MX2010012626A - Produccion eficiente de proteinas heterologas utilizando inhibidores de manosil transferasa. - Google Patents

Abstract

Se describen compuestos y métodos para la producción de composiciones de proteína que tienen cantidades reducidas de glicosilación O-enlazada; el método incluye la producción de la proteína en las células cultivadas en la presencia de ciertos inhibidores de benciliden tiazolidinedionas de la glicosilación O-enlazada mediada por Pmt.

Description

ODUCCIÓN EFICIENTE DE PROTEINAS HETERÓLOGAS UTIL INHIBIDORES DE MANOSIL TRANSFERASA ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las glicoproteínas median muchas funciones esencial s humanos y en otros mamíferos, incluyendo la catálisis, señ unicación célula-célula, y reconocimiento y asociación molec proteínas constituyen la mayoría de las proteínas no citolí nismos eucariontes (Lis y Sharon, 1993, Eur. J. Biochem. 21 has glicoproteínas se han explotado con fines terapéuticos, y du últimas décadas, las versiones recombinantes de glicoproteína entan de manera natural han sido una parte importante de la ind biotecnología. Los ejemplos de proteínas recombinantes gli adas como agentes terapéuticos incluyen eritropoyetina En general, las estructuras de glicosilación de los oligo glicoproteína variarán dependiendo de las especies hospedera las utilizadas para su producción. Las proteínas terapéuticas pr élulas hospederas no humanas probablemente contengan glicosil ana que pueda provocar una respuesta inmune en human plo, hipermannosilación en levadura (Ballou, 1990, Methods : 440-470); a(1 ,3)-fucosa y (1 ,2)-x¡losa en plantas, (Cabanes-M l, 1999. Glycobiology, 9: 365-372), ácido N-glicolilneuramínico e vario de hámster chino (Noguchi et al., 1995. J. Biochem 117: -1 ,3Gal glicosilación en ratones (Borrebaeck, et al., 1993, Immu 477-479). Las cadenas de carbohidrato unidas a las proteína las animales incluyen las cadenas de carbohidrato tipo enlace N- ibién llamadas N-glicanos, o glicosilación N-enlazada) unidas a u aragina (Asn) en la proteína y cadenas de carbohidrato tipo e osido (también llamados O-glicanos, o glicosilación O-enlazada) ífero producen poblaciones heterogéneas de glicoformas, tien s volumétricos, y requieren tanto la contención viral en curso po considerable para generar líneas celulares estables.

Es bien sabido que las glicoformas particulares en una den afectar profundamente las propiedades de la proteína, inclu acocinética, farmacodinámica, interacción del receptor, y las pro ireccionamiento específicas del tejido (Graddis et al., 2002. Cu echnol 3: 285-297). Por ejemplo, se ha demostrado que los d oñes de glicosilación de las Igs están asociados con d iedades biológicas (Jefferis y Lund, 1997, Antibody Eng. Chem. I 111-128; Wright y Morrison, 1997, Trends Biotechnol, 15: 26-32). a demostrado que la galactosilación de una glicoproteína pue ún las condiciones de cultivo celular, que puede volver a posiclones de glicoproteína inmunogénicas dependiendo del p ctosa específica en la glicoproteína (Patel et al., 1992. Bioche en una glicoforma específica permite la producción de glico péuticas que tiene características específicas en particular, ucción de composiciones de glicoproteína que están enriqueci formas particulares, es altamente deseable.

Aunque la vía para la N-glicosilación ha sido objeto d lisis, el proceso y la función de la glicosilación O-enlazada no comprendidos. Sin embargo, se sabe que a diferencia de la glic nlazada, la O-glicosilación es un evento postraduccional, que se el cis-Golgi (Varki, 1993, Glycobiol, 3: 97-130). Aunque una s ptora consenso para la glicosilación O-enlazada igual que la glic nlazada no parecen existir, una comparación de las secue noácidos en torno a un gran número de sitios de glicosilación O- arias glicoproteínas muestra una mayor frecuencia de residuos d las posiciones -1 y +3 en relación con los residuos glicosilad cado aumento de los residuos de serina, treonina, y alanina (Wils a siete genes PMT q e codifican los homólgos de Pmt (revisado ., Curr. Opin. Struct. Biol. 2003 Oct; 13 (5): 621-30). En la lev silación O-enlazada inicia por la adición de la mañosa inicial a ol-fosfato mañosa a un residuo de serina o treonina de una glico nte en el retículo endoplasmático por uno de los siete gene osil transferasa. Aunque parece que hay siete genes PMT que homólogos de Pmt en la levadura, la O-manosilación de p etadas por hongos y heterologa en levadura depende principal genes que codifican Pmt1 y Pmt2, que parecen funcionar c rodímero. PMT1 y PMT2 y sus productos proteicos, Pmt1 ctivamente, parecen estar altamente conservados entre las espe Tanner et al. en la Patente de E.U.A. No. 5,714,377 des s PMT1 y PMT2 de Saccharomyces cerevisiae y un método cación de proteínas recombinantes que tienen glicosilación O-eida que utiliza células fúngales en donde uno o más de los gen Las UDP-N-acetil-alfa-D-galactosamina:polipéptido de 1 tosaminil transferasas (GalNAc-transferasas) participan silación O-enlazada tipo mucina que se encuentra en euc riores. Estas enzimas inician la O-glicosilación de los amin cíficos serina y treonina en las proteínas mediante la adició ilgalactosamina al grupo hidroxilo de estos aminoácidos a los c ueden añadir residuos de mañosa de forma gradual. Clausen et nte de E.UA No. 5,871 ,990 y la Solicitud de Patente Public 0026266 describen una familia de ácidos nucleicos que codifican etil-alfa-D-galactosamina:polipéptido de N-acetil-galact ferasas (GalNAc-transferasas). Clausen en la Solicitud de icada de E.U.A. No. 20030186850 describe el uso de GalNac-bet inhibir selectivamente las lectinas del polipéptido GalNAc-transf irve como sustrato para otras glicosiltransferasas implicada ntesis del O-glicano, inhibiendo así la O-glicosilación.

Konrad et al. en la Solicitud de Patente de E.U.A. PubliC 0128235 describen un método para tratar o prevenir la diabetes iante inhibición farmacológica de la glicosilación de proteína O- n tejido o célula. El método se basa en el tratamiento de un i ético con (Z)-1-[N-(3-Amoniopropil)-N-(n-propil)arnino]diazen-io-1 , derivado del mismo, que se une a la N-acetilglucosamina transf zada y por lo tanto inhibe la glicosilación O-enlazada.

Kojima et al. en la Patente de E.U.A. No. 5,268,364 posiciones terapéuticas para la inhibición de la O-glicosilación u puestos tales como bencil-a-N-acetilgalactosamina, que in sión de la O-glicosilación que conduce a la acumulación de O-a- bloquear la expresión de SLex o SLea por los leucocitos o las rales y, por tanto inhibir la adhesión de estas células a las teliales y las plaquetas.

Boime et al. en la Patente de E.U.A. No. 6,103,501 divu BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Se describen los compuestos y métodos para la produ posiciones de proteína que tiene cantidades reducidas de glicosil ada. El método incluye la producción de la proteína en células c a presencia de ciertos inhibidores benciliden tiazolidinediona silación O-enlazada mediada por Pmt.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las figuras 1A-1 C ilustran el efecto de los inhibidores yendo el inhibidor novedoso que se muestra como el Ejemplo 4 cosilación del anticuerpo monoclonal recombinante secretado e ris. Los inhibidores químicos de Pmt redujeron la O-glicosilación era dosis-dependiente. El western blot utilizando un anticuerpo DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona compuestos nove dos para expresar una proteín recombinante (incluyendo polip proteínas), que sean susceptibles a la glicosilación O-enlazada la hospedera particular, que tiene una cantidad reducida de glic lazada (incluyendo la glicosilación no O-enlazada) en ese tipo c do consiste en inducir la expresión de una proteíná de interés la hospedera en la que la proteína es susceptible a la glicosil zada en la célula hospedera en la presencia de uno o más co dosos de la invención, que son inhibidores de la actividad de un o proteínas Dol-P-Man:Proteína (Ser/Thr) Manosil Transferasa icadas en la transferencia de mañosa a un residuo de serina o tre oteína en la célula, opcionalmente con uno o más a 1 ,2-man 0 se describe en Bobrowicz et al. Solicitud de Patente de riontes inferiores, por ejemplo levadura y bacterias, que norm ían producir proteínas con glicanos O-enlazada, que tienen un cido de glicanos O-enlazada. Sin embargo, mientras que el m cialmente adecuado para la expresión de proteínas con glicosil ada reducida en los organismos eucariontes inferiores, el ién se puede practicar en los organismos eucariontes superiores rias.

Los inhibidores de Pmt de la invención se seleccio ente grupo: riben un método para la elaboración de proteínas recombinan n glicosilación O-enlazada reducida utilizando células funga le o células de levadura en las cuales uno o más de los genes ican la proteína Pmt han sido genéticamente modificados de m ucen proteínas recombinantes que tienen glicosilación O-e cida. Si bien la deleción de los genes PMT1, PMT2, o PMT4 en u ederá fungal permite la producción de una proteína recombina glicosilación O-enlazada reducida en la célula hospedera fu esión de los genes PMT es importante para el crecimiento de ederá y cualquier deleción sola también afecta negativam cidad de la célula hospedera fungal para crecer por lo que ucir una cantidad suficiente de células hospederas o de la mbinante con una cantidad reducida de glicosilación O-enlaz ión de PMT2 más cualquier PMT1 o PMT4 parece ser letal para l ederá fungal. Por lo tanto, la eliminación genética de los genes ían obtener si los genes PMT hubieran sido eliminados. Ade alidades particulares, la expresión de la proteína recombinant la hospedera se controla por un promotor inducible y la actividad célula hospedera no se inhibe hasta que se induce la expresi ína recombinante. Esto permite que grandes cantidades de ederás que contienen un ácido nucleico que codifica una mbinante se produzcan en el cultivo antes de inducir la expresi ína recombinante y de añadir del inhibidor de PMT. Esto puede roducción de grandes cantidades de proteína recombinante q silación O-enlazada reducida como un producto en el cultiv do de tiempo más corto de lo que ocurre para las células hosped n uno o más genes PMT deletados y que crecen poco en cultivo.

Los inhibidores de Pmt descritos en la presente invenci rados en comparación con aquellos descritos anteriormente en l. (Patente de E.U.A. No. 7,105,554) y Bobrowicz et al. (Soli proteínas que tienen predominantemente una estructura parti no N-enlazada, pero que también O-glicosilan la glicoproteí dos para producir una amplia variedad de glicoproteínas qu formas N-enlazada predominantemente particulares, se han divul atente de E.U.A. No. 7.029.872 y las Solicitudes de Patente d icadas Nos. 20050170452, 20050260729, 20040230042, 20050 0208617, 20040171826, 20060160179, 20060040353, y 20060 quiera de las células hospederas descritas en la patente anteri cionada y en las solicitudes de patente se pueden utilizar para glicoproteína que tiene principalmente una estructura particular d lazada y que tiene glicosilación O-enlazada reducida utilizando el rito en la presente invención. Se ha encontrado que algunas ederás que han sido genéticamente modificadas para proteínas que tienen predominantemente una estructura parti no N-enlazada pueden crecer menos en cultivo bajo con élulas, o afecta negativamente la capacidad de las células par a cantidades adecuadas en cultivo. Los métodos en la presente i n los efectos nocivos potenciales de la deleción de los genes iitir que las células crezcan hasta cantidades adecuadas en culti ducir la expresión de la glicoproteína recombinante y la adició idor de la actividad de las proteínas Pmt, opcionalmente con uno anosidasas, para producir la glicoproteína recombinante q cturas de glicano N-enlazada particularmente predomin silación O-enlazada reducida.

Un aspecto de los métodos descritos en la presente inve provee una composición de glicoproteína que comprende glicosil ada reducida y predominantemente una glicoforma N-e cífica en la que la glicoproteína recombinante puede presentar un idad biológica y/o disminución de la inmunogenicidad no dés ión con las composiciones de la misma glicoproteína producidas AcMan5GlcNAc2, GlcNAcMan3GlcNAc2) GlcNAc2Man3 lcNAcMan5GlcNAc2, Gal(GlcNAc)2Man5 GIcNAc)2 an5GlcNAc2, NANAGalGlcNAcMan3 A2Gal2GlcNAcMan3GlcNAc2 y GalGlcNAcMan3GlcNAc2 y que silación O-enlazada reducida pueden ser efectivas en dosis má o tanto teniendo una mayor eficacia/potencia.

En general, el método para producir proteínas qu silación O-enlazada reducida comprende la transformación de un ederá con un ácido nucleico que codifica una proteína recomb rologa en la que es deseable producir la proteína que tiene glic lazada reducida. El ácido nucleico que codifica la proteína reco ne operativamente a secuencias reguladoras que permiten la e a proteína recombinante. Dichas secuencias reguladoras incl otor inducible y, opcionalmente, un potenciador hacia 3', o ha nucleico que codifica la proteína de fusión y un sitio de terminaci ueden transformar con éxito con un ácido nucleico que car encias externas al vector.

Los ácidos nucleicos que codifican proteínas recom adas se pueden obtener a partir de varias fuentes. Las secue c pueden ser amplificadas a partir de líneas celulares que se s esan la proteína usando los iniciadores para regiones cons se, por ejemplo, Marks et al., J. Mol. Biol. 581-596 (1991)). Lo icos también se pueden sintetizar de novo basándose en las se literatura científica. Los ácidos nucleicos también se pueden la extensión de la superposición de oligonucleótidos que abar encia deseada (véase, por ejemplo, Caldas et al., Protein Engi 53-360 (2000)).

En un aspecto, el ácido nucleico que codifica la proteín ativamente a un promotor inducible, que permite la expresió ína que se induce cuando se desea. En otro aspecto, el ácido al medio de cultivo. El inductor y el inhibidor se puede añadir al c era simultánea o el inductor se añade al cultivo antes de añadir un idores de Pmt o antes de que uno o más inhibidores de Pmt se a o antes de añadir el inductor. Se produce la proteína inducida q silación O-enlazada reducida y se puede recuperar del medio de s proteínas que no tienen una secuencia señal, de la célula ho isis. En el segundo aspecto, en donde el ácido nucleico que co ína está operativamente unido a un promotor constitutivo, el un idores de la glicosilación O-enlazada mediada por Pmt se añade ultivo, al mismo tiempo que el cultivo se establece y la proteína, uce tiene glicosilación O-enlazada reducida, se puede recuperar edio de cultivo o de las proteínas que no tienen una secuencia r de la célula hospedera por lisis.

Los químicos o composiciones que inhiben la actividad de las proteínas Pmt útiles para producir proteínas con glicosil cida en las cepas Pichia pastoris que tiene los genes PMT fun tos. El Cuadro 1 y las Figuras 1A-1 C del Ejemplo 5 muestran o cualquiera de las cuatro inhibidores químicos Pmt anteri cionados añadido a una cultivo de Pichia pastoris recombina s PMT funcionales, intactos y que se transforma con un ácido codifica una proteína recombinante humana de anticuerpos a ativamente unida a un promotor inducible en el momento de expr oteína recombinante, produciendo una proteína recombinante q ivel de glicosilación O-enlazada reducida que fue mejorada en el nivel de glicosilación O-enlazada observada en las células d oris tratadas con inhibidor de Pmt Pmti-3 descrito en Orchar rgan & Med Chem Letters (2004) 14: 3975-3978) y las publicaci nte por los mismos autores incluyendo EP 1313471 B1 y Bobrowi itud de Patente de E.U.A. Publicada No. 2007061631. ína, y cuando se modifican adecuadamente son capaces de ínas que tienen patrones de glicosilación adecuados. Los euc iores incluyen levaduras, hongos, flagelados con collar, micro lados (por ejemplo, dinoflagelados), stramenofilos (por ejemplo, l oñes, protozoos), Rodofita (por ejemplo, algas rojas), plant plo, algas verdes, células vegetales, musgo) y otros protist uras y hongos incluyen, pero no se limitan a: Pichia sp. (por ia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclama branaefaciens, Pichia minuta (Ogataea minuta, Pichia lindneri) tiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum ri, Pichia stiptis, Pichia methanolica), Saccharomyces sp. (por haromyees cerevisiea), Hansenula polymorpha, Kluyveromyces plo, Kluyveromyces lactis), Candida albicans, Aspergillus plo, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oderma reesei, Chrysosporium lucknowense, Fusaríum sp. (por Diversas levaduras, tales como K. lactis, Pichia pastori anolica y Hansenula polymorpha actualmente se prefieren para ar, ya que son capaces de crecer a altas densidades celulares y des cantidades de proteínas recombinantes. Del mismo modo, los entosos, tales como Aspergillus n/ger, Fusarium sp, Neurospora se pueden utilizar para producir proteínas recombinantes a un strial.

Los eucariontes inferiores, en particular los hongos filar s levaduras, se pueden modificar genéticamente para que e ínas o glicoproteínas en las que el patrón de glicosilación es simi ano o está humanizado. Esto puede lograrse mediante la elimin as de glicosilación endógenas seleccionadas y/o el sumin as exogenas como se describe por Gerngross et al. en la Pa A. No. US7029872, y las Solicitudes de Patente de E.U.A. Pu 20040018590, 20050170452, 20050260729, 20040 zúcar nucleótido y/o una enzima nucleótido difosfatasa. El transp fosfatasa mejoran la eficacia de los pasos de glicosilación modifi orcionar los sustratos adecuados para las enzimas de glicosilació partimientos apropiados, reducir la inhibición competitiva del pro over la eliminación de nucleósido difosfatos. Véase, por gross et al. en la Solicitud de Patente de E.U.A. Public 0018590 y Hamilton, 2003, Science 301 : 1244-46 y la patentes d nórmente mencionada y las solicitudes de patente.

A modo de ejemplo, una célula hospedera (por uras u hongos) se puede seleccionar o diseñar para ser deplet ctividades de 1 ,6-manosil transferasa, que de otro modo añade añosa en el N-glicano de una glicoproteína, y para incluir ad nucleico para la expresión ectópica de una actividad ct-1 ,2 man permite la producción de glicoproteínas recombinantes que tie 0 por ciento de moles porcentuales de N-glicanos Man5GlcNAc2.

AcMan5GlcNAc2. Cuando se produce una glicoproteína en las ederás de conformidad con el método descrito en la presente in células hospederas producirán una glicoproteína que ominantemente una estructura N-glicano GlcNAcMan5GlcNA silación reducida en comparación con la glicoproteína produci a de otra manera. En incluso un aspecto adicional, la célula ho diseñada para incluir además un ácido nucleico para la e ica de la actividad de manosidasa II, que permite la produc proteínas que tienen predominantemente N-AcMan3GlcNAc2. Cuando se produce una glicoproteína en las ederás de conformidad con el método descrito en la presente in células hospederas producirán una glicoproteína que ominantemente una estructura de N-glicano GlcNAcMan3GlcN silación reducida en comparación con la glicoproteína produci a de otra manera. En incluso un aspecto adicional, la célula ho a de otra manera. Incluso en aspectos adicionales, las ederás anteriormente mencionadas se pueden modificar adicion producir un híbrido particular o un complejo de estructuras de N-canos semejante a humano, al incluir además uno o má riontes superiores involucrados en la N-glicosilación, en c binación, que codifican por ejemplo, las actividades de la sialiltran dades de la manosidasa clase II y III, la actividad de la ferasa II, III, IV, V, VI, IX, y la actividad de la transferasa g almente es preferible que las células incluyan además uno o má s nucleicos que codifican actividad de difosfatasa específica idad de difosfatasa específica de GDP, y actividad del transpor -GlcNAc.

Las plantas y los cultivos de células vegetales se puede la expresión de proteínas y glicoproteínas con glicosilación O-e eida como se enseña en la presente invención (Véase, por mas de expresión basados en baculovirus (Véase, por ejemplo, 990, Bio/Technology 8: 651-654).

Aunque actualmente no se utiliza porque no es tan ec cultivar como los eucariontes y procariontes inferiores, el cultiv ejido de mamífero también se puede utilizar para expresar y ínas y glicoproteínas con glicosilación O-enlazada reducida c ña en la presente invención (véase Winnacker, From Genes to Publishers, NY , 1987). Las células hospederas adecuadas s de células CHO, diversas líneas de células COS, célula riblemente líneas de células de mieloma o similares, o c formadas o hibridomas. Los vectores de expresión para estas en incluir secuencias de control de expresión, tal como un o cación, un promotor, un potenciador (Queen et al., 1986. Irnmun 9-68), y los sitios de procesamiento de información necesari o los sitios de unión al ribosoma, los sitios de procesamiento alt en variar dependiendo del tipo de célula hospedera. Por eje miento con fosfato de calcio, la fusión del protoplasto, la repr ral, lipofección, biolística, transducción basada en virus, o electro ueden utilizar para los hospederos celulares. La transgénesis bal cula de tungsteno se prefiere para las células y tejidos vegetales, eneral, Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manu g Harbor Press, 1982)).

Una vez expresadas, las proteínas o glicoproteínas qu silación O-enlazada reducida se pueden purificar de conformidad edimientos estándares de la técnica, incluyendo precipitación co monio, columnas de afinidad, cromatografía en columna, electrof y los similares (Véase, en general, Scopes, R., Protein Pu nger-Verlag, N.Y., 1982)). Se prefieren las glicoproteínas sustanci s con al menos aproximadamente 90 a 95% de homogeneidad, y ridos para usos farmacéuticos los que tienen de 98 a 99% o no y tienen glicosilación O-enlazada reducida en comparación posiciones de la glicoproteína que se han producido en las ederás que no han sido incubadas en la presencia de un inhibid silación O-enlazada mediada por Pmt o una a-1 ,2-manosidasa C rtar más de un residuo de mañosa de una estructura de glican os. En aspectos particulares, la composición de glicoproteína cor glicoproteína que tiene una estructura predominante de N cionada del grupo que consiste de las glicoformas Mans 3GlcNAc2, GlcNAcMan5GlcNAc2, GlcNAcMan3 Ac2Man3GlcNAc2, GalGlcNAcMan5GlcNAc2, Gal(GlcNAc)2Man5 GIcNAc)2Man5GlcNAc2, NANAGalGlcNAcMan3 A2Gal2GlcNAcMan3GlcNAc2 y GalGlcNAcMan3GlcNAc2.

Composiciones farmacéuticas Las proteínas y las glicoproteínas que tienen glicosila ulos comúnmente utilizados para formular composiciones farma administración animal o humana. El diluyente se selecciona de no afecte la actividad biológica de la combinación. Los ejemplos d entes son agua destilada, solución salina fisiológica con pH regul to, soluciones de Ringer, solución de dextrosa y solución d ás, la composición farmacéutica o formulación también puede vehículos, adyuvantes, o estabilizantes no tóxicos, no terapéut nogénico, y los similares.

Las composiciones farmacéuticas para administración p estériles, sustancialmente isotónicas, libres de pirógenos y prepar rmidad con GMP de la FDA o un cuerpo similar. Las glicoprot en administrar como dosis inyectables de una solución o suspe stancia en un disolvente fisiológicamente aceptable con un acéutico que puede ser un líquido estéril, tales como los aceites ión salina, glicerol o etanol. Además, las sustancias auxiliar nte que se puede formular de tal manera que permite una li nida del ingrediente activo. Típicamente, las composiciones se inyectables, ya sea como soluciones líquidas o suspensiones; uede preparar formas sólidas adecuadas para solución en, o sus ehículos líquidos antes de la inyección. La preparación también s lsionar o encapsular en liposomas o micro partículas tale ctida, poliglicolida, o copolímero para el efecto adyuvante m se mencionó anteriormente (Véase Langer, Science 249, 1527 s, Advanced Drug Delivery Reviews 28, 97-119 (1997).

El término "o una sal del mismo" se refiere a las sales pre rtir de bases aceptables incluyendo bases inorgánicas u orgáni derivadas de bases inorgánicas incluyen aluminio, amonio, calci o, ferroso, litio, magnesio, sales mangánicas, manganosas, , zinc, y las similares. Las sales en la forma sólida pueden existir na estructura cristalina, y también puede estar en la forma de razina, piperidina, resinas de poliamina, procaína, purinas, teo lamina, trimetilamina, tripropilamina, trometamina, y las similares.

Los compuestos de la presente invención pueden conten centros asimétricos y por lo tanto pueden presentarse como race clas racémicas, enantiómeros individuales, mezclas diastereom ereómeros individuales. La presente invención pretende co s esas formas isoméricas de estos compuestos.

A menos que se defina de otra manera en la presente in érminos científicos y técnicos y las frases utilizadas en relació ente invención deberán tener los significados que se e únmente por aquellos expertos en la técnica. Además, a menos iera de otra manera por el contexto, los términos singulares debe lural y los términos plurales deben incluir el singular. En gen enclaturas utilizadas en relación con, y las técnicas de bio ología, biología molecular y celular, microbiología, genética y quí s, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), Ausubel et al, Current Pro cular Biology, Greene Publishing Associates (1992, y suplement ); Harlow y Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Sprin ratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990), Taylor y Dri duction to Glycobiology, Oxford Univ. Press (2003), Worthington ual, Worthington Biochemical Corp., Freehold, NJ; Hand hemistry: Section A Proteins, Vol I, CRC Press (1976), Hand hemistry: Section A Proteins, Vol II, CRC Press (1976), Esse obiology, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999).

Los siguientes ejemplos proporcionan métodos aración de varios inhibidores Pmt de la invención.

EJEMPLO 1 Paso A 1-1 1-2 A una solución de 1-1 (5.90 g, 25 mmoles) en THF (200 ió NaH (2.0 g, 50 mmoles) en porciones. La mezcla resultante s durante media hora. Luego se añadió NBS (4.86 g, 27.5 mmol durante 15 minutos. El sólido de color blanco se filtró y el fil entró para dar un residuo, que se disolvió en CHCI3 y se se 04. El disolvente se evaporó para dar 1-2 (5 g, rendimiento del 6 ilizó para el paso siguiente sin purificación adicional.

Paso B peratura ambiente durante la noche. La mezcla resultante se rep ua y EtOA. Las capas orgánicas combinadas se lavaron con sal caron sobre sulfato de sodio y se concentraron. El residuo diante TLC preparativa para dar 1-4 (800 mg, rendimiento del R (400 MHz, CDCI3) d 9.66 (s, 1 H), 7.74-7.71 (m, 2H), 7.49-7.4 7-7.33 (m, 5H), 7.20 (d, J = 2.02 Hz, 1H), 6.97-6.92 (m, 3H), 4.2 ), 3.16 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 1.11 (m, 6H). 1-5 1-6 A una solución de 1-5 (300 mg, 0.54 mmoles) toxilpropano (1 mL) se le añadió una cantidad catalítica de Ts mg) y luego la mezcla resultante se agitó durante una hora a tem iente. La mezcla se purificó directamente mediante TLC-prepara 1-6 (100 mg, rendimiento del 28%). 1H-NMR (400 MHz, MeOD (d, J = 8.05 Hz, 2H), 7.40-7.15 (m, 5H), 6.90-6.85 (m, 2H), 6.80~ 4.25 (s, 2H), 4.23 (m, 6H), 3.0 (m, 2H), 1.48 (t, 6H).

Paso E residuo se purificó mediante TLC-preparativa para dar 1-7 dimiento del 60%). 1H-NMR (400 MHz, MeOD) d 9.5 ppm (s, 1 H), .2 Hz, 1 H), 7.48 (d, J = 2.8 Hz, 2H), 7.30 (m, 3H), 7.25 (m, 6H), Hz, 2H), 6.89 (m, J=8.6 Hz, 2H), 6.76 (d, J=8 Hz, 1 H), 4.23 ( , 2H), 1.48 (t, 6H). 1-7 1-8 A una solución de 1-7 (80 mg, 0.17 mmoles) en THF se \ 6 N y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente as. El disolvente se eliminó in vacuo para producir el producto si 1-8 (60 mg, rendimiento del 82%), que se sometió al siguient A una solución de 1-8 (60 mg, 0.146 mmoles) en DMF (6 ió NaH (24 mg, 1 mmol) a 0°C y la mezcla resultante se agitó a l eratura por aproximadamente 30 minutos y luego se añad ml_). La mezcla se agitó a la misma temperatura por otra hora. L ividió entonces entre H2O y EtOAc. Las capas orgánicas combin on con salmuera, se secaron sobre sulfato de sodio, y se conc esiduo se purificó mediante TLC-preparativa para dar 1-9 ( imiento del 63.0%). 1H-NMR (400 MHz, MeOD) d 9.6 ppm (s, 1 H), 08 Hz, 2H), 7.43 (m, 1 H), 7.36-7.30 (m, 5H), 7.16 (d, J=2.02 Hz, = 8.6 Hz, 2H), 6.89 (mt J=8.6 Hz, 2H), 4.23 (t, J=6.56 Hz, 2H), 3. H), 3.30 (s, 6H), 3.13 (dd, J1 = 6.26 Hz, J2 = 6.26 Hz, 2H).

Paso H nicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron sobre N oncentraron. El residuo se purificó mediante HPLC-preparativa pa MPLO 1 (30 mg, rendimiento del 50%) como un sólido de color MR (400 MHz, MeOD) d ppm 7.46-7.53 (m, 3H), 7.31-7.40 -7.18 (m, 1 H), 6.92-7.06 (m, 4H), 4.71 (s, 2H), 4.25-4.30 ( -3.94 (m, 4H), 3.26-3.29 (m, 6H), 3.10-3.13 (dd, J = 6.26 HZ, H). MS m/z 612 (M+1)+.

Paso A A una solución del compuesto 2-1 (150 mg, 0.58 mm valente), compuesto 2-2 (214 mg, 0.87 mmoles, 1.5 equivalentes) ml_) se le añadió CS2CO3 (161 mg, 0.49 mmoles, 0.85 equivale c\a se agitó entonces a temperatura ambiente durante la noche y l ntó a 80°C durante 1.5 horas. La mezcla resultante se particionó H20 y EtOAc. Las capas orgánicas combinadas se lavaron con s Paso B EJEMPLO 2 Una mezcla del compuesto 2-3 (122 mg, 0.29 mmo valente), 2-4 (57 mg, 0.30 mmoles, 1.05 equivalentes) y NH4OAc ( mmoles, 10.0 equivalentes) en tolueno (15 mL) se calentó bajo at itrógeno a reflujo por aproximadamente 3 horas. La mezcla resul con 10% de HCI ácido a pH = 4-5, y luego se particionó entr c. Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmue ron sobre Na2S04, se concentraron y purificaron mediant Paso A 3-1 3-2 A una solución de 3-1 (1 g, 6.37 mmoles) en THF seco (2 adió BuLi (3 ml_, 7.68 mmoles) gota a gota a -70°C y luego la m durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de enfriar uevo, se añadió gota a gota una solución de ciclohexancarbaldehí 43 mmoles) en THF seco (5 mi). Después de agitar durante 30 ñadió NH4CI acuoso saturado en la mezcla y la mezcla resui jo con EtOAc. Las capas orgánicas se combinaron y se secar 04, se concentraron para dar 3-2 (1.52 g, 14.3%) como un a icar. itante se agitó durante 2 horas a temperatura ambiente. La m entró bajo presión reducida y lueo se diluyó con EtOAc. La capa vó con NaHCC acuoso saturado, salmuera, se secó sobre N o se concentró para dar 3-3 (500 mg, sin purificar).

Paso C A una solución de 3-3 (450 mg, sin purificar) y 3-4 (375 les) en DMF (10 mL) se le añadió Cs2C03 (399 mg, 1.22 mmoles ión y luego la mezcla se calentó a 110°C durante 18 horas. La m Paso D EJEMPLO 3 A una mezcla de 3-5 (130 mg, 0.3 mmoles) y 3-6 (60 r les) en tolueno (15 mL) se le añadió NH4OAc (180 mg, 2.34 mm porción y luego la mezcla se calentó a reflujo durante 3.5 inuación, la mezcla se enfrió a temperatura ambiente y se añ so al 10% a pH = 5. La mezcla se extrajo con EtOAc. La nicas se combinaron y se secaron sobre Na2S04> se concentra aceite de color amarillo. El residuo se purificó mediante TLC-pr EJEMPLO 4 ió subsecuentemente, gota a gota a 50°C durante 30 min inuación, la mezcla de reacción se calentó a 70°C y se agitó d e. La mezcla resultante se particionó entre H2O y EtOAc. nica se lavó con salmuera, se secó sobre sulfato sódico y se c dar 4-2 (1.0 g, sin purificar), que se utiliza directamente para el .

Paso B A una solución de 4-2 (1.0 g, sin purificar), 4-3 (400 3.68-3.74 (m, 1 ?), 3.24-3.34 (m, 2H), 3.12-3.18 (m, 2H), 1.82- 0.84-0.88 (m, 6H).

Paso C La preparación del EJEMPLO 4 es el mismo que aquel MPLO 3. 1H-NMR (400 MHz, MeOD) S 7.49 (s, 1H), 7.24-7.40 -7.05 (m, 4H), 6.90-6.91 (m, 1H), 5.37-5.40 (m, 1H), 4.75 (s, 2 (m, 2H), 3.83-3.88 (m, 1H), 3.69-3.72 (m, 1 H), 3.33-3.35 (m, 2 descritos en la presente invención produciendo una glicoprote O-glicosilación reducida.

El vector de expresión/integración del plásmido p iene cassettes de expresión bajo el control del promotor AOX1 d oris inducible por metanol que codifican las cadenas pesada (He) de anti-Her2. He y Le marcadas con anti-Her2 se fusionaro mo N-terminal del péptido pre-señal a-MAT (SEQ ID Nos: 1 y tizaron mediante GeneArt AG. Cada uno se sintetizó con los sitio oR1 y 3' Fse1. Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos HER2 se muestran en la SEQ ID Nos: 3 y 4, respectivame encias de nucleótidos y de aminoácidos de la Le anti-HER2 se a SEQ ID Nos: 5 y 6, respectivamente. Ambos fragmentos d ico que codifican las proteínas He y Le se fusionan al pre-pépti T se subclonaron por separado utilizando los sitios únicos 5' Ec en un vector de expresión plasmídico pGLY2198, que contiene La cepa de expresión anti-Her2 yGLY4280 se constru iente manera: cinco microgramos de pGLY2988 digerido con la en icción Spe1 que corta en la región direccionadora de TRP2 se i transformar la cepa yGLY22-1. La cepa y 1A::lacZbmt2A::lacZ/KIMNN2-2/mnn4L1A::lacZ/MmSLC35A3 Amnn4A::lacZAmet16A::lacZ), se construyó utilizando los ritos anteriormente (Nett y Gerngross, Yeast 20: 1279 (2003), C S USA 100: 5022 (2003), Hamilton et al, Science 301 : 1244 (2003 La transformación de yGLY22-1 se llevó a cabo esenci o sigue: YGLY22-1 se cultivó en 50 mi de medio YPD (extr ura (1 %), peptona (2%), dextrosa (2%)) durante la noche a un aproximadamente 0.2 a 6. Después de la incubación en hielo du tos, las células se sedimentaron mediante centrifugación a 25 durante 5 minutos. El medio se removió y las células se lava s con sorbitol 1 M estéril enfriado con hielo antes de la resuspe l medio selectivo. Después de la selección en el medio con zeo formantes fueron seleccionadas mediante el análisis de la exp eña escala para detectar la expresión de anti-Her2. La cepa y leccionó basándose en el alto nivel de expresión anti-Her2.

La expresión de la proteína anti-Her2 para la cepa yGLY a cabo en matraces de agitación a 24°C con medio con pH regu plejo de glicerol (BMGY) que consiste de 1 % de extracto de leva eptona, 100 mM de regulador de pH con fosfato potásico pH 6. ase nitrogenada de levadura, 4 x biotina al 10-5%, y 1 % de gli \o de inducción para la expresión de proteína fue medio con pH complejo de metanol (BMMY) que consistía de 1 % de metanol licerol en el BMGY. Los inhibidores de Pmt en metanol al 1 ieron al medio de crecimiento hasta una concentración final de 0. \ momento en que se añadió el medio de inducción. Esta es u media que es adecuada para reducir la O-glicosila atografía de proteína A (Li et al. Nat. Biotechnol. 24 (2): 210-5 ( -glicanos liberados de y separados de las proteínas por elir lina (beta-eliminación) (Harvey, Mass Spectrometry Reviews 18: 9)). Este proceso también reduce al extremo reducido recién ado del O-glicano liberado (ya sea oligomanosa o mañosa) al m O manitol sirve así como un indicador único de cada uno d nos. 0.5 nmoles o más de proteínas, contenidos dentro de un vol µ? del regulador de pH con PBS, se requiere para la beta elimina stra se trató con 25 µ?_ del reactivo de borohidruro alcalino y se i durante 16 horas. Se añadieron aproximadamente 20 uL del no de arabitol, seguido de 10 pL de ácido acético glacial. La mu rifugó entonces a través de un filtro Millipore que contení ABEADS como resina AG 50W-X8 y se lavó con agua. Las m yendo el lavado, se transfirieron a viales automuestra de plásti oraron hasta sequedad en un evaporador centrífugo. Se añadi Los resultados se resumen en el Cuadro 1 , que muestra o inhibidores Pmt novedosos, los Ejemplos 1 a 4, reduce silación hasta niveles más bajos que los observados con el inhi Pmti-3 como se describe en Orchard et al. (Bioorgan & Med Che ) 14: 3975-3978) y las publicaciones de patentes de los mismos yendo EP 1313471 B1 y Bobrowicz et al., Solicitud de Patente d icada No. 2007061631. Pmti-3 tiene la siguiente estructura químic CUADRO 1 Inhibidor (0.15 ug/mL) Ocupación de O-glican (moles de O-manosa/moles d Ab silación de la cadena pesada anti-Her2 (He). La cepa YGLY uló en placas de 96 pozos profundos (Qiagen, Valencia, enían 0.5 mi de medio BMGY por pozo. Después de 24 h miento con agitación vigorosa, la placa de 96 pozos se centrifugó durante cinco minutos para precipitar las células. El medio se ués de un paso de lavado con 0.5 mi de medio B MY, las c spendieron en 0.2 mL de medio BMMY en el que los inhibidores iluyeron dos veces a través de las filas (1 1 pozos). El pozo #1 co IL de inhibidor, el pozo #2 contenía 2.5 ug/mL y así sucesivamen zo #10 que contenía 0.009 ug/mL; el pozo #1 1 no contenía el i ués de un crecimiento adicional por 24 horas con agitación vig a se centrifugó a 2,000 rpm durante cinco minutos para preci las, y el sobrenadante aclarado se sometió a análisis de Western etar la expresión de anti-Her2. El Western blot se realizó de la era: siete µ?_ de los sobrenadantes se separaron mediante elect de dichos análisis en el que el inhibidor novedoso de Pmt a p plo 4 (EJ. 4, figura 1A) se ensayó contra Pmti-3 de Orchard et a y también un compuesto inactivo como un control (figura 1 C). stra en las figuras 1A y 1 B, el Ejemplo 4 y Pmti-3 efectivamente r -glicosilación de anti-Her2 He a concentraciones tan bajas com L En contraste, el compuesto control inactivo (figura 1C) no eción en la O-glicosilación de He. Se obtuvieron resultados simil idores mostrados en los Ejemplos 1 , 2 y 3. En conjunto, estos re an que los inhibidores novedosos de Pmt mostrados en los Ejem n inhibidores eficaces de la O-glicosilación fungal.

Aunque la presente invención se describe en la ción con referencia a las modalidades ilustradas, debe entenders ción no se limita a éstas. Aquellos que tienen habilidad ordina ica y el acceso a las enseñanzas en la presente invención reco ificaciones adicionales y modalidades dentro del alcance de las

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES uesto seleccionado del siguiente grupo: orcionar un ácido nucleico que codifica una proteína, y (b) intr o nucleico en la célula. 4. - El método de conformidad con la reivindica cterizado además porque el cultivo se crece durante un tiempo S proporcionar una multiplicidad de las células que tienen el ácido s de poner en contacto el cultivo con cualquiera de los uno puestos que inhiben la glicosilación O-enlazada mediada por Pmt. 5. - El método de conformidad con la reivindica cterizado además porque el cultivo se crece en la presencia de CU os unos o más compuestos que inhiben la glicosilación O-iada por Pmt. 6. - El método de conformidad con la reivindica cterizado además porque el ácido nucleico está operativamente romotor inducible. 7. - El método de conformidad con la reivindica 8. - El método de conformidad con la reivindica cterizado además porque el cultivo se pone en contacto con un romotor para inducir la expresión de la proteína por un tiempo r en contacto el cultivo con los uno o más compuestos que in silación O-enlazada mediada por Pmt y aislar la proteína produci a en la presencia de los uno o más compuestos que in silación O-enlazada mediada por Pmt y el inductor para pro ína que tiene glicosilación O-enlazada reducida. 9. - El método de conformidad con la reivindica cterizado además porque la célula es una célula fungal. 10. - El método de conformidad con la reivindica cterizado además porque la célula es una célula de levadura. 11. - El método de conformidad con la reivindica cterizado además porque la célula se selecciona del grupo que . lactis, Pichia pastoris, Pichia methanoiiea y Hansenula. producir glicoproteínas en las que el patrón de N-glicosilación e humano o está humanizado. 15.- El método de conformidad con la reivindica cterizado además porque la proteína se produce con un rendimie os 100 mg/litro de medio de cultivo.