO4、FeSO4、ZnSO4、CaCl2、CuSO4、MnCl2、LiCl、KCl、与CmYC1(1.35U/ml)按1:1(v/v)比例混合，用水作为对照。在室温下处理1h。然后加入酪蛋白底物在40℃反应10min，通过福林酚法测定各个处理蛋白酶酶活，每个处理重复3次，残余活性＝处理酶活/对照酶活*100％。

实验结果分析：在Zn²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺和Cu²⁺存在的条件下会增强CmYC1的活性，在F e²⁺和Li⁺存在的条件下，会抑制CmYC1的活性。Mg²⁺和K⁺存在的条件下，对CmYC1的活性影响不大。

8)不同抑制剂对蛋白酶CmYC1活性影响测定：将不同抑制剂100μΜ半胱氨酸蛋白酶抑制剂(Iodocacetamide)、0.3μM胰蛋白酶抑制剂(Aprotinin)、2mM胰蛋白酶抑制剂(Leupeptin)、100μΜ胰蛋白酶抑制剂(Tryinhibitor)、3mM金属蛋白酶抑制剂(EDTA)、5mM巯基蛋白酶抑制剂(DTT)、5mM金属蛋白酶抑制剂(EGTA)、1mM丝氨酸蛋白酶抑制剂(PMSF)分别与CmYC1(3.19U/ml)按1：1(v/v)比例混合，在室温下处理30min，然后加入酪蛋白底物在37℃反应10min，通过福林酚法测定各个处理蛋白酶酶活，每个处理重复3次，残余活性＝处理酶活/对照酶活*100％。

实验结果分析：蛋白酶CmYC1用PMSF处理后，基本失去活性。存在的条件下会抑制CmYC1的活性。DTT、Aprotinin处理CmYC1，对其酶活没有显著影响。Leupeptin、Iodocacetamide处理后，对CmYC1活性有抑制作用。EDTA、EGTA处理，会显著抑制CmYC1活性。

实施例3：

蛋白酶CmYC1对核盘菌，灰霉菌，小核盘菌，毛霉，丝核菌，禾谷镰刀菌，尖孢镰刀菌，瓜果腐霉菌丝生长的影响实验：

将诱导48h CmYC1酵母发酵液(8.26U/ml)添加到PDA培养基中(每100mlPDA加10ml发酵液)，煮沸灭活发酵液作为对照；将活化的病原菌打菌饼(直径0.5厘米)接种至培养基中，24h后计算抑菌率(抑菌率＝(对照菌落半径-处理菌落半径)*100％)。蛋白酶Cm YC1对核盘菌，灰霉菌，小核盘菌，毛霉，丝核菌，赤霉，尖孢镰刀菌，瓜果腐霉的菌丝生长均有一定得抑制效果。

菌株	抑菌率(％)
		核盘菌Sclerotinia sclerotiorum	22.21±2.35
小核盘菌Sclerotinia minor	22.54±2.38
		灰霉菌Botrytis cinerea	29.88±3.67
毛霉Mucor hiemails	10.62±1.49
		立枯丝核菌Rhizoctonia solani	13.98±0.81
禾谷镰刀菌Fusarium graminearum	19.48±0.01
		尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum	14.95±1.07
瓜果腐霉Pythium apanidermatum	12.82±2.61

实施例4：

蛋白酶CmYC1对核盘菌子囊孢子侵染油菜叶片的影响实验

1)取核盘菌菌核，埋在土壤中，20℃保湿培养，待菌核萌发出子囊盘后，将子囊盘磨碎，用CmYC1(0.34U/ml)重悬浮子囊孢子，使其孢子浓度为2×10⁵个/ml，用水重悬浮的核盘菌子囊孢子做对照。

2)将油菜叶片上放置油菜花瓣，在油菜花瓣上滴加20微升核盘菌孢子悬浮液，20℃保湿培养4天，观察油菜叶片发病情况。

实验结果分析：对照组油菜叶片发病，用CmYC1处理核盘菌子囊孢子的油菜叶片未发病(图2)，说明CmYC1有抑制核盘菌子囊孢子侵染油菜叶片的效果。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种利用真核发酵制备得到的抑菌蛋白酶CmYC1及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1185

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgcgtctcg acttcatcac cctcgccgcc ttgcctttgg tgctcggtgc tcccgttgtc 60

actcctcgct ctggacaggt cattcccggt cgatacattg tcaagttcaa gaacagcgac 120

ttcacgacct cggtcatcaa cagcgtcctc gctctgctgc ccgccgcccc ggcccacacc 180

tacaccctta gcaccttcaa gggtttcgcg ggtgagctca gtgatgagct cgtcaaaacc 240

attgccgctc ttcccaacgt tgaatacatt gagaaggacg caatcgtcaa gattgctcaa 300

tgggaagagg atgtagctct tgagaagaag gccctcacaa cgcagtccgg cgccccttgg 360

ggcctgggcc gtatctcgca cgttgccaag ggttcaacat cctacgtcta cgacaccacc 420

gcgggggctg atacctgctc ctacatcatt gacaccggta tctacacctc acactctgac 480

tttggtggac gtgctacatt ccttgccaac tacgctggtg acggctctaa cactgatggt 540

aacggtcacg gtacccacgt tgctggaacc atcggatcta agacctacgg tatcgccaag 600

aacactaagc tctacgctgt caaggtcctt gacgccagcg gctctggtac caactctggt 660

gtcattgctg gcatcaattt cgtcgccagc gatgtcaaga cccgcaactg ccccaagggt 720

gctgttgcga acatgtcttt aggtggcagc aagtccactg ctgtgaacag cgccgccgct 780

gcagtcgtct ctgctggtgt cttcttggct gttgcggctg gtaacgaggc tcaggcagct 840

gtcaacacct cccccgcctc tgagcccagc gtcttcaccg tcggggctac cgacagctct 900

gatgttttcg ccaccttctc caactacggc tcctctgtgg atggtaacgc ccctggtgtt 960

tccatccttt ccacctggaa caacggtggt accaacacca tctccggaac ctcgatggct 1020

tctccccatg ttgctggtct cggtgcttac ctgttgtctc ttgagggcaa ggttacgcct 1080

gccgctctta ccacccgcat ccagtctctt tccaacaaga acaagatcac cagcatcaag 1140

actggaaccg tcaactacct cgtctacaac ggcaacggcg cataa 1185

<210> 2

<211> 394

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Arg Leu Asp Phe Ile Thr Leu Ala Ala Leu Pro Leu Val Leu Gly

1 5 10 15

Ala Pro Val Val Thr Pro Arg Ser Gly Gln Val Ile Pro Gly Arg Tyr

20 25 30

Ile Val Lys Phe Lys Asn Ser Asp Phe Thr Thr Ser Val Ile Asn Ser

35 40 45

Val Leu Ala Leu Leu Pro Ala Ala Pro Ala His Thr Tyr Thr Leu Ser

50 55 60

Thr Phe Lys Gly Phe Ala Gly Glu Leu Ser Asp Glu Leu Val Lys Thr

65 70 75 80

Ile Ala Ala Leu Pro Asn Val Glu Tyr Ile Glu Lys Asp Ala Ile Val

85 90 95

Lys Ile Ala Gln Trp Glu Glu Asp Val Ala Leu Glu Lys Lys Ala Leu

100 105 110

Thr Thr Gln Ser Gly Ala Pro Trp Gly Leu Gly Arg Ile Ser His Val

115 120 125

Ala Lys Gly Ser Thr Ser Tyr Val Tyr Asp Thr Thr Ala Gly Ala Asp

130 135 140

Thr Cys Ser Tyr Ile Ile Asp Thr Gly Ile Tyr Thr Ser His Ser Asp

145 150 155 160

Phe Gly Gly Arg Ala Thr Phe Leu Ala Asn Tyr Ala Gly Asp Gly Ser

165 170 175

Asn Thr Asp Gly Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Ile Gly

180 185 190

Ser Lys Thr Tyr Gly Ile Ala Lys Asn Thr Lys Leu Tyr Ala Val Lys

195 200 205

Val Leu Asp Ala Ser Gly Ser Gly Thr Asn Ser Gly Val Ile Ala Gly

210 215 220

Ile Asn Phe Val Ala Ser Asp Val Lys Thr Arg Asn Cys Pro Lys Gly

225 230 235 240

Ala Val Ala Asn Met Ser Leu Gly Gly Ser Lys Ser Thr Ala Val Asn

245 250 255

Ser Ala Ala Ala Ala Val Val Ser Ala Gly Val Phe Leu Ala Val Ala

260 265 270

Ala Gly Asn Glu Ala Gln Ala Ala Val Asn Thr Ser Pro Ala Ser Glu

275 280 285

Pro Ser Val Phe Thr Val Gly Ala Thr Asp Ser Ser Asp Val Phe Ala

290 295 300

Thr Phe Ser Asn Tyr Gly Ser Ser Val Asp Gly Asn Ala Pro Gly Val

305 310 315 320

Ser Ile Leu Ser Thr Trp Asn Asn Gly Gly Thr Asn Thr Ile Ser Gly

325 330 335

Thr Ser Met Ala Ser Pro His Val Ala Gly Leu Gly Ala Tyr Leu Leu

340 345 350

Ser Leu Glu Gly Lys Val Thr Pro Ala Ala Leu Thr Thr Arg Ile Gln

355 360 365

Ser Leu Ser Asn Lys Asn Lys Ile Thr Ser Ile Lys Thr Gly Thr Val

370 375 380

Asn Tyr Leu Val Tyr Asn Gly Asn Gly Ala

385 390

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atcgaattca tggctcccgt tgtcactcct 30

<210> 4

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aaatatgcgg ccgcttagtg gtggtggtgg tggtgtgcgc cgttgccgtt gtaga 55

Claims

1.一种抑菌蛋白酶CmYC1，所述蛋白酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

2.权利要求1所述的抑菌蛋白酶CmYC1在制备成抑菌剂中的应用；所述的抑菌剂抑制核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）、灰霉菌（Botrytis cinerea），小核盘菌（Sclerotinia minor）、Mucor hiemails、立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）、禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）或瓜果腐霉（Pythium apanidermatum）。

3.权利要求1所述的抑菌蛋白酶CmYC1在制备成核盘菌防护剂中的应用。