KR20160030127A - O-만노실트랜스퍼라제 결핍 사상균 세포 및 이의 이용 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명의 개시사항은 사상균 세포, 예컨대 트리코데르마 세포에서 감소된 O-만노실화를 가지는 이종 단백질의 생산에 유용한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 보다 특이적으로는, 본 발명은 a) 첫 번째 돌연변이를 가지지 않는 부모 사상균 세포와 비교하여 내인성 프로테아제 활성을 감소시키는 최소 하나의 첫 번째 돌연변이, 및 b) 두 번째 돌연변이를 가지지 않는 부모 사상균 세포와 비교하여 내인성 O-만노실트랜스퍼라제 활성을 감소시키는 PMT 유전자 내의 최소 하나의 두 번째 돌연변이를 포함하는 PMT-결핍 사상균 세포를 제공하며, 상기 사상균 세포는 트리코데르마, 뉴로스포라, 미셀리오프토라 및 크리소스포리움 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
Description
본 발명의 개시사항은 사상균 세포(filamentous fungal cell)에서 이종 단백질의 생산에 유용한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
진핵세포 단백질, 특히 면역글로불린 같은 치료용 단백질의 번역후 변형은 적절한 단백질 폴딩 및 기능을 위해 종종 필요하다. 표준 원핵세포 발현 시스템은 그러한 변형을 위해 필요한 적합한 기구(machinery)가 부재하기 때문에, 택일적인 발현 시스템이 이들 치료용 단백질의 생산에 이용되어야만 한다. 진핵세포 단백질이 번역후 변형을 가지지 않는 경우에도, 원핵세포 발현 시스템은 적절한 폴딩에 요구되는 필수적인 샤페론 단백질이 종종 없다. 효모 및 곰팡이는 간단한 배지에서 큰 규모에서 쉽게 배양할 수 있어 낮은 생산 비용을 허용하기 때문에 단백질을 발현시키기 위한 매력적인 선택이며, 효모 및 곰팡이는 포유동물 세포에서 발견되는 유사한 기능을 실행하는 번역후 기구 및 샤페론을 가진다. 더욱이, 효모 및 곰팡이 세포의 상대적으로 간단한 유전적 구성을 조작하는 데 유용한 수단 뿐 아니라 포유동물 또는 곤충 세포 같은 보다 복잡한 진핵세포의 유전적 구성을 조작하는 데 유용한 수단이 있다 (De Pourcq 등, Appl Microbiol Biotechnol, 87(5):1617-31).
하지만, 효모 및 곰팡이에서 일어나는 번역후 변형은 재조합 치료용 단백질의 생산에 있어서 여전히 걱정일 수 있다. 특히, O-만노실화(mannosylation)는 곰팡이에서 인간 적용을 위한 바이오의약품(biopharmaceuticals)의 생산에서 극복해야 할 가장 큰 장애물들 중 하나이다. 보다 구체적으로는, 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 및 사카로미세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 같은 효모는 이종적으로 발현된 바이오의약품을 과다-만노실화시켜 인간에 적용되었을 때 부작용을 유발하는 경향이 있다.
세린 및 트레오닌 잔기에 대한 O-만노실화는 포유동물 GalNAc 기반된 올리고사카라이드 또는 O-결합된 만노오스 글리칸을 포함하는 GlcNAc/N-아세틸락토사민을 포함한다. 곰팡이에서 O-만노실화는 헥소오스 모노머 또는 올리고머로서 일어난다. 효모에는, 전형적으로 종종 복합체로서 기능하는 여러 단백질(/폴리펩타이드) O-만노실트랜스퍼라제들이 있다. 넉-아웃(knock-outs)의 일부가 적어도 세포 구조 및 안정성에 대해 해롭고 모든 효모 넉-아웃 또는 조합이 견뎌지는 것은 아니다 (검토를 위해, Goto 2007, Biosci . Biotechnol . Biochem . 71 (6), 1415-1427을 참조하라).
O-만노실화 레벨을 감소시키고자 하는, 효모 O-만노실트랜스퍼라제 유전자들의 넉-아웃들 및 심지어 S. 세레비지에에서 2개 또는 3개의 pmt 유전자를 포함하는 복수의 넉-아웃 돌연변이들에 대한 보고들이 있었다(WO/1994/004687). S. 세리비지에의 pmt1 또는 pmt2 넉-아웃은 항동결 당단백질 III의 O-만노실화 레벨을 약 30%까지 감소시켰으며 상기 잔기의 만노실화된 단백질은 단백질 당 수많은 만노오스 잔기들을 포함하고, 분명히 올리고사카라이드도 포함한다 (WO/2004/057007).
WO/2010/034708은 재조합 히드로포빈 트리코데르마 단백질이 S. 세레비지에 숙주세포의 pmt1 넉-아웃에서 발현되는 경우 상기 단백질의 O-만노실화의 유의한 레벨을 보이지 않는다고 보고한다. 그러한 O-만노실화는 상기 원래의 비-만노실화된 사상균 단백질의 인위적인 효모 글리코실화인 것처럼 보인다.
WO/2010/128143은 효모 S. 세레비지에 pmt1 및/또는 pmt4 넉-아웃 스트레인들에서 단일 사슬 항체-알부민 융합 컨스트럭트를 추가적으로 보고한다.
아스페르길루스 종(아스페르길루스 니둘란스, 아스페르길루스 퓨미가투스, 및/또는 아스페르길루스 아와모리)의 pmt1 , pmt2, 및 pmt3 단일 유전자 넉-아웃, 이중 유전자 넉-아웃, 및 삼중 유전자 넉-아웃들은 Goto 등, 2009 (Eukaryotic cell 2009, 8(10):1465); Mouyna 등, 2010 (Molecular Microbiology 2010, 76(5), 1205-1221); Zhou 등, 2007 (Eukaryotic cell 2007, 6(12):2260); Oka 등, 2004 (Microbiology 2004, 150, 1973-1982); Kriangkripipat 등, 2009; Fang 등, 2010 (Glycobiology, 2010, vol. 20 pp 542-552); 및 Oka 등, 2005 (Microbiology 2005, 151 , 3657-3667)에 기재되어 있다.
사상균에서 pmt 상동체들의 넉 아웃에 대한 수많은 보고들에도 불구하고, 감소된 O-만노실화를 가지고 재조합 당단백질의 생산을 위한 숙주세포로서 유용한 사상균 세포의 기재는 없다.
특히, Gorka-Niec 등 (2008, Acta Biochimica Polonica, Vol. 55 No 2/2008, 251-259)은 트리코데르마 리세이(Trichoderma reesei) 내의 pmt1 유전자의 결실을 보고하였다. PMT1 단백질은 S. 세레비지에의 Pmt4p와 가장 높은 동일성 (51%)을 보였지만 pmt2Δ S. 세레비지에 돌연변이를 기능적으로 보충한다 (Gorka-Niec 등, 2007, Biochimica et Biophysica Acta 1770, 2007, 774-780). 하지만, 본 저자들은 pmt1 유전자의 파괴는 단백질 분비의 감소를 야기하지만 분비된 단백질의 O- 및 N-글리코실화를 변화시키지 않는다는 것을 보고하였다.
Zakrzewska 등 (Curr Genet 2003 43: 11-16)은 트리코데르마 리세이 pmt1 유전자가 pmt4Δ S. 세레비지에 돌연변이를 기능적으로 보충하지 않는다는 것을 추가적으로 보고하였다.
실제로, 효모 또는 사상균에서 PMT 유전자의 결실은 어떠한 표현형을 나타내지 않거나 또는 세포에 대해 치명적이거나 또는 심각하게 손상된 생존 기능 중 어느 하나를 초래하는 것처럼 보이고, 이는 이종 단백질, 특히 포유동물 당단백질의 재조합 생산에 적합하지 않을 것이다. 이러한 이유로, pmt 억제제의 이용 같은 택일적인 방법들이 pmt 넉 아웃 스트레인들에 대한 선택사항으로서 제안되어졌었다 (WO2009/143041).
따라서, O-만노실화가 없거나 또는 감소된 이종 단백질, 예컨대 면역글로불린을 안정적으로, 좋게는 높은 레벨의 발현으로 생산할 수 있는 트레코데르마 곰팡이 세포 같은 개선된 사상균 세포에 대한 요구가 있다.
요약
본 발명은 사상균 발현 시스템에서 O-만노실화가 없거나 또는 감소된 단백질을 생산하기 위해 개선된 방법에 관한 것이고, 보다 구체적으로는 사상균 발현 시스템에서 생산되는 경우 O-만노실화될 수 있는 항체 또는 관련된 면역글로불린 같은 당단백질 또는 융합 단백질을 생산하기 위한 개선된 방법에 관한 것이다.
본 발명은 트리코데르마 세포 같은 사상균 세포가 생존율 및 생산된 당단백질의 수율에 해로운 영향 없이 O-만노실화 활성을 감소 또는 억제하도록 유전적으로 변형될 수 있다는 놀라운 발견에 일부 기반한다.
따라서, 첫 번째 양태에서, 본 발명은
a) 첫 번째 돌연변이를 가지지 않는 부모 사상균 세포와 비교하여 내인성 프로테아제 활성을 감소 또는 제거시키는 첫 번째 돌연변이, 및
b) 두 번째 돌연변이를 가지지 않는 부모 사상균 세포와 비교하여 내인성 O-만노실트랜스퍼라제 활성을 감소시키는 PMT 유전자 내의 두 번째 돌연변이
를 포함하는 PMT-결핍 사상균 세포에 관한 것으로서,
상기 사상균 세포는 트리코데르마, 뉴로스포라(Neurospora), 미셀리오프토라(Myceliophthora) 및 크리소스포리움(Chrysosporium) 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
하나의 구현예에서, 상기 PMT-결핍 세포는 세린 및/또는 트레오닌 잔기를 포함하는 이종 단백질을 추가적으로 발현한다. 세린 및/또는 트레오닌 잔기를 가지는 상기 발현된 이종 단백질은 상기 PMT 유전자 내 상기 돌연변이로 인해 감소된 O-만노실화를 가진다. 예를 들어, 상기 두 번째 PMT-결핍 돌연변이를 가지지 않는 부모(parental) 사상균 세포에서 발현되는 경우 상기 이종 단백질의 O-만노실화 레벨과 비교하여 본 발명의 PMT-결핍 세포에서 발현되는 이종 단백질의 O-만노실화 레벨은 최소 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 최소 90% 더 낮다.
다른 구현예에서, 내인성 O-만노실트랜스퍼라제 활성을 감소시키는 상기 두 번째 돌연변이는 내인성 단백질 O-만노실트랜스퍼라제 활성을 인코딩하는 PMT 유전자의 결실 또는 파괴이다.
다른 구현예에서, 상기 PMT 유전자 내의 두 번째 PMT-결핍 돌연변이는:
a) 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 PMT1 유전자,
b) PMT1 유전자의 기능성 상동 유전자로서, 상기 기능성 유전자가 상기 PMT1 유전자에서 파괴를 가지는 T. 리세이 스트레인 내로 도입되는 경우 기능 상보성(functional complementation)에 의해 부모 O-만노실화 레벨을 회복시킬 수 있는 것인 PMT1 유전자의 기능성 상동 유전자, 또는,
c) 서열번호 2와 최소 50%, 최소 60%, 최소 70%, 최소 90%, 또는 최소 95% 동일성을 가지는 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 폴리펩타이드는 O-만노실트랜스퍼라제 활성을 가지는 것인 폴리뉴클레오타이드
중 어느 하나에 존재하는 돌연변이 (예컨대, 결실 또는 파괴)일 수 있다.
선행하는 구현예들과 조합될 수 있는 다른 구현예에서, 상기 PMT-결핍 세포는 ALG3 유전자의 발현 레벨을 감소 또는 제거시키는 그러한 세 번째 돌연변이를 가지지 않는 부모 세포 내 발현 레벨과 비교하여 ALG3 유전자의 발현 레벨을 감소 또는 제거시키는 세 번째 돌연변이를 가진다. 특이적 구현예에서, 상기 PMT-결핍 세포는 N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 I 촉매 도메인을 인코딩하는 첫 번째 폴리뉴클레오타이드 및 N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 II 촉매 도메인을 인코딩하는 두 번째 폴리뉴클레오타이드를 추가적으로 포함한다.
선행하는 구현예들과 조합될 수 있는 다른 구현예에서, 상기 PMT-결핍 세포는:
a) α1,2 만노시다제,
b) N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 I 촉매 도메인,
c) α 만노시다제 II, 및
d) N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 II 촉매 도메인
으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩타이드를 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 추가적으로 포함한다.
선행하는 구현예들과 조합될 수 있는 다른 구현예에서, 상기 PMT-결핍 세포는 β1,4 갈랄토실트랜스퍼라제 및/또는 푸코실트랜스퍼라제를 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 추가적으로 포함한다.
하나의 특이적인 구현예에서, 상기 PMT-결핍 세포는 트리코데르마 pmt1의 단백질 O-만노실트랜스퍼라제 활성을 감소 또는 제거시키는 최소 하나의 돌연변이를 포함하는 트리코데르마 세포이고, 선택적으로 pmt2 및 pmt3로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질 O-만노실트랜스퍼라제 활성을 감소 또는 제거시키는 최소 하나 이상의 다른 PMT 유전자들 내 돌연변이를 추가적으로 포함하는 트리코데르마 세포이다.
선행하는 구현예들과 조합될 수 있는 하나의 구현예에서, 상기 PMT-결핍 세포는 최소 2개, 또는 최소 3개의 내인성 프로테아제의 활성을 감소 또는 제거시키는 돌연변이를 포함한다. 전형적으로, 상기 세포는 트리코데르마 세포일 수 있으며
a) 3개의 내인성 프로테아제 pepl, tspl 및 slpl,
b) 3개의 내인성 프로테아제 gapl, slpl 및 pepl,
c) pepl, pep2, pep3, pep4, pep5, pep8, pep11, pep12, tspl, slpl, slp2, slp3, slp7, gapl 및 gap2로 이루어진 군으로부터 선택된 3개의 내인성 프로테아제,
d) pepl, pep2, pep3, pep4, pep5, tspl, slpl, slp2, slp3, gapl 및 gap2로 이루어진 군으로부터 선택된 3개 내지 6개의 프로테아제, 또는,
e) pepl, pep2, pep3, pep4, pep5, pep7, pep8, tspl, slpl, slp2, slp3, slp5, slp6, slp7, slp8, tppl, gapl 및 gap2로 이루어진 군으로부터 선택된 7개 내지 10개의 프로테아제
의 활성을 감소 또는 제거시키는 돌연변이를 포함할 수 있다.
선행하는 구현예들과 조합될 수 있는 하나의 구현예에서, 본 발명의 사상균 세포는 샤페론 단백질을 인코딩하는 내인성 유전자의 결실 또는 파괴를 포함하지 않는다. 특히, 본 발명의 상기 사상균 세포는 기능성 내인성 샤페론 단백질, 단백질 디술피드 이소머라제 (PDI)를 발현한다.
다른 양태에서, 본 발명은 감소된 O-만노실화를 가지는 단백질을 생산하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은:
a) 내인성 O-만노실트랜스퍼라제 활성을 감소시키는 그러한 돌연변이를 가지지 않는 부모 스트레인과 비교하여 내인성 O-만노실트랜스퍼라제 활성을 감소시키는 PMT 유전자 내의 돌연변이를 가지는 PMT-결핍 사상균 세포를 제공하는 단계이고, 상기 단계는 추가적으로 세린 또는 트레오닌 잔기를 가지는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것인 단계,
b) 상기 PMT-결핍 사상균 세포를 배양하여 감소된 O-만노실화를 가지는 상기 단백질을 생산하는 단계
를 포함하며,
상기 사상균 세포는 트리코데르마, 뉴로스포라, 미셀리오프토라 및 크리소스포리움 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
상기 방법의 하나의 특이적인 구현예에서 따르면, PMT 유전자 내의 상기 돌연변이는:
a) 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 PMT1 유전자,
b) PMT1 유전자의 기능성 상동 유전자로서, 상기 유전자가 상기 PMT1 유전자에서 파괴를 가지는 T. 리세이 스트레인 내로 도입되는 경우 기능 상보성에 의해 부모 O-만노실화 레벨을 회복시킬 수 있는 것인 PMT1 유전자의 기능성 상동 유전자, 또는
c) 서열번호 2와 최소 50%, 최소 60%, 최소 70%, 최소 90%, 또는 최소 95% 동일성을 가지는 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 폴리펩타이드는 O-만노실트랜스퍼라제 활성을 가지는 것인 폴리뉴클레오타이드
중 어느 하나에 존재하는 결실 또는 파괴 같은 돌연변이이다.
상기 방법의 다른 구현예에서, 상기 PMT-결핍 세포는 트리코데르마 리세이 세포이며 상기 돌연변이는 T. 리세이 PMT1 유전자의 결실 또는 파괴이다.
상기 방법의 다른 구현예들에서, 상기 PMT-결핍 세포는 상기 기재된 대로의 본 발명의 PMT-결핍 세포이다.
특이적 구현예에서, 단백질을 인코딩하는 상기 폴리뉴클레오타이드는 이종 단백질을 인코딩하는 재조합 폴리뉴클레오타이드이다. 전형적으로, 상기 이종 단백질은
a) IgG 같은 면역글로불린,
b) 면역글로불린의 경쇄 또는 중쇄,
c) 항체의 중쇄 또는 경쇄,
d) 단일 사슬 항체,
e) 카멜리드(camelid) 항체,
f) 모노머 또는 멀티머 단일 도메인 항체,
g) FAb-단편, FAb2-단편, 및,
h) 이들의 항체-결합 단편들
로 이루어진 군으로부터 선택되는 포유동물 단백질일 수 있다.
선행하는 구현예들과 조합될 수 있는 상기 방법의 하나의 구현예에서, 상기 단백질을 인코딩하는 상기 폴리뉴클레오타이드는 운반 단백질로서 CBH1 촉매 도메인 및 링커를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 cbh1 프로모터를 추가적으로 포함한다.
다른 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는, PMT 기능성 부모 스트레인에서 O-만노실화될 수 있는 세린 또는 트레오닌을 가지는 단백질을 인코딩하고, 최소 하나의 N-글리칸을 추가적으로 포함한다.
또한 본 발명은 감소된 O-만노실화를 가지는 항체를 생산하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은:
a) PMT-결핍 사상균 세포를 제공하는 단계로서, 상기 세포는
i. 내인성 단백질 O-만노실트랜스퍼라제 활성을 감소시키는 그러한 돌연변이를 가지지 않는 부모 스트레인과 비교하여 내인성 단백질 O-만노실트랜스퍼라제 활성을 감소시키는 돌연변이 및
ii. 경쇄 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 중쇄 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드
를 가지는 것인 단계,
b) 상기 세포를 배양하여 감소된 O-만노실화를 가지는 중쇄 및 경쇄로 이루어진 상기 항체를 생산하는 단계
를 포함하며,
상기 사상균 세포는 트리코데르마, 뉴로스포라, 미셀리오프토라 및 크리소스포리움 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
항체를 생산하기 위한 특이적인 방법에서, 상기 PMT-결핍 세포는 트리코데르마 리세이 세포이고 상기 돌연변이는 T. 리세이 PMT1 유전자의 결실 또는 파괴이다.
항체를 생산하기 위한 하나의 구현예에서, 상기 생산된 항체의 최소 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 100%가 O-만노실화되지 않는다.
또한 본 발명은 상기 논의된 대로 본 발명의 방법에 의해 얻어질 수 있거나 또는 얻어지는 단백질 조성물 또는 항체 조성물에 관한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 방법에 의해 얻어지거나 또는 얻어질 수 있는 최소 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 100%의 항체는 O-만노실화되지 않는다.
하나의 특이적인 구현예에서, 감소된 O-만노실화를 가지는 그러한 단백질 (예컨대, 당단백질) 또는 항체 조성물은, 주요 글리코형(glycoform)으로서:
· Manα3[Manα6(Manα3)Manα6]Manβ4GlcNAβ4GlcNAc (Man5 글리코형);
· Manα6(Manα3)Manβ4GlcNAβ4GlcNAc (Man3 글리코형);
· 하이브리드 또는 복합체 타입 N-글리칸, 예컨대 GlcNAcMan3, GO, 하이브리드 글리칸 GlcNAcMan5, 그리고 GalGlcNAcMan3, G1, G2; 및 GalGlcNAcMan5 글리코형 같은 갈락토실화된 유도체들로 이루어진 서브군으로부터 선택된 글리코형
중 어느 하나를 포함한다.
하나의 특이적인 구현예에서, 글리칸의 코어가 Man3로 구성되는 경우 상기 조성물은 본질적으로 Man5 글리코형을 가지지 않는다.
하나 이상의 선행하는 구현예들과 조합될 수 있는 하나의 구현예에서, 상기 단백질 조성물의 N-글리칸 및/또는 O-글리칸 중 0.1% 미만, 0.01%, 0.001% 또는 0%가 Neu5Gc 및/또는 Galα-구조를 포함한다. 선행하는 구현예들과 조합될 수 있는 구현예에서, 상기 항체 조성물의 N-글리칸 및/또는 O-글리칸 중 0.1% 미만, 0.01%, 0.001% 또는 0%가 Neu5Gc 및/또는 Galα-구조를 포함한다.
하나 이상의 선행하는 구현예들과 조합될 수 있는 하나의 구현예에서, 상기 당단백질 조성물의 N-글리칸 및/또는 O-글리칸 중 0.1% 미만, 0.01%, 0.001%, 또는 0%가 코어 푸코오스 구조를 포함한다. 선행하는 구현예들과 조합될 수 있는 구현예에서, 상기 항체 조성물의 N-글리칸 및/또는 O-글리칸 중 0.1% 미만, 0.01%, 0.001%, 또는 0%가 코어 푸코오스 구조를 포함한다.
하나 이상의 선행하는 구현예들과 조합될 수 있는 하나의 구현예에서, 상기 당단백질 조성물의 N-글리칸 및/또는 O-글리칸 중 0.1% 미만, 0.01%, 0.001%, 또는 0%가 말단 갈락토오스 에피토프 Galβ3/4GlcNAc를 포함한다. 선행하는 구현예들과 조합될 수 있는 구현예에서, 상기 항체 조성물의 N-글리칸 및/또는 O-글리칸 중 0.1% 미만, 0.01%, 0.001%, 또는 0%가 말단 갈락토오스 에피토프 Galβ3/4GlcNAc를 포함한다.
하나 이상의 선행하는 구현예들과 조합될 수 있는 하나의 구현예에서, 상기 당단백질 조성물의 1.0% 미만, 0.5%, 0.1%, 0.01%, 0.001%, 또는 0%가 당화(glycation) 구조를 포함한다. 선행하는 구현예들과 조합될 수 있는 구현예에서, 상기 당단백질 조성물의 1.0% 미만, 0.5%, 0.1%, 0.01%, 0.001%, 또는 0%가 당화 구조를 포함한다.
하나 이상의 선행하는 구현예들과 조합될 수 있는 다른 구현예에서, 항체 같은 당단백질 조성물은 Neu5Gc, 말단 Galα3Galβ4GlcNAc, 말단 Galβ4GlcNAc, 말단 Galβ3GlcNAc, 코어 결합된 푸코오스 및 당화 구조의 군으로부터 선택되는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 구조가 없다.
또한 본 발명은 사상균 세포, 예를 들어 트리코데르마 세포, 전형적으로 트리코데르마 리세이에서 생산된 재조합 당단백질 조성물의 O-만노실화 레벨을 감소시키는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 PMT 유전자 내 돌연변이를 가지는 사상균 세포를 이용하는 단계로 이루어지며 상기 PMT 유전자는:
i. 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 PMT1 유전자,
ii. PMT1 유전자의 기능성 상동 유전자로서, 상기 유전자가 상기 PMT1 유전자에서 파괴를 가지는 T. 리세이 스트레인 내로 도입되는 경우 기능 상보성에 의해 부모 O-만노실화 레벨을 회복시킬 수 있는 것인 PMT1 유전자의 기능성 상동 유전자, 또는;
c) 서열번호 2와 최소 50%, 최소 60%, 최소 70%, 최소 90%, 또는 최소 95% 동일성을 가지는 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 폴리펩타이드는 O-만노실트랜스퍼라제 활성을 가지는 것인 폴리뉴클레오타이드
중 어느 하나이다.
정의
본 명세서에서 사용되는 대로, "발현 시스템" 또는 "숙주세포"는 목적 폴리펩타이드 또는 단백질, 전형적으로는 포유동물 단백질의 전사, 번역 및 적절한 폴딩이 가능할 수 있게 유전적으로 변형된 세포를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 대로, 상기 용어 "폴리뉴클레오타이드" 또는 "올리고뉴클레오타이드" 또는 "핵산"은 전형적으로 포스포디에스테르 결합에 의해 함께 연결된 최소 2개의 뉴클레오타이드들의 폴리머를 의미하고 숙주 세포의 유전적 변형을 위해 숙주 세포 내로 도입될 수 있는 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시뉴클레오타이드 또는 이들의 유도체 중 어느 것으로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드는 단백질의 코딩 서열을 인코딩하고/하거나 인핸서 또는 프로모터 서열 또는 종결인자 같은 단백질의 코딩 서열의 제어 또는 조절 서열을 포함한다. 폴리뉴클레오타이드는 예를 들어 유전자의 본래의 코딩 서열 또는 이의 단편, 또는 특정 숙주세포 내 최적 유전자 발현을 위해 (예컨대 코돈 편향을 고려하여) 최적화되었던 변이체 서열을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 대로, 상기 용어 폴리뉴클레오타이드와 관련하여 "최적화된(optimized)"은 폴리뉴클레오타이드가 생산 세포 또는 생물, 예를 들어 트리코데르마 세포 같은 사상균 세포에서 선호되는 코돈을 이용하는 아미노산 서열을 인코딩하도록 변형되었다는 것을 의미한다. 숙주세포 내로 트랜스펙션되는 이종 뉴클레오타이드 서열들은 전형적으로 원래의 (최적화되지 않은) 뉴클레오타이드 서열에 의해 본래 인코딩되는 아미노산을 완전히 또는 가능한 한 많이 보유하도록 최적화된다. 본 명세서에서 상기 최적화된 서열은 상응하는 생산 세포 또는 생물, 예를 들어 사상균 세포에서 선호되는 코돈들을 가지도록 조작되었다.
최적화된 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열은 또한 최적화된 것으로서 언급될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 대로, "펩타이드" 또는 "폴리펩타이드"는 중합화된 연속적인 아미노산 잔기들 다수를 포함하는 아미노산 서열이다. 상기 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 변형된 아미노산 잔기들, 코돈에 의해 인코딩되지 않는 천연의 아미노산 잔기 및 비-천연의 아미노산 잔기들을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 대로, "단백질"은 하나의 펩타이드 또는 폴리펩타이드 또는 공유 결합 또는 비-공유 결합에 의해 함께 어셈블리된 하나 이상의 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 조합을 의미할 수 있다. 특화되지 않는다면, 상기 용어 "단백질"은 번역-후 변형을 가지는 하나 이상의 아미노산 서열들, 및 특히 O-만노실화 또는 N-글리칸 변형을 가지는 하나 이상의 아미노산 서열들을 포괄할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 대로, 상기 용어 "당단백질"은 단백질의 최소 하나의 아스파라긴 잔기에 부착된 최소 하나의 N-연결된 글리칸, 또는 O-만노실화를 초래하는 최소 하나의 세린 또는 트레오닌에 부착된 최소 하나의 만노오스를 포함하는 단백질을 의미한다.
상기 용어 "O-만노실화(mannosylation)" 또는 "O-만노실트랜스퍼라제 활성"은 (전형적으로는 세린 또는 트레오닌으로부터 유래된) 하나의 산소를 통해 하나의 특이적 아미노산에 최소 하나의 만노오스의 공유적 결합을 의미하도록 본 명세서에서 사용된다. O-만노실트랜스퍼라제 단백질은 전형적으로 만노오스를 세린 또는 트레오닌 잔기의 히드록실 같은 히드록실기에 부가한다.
특히, O-만노실트랜스퍼라제 활성은 효소를 인코딩하는 곰팡이 PMT 유전자의 O-만노실트랜스퍼라제 활성의 특이성을 의미할 수 있고, 보다 구체적으로는 T. 리세이 PMT1의 동일한 특이성을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 대로, "글리칸(glycan)"은 아미노산, 펩타이드, 폴리펩타이드, 지질 또는 환원성 말단 컨쥬게이트 같은 운반체에 결합될 수 있는 올리고사카라이드 사슬을 의미한다. 어떤 구현예들에서, 본 발명은 아스파라긴 잔기 (Asn)의 측-쇄 아미드 질소에 N-결합(N-linkage)에 의해 -Asn-Xaa-Ser/Thr- 같은 폴리펩타이드 N-글리코실화 위치에 컨쥬게이션되는 N-결합된 글리칸 ("N-glycan")에 관한 것이고, 상기 Xaa는 Pro을 제외한 어떠한 아미노산 잔기이다. 본 발명은 추가적으로 진핵세포의 소포체 내 N-결합된 글리칸의 전구체인 돌리콜-포스포-올리고사카라이드 (Dol-P-P-OS) 전구체 지질 구조체들의 일부인 글리칸에 관한 것일 수 있다. 상기 전구체 올리고사카라이드는 이들의 환원성 말단으로부터 상기 돌리콜 지질 상의 2개의 포스페이트 잔기와 결합된다. 예를 들어, α3-만노실트랜스퍼라제 Alg3은 N-글리칸의 Dol-P-P-올리고사카라이드 전구체를 변형시킨다. 일반적으로, 본 명세서에 기재된 상기 글리칸 구조체는 비-환원성 잔기들이 다른 모노사카아리드 잔기 또는 잔기들로 변형되지 않은 말단 글리칸 구조체이다.
본 발명의 개시사항 전반에 걸쳐서 사용되는 대로, 당지질 및 카보하이드레이트 명명법은 본질적으로 생화학 명명법에 대한 IUPAC-IUB 위원회에 의한 추천에 따른다 (예를 들어, Carbohydrate Res. 1998, 312, 167; Carbohydrate Res. 1997, 297, 1 ; Eur. J. Biochem. 1998, 257, 29). Gal (갈락토오스), Glc (글루코오스), GlcNAc (N-아세틸글루코사민), GalNAc (N-아세틸갈락토사민), Man (만노오스), 및 Neu5Ac가 D-형상(configuration)이고, Fuc는 L-형상이며, 모든 모노사카라이드 단위는 피라노오스 형태 (D-Galp, D-Glcp, D-GlcpNAc, D-GalpNAc, D-Manp, L-Fucp, D-Neup5Ac)인 것으로 가정된다. 아민기는 GalNAc 또는 GlcNAc의 2-위치 상의 천연 갈락토오스 및 글루코사민에 대해 정의된 대로이다. 글리코시드 결합은 부분적으로 더 짧게 명명되고 부분적으로 더 길게 명명되는 것으로 보여지며, 시알산 SA/Neu5X-잔기 α3와 α6의 결합은 각각 α2-3 및 α2-6와 같고, 헥소오스 모노사카라이드에 대해 잔기 α1-3, α1-6, β1-2, β1-3, β1-4, 및 β1-6는 각각 α3, α6, β2, β3, β4, 및 β6으로 단축될 수 있다. 락토사민은 타입 II N-아세틸락토사민, Galβ4GlcNAc, 및/또는 타입 I N-아세틸락토사민을 의미한다. Galβ3GlcNAc 및 시알산 (SA)는 N-아세틸뉴라민산 (Neu5Ac), N-글리콜릴뉴라민산 (Neu5Gc), 또는 Neu5X의 유도체를 포함하는 어떠한 다른 천연 시알산을 의미한다. 시알산은 NeuNX 또는 Neu5X로서 언급되며, 상기 X는 Ac 또는 Gc이다. 때때로 Neu5Ac/Gc/X는 NeuNAc/NeuNGc/NeuNX로서 언급될 수 있다.
전형적으로 포유동물 당단백질에서 발견되는 N-글리칸을 구성하는 당(sugars)은, N-아세틸글루코사민 (이후 본 명세서에서 "GlcNAc"로 단축됨), 만노오스 (이후 본 명세서에서 "Man"으로 단축됨), 글루코오스 (이후 본 명세서에서 "Glc"로 단축됨), 갈락토오스 (이후 본 명세서에서 "Gal"로 단축됨), 및 시알산 (이후 본 명세서에서 "Neu5Ac"로 단축됨)을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. N-글리칸은 "코어(core)" 구조 Man3GlcNAc2 (Man3로 언급되는 Manα6(Manα3)Manβ4GlcNAβ4GlcNAc)로 언급되는 일반적인 펜타사카라이드를 공유한다. 몇몇 구현예들에서, Man3 글리칸 또는 이의 유도체 Μanα6(GlcNAcβ2Μanα3)Μanβ4GlcNAβ4GlcNAc는 주요 글리코형이다. 푸코오스가 상기 코어 구조에 부착, 좋게는 환원성 말단 GlcNAc에 α6-결합되는 경우, N-글리칸 또는 이의 코어는 Man3GlcNAc2(Fuc)로서 표시될 수 있다. 하나의 구현예에서, 주요 N-글리칸은 Manα3[Manα6(Manα3)Manα6]Manβ4GlcNAβ4GlcNAc (Man5)이다.
선호되는 하이브리드 타입 N-글리칸은 GlcNAcβ2Manα3[Manα6(Manα3)Manα6]Manβ4GlcNAβ4GlcNAc ("GlcNAcMan5"), 또는 이의 b4-갈락토실화된 유도체 Galβ4GlcNAcMan3, G1 , G2, 또는 GalGlcNAcMan5 글리코형을 포함한다.
"복합체 N-글리칸(complex N-glycan)"은 상기 코어 구조체의 말단성 1,3 만노오스 암(arm) 상에 최소 하나의 GlcNAc 잔기, 선택적으로 GlcNAcβ2-잔기에 의한 최소 하나의 GlcNAc 잔기 및 상기 코어 구조체의 말단성 1,6 만노오스 암 상에 최소 하나의 GlcNAc 잔기, 선택적으로 GlcNAcβ2-잔기에 의한 최소 하나의 GlcNAc 잔기를 가지는 N-글리칸을 의미한다.
그러한 복합체 N-글리칸은, GlcNAc2Man3GlcNAc2 (GO 글리코형으로도 언급됨), Gal1GlcNAc2Man3GlcNAc2 (G1 글리코형으로도 언급됨), 및 Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 (G2 글리코형으로도 언급됨), 그리고 각각 GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc), Gal1GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc), 및 Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)인 이들의 푸코실화된 글리코형 FG0, FG1 및 FG2을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
"내인성 효소의 증가된 활성" 또는 "내인성 효소의 감소된 활성": 상기 사상균 세포는 다양한 내인성 효소들의 활성의 증가된 또는 감소된 레벨을 가질 수 있다. 활성의 감소된 레벨은 억제제, 항체, 또는 이와 유사한 것으로 상기 내인성 효소의 활성을 억제시킴으로써 제공될 수 있다. 어떤 구현예들에서, 상기 사상균 세포는 다양한 내인성 효소들의 활성을 증가 또는 감소시키는 방식에따라 유전적으로 변형된다. "유전적으로 변형된(genetically modified)"은 증가된 레벨, 저감된 레벨, 또는 돌연변이된 형태로 폴리펩타이드를 발현하는 원핵 또는 진핵세포를 창출하는 데 이용되는 어떠한 재조합 DNA 또는 RNA 방법을 의미한다. 다시 말해서, 상기 숙주세포는 재조합 폴리뉴클레오타이드 분자로 트랜스펙션되거나, 형질전환되거나, 또는 트랜스덕션되었고, 이에 따라 상기 세포에 소망된 단백질의 발현을 변화시키는 것을 야기하도록 변형되었다.
유전자 발현, 유전자의 기능, 또는 상기 유전자 산물 (즉, 상기 유전자에 의해 인코딩된 단백질)의 기능에서 감소 또는 결핍을 초래하는 "유전적 변형(genetic modifications)"은 유전자 발현의 불활성화 (완전 또는 부분적), 넉-아웃(knock-out), 결실, 파괴, 방해, 차단(blockage), 사일런싱, 또는 하향-조절, 또는 약화(attenuation)로서 언급될 수 있다. 예를 들어, 유전자에 의해 인코딩되는 단백질 기능의 감소를 초래하는 유전자 내 유전적 변형은 상기 유전자의 완전한 결실 (즉, 상기 유전자가 존재하지 않아 단백질이 존재하지 않음), 상기 단백질의 불완전한 번역 (파괴) 또는 번역 없음 (예컨대, 단백질이 발현되지 않음)을 초래하는 유전자 내 돌연변이, 또는 상기 단백질의 천연 기능을 감소 또는 폐지시키는 유전자 내 돌연변이 (예컨대, 감소되거나 또는 전혀 효소적 활성 또는 활동을 가지지 않는 단백질이 발현됨)일 수 있다. 보다 구체적으로는, 본 명세서에서 논의되는 단백질의 활동을 감소시키는 것에 대한 언급은 일반적으로 문제의 숙주세포에서 어떠한 유전적 변형을 의미하는데, 이는 단백질의 감소된 발현 및/또는 기능성 (생물학적 활성)을 초래하며 단백질의 감소된 활성 (예컨대, 감소된 촉매 작용), 단백질의 증가된 억제 또는 분해 뿐 아니라 단백질 발현의 감소 또는 제거를 포함한다. 예를 들어, 단백질의 활동 또는 활성은 상기 단백질의 생산을 차단 또는 감소시키거나, 단백질 활동을 감소시키거나, 또는 단백질 활동을 억제하는 것에 의해 감소될 수 있다. 이들 변형들 중 일부의 조합도 가능하다. 단백질의 생산을 차단 또는 감소시키는 것은 성장 배지에서 유도성 화합물의 존재를 필요로 하는 프로모터의 제어 하에서 단백질을 인코딩하는 유전자를 위치시키는 것을 포함할 수 있다. 상기 유도인자(inducer)가 상기 배지로부터 결핍되는 그러한 조건을 확립하기 위해, 단백질을 인코딩하는 유전자의 발현 (및 이에 따른 단백질 합성)이 중단될 수 있다. 단백질 활동을 차단 또는 감소시키는 것은 미국 특허 제4,743,546호에 기재된 것과 유사한 제거(excision) 기술 접근방법을 이용하는 것을 포함할 수도 있다. 이러한 접근방법을 이용하기 위해, 목적 단백질을 인코딩하는 유전자는 게놈으로부터 상기 유전자의 특이적, 조절된 제거를 허용하는 특이적 유전 서열 사이에 클로닝한다. 제거는, 예를 들어 미국 특허 제4,743,546호처럼 배양물의 배양 온도의 이동(shift) 또는 몇몇 다른 물리적 또는 영양적 시그널에 의해 촉발시킬 수 있다.
일반적으로, 본 발명에 따르면, 주어진 특성의 돌연변이 또는 변형된 단백질 (예컨대, 효소 활성)에서의 증가 또는 감소는 동일한 생물로부터 (동일한 소스 또는 부모 서열로부터) 유래된 동일한 특성의 부모 단백질(즉, 정상, 변형되지 않은)과 관련되어 사용되는데, 상기 증가 또는 감소는 동일한 또는 동등한 조건 하에서 측정 또는 확립된다. 유사하게, 유전적으로 변형된 숙주세포의 특성 (예컨대, 단백질의 발현 및/또는 생물학적 활성, 또는 단백질의 생산)에서의 증가 또는 감소는 동일한 또는 동등한 조건 하에서 동일한 종의 야생-형 숙주세포 및 좋게는 동일한 스트레인의 동일한 특성과 관련하여 사용된다. 그러한 조건은 단백질의 활성 (예컨대, 발현 또는 생물학적 활성) 또는 숙주세포의 다른 특징이 측정되는 어세이 또는 배양 조건 (예컨대, 배지 구성성분, 온도, pH, 등)을 포함할 뿐 아니라, 이용될 어세이 타입, 평가될 숙주세포, 등도 포함한다. 상기 논의된 대로, 동등한 조건은 유사하지만, 반드시 동일할 필요는 없고 (예컨대, 조건에서의 일부 보존적 변화는 용인될 수 있음), 동일한 조건 하에서 실시된 비교예와 비교하여 세포 성장 또는 효소 발현 또는 생물학적 활성 상의 효과를 구체적으로 변화시키지 않는 조건 (예컨대, 배양 조건)을 포함한다.
좋게는, 주어진 단백질 (예컨대, O-만노실트랜스퍼라제 또는 프로테아제)의 활성을 증가 또는 축소 (감소)시키는 유전적 변형을 가지는 유전적으로 변형된 숙주세포는 (그러한 유전적 변형을 가지 않는) 부모 숙주세포 내 상기 단백질의 활성과 비교하여 상기 단백질의 활성 또는 활동 (예를 들어, 발현, 생산 및/또는 생물학적 활성)에서 각각 최소 약 5%, 및 보다 좋게는 최소 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55 60%, 65%, 70%, 75 80%, 85 90%, 95%, 또는 5%와 100% 사이의 전체 정수 내의 어떠한 백분율 (예컨대, 6%, 7%, 8%, 등)의 증가 또는 감소를 가진다.
본 발명의 다른 양태에서, 주어진 단백질 (예컨대, O-만노실트랜스퍼라제 또는 프로테아제)의 활성을 증가 또는 축소 (감소)시키는 유전적 변형을 가지는 유전적으로 변형된 숙주세포는 부모 숙주세포 내 야생-형 단백질의 활성과 비교하여 상기 단백질의 활성 또는 활동 (예를 들어, 발현, 생산 및/또는 생물학적 활성)에서 각각 최소 약 2-배, 및 보다 좋게는 최소 약 5-배, 10-배, 20-배, 30-배, 40-배, 50-배, 75-배, 100-배, 125-배, 150-배, 또는 최소 약 2-배로부터 시작하는 어떠한 전체 정수 증가배 (예컨대, 3-배, 4-배, 5-배, 6-배, 등)의 증가 또는 감소를 가진다.
본 명세서에서 사용되는 대로, 2개 이상의 핵산 또는 아미노산 서열의 맥락에서 상기 용어 "동일한(identical)" 또는 퍼센트 "동일성(identity)"은 같은 2개 이상의 서열 또는 서브서열을 의미한다. 비교 윈도우 또는 다음의 서열 비교 알고리즘 중 하나를 이용하거나 또는 수동 정렬 및 시각 검사에 의해 측정되는 지정된 부위 상에 최대 관련성(correspondence)으로 비교 및 정렬되는 경우, 2개의 서열들이 명시된 백분율의 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드를 가진다면 (즉, 특화된 부위에서 29% 동일성, 선택적으로 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일성, 또는 명시되지 않은 경우, 전체 서열에서 29% 동일성, 선택적으로 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일성), 상기 2개의 서열은 "실질적으로 동일한(substantially identical)"을 의미한다. 선택적으로, 상기 동일성은 최소 약 50개의 뉴클레오타이드 길이 (또는 10개의 아미노산 길이), 또는 보다 좋게는 100 내지 500개 또는 1000개 또는 이상의 뉴클레오타이드 길이 (또는 20개, 50개, 200개, 또는 이상의 아미노산 길이)인 부위에 걸쳐서 존재한다.
서열 비교를 위해, 전형적으로 하나의 서열이 레퍼런스(reference) 서열로서 기능하고, 이에 대해 테스트 서열들이 비교된다. 서열 비교 알고리즘을 이용하는 경우, 테스트 서열 및 레퍼런스 서열을 컴퓨터 내로 입력하고, 필요하다면 서브서열 좌표(coordinates)를 지정하며, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터가 지정된다. 디폴트 프로그램 파라미터가 이용될 수 있거나, 또는 택일적인 파라미터가 지정될 수 있다. 이후 서열 비교 알고리즘은 프로그램 파라미터에 기반하여 레퍼런스 서열에 대해 상대적인 테스트 서열에 대한 퍼센트 서열 동일성을 계산한다. 동일성에 대해 2개의 서열을 비교하는 경우, 서열이 인접할 필요는 없지만, 어떠한 갭은 전체 퍼센트 동일성을 감소시키는 패널티를 동반할 것이다. blastn의 경우, 상기 디폴트 파라미터는 갭 개방(Gap opening) 패널티 = 5 및 갭 연장(Gap extension) 패널티 = 2이다. blastp의 경우, 상기 디폴트 파라미터는 갭 개방 패널티 = 11 및 갭 연장 패널티 = 1이다.
본 명세서에서 사용되는 대로, "비교 윈도우(comparison window)"는 2개의 서열이 최적으로 정렬된 후 동일한 수의 인접한 위치의 레퍼런스 서열과 20개부터 600개까지, 일상적으로 약 50개 내지 약 200개, 보다 일상적으로 약 100개 내지 약 150개의 비교를 포함하지만, 이에 한정되지 않는 인접한 위치의 수 중 어느 하나의 절편에 대한 레퍼런스를 포함한다. 비교를 위한 서열들의 정렬 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 비교를 위한 서열들의 최적 정렬은, 예를 들어 Smith 및 Waterman (1981)의 국소 상동성 알고리즘, Needleman 및 Wunsch (1970) J Mol Biol 48(3):443-453의 상동성 정렬 알고리즘, Pearson 및 Lipman (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85(8):2444-2448의 유사성 방법에 대한 조사, 이들 알고리즘의 컴퓨터화된 실행 (GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl), 또는 수동 정렬 및 시각 검사 [예컨대, Brent 등, (2003) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (Ringbou Ed)을 참조하라]에 의해 실시할 수 있다.
퍼센트 서열 동일성 및 서열 유사성을 결정하는 데 적합한 알고리즘의 두 개의 예는 각각 Altschul 등 (1997) Nucleic Acids Res 25(17):3389-3402 및 Altschul 등 (1990) J. Mol Biol 215(3)-403-410에 기재되어 있는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이다. BLAST 분석을 실시하기 위한 소프트웨어는 국립생물공학정보센터(National Center for Biotechnology Information)를 통해 공개적으로 이용가능하다. BLASTN 프로그램 (뉴클레오타이드 서열용)은 11의 단어길이(wordlength) (W), 기대값(Expectation) (E) 또는 10, M=5, N=-4 및 양 가닥의 비교를 디폴트로서 이용한다. 아미노산 서열의 경우, BLASTP 프로그램은 3의 단어길이, 및 10의 기대값 (E), 및 50의 BLOSUM62 스코어링 매트릭스 [Henikoff and Henikoff, (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89(22):10915-10919를 참고하라] 정렬 (B), 10의 예상 (E), M=5, N=-4, 및 양 가닥의 비교를 디폴트로서 이용한다.
BLAST 알고리즘은 2개의 서열 간의 유사성의 통계적 분석도 실행한다 (예컨대 Karlin and Altschul, (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90(12):5873-5877을 참고하라). BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 하나의 척도는 가장 작은 합산 확률 (P(N))로, 이는 2개의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열들 간의 매치가 우연히 일어날 확률의 지표를 제공한다. 테스트 핵산 대 레퍼런스 핵산의 비교에서 가장 작은 합산 확률이 약 0.2 미만, 보다 좋게는 약 0.01 미만, 및 가장 좋게는 0.001 미만인 경우 핵산 서열은 레퍼런스 서열과 유사한 것으로 간주된다.
본 명세서에서 사용되는 대로 "기능성 변이체(functional variant)" 또는 "기능성 상동 유전자(functional homologous gene)"는 레퍼런스 서열과 서열 유사성, 전형적으로는 상기 레퍼런스 코딩 서열 또는 단백질과 최소 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 동일성을 가지고 상기 레퍼런스 코딩 서열 또는 단백질과 실질적으로 동일한 기능을 보유하는 코딩 서열 또는 단백질을 의미한다. 기능성 변이체는 동일한 기능을 보유할 수 있지만 감소된 활성 또는 증가된 활성을 보유할 수 있다. 기능성 변이체는 천연 변이체들, 예를 들어 다른 종으로부터 유래된 상동체 또는 상기 코딩 서열 내 돌연변이의 도입에 따라 얻어지는 인위적 변이체를 포함한다. 기능성 변이체는 보존적으로 변형된 돌연변이들만을 가진 변이체일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 대로 "보존적으로 변형된 돌연변이(conservatively modified mutations)"는 인코딩된 아미노산 서열로의 개별적 치환, 결실 또는 부가를 포함하는 데 이는 화학적으로 유사한 아미노산을 이용한 아미노산의 치환을 초래한다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 당업계에서 잘 알려져 있다. 그러한 보존적으로 변형된 변이체는 이에 더하여 다형성 변이체, 종간 상동체, 및 본 개시사항의 대립형질을 배제하지 않는다. 다음의 8개 그룹은 서로에 대해 보존적 치환인 아미노산을 포함한다: 1) 알라닌 (A), 글리신 (G); 2) 아스파르트산 (D), 글루탐산 (E); 3) 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q); 4) 아르기닌 (R), 리신 (K); 5) 이소루이신 (I), 루이신 (L), 메티오닌 (M), 발린 (V); 6) 페닐알라닌 (F), 타이로신 (Y), 트립토판 (W); 7) 세린 (S), 트레오닌 (T); 및 8) 시스테인 (C), 메티오닌 (M) (예를 들어, Creighton, Proteins (1984)을 참고하라).
사상균
세포
본 명세서에서 사용되는 대로, "사상균 세포(filamentous fungal cells)"는 모든 균사 모양의 세분 유미코타(Eumycota) 및 오미코타(Oomycota)로부터 유래된 세포를 포함한다 (Hawksworth 등, In, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK에 의해 정의된 대로). 사상균 세포는 일반적으로 키틴, 셀룰로오스, 글루칸, 키토산, 만난, 및 다른 복잡한 폴리사카라이드로 이루어진 균사벽(mycelial wall)으로 특징화된다. 영양 성장은 균사 연장에 의해 이루어지고 탄소 이화작용은 절대적으로 호기성이다. 대조적으로, 사카로미세스 세레비지에 같은 효모에 의한 영양 성장은 단세포성 엽상체(unicellular thallus)의 버딩에 의해 이루어지고 탄소 이화작용은 발효성일 수 있다.
좋게는, 상기 사상균 세포는 필요한 핵산 서열의 트랜스덕션, 이후 단백질 (예컨대, 포유동물 단백질)의 발현, 또는 결과적인 중간산물에 의해 나쁘게 영향받지 않는다. 사상균 세포의 유전자를 파괴하고 상기 세포를 배양하는 일반적인 방법은, 예를 들어 페니실리움(Penicillium)의 경우 Kopke 등 (2010) Appl Environ Microbiol. 76(14):4664-74. doi: 10.1 128/AEM.00670-10, 아스페르길루스의 경우 Maruyama 및 Kitamoto (2011), Methods in Molecular Biology, vol. 765, DOM 0.1007/978-1-61779-197-0_27; 뉴로스포라의 경우, Collopy 등 (2010) Methods Mol Biol. 2010;638:33-40. doi: 10.1007/978-1-60761-611-5_3; 및 미셀리오프토라 또는 크리소스포리움의 경우 PCT/NL2010/000045 및 PCT/EP98/06496에 개시되어 있다.
적합한 사상균 세포의 예들은 아크레모니움(Acremonium), 아스페르길루스, 푸사리움(Fusarium), 후미콜라(Humicola), 무코르(Mucor), 미셀리오프토라, 뉴로스포라, 페니실리움, 스시탈리디움(Scytalidium), 티엘라비아(Thielavia), 톨리포클라디움, 또는 트리코데르마/히포크레아 스트레인으로부터 유래된 세포를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
어떤 구현예들에서, 상기 사상균 세포는 트리코데르마 종, 아크레모니움, 아스페르길루스, 아우레오바시디움, 크립토코커스, 크리소스포리움, 크리소스포리움 루크노웬스(Chrysosporium lucknowense), 필리바시디움, 푸사리움, 기베렐라, 마그나포르테, 무코르, 미셀리오프토라, 미로테시움, 네오칼리마스틱스, 뉴로스포라, 파에실로미세스, 페니실리움, 피로미세스, 쉬조필룸(Schizophyllum), 탈라로미세스, 테르모아스쿠스(Thermoascus), 티엘라비아, 또는 톨리포클라디움 스트레인으로부터 유래한다.
몇몇 구현예들에서, 상기 사상균 세포는 미셀리오프토라 또는 크리소스포리움, 뉴로스포라 또는 트리코데르마 스트레인이다.
본 개시사항의 아스페르길루스 곰팡이 세포는 아스페르길루스 아쿨레아투스, 아스페르길루스 아와모리, 아스페르길루스 클라바투스, 아스페르길루스 플라부스, 아스페르길루스 포에티두스, 아스페르길루스 퓨미가투스, 아스페르길루스 자포니쿠스, 아스페르길루스 니둘란스, 아스페르길루스 니게르, 아스페르길루스 오리제, 또는 아스페르길루스 테레우스를 포함할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 개시사항의 뉴로스포라 곰팡이 세포는 뉴로스포라 크라사를 포함할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 개시사항의 미셀리오프토라 곰팡이 세포는 미셀리오프토라 테르모필라를 포함할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
선호되는 구현예에서, 상기 사상균 세포는 트리코데르마 곰팡이 세포이다. 본 개시사항의 트리코데르마 곰팡이 세포는 야생형 트리코데르마 스트레인 또는 이의 돌연변이로부터 유래될 수 있다. 적합한 트리코데르마 곰팡이 세포의 예들은 트리코데르마 하지아눔(Trichoderma harzianum), 트리코데르마 코닌기, 트리코데르마 론기브라키아툼, 트리코데르마 리세이, 트리코데르마 아트로비리데, 트리코데르마 비렌스, 트리코데르마 비리데; 및 이의 택일적인 성 형태 (즉, 히포크레아)를 포함할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
보다 선호되는 구현예에서, 상기 사상균 세포는 트리코데르마 리세이이고, 예를 들어 ATCC 13631 (QM 6a), ATCC 24449 (QM 6a의 방사선 돌연변이 207), ATCC 26921 (QM 9414; ATCC 24449의 돌연변이), VTT-D-00775 (Selinheimo 등, FEBS J., 2006, 273: 4322-4335), Rut-C30 (ATCC 56765), RL-P37 (NRRL 15709) 또는 T. 하지아눔 분리체 T3 (Wolffhechel, H., 1989)으로부터 유래된 스트레인들이다.
본 명세서에 기재된 대로 본 발명은 PMT 결핍 사상균 세포에 관한 것으로, 예를 들어 상기 세포는 트리코데르마 리세이 곰팡이 세포 같은 트리코데르마, 뉴로스포라, 미셀리오프토라 및 크리소스포리움 세포로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 세포는:
a. 첫 번째 돌연변이(즉, 프로테아제-결핍 돌연변이)를 가지지 않는 부모 사상균 세포와 비교하여 내인성 프로테아제 활성을 감소 또는 제거시키는 최소 하나의 첫 번째 돌연변이, 및
b. 두 번째 돌연변이 (즉, PMT-결핍 돌연변이)를 가지지 않는 부모 사상균 세포와 비교하여 내인성 O-만노실트랜스퍼라제 활성을 감소 또는 제거시키는 PMT 유전자 내의 최소 하나의 두 번째 돌연변이
를 포함한다.
감소된
활성을 가지는 프로테아제
프로테아제 활성을 감소시키는 것이 이종 포유동물 단백질의 생산을 상당히 증가시킬 수 있다는 것이 알려졌다. 실제로, 이종 단백질을 발현하는 사상균 세포에서 발견되는 그러한 프로테아제는 발현된 재조합 단백질의 유의한 분해를 정상적으로 촉매한다. 따라서, 이종 단백질을 발현하는 사상균 세포 내의 프로테아제 활성을 감소시킴으로써, 상기 발현된 단백질의 안정성을 증가시켜, 상기 단백질의 증가된 레벨의 생산을 초래하고, 일부 상황에서 상기 생산된 단백질의 개선된 특질 (예컨대, 분해된 단백질 대신에 전장 단백질)을 야기한다.
프로테아제는 아스파르트 프로테아제, 트립신-유사 세린 프로테아제, 서브틸리신 프로테아제, 글루탐산 프로테아제, 및 세돌리신 프로테아제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 그러한 프로테아제는 사상균 세포로부터 동정 및 분리될 수 있으며 이들의 활성에서의 감소가 상기 사상균 세포로부터 재조합 폴리펩타이드의 생산에 영향을 미치는 지를 결정하기 위해 테스트될 수 있다. 프로테아제를 동정하고 분리하기 위한 방법들은 당업계에 잘 알려져 있고, 친화도 크로마토그래피, 자이모그램(zymogram) 어세이, 및 겔 전기영동을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 동정된 프로테아제는 이후 재조합 폴리펩타이드, 그러한 이종 또는 포유동물 폴리펩타이드를 발현하는 사상균 세포로부터 동정된 프로테아제를 인코딩하는 유전자를 결실시키고 상기 결실이 세포의 총 프로테아제 활성의 감소 및 상기 발현된 재조합 폴리펩타이드의 생산 레벨에서의 증가를 초래하는 지를 결정함으로써 테스트될 수 있다. 유전자를 결실시키거나, 총 프로테아제 활성을 측정하고, 생산된 단백질의 레벨을 측정하기 위한 방법들은 당업계에 잘 알려져 있으며 본 명세서에 기재된 방법들을 포함한다.
아스파르트
프로테아제(
Aspartic
Proteases
)
아스파르트 프로테아제는 폴리펩타이드 및 단백질 내 펩타이드 결합의 가수분해를 위해 아스파르트산 잔기를 이용하는 효소이다. 전형적으로, 산성 pH에 최적으로 활성을 가지는 아스파르트 프로테아제는 이의 활성 위치 내에 2개의 매우-보존된 아스파르트산 잔기들을 포함한다. 트리코데르마 곰팡이 같은 진핵생물로부터 유래된 아스파르트 프로테아제는 펩신, 카뎁신, 및 레닌을 포함한다. 그러한 아스파르트 프로테아제는 선조 유전자 중복(gene duplication)으로부터 일어난 것으로 생각되는 2-도메인 구조를 가진다. 그러한 중복 이벤트와 일맥상통하여, 2개의 도메인 간의 서열이 분기되기 시작하였을 지라도 각 도메인의 전체적인 폴드(fold)가 유사하다. 각 도메인은 촉매성 아스파르트산 잔기 중 하나에 기여한다. 상기 활성 위치는 아스파르트 프로테아제의 2개의 도메인에 의해 형성된 클레프트(cleft) 내에 위치한다. 진핵세포 아스파르트 프로테아제는 보존된 이황화 브릿지(disulfide bridges)를 추가적으로 포함하는데, 이는 아스파르트산 프로테아제인 폴리펩타이드의 동정에 도움을 줄 수 있다.
트리코데르마 곰팡이 세포에서 9개의 아스파르트 프로테아제가 동정되었다: pepl (tre74156); pep2 (tre53961 ); pep3 (tre121133); pep4 (tre77579), pep5 (tre81004), 및 pep7 (tre58669), pep8 (tre122076), pep11 (121306), 및 pep12 (tre119876).
적합한 아스파르트 프로테아제의 예들은 트리코데르마 리세이 pepl (서열번호 22), 트리코데르마 리세이 pep2 (SEQ ID NO: 18), 트리코데르마 리세이 pep3 (서열번호 19); 트리코데르마 리세이 pep4 (서열번호 20), 트리코데르마 리세이 pep5 (서열번호 21) 및 트리코데르마 리세이 pep7 (서열번호 23), 트리코데르마 리세이 EGR48424 pep8 (서열번호 134), 트리코데르마 리세이 EGR49498 pep11 (서열번호 135), 트리코데르마 리세이 EGR52517 pep12 (서열번호 35) 및 이의 상동체를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 다른 생물체에서 동정된 pepl, pep2, pep3, pep4, pep5, pep7, pep8, pepl1 및 pep12 프로테아제의 상동체의 예들은 또한 PCT/EP/2013/050186에 기재되어 있고, 이의 내용이 참조로서 삽입된다.
트립신-유사 세린 프로테아제(
Trypsin
-
Like
Serine
Proteases
)
트립신-유사 세린 프로테아제는 트립신의 기질 특이성과 유사한 기질 특이성을 가지는 효소이다. 트립신-유사 세린 프로테아제는 폴리펩타이드 및 단백질 내 펩타이드 결합의 가수분해를 위해 세린 잔기를 이용한다. 전형적으로, 트립신-유사 세린 프로테아제는 양-전하된 아미노산 잔기가 뒤따르는 펩타이드 결합을 절단한다. 트리코데르마 곰팡이 같은 진핵 생물로부터 유래된 트립신-유사 세린 프로테아제는 트립신 1, 트립신 2, 및 메소트립신을 포함한다. 그러한 트립신-유사 세린 프로테아제는 일반적으로 활성 위치 세린을 친핵성으로 만드는 전하 릴레이(charge relay)를 형성하는 3개의 아미노산 잔기 (예컨대, 히스티딘, 아스파르트산, 및 세린)의 촉매 트리아드(triad)를 포함한다. 진핵 트립신-유사 세린 프로테아제는 글리신과 세린의 백본 아미드 수소 원자에 의해 형성되는 "산소음이온 구멍(oxyanion hole)"를 추가적으로 포함하며, 이는 트립신-유사 세린 프로테아제인 폴리펩타이드의 동정에 도움을 줄 수 있다.
하나의 트립신-유사 세린 프로테아제가 트리코데르마 곰팡이 세포에서 동정되었다: tspl (tre73897). PCT/EP/2013/050186에 논의된 대로, tspl은 면역글로불린 같은 재조합 당단백질의 발현에 유의한 충격을 주는 것으로 증명되었다.
적합한 tsp1 프로테아제의 예들은 트리코데르마 리세이 tspl (서열번호 24) 및 이의 상동체를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 다른 생물체에서 동정된 tsp1 프로테아제의 상동체의 예들은 PCT/EP/2013/050186에 기재되어 있다.
서브틸리신
프로테아제(
Subtilisin
Proteases
)
서브틸리신 프로테아제는 서브틸리신의 기질 특이성과 유사한 기질 특이성을 가지는 효소이다. 서브틸리신 프로테아제는 폴리펩타이드 및 단백질 내 펩타이드 결합의 가수분해를 위해 세린 잔기를 이용한다. 일반적으로, 서브틸리신 프로테아제는 3개의 아미노산 아스파르트산, 히스티딘, 및 세린의 촉매 트리아드를 포함하는 세린 프로테아제이다. 이러한 촉매 잔기들의 배치는 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis)로부터 유래된 원형 서브틸리신과 공유한다. 트리코데르마 곰팡이 같은 진핵생물로부터 유래된 서브틸리신 프로테아제는 퓨린(furin), MBTPS1, 및 TPP2를 포함한다. 진핵 트립신-유사 세린 프로테아제는 산소음이온 구멍에 아스파르트산 잔기를 추가적으로 포함한다.
일곱 개의 서브틸리신 프로테아제는 트리코데르마 곰팡이 세포에서 동정되었다: slpl (tre51365); slp2 (trel23244); slp3 (trel23234); slp5 (tre64719), slp6 (tre121495), slp7 (trel23865), 및 slp8 (tre58698). 또한 서브틸리신 프로테아제 slp7은 세돌리신 프로테아제 tpp1과 유사하다.
적합한 slp 프로테아제의 예들은 트리코데르마 리세이 slpl (서열번호 25), slp2 (서열번호 26); slp3 (서열번호 27); slp5 (서열번호 28), slp6 (서열번호 29), slp7 (서열번호 30), 및 slp8 (서열번호 31), 및 이의 상동체를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 다른 생물체에서 동정된 slp 프로테아제의 상동체의 예들은 PCT/EP/2013/050186에 기재되어 있다.
글루탐산 프로테아제(
Glutamic
Proteases
)
글루탐산 프로테아제는 폴리펩타이드 및 단백질 내 펩타이드 결합을 가수분해하는 효소이다. 글루탐산 프로테아제는 펩스타틴 A에 둔감하여, 때때로 펩스타틴 둔감 산 프로테아제로도 언급된다. 글루탐산 프로테아제는 이전에 아스파르트산 프로테아제로 분류되고 종종 산 프로테아제로도 함께 언급되었지만, 글루탐산 프로테아제가 아스파르트산 프로테아제와는 매우 다른 활성 위치 잔기를 가진다는 것이 최근에 밝혀졌다.
두 개의 글루탐산 프로테아제가 트리코데르마 곰팡이 세포에서 동정되었다: gapl (tre69555) 및 gap2 (trel06661).
적합한 gap 프로테아제의 예들은 트리코데르마 리세이 gapl (서열번호 32), 트리코데르마 리세이 gap2 (서열번호 33), 및 이의 상동체를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 다른 생물체에서 동정된 gap 프로테아제의 상동체의 예들은 PCT/EP/2013/050186에 기재되어 있다.
세돌리신
프로테아제 및 프로테아제의
상동체
세돌리신 프로테아제는 폴리펩타이드 및 단백질 내 펩타이드 결합의 가수분해를 위해 세린 잔기를 이용하는 효소이다. 세돌리신 프로테아제는 일반적으로 세린, 글루탐산, 및 아스파르트산의 독특한 촉매 트리아드를 포함한다. 세돌리신 프로테아제는 또한 산소음이온 구멍 내에 아스파르트산을 포함한다. 트리코데르마 곰팡이 같은 진핵 생물로부터 유래된 세돌리신 프로테아제는 트리펩티딜 펩티다제를 포함한다.
적합한 tpp1 프로테아제의 예들은 트리코데르마 리세이 tpp1 tre82623 (서열번호 34) 및 이의 상동체를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 다른 생물체에서 동정된 tpp1 프로테아제의 상동체의 예들은 PCT/EP/2013/050186에 기재되어 있다.
프로테아제를 언급하면서 이용되는 대로, 상기 용어 "상동체(homolog)"는 프로테아제 활성을 가지고 알려진 (레퍼런스) 프로테아제 서열과 서열 유사성을 보이는 단백질을 의미한다. 상동체는 당업계에 알려진 어떠한 방법, 좋게는 레퍼런스 서열을 단일 두 번째 서열 또는 서열의 단편 또는 서열의 데이터베이스와 비교하는 BLAST 수단을 이용하여 동정될 수 있다. "정의" 섹션에 기재된 대로, BLAST는 퍼센트 동일성 및 유사성에 기반하여 서열들을 비교할 것이다.
좋게는, 상동 프로테아제는, T. 리세이 pepl, pep2, pep3, pep4, pep5, pep7, pep8, pep11, pep12, tspl, slpl, slp2, slp3, slp5, slp6, slp7, slp8, tppl, gapl 및 gap2를 포함하여 상기 나열된 프로테아제 서열들 중 하나와 비교하는 경우, 최소 30% 동일성 (선택적으로 명시된 부위에서, 또는 명시되지 않은 경우에는 전체 서열에서 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일성)을 가진다. N. 크라사 및 M. 테르모필라로부터 유래된 상응하는 상동 프로테아제들은 서열번호 136-169에 보여진다.
본 발명의
사상균
세포 내 프로테아제 활성을 감소시키는 것
본 발명에 따른 사상균 세포는 최소 하나, 전형적으로 2개, 3개, 4개, 5개 또는 이상의 내인성 프로테아제의 감소된 활성을 가져 상기 사상균 세포, 좋게는 PMT-결핍 트리코데르마 세포에서 감소된 O-만노실화를 가지는 단백질의 안정성 및 생산을 개선한다.
사상균 세포에서 발견되는 프로테아제의 활성은 당업자에게 알려진 어떠한 방법에 의해 감소될 수 있다. 몇몇 구현예들에서 프로테아제의 감소된 활성은 상기 프로테아제의 발현을, 예를 들어 프로모터 변형 또는 RNAi에 의해 감소시켜 달성된다.
추가적인 구현예들에서, 상기 프로테아제의 감소된 또는 제거된 발현은 상기 프로테아제 각각을 인코딩하는 유전자 각각에 대해 특이적인 안티-센스 폴리뉴클레오타이드 또는 RNAi 컨스트럭트의 결과이다. 하나의 구현예에서, RNAi 컨스트럭트는 pep-타입 프로테아제 같은 아스파르트 프로테아제, tsp1 같은 트립신-유사 세린 프로테아제, gap-타입 프로테아제 같은 글루탐산 프로테아제, slp-타입 프로테아제 같은 서브틸리신 프로테아제, 또는 tpp1 또는 slp7 프로테아제 같은 세돌리신 프로테아제를 인코딩하는 유전자에 대해 특이적이다. 하나의 구현예에서, RNAi 컨스트럭트는 slp-타입 프로테아제를 인코딩하는 유전자에 대해 특이적이다. 하나의 구현예에서, RNAi 컨스트럭트는 slp2, slp3, slp5 또는 slp6을 인코딩하는 유전자에 대해 특이적이다. 하나의 구현예에서, RNAi 컨스트럭트는 2개 이상의 프로테아제들에 대해 특이적이다. 하나의 구현예에서, 2개 이상의 프로테아제들은 pep-타입 프로테아제들 중 어느 하나, 트립신-유사 세린 프로테아제들 중 어느 하나, slp-타입 프로테아제들 중 어느 하나, gap-타입 프로테아제들 중 어느 하나 및/또는 세돌리신 프로테아제들 중 어느 하나이다. 하나의 구현예에서, 2개 이상의 프로테아제들은 slp2, slp3, slp5 및/또는 slp6이다. 하나의 구현예에서, RNAi 컨스트럭트는 다음의 핵산 서열들 중 어느 하나를 포함한다 (또한 PCT/EP/2013/050186를 참고하라).
다른 구현예들에서, 프로테아제의 감소된 활성은 상기 프로테아제를 인코딩하는 유전자를 변형시킴으로써 달성된다. 그러한 변형의 예들은 상기 내인성 프로테아제 활성을 인코딩하는 유전자의 결실 또는 파괴 같은 돌연변이를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
따라서, 본 발명은 PMT-결핍 트리코데르마 세포 같은 사상균 세포에 관한 것으로서, 상기 세포는 내인성 프로테아제 활성 결핍 돌연변이를 가지지 않는 부모 사상균 세포와 비교하여 최소 하나의 내인성 프로테아제 활성을 감소 또는 제거시키는 첫 번째 돌연변이를 가지며, 상기 사상균 세포는 두 번째 PMT-결핍 돌연변이를 가지지 않는 부모 트리코데르마 세포와 비교하여 내인성 O-만노실트랜스퍼라제 활성을 감소시키는 PMT 유전자 내의 최소 하나의 두 번째 돌연변이를 추가적으로 포함한다.
결실 또는 파괴 돌연변이는 넉-아웃 돌연변이, 절단된 돌연변이, 점 돌연변이, 미스센스 돌연변이, 치환 돌연변이, 프레임쉬프트 돌연변이, 삽입 돌연변이, 중복 돌연변이, 증폭 돌연변이, 전좌 돌연변이, 또는 역위 돌연변이를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니고, 그것은 상응하는 프로테아제 활성에서의 감소를 초래한다. 목적 유전자를 인코딩하는 프로테아제 내 최소 하나의 돌연변이를 발생시키는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 임의적 돌연변이유발법 및 스크리닝, 위치-지정된 돌연변이유발법, PCR 돌연변이유발법, 삽입 돌연변이유발법, 화학적 돌연변이유발법, 및 방사선 조사를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
어떤 구현예들에서, 프로테아제 인코딩 유전자의 부분이 변형되는데, 예컨대 상기 부분은 촉매 도메인을 인코딩하는 부위, 코딩 부위, 또는 상기 코딩 부위의 발현에 필요한 조절 서열이다. 유전자의 그러한 조절 서열은 프로모터 서열 또는 이의 기능성 부분, 즉 유전자의 발현에 영향을 미치기에 충분한 부분일 수 있다. 예를 들어, 프로모터 서열은 어떠한 발현도 없도록 불활성화되거나 또는 상기 코딩 서열의 발현을 감소시키기 위해 원래의 프로모터 서열을 더 약한 프로모터로 대체할 수 있다. 가능한 변형을 위해 다른 조절 서열은 리더 서열, 프로펩타이드 서열, 시그널 서열, 전사 종결인자, 및 전사적 활성인자를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
사상균 세포에 존재하는 프로테아제 인코딩 유전자는 상기 유전자의 발현을 제거 또는 감소시키기 위해 유전자 결실 기술을 이용하여 변형될 수도 있다. 유전자 결실 기술은 유전자의 일부 또는 완전 제거를 가능하게 하여 이의 발현을 제거한다. 그러한 방법에서, 유전자의 결실은 상기 유전자의 옆의 5' 및 3' 부위를 인접하여 포함하도록 구축된 플라스미드를 이용한 상동 재조합에 의해 달성될 수 있다.
또한 사상균 세포에 존재하는 프로테아제를 인코딩하는 유전자는 상기 유전자, 또는 상기 유전자의 전사 또는 번역에 필요한 이의 조절 서열 내에 하나 이상의 뉴클레오타이드를 도입, 치환, 및/또는 제거하여 변형될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오타이드는 종결 코돈의 도입, 시작 코돈의 제거, 또는 개방 판독 프레임(open reading frame)의 프레임-쉬프트를 위해 삽입 또는 제거될 수 있다. 그러한 변형은 당업계에 알려진 방법들에 의해 달성될 수 있는데, 상기 방법은 위치-지정된 돌연변이유발법 및 peR 발생된 돌연변이유발법을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다 (예컨대, Botstein 및 Shortie, 1985, Science 229: 4719; Lo 등, 1985, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 2285; Higuchi 등, 1988, Nucleic Acids Research 16: 7351; Shimada, 1996, Meth. Mol. Bioi. 57: 157; Ho 등, 1989, Gene 77: 61; Horton 등, 1989, Gene 77: 61; 그리고 Sarkar 및 Sommer, 1990, BioTechniques 8: 404를 참고하라).
또한, 사상균 세포에 존재하는 프로테아제 인코딩 유전자는 상기 유전자에 대해 상동인 핵산 단편을 포함하는 파괴적 핵산 컨스트럭트를 유전자 내로 삽입시키는 유전자 파괴 기술에 의해 변형될 수 있는데, 상기 파괴적 핵산 컨스트럭트는 상동 부위의 중복을 창출하고 상기 중복된 부위 간에 컨스트럭트 핵산을 삽입시킨다. 상기 삽입된 컨스트럭트가 상기 유전자의 프로모터를 상기 코딩 부위와 분리시키거나 또는 상기 코딩 서열을 방해하여 비기능성 유전자 산물을 초래한다면 그러한 유전자 파괴는 유전자 발현을 제거시킬 수 있다. 파괴성 컨스트럭트는 상기 유전자에 상동적인 5' 및 3' 부위를 동반하는 단순 선택가능한 마커 유전자일 수 있다. 상기 선택가능한 마커는 상기 파괴된 유전자를 포함하는 형질전환체의 동정을 가능하게 해준다.
사상균 세포에 존재하는 프로테아제 인코딩 유전자는 유전자 변환(gene conversion)의 과정에 의해 변형될 수도 있다 (예컨대, Iglesias 및 Trautner, 1983, Molecular General Genetics 189:573-76). 예를 들어, 유전자 변환에서 상기 유전자에 상응하는 뉴클레오타이드 서열을 인 비트로에서 돌연변이 유발시켜 결함 뉴클레오타이드 서열을 제조한 후, 트리코데르마 스트레인 내로 형질전화시켜 결함 유전자를 생산한다. 상동 재조합에 의해, 상기 결함 뉴클레오타이드 서열이 상기 내인성 유전자를 대체한다. 상기 결함 뉴클레오타이드 서열은 또한 상기 결함 유전자를 포함하는 형질전환체의 선택을 위한 마커를 포함하는 것이 바람직할 것이다.
재조합 폴리펩타이드를 발현하는 사상균 세포에 존재하는 본 발명의 개시사항의 프로테아제 인코딩 유전자는 상기 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 이용하는 확립된 안티-센스 기술에 의해 변형될 수도 있다 (예컨대, Parish 및 Stoker, 1997, FEMS Microbiology Letters 154: 151-157를 참고하라). 특히, 사상균 세포에 의한 유전자 발현은 상기 스트레인에서 전사되고 세포 내에서 생산되는 mRNA에 혼성화할 수 있는 상기 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 도입함으로써 감소 또는 불활성화될 수 있다. 따라서, 상보적 안티-센스 뉴클레오타이드 서열이 상기 mRNA와 혼성화할 수 있는 조건 하에서, 번역된 단백질의 양은 감소 또는 제거된다.
사상균 세포에 존재하는 본 발명의 개시사항의 프로테아제 인코딩 유전자는, 화학적 돌연변이유발법 (예컨대, Hopwood, The Isolation of Mutants in Methods in Microbiology (J.R. Norris and D.W. Ribbons, eds.) pp. 363-433, Academic Press, New York, 25 1970을 참고하라)를 포함하지만, 이에 한정되지 않는 당업계에 알려진 방법들을 이용하는 임의적 또는 특이적 돌연변이유발법에 의해 변형될 수도 있다. 상기 유전자의 변형은 사상균 세포에 돌연변이를 유발시키고 상기 유전자의 발현이 감소 또는 불활성화된 돌연변이 세포를 스크리닝함으로써 실시할 수 있다. 특이적이거나 또는 임의적일 수 있는 돌연변이유발법은, 예를 들어 적합한 물리적 또는 화학적 돌연변이유발제의 사용, 적합한 올리고뉴클레오타이드의 사용, 상기 DNA 서열에 peR 발생된 돌연변이유발법을 실시, 또는 이의 어떠한 조합에 의해 실시될 수 있다. 물리적 및 화학적 돌연변이유발제의 예들은 자외선 (UV) 조사, 히드록실아민, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘 (MNNG), N-메틸-N'-니트로소구아니딘 (NTG) O-메틸 히드록실아민, 아질산, 에틸 메탄 술포네이트 (EMS), 소듐 비술피트(sodium bisulphite), 포름산, 및 뉴클레오타이드 유사체를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 그러한 제제가 이용되는 경우, 상기 돌연변이유발법은 적합한 조건 하에서 선택된 돌연변이 유발제의 존재에서 돌연변이되도록 사상균 세포, 예컨대 트리코데르마 세포를 배양시킨 후 상기 유전자의 발현이 감소되거나 또는 어떠한 발현도 없는 돌연변이에 대해 선택함으로써 실시된다.
어떤 구현예들에서, 본 발명의 개시사항의 프로테아제 인코딩 유전자 내의 최소 하나의 돌연변이 또는 변형은 검출가능한 프로테아제 활성을 가지지 않는 변형된 프로테아제를 초래한다. 다른 구현예들에서, 본 발명의 개시사항의 프로테아제 인코딩 유전자 내의 최소 하나의 변형은 상응하는 비-변형된 프로테아제와 비교하여 최소 25% 이하, 최소 50% 이하, 최소 75% 이하, 최소 90%, 최소 95%, 또는 더 높은 백분율 이하의 프로테아제 활성을 가지는 변형된 프로테아제 활성을 가지는 변형된 프로테아제를 초래한다.
본 발명의 개시사항의 사상균 세포 또는 트리코데르마 곰팡이 세포는 pepl, pep2, pep3, pep4, pep5, pep8, pep11, pep12, tspl, slpl, slp2, slp3, slp5, slp6, slp7, gapl 및 gap2로부터 선택되는 최소 3개, 또는 최소 4개의 프로테아제의 감소된 활성 또는 검출가능하지 않은 프로테아제 활성을 가질 수 있다. 선호되는 구현예에서, 본 발명에 따른 사상균 세포는 최소 3개 또는 4개의 내인성 프로테아제에서 결실 또는 파괴를 가져 그러한 결실되거나 또는 파괴된 내인성 프로테아제에 대해 검출가능한 활성이 없고 내인성 단백질 O-만노실트랜스퍼라제 활성을 감소시키는 돌연변이를 가지지 않는 부모 트리코데르마 세포와 비교하여 내인성 단백질 O-만노실트랜스퍼라제 활성을 감소시키는 PMT 유전자에서 다른 돌연변이를 추가적으로 포함하는 PMT-결핍 사상균 세포이다.
어떤 구현예들에서, 상기 PMT-결핍 사상균 세포 또는 트리코데르마 세포는 pepl, tspl, 및 slpl에서 감소되거나 또는 검출가능하지 않은 프로테아제 활성을 가진다. 다른 구현예들에서, 상기 PMT-결핍 사상균 세포 또는 트리코데르마 세포는 gapl, slpl, 및 pepl에서 감소되거나 또는 검출가능하지 않은 프로테아제 활성을 가진다. 어떤 구현예들에서, 상기 PMT-결핍 사상균 세포 또는 트리코데르마 세포는 slp2, pepl 및 gapl에서 감소되거나 또는 검출가능하지 않은 프로테아제 활성을 가진다. 어떤 구현예들에서, 상기 PMT-결핍 사상균 세포 또는 트리코데르마 세포는 slp2, pepl, gapl 및 pep4에서 감소되거나 또는 검출가능하지 않은 프로테아제 활성을 가진다. 어떤 구현예들에서, 상기 PMT-결핍 사상균 세포 또는 트리코데르마 세포는 slp2, pepl, gap1, pep4 및 slpl에서 감소되거나 또는 검출가능하지 않은 프로테아제 활성을 가진다. 어떤 구현예들에서, 상기 PMT-결핍 사상균 세포 또는 트리코데르마 세포는 slp2, pepl, gap1, pep4, slp1, 및 slp3에서 감소되거나 또는 검출가능하지 않은 프로테아제 활성을 가진다. 어떤 구현예들에서, 상기 PMT-결핍 사상균 세포 또는 트리코데르마 세포는 slp2, pepl, gap1, pep4, slp1, slp3, 및 pep3에서 감소되거나 또는 검출가능하지 않은 프로테아제 활성을 가진다. 어떤 구현예들에서, 상기 PMT-결핍 사상균 세포 또는 트리코데르마 세포는 slp2, pepl, gap1, pep4, slp1, slp3, pep3 및 pep2에서 감소되거나 또는 검출가능하지 않은 프로테아제 활성을 가진다. 어떤 구현예들에서, 상기 PMT-결핍 사상균 세포 또는 트리코데르마 세포는 slp2, pepl, gap1, pep4, slp1, slp3, pep3, pep2 및 pep5에서 감소되거나 또는 검출가능하지 않은 프로테아제 활성을 가진다. 어떤 구현예들에서, 상기 PMT-결핍 사상균 세포 또는 트리코데르마 세포는 slp2, pepl, gap1, pep4, slp1, slp3, pep3, pep2, pep5 및 tsp1에서 감소되거나 또는 검출가능하지 않은 프로테아제 활성을 가진다. 어떤 구현예들에서, 상기 PMT-결핍 사상균 세포 또는 트리코데르마 세포는 slp2, pepl, gap1, pep4, slp1, slp3, pep3, pep2, pep5, tsp1 및 slp7에서 감소되거나 또는 검출가능하지 않은 프로테아제 활성을 가진다. 어떤 구현예들에서, 상기 PMT-결핍 사상균 세포 또는 트리코데르마 세포는 slp2, pepl, gap1, pep4, slp1, slp3, pep3, pep2, pep5, tsp1, slp7 및 slp8에서 감소되거나 또는 검출가능하지 않은 프로테아제 활성을 가진다. 어떤 구현예들에서, 상기 PMT-결핍 사상균 세포 또는 트리코데르마 세포는 slp2, pepl, gap1, pep4, slp1, slp3, pep3, pep2, pep5, tsp1, slp7, slp8 및 gap2에서 감소되거나 또는 검출가능하지 않은 프로테아제 활성을 가진다. 어떤 구현예들에서, 상기 PMT-결핍 사상균 세포 또는 트리코데르마 세포는 pepl, pep2, pep3, pep4, pep5, pep8, pep11, pep12, tspl, slp2, slp3, slp7, gapl 및 gap2로 이루어진 군으로부터 선택된 최소 3개의 내인성 프로테아제에서 감소되거나 또는 검출가능하지 않은 프로테아제 활성을 가진다. 어떤 구현예들에서, 상기 PMT-결핍 사상균 세포 또는 트리코데르마 세포는 pepl, pep2, pep3, pep4, pep5, tspl, slpl, slp2, slp3, gapl 및 gap2로 이루어진 군으로부터 선택된 최소 3개 내지 6개의 내인성 프로테아제에서 감소되거나 또는 검출가능하지 않은 프로테아제 활성을 가진다. 어떤 구현예들에서, 상기 PMT-결핍 사상균 세포 또는 트리코데르마 세포는 pepl, pep2, pep3, pep4, pep5, pep7, pep8, tspl, slpl, slp2, slp3, slp5, slp6, slp7, slp8, tppl, gapl 및 gap2로 이루어진 군으로부터 선택된 최소 7개 내지 10개의 내인성 프로테아제에서 감소되거나 또는 검출가능하지 않은 프로테아제 활성을 가진다.
선행하는 구현예들과 조합될 수 있는 하나의 구현예에서, 본 발명의 사상균 세포는 샤페론 단백질을 인코딩하는 내인성 유전자의 결실 또는 파괴를 포함하지 않는다. 특히, 본 발명의 사상균 세포는 기능성 내인성 샤페론 단백질 단백질 디술피드 이소머라제 (PDI)를 발현한다.
사상균
세포에서 내인성 O-
만노실트랜스퍼라제
O-만노실트랜스퍼라제는 효모 및 균사성 곰팡이 내 pmt 유전자에 의해 인코딩되고, 상기 유전자는 서열 상동성에 기반하여 3개의 서브패밀리로 분류될 수 있다: PMT1 , PMT2 및 PMT4.
예를 들어, 효모 S. 세레비지에에서, 7개의 다른 PMTs가 규명되었다: ScPMT1, ScPMT5 및 ScPMT7은 PMT1 서브패밀리에 속한다. ScPMT2, ScPMT3 및 ScPMT6은 PMT2 서브패밀리에 속하며 ScPMT4은 PMT4 서브패밀리에 속한다. 그러한 O-만노실트랜스퍼라제 및 이의 코딩 서열들은 사상균 세포로부터 동정 및 분리될 수 있고 이들의 활성에서의 감소가, 좋게는 상기 사상균 세포로부터 유래된 그러한 재조합 폴리펩타이드의 생산에 영향을 주지 않으면서 분비된 O-만노실화된 재조합 단백질 상의 O-만노실화의 감소를 가능하게 하는 지를 결정하도록 테스트될 수 있다. PMTs를 동정 및 분리하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 동정된 O-만노실트랜스퍼라제는, 이후 재조합 O-만노실화된 단백질, 예컨대 이종 또는 포유동물 O-만노실화된 단백질을 발현하는 사상균 세포로부터 동정된 O-만노실트랜스퍼라제를 인코딩하는 유전자를 결실시키고, 상기 결실이 좋게는 상기 발현된 재조합 단백질의 생산 레벨에 영향을 주지 않으면서 상기 세포 내 총 O-만노실트랜스퍼라제 활성에서의 감소를 초래하는 지를 결정함에 따라 테스트될 수 있다. 유전자를 결실시키는 방법 및 생산된 단백질의 레벨을 측정하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며 본 명세서에 기재된 방법을 포함한다.
세 개의 O-만노실트랜스퍼라제가 트리코데르마 곰팡이 세포에서 동정되었다: pmt1, pmt2 및 pmt3, 각각은 서열 상동성에 기반하여 PMT4, PMT1 및 PMT2 서브패밀리에 속한다.
적합한 O-만노실트랜스퍼라제의 예들은 트리코데르마 리세이 pmt1 (서열번호 2), 트리코데르마 리세이 pmt2 (서열번호 3), 트리코데르마 리세이 pmt3 (서열번호 4) 및 이의 상동체를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 도 5는 선택된 사상균의 pmt 상동체의 계통발생(phylogeny)을 보여주며 도 6은 다른 종들 간 pmt1 보존적 도메인들의 정렬을 보여준다.
선호되는 구현예에서, 상기 PMT-결핍 사상균 세포, 예컨대 트리코데르마 세포는:
a) 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 PMT1 유전자,
b) PMT1 유전자의 기능성 상동 유전자로서, 상기 기능성 상동 유전자가 상기 PMT1 유전자에서 파괴를 가지는 T. 리세이 스트레인 내로 도입되는 경우 기능 상보성에 의해 부모 O-만노실화 레벨을 회복시킬 수 있는 것인 PMT1 유전자의 기능성 상동 유전자, 및,
c) 서열번호 2와 최소 50%, 최소 60%, 최소 70%, 최소 90%, 또는 최소 95% 동일성을 가지는 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 폴리펩타이드는 O-만노실트랜스퍼라제 활성을 가지는 것인 폴리뉴클레오타이드
로 이루어진 군으로부터 선택된 PMT 유전자 내 최소 하나의 돌연변이를 가진다.
보다 좋게는, 상기 PMT-결핍 사상균 세포, 예컨대 트리코데르마 세포는:
a) 서열번호 2와 최소 50%, 최소 60%, 최소 70%, 최소 90%, 또는 최소 95% 동일성을 가지는 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 가지고,
b) T. 리세이 PMT1 유전자 내 파괴를 가지는 T. 리세이 스트레인 내로 도입되는 경우 기능 상보성에 의해 부모 O-만노실화 레벨을 최소 50%, 좋게는 약 100% 회복시킬 수 있는
PMT 유전자 내 최소 하나의 돌연변이를 가진다.
T. 리세이에서 PMT1 유전자를 파괴시키는 방법은 하기 실시예들에 개시되어 있다.
균사성 곰팡이 내 pmt1의 상동체 서열들은 서열 정렬 조사 수단, 예컨대 BLAST 알고리즘을 이용하여 데이터베이스에서 확인할 수 있다. 상기 서열은 A. 오리제 gi391865791, EIT75070.1 (서열번호 5), A. 니게르 gi317036343, XP_001398147.2 (서열번호 6), A. 니둘란스 gi67522004, XP_659063.1 (서열번호 7), T. 비렌스 gi358379774, EHK17453.1 (서열번호 8), T. 아트로비리데 gi358400594, EHK49920.1 (서열번호 9), F. 옥시스포룸 gi342879728, EGU80965.1 (서열번호 10), G. 제애 gi46107450, XP_380784.1 (서열번호 11), M. 테르모필라 gi367020262, XP_003659416.1 (서열번호 12), N. 크라사 gi164423013, XP_963926.2 (서열번호 13), 및 P. 크리소게눔 gi255953619, XP_002567562.1 (서열번호 14)을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의
사상균
세포 내 내인성 단백질 O-
만노실트랜스퍼라제
활성을 감소시키는 것
본 발명에 따른 PMT-결핍 사상균 세포는 최소 하나의 O-만노실트랜스퍼라제 활성에서 감소된 활성을 가져, 상기 PMT-결핍 사상균 세포, 좋게는 트리코데르마 세포에서 O-만노실화를 감소 또는 축소시킨다.
사상균 세포에서 발견되는 상기 O-만노실트랜스퍼라제 활성은 당업자에게 알려진 어떠한 방법에 의해 감소될 수 있다. 몇몇 구현예들에서 O-만노실트랜스퍼라제의 감소된 활성은, 예를 들어 프로모터 변형 또는 RNAi에 의해 O-만노실트랜스퍼라제의 발현을 감소시켜 달성된다.
다른 구현예들에서, O-만노실트랜스퍼라제의 감소된 활성은 O-만노실트랜스퍼라제를 인코딩하는 유전자를 변형시켜 달성된다. 그러한 변형의 예들은 상기 내인성 O-만노실트랜스퍼라제 활성을 인코딩하는 유전자의 결실 또는 파괴 같은 돌연변이를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
결실 또는 파괴 돌연변이는 상기 섹션, 특히 프로테아제를 인코딩하는 유전자의 결실 또는 파괴와 관련된 섹션에 기재된 대로 실시할 수 있다. 상기 결실 또는 파괴 돌연변이는 넉-아웃 돌연변이, 절단된 돌연변이, 점 돌연변이, 미스센스 돌연변이, 치환 돌연변이, 프레임쉬프트 돌연변이, 삽입 돌연변이, 중복 돌연변이, 증폭 돌연변이, 전좌 돌연변이, 또는 역위 돌연변이를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니고, 그것은 상응하는 O-만노실트랜스퍼라제 활성에서의 감소를 초래한다.
어떤 구현예들에서, 본 발명의 개시사항의 O-만노실트랜스퍼라제 (PMT) 인코딩 유전자 내 돌연변이 또는 변형은 O-만노실트랜스퍼라제 활성이 검출가능하지 않은 변형된 O-만노실트랜스퍼라제를 초래한다. 다른 구현예들에서, 본 발명의 개시사항의 O-만노실트랜스퍼라제 (PMT) 인코딩 유전자 내 최소 하나의 변형은 상응하는 비-변형된 O-만노실트랜스퍼라제와 비교하여 최소 25% 이하, 최소 50% 이하, 최소 75% 이하, 최소 90%, 최소 95%, 또는 더 높은 백분율 이하의 O-만노실트랜스퍼라제 활성을 가지는 변형된 프로테아제 활성을 가지는 변형된 O-만노실트랜스퍼라제를 초래한다.
선호되는 구현예에서, PMT-결핍 사상균 세포, 예컨대 트리코데르마 세포에서 내인성 단백질 O-만노실트랜스퍼라제 활성을 감소시키는 돌연변이는 상기 O-만노실트랜스퍼라제 활성을 인코딩하는 PMT 유전자의 결실 또는 파괴를 가져 그러한 결실된 또는 파괴된 PMT 유전자에 대해 검출가능한 발현을 초래하지 않는 PMT-결핍 세포이다.
본 발명의 하나의 특이적인 구현예는
a. 첫 번째 돌연변이를 가지지 않는 부모 트리코데르마 세포와 비교하여 내인성 프로테아제 활성을 감소 또는 제거시키는 최소 하나의 첫 번째 돌연변이, 및
b. T. 리세이의 PMT1 유전자의 최소 하나의 파괴 또는 결실
c. 선택적으로, 상기 세포는 상기 PMT 유전자 내 상기 돌연변이로 인해 감소된 O-만노실화를 가지는 세린 또는 트레오닌을 가지는 이종 단백질을 추가적으로 발현하는 것
을 포함하는 PMT-결핍 트리코데르마 리세이 세포이다.
O-만노실트랜스퍼라제 활성의 감소(또는 축소)는 본 발명에 따른 PMT-결핍 사상균 세포 내 이종 단백질의 O-만노실화 레벨과 상기 PMT-결핍 돌연변이를 가지지 않는 부모 세포 내 이종 단백질의 O-만노실화 레벨을 비교하여 결정할 수 있다.
특이적 구현예들에서, 본 발명에 따른 PMT-결핍 사상균 세포는 상기 PMT 유전자 내 상기 돌연변이로 인해 감소된 O-만노실화를 가지는 이종 단백질을 발현하고, 상기 발현된 이종 단백질 상의 O-만노실화 레벨은 상기 두 번째 PMT-결핍 돌연변이를 가지지 않는 부모 사상균 세포에서 발현된 이종 단백질의 O-만노실화 레벨보다 최소 20%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 더 낮다.
O-만노실화 레벨은 본 발명의 숙주세포에 의해 생산된 총 폴리펩타이드 당 O-만노실화된 폴리펩타이드의 몰%(mole%)로서 결정할 수 있다. MALDI TOF MS 분석 같은 분석 방법이 하기 실시예 1, "Dpmtl 스트레인들 M403, M404, M406 및 M407의 분석"이라는 제목의 섹션에 자세히 기재된 대로 O-만노실화 레벨을 결정하는 데 이용될 수 있다. 간략하게는, PMT-결핍 사상균 세포에 의해 생산된 폴리펩타이드를 정제하여 O-만노실화 레벨을 결정한다. 상기 폴리펩타이드의 비 O-만노실화된 구조 및 O-만노실화된 구조를 MALDI-TOF MS 분석을 통해 분리 및 정량한다. 예를 들어, O-만노실화 레벨의 정량은 MALDI-TOF MS 스펙트럼의 다른 피크들의 면적값 또는 강도를 결정하여 실시할 수 있다. 면적값 또는 강도를 이용하는 그러한 방법에 의해 결정된 5%의 O-만노실화 레벨은 조성물 내 분석된 폴리펩타이드의 약 95%(몰%)가 O-만노실화되지 않았다는 것을 반영한다. 특이적 구현예들에서, 상기 PMT-결핍 사상균 세포는 상기 PMT 유전자 내 상기 돌연변이로 인해 감소된 O-만노실화를 가지는 이종 단백질을 발현하며 상기 발현된 이종 단백질 상의 O-만노실화 레벨 (예를 들어, MALDI TOF MS 스펙트럼 피크의 면적 또는 강도 값을 결정하여 상기 정의된 대로의 레벨)은 (폴리펩타이드 사슬 당 만노오스 잔기의 몰%로서) 25% 미만, 20%, 17%, 15%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1%, 또는 0.5%로 감소된다.
하나의 구현예에서, 감소된 O-만노실화를 가지는 이종 단백질은:
a) IgG 같은 면역글로불린,
b) 면역글로불린의 경쇄 또는 중쇄,
c) 항체의 중쇄 또는 경쇄,
d) 단일 사슬 항체,
e) 카멜리드 항체,
f) 모노머 또는 멀티머 단일 도메인 항체,
g) FAb-단편, FAb2-단편, 및,
h) 이들의 항체-결합 단편들
로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특이적인 구현예에서, 내인성 O-만노실트랜스퍼라제 활성을 감소시키는 돌연변이는 상기 내인성 단백질 O-만노실트랜스퍼라제 활성을 인코딩하는 PMT 유전자의 결실 또는 파괴이다. 예를 들어, 트리코데르마 세포에서 내인성 O-만노실트랜스퍼라제 활성을 감소시키는 돌연변이는 PMT1 유전자의 결실 또는 파괴이다.
감소된
O-
만노실화
및 포유동물-유사 N-
글리칸을
가지는 당단백질을 생산하기 위한
사상균
세포
본 발명에 따른 사상균 세포는 특히 감소된 O-만노실화 및 포유동물-유사 N-글리칸, 예컨대 복합체 N-글리칸을 가지는 이종 당단백질을 생산하는 데 유용할 수 있다.
따라서, 하나의 양태에서, 상기 사상균 세포는 추가적으로 포유동물-유사 N-글리칸을 생산하도록 유전적으로 변형되어, O-만노실화가 없거나 또는 감소된 O-만노실화 및 주요 글리코형으로서 포유동물-유사 N-글리칸을 가지는 당단백질의 인 비보 생산을 가능하게 해 준다.
어떤 구현예들에서, 이러한 양태는 트리코데르마 세포에서 포유동물-유사 N-글리칸을 가지는 당단백질을 생산하는 방법을 포함한다.
어떤 구현예에서, 상기 당단백질은, 주요 글리코형으로서 다음의 공식 [(Ga1β4)xGlcNAcβ2]zManα3([(Galβ4)yGlcNAcβ2]wManα6)Man{β4GlcNAcβGlcNAc를 가지는 포유동물-유사 N-글리칸을 포함하며, ()는 상기 구조에서 가지를 정의하고, [] 또는 {}는 선형 서열 내에 존재 또는 부존재 중 하나인 글리칸 구조의 부분을 정의하며, x, y, z 및 w는 독립적으로 0 또는 1이다. 하나의 구현예에서 w 및 z는 1이다.
어떤 구현예들에서, 상기 당단백질은, 주요 글리코형으로서:
i. Manα3[Manα6(Manα3)Manα6]Manβ4GlcNAβ4GlcNAc (Man5 글리코형);
ii. GlcNAcβ2Manα3[Manα6(Manα3)Manα6]Manβ4GlcNAβ4GlcNAc (GlcNAcMan5 글리코형);
iii. Manα6(Manα3)Manβ4GlcNAβ4GlcNAc (Man3 글리코형);
iv. Manα6(GlcNAcβ2Manα3)Manβ4GlcNAβ4GlcNAc (GlcNAcMan3) 또는,
v. GO, G1, 또는 G2 글리코형으로부터 선택되는 복합체 타입 N-글리칸
으로 이루어진 군으로부터 선택된 포유동물-유사 N-글리칸을 포함한다.
하나의 구현예에서, 포유동물-유사 N-글리칸을 가지는 당단백질 조성물, 좋게는 alg3 넉-아웃 스트레인에 의해 생산된 포유동물-유사 N-글리칸을 가지는 당단백질 조성물은 글리칸 Manα3[Manα6(Manα3)Manα6]Manβ4GlcNAβ4GlcNAc (Man5)이 실질적으로 없거나 또는 없는 글리코형을 포함한다. 특이적 구현예들에서, 상기 사상균 세포는 주요 글리코형으로서 트리만노실 N-글리칸 구조 Manα3[Manα6]Manβ4GlcNAcβ4GlcNAc를 가지는 당단백질을 생산한다. 다른 구현예들에서, 상기 사상균 세포는 주요 글리코형으로서 GO N-글리칸 구조 GlcNAcβ2Manα3[GlcNAcβ2Manα6]Manβ4GlcNAcβ4GlcNAc를 가지는 당단백질을 생산한다.
어떤 구현예들에서, 본 발명의 PMT-결핍 사상균 세포는 다른 N-글리칸의 혼합물을 가지는 당단백질 조성물을 생산한다.
몇몇 구현예들에서, Man3GlcNAc2 N-글리칸 (즉, Manα3[Manα6]Manβ4GlcNAcβ4GlcNAc)은 본 발명의 사상균 세포에서 발현되는 경우, 감소된 O-만노실화를 가진 이종 단백질의 총 (몰%) 중성 N-글리칸의 최소 10%, 최소 20%, 최소 30%, 최소 40%, 최소 50%, 최소 60%, 최소 70%, 최소 80%, 최소 90% 또는 이상을 나타낸다.
다른 구현예들에서, GlcNAc2Man3 N-글리칸 (예를 들어 GO GlcNAcβ2Manα3[GlcNAcβ2Manα6]Manβ4GlcNAcβ4GlcNAc)은 본 발명의 사상균 세포에서 발현되는 경우, 감소된 O-만노실화를 가진 이종 단백질의 총 (몰%) 중성 N-글리칸의 최소 10%, 최소 20%, 최소 30%, 최소 40%, 최소 50%, 최소 60%, 최소 70%, 최소 80%, 최소 90% 또는 이상을 나타낸다.
다른 구현예들에서, GalGlcNAc2Man3GlcNAc2 N-글리칸 (예를 들어 G1 N-글리칸)은 본 발명의 사상균 세포에서 발현되는 경우, 감소된 O-만노실화를 가진 이종 단백질의 총 (몰%) 중성 N-글리칸의 최소 10%, 최소 20%, 최소 30%, 최소 40%, 최소 50%, 최소 60%, 최소 70%, 최소 80%, 최소 90% 또는 이상을 나타낸다.
다른 구현예들에서, Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-글리칸 (예를 들어 G2 N-글리칸)은 본 발명의 사상균 세포에서 발현되는 경우, 감소된 O-만노실화를 가진 이종 단백질의 총 (몰%) 중성 N-글리칸의 최소 10%, 최소 20%, 최소 30%, 최소 40%, 최소 50%, 최소 60%, 최소 70%, 최소 80%, 최소 90% 또는 이상을 나타낸다.
다른 구현예들에서, 복합체 타입 N-글리칸은 본 발명의 사상균 세포에서 발현되는 경우, 감소된 O-만노실화를 가진 이종 단백질의 총 (몰%) 중성 N-글리칸의 최소 10%, 최소 20%, 최소 30%, 최소 40%, 최소 50%, 최소 60%, 최소 70%, 최소 80%, 최소 90% 또는 이상을 나타낸다.
다른 구현예들에서, 하이브리드 타입 N-글리칸은 본 발명의 사상균 세포에서 발현되는 경우, 감소된 O-만노실화를 가진 이종 단백질의 총 (몰%) 중성 N-글리칸의 최소 10%, 최소 20%, 최소 30%, 최소 40%, 최소 50%, 최소 60%, 최소 70%, 최소 80%, 최소 90% 또는 이상을 나타낸다.
다른 구현예들에서, 본 발명의 숙주세포에 의해 생산된 당단백질 조성물의 0.5% 미만, 0.1%, 0.05%, 또는 0.01% 미만의 N-글리칸은 갈락토오스를 포함한다. 어떤 구현예들에서, N-글리칸 중 어느 것도 갈락토오스를 포함하지 않는다.
Neu5Gc 및 Galα- (비-환원성 끝 말단 Galα3Galβ4GlcNAc) 구조는 CHO 세포 같은 동물세포에서 생산된 항체의 알려진 이종항원성 (동물 유래된) 변형이다. 상기 구조는 항원성일 수 있어 낮은 농도에서조차도 해로울 수 있다. 본 발명의 균사성 곰팡이는 말단 Neu5Gc 및 Galα- 구조를 생산하는 생합성 경로를 가지지 않는다. 선행하는 구현예들과 조합될 수 있는 구현예에서, 0.1% 미만, 0.01%, 0.001% 또는 0%의 N-글리칸 및/또는 O-글리칸의 당단백질 조성물은 Neu5Gc 및/또는 Galα- 구조를 포함한다. 선행하는 구현예들과 조합될 수 있는 구현예에서, 0.1% 미만, 0.01%, 0.001% 또는 0%의 N-글리칸 및/또는 O-글리칸의 항체 조성물은 Neu5Gc 및/또는 Galα- 구조를 포함한다.
본 발명의 사상균 세포는 푸코실화된 이종 단백질을 생산하는 유전자를 가지지 않는다. 선행하는 구현예들과 조합될 수 있는 구현예에서, 0.1% 미만, 0.01%, 0.001% 또는 0%의 N-글리칸의 당단백질 조성물은 코어 푸코오스 구조를 포함한다. 선행하는 구현예들과 조합될 수 있는 구현예에서, 0.1% 미만, 0.01%, 0.001% 또는 0%의 N-글리칸의 항체 조성물은 코어 푸코오스 구조를 포함한다.
포유동물 세포 생산된 글리칸의 N-글리칸의 말단 Galβ4GlcNAc 구조는 항체의 생활성에 영향을 미치고 Galβ3GlcNAc는 식물 세포 생산된 단백질로부터 유래된 이종항원 구조일 수 있다. 하나 이상의 선행하는 구현예들과 조합될 수 있는 구현예에서, 0.1% 미만, 0.01%, 0.001%, 또는 0%의 N-글리칸의 당단백질 조성물은 말단 갈락토오스 에피토프 Galβ3/4GlcNAc 구조를 포함한다. 하나 이상의 선행하는 구현예들과 조합될 수 있는 구현예에서, 0.1% 미만, 0.01%, 0.001%, 또는 0%의 N-글리칸의 항체 조성물은 말단 갈락토오스 에피토프 Galβ3/4GlcNAc 구조를 포함한다.
당화(glycation)는 글루코오스 같은 환원성 당과 단백질 상의 1차 아미노 그룹 간의 화학적 반응으로부터 야기되는 단백질의 일반적인 번역-후 변형이다. 당화는 전형적으로 세포 배양 조건에서 중성 또는 약간 알칼리 pH에서 일어나는데, 예를 들어 CHO 세포에서 항체를 생산하여 이를 분석하는 조건 하에서 일어난다 (예를 들어, Zhang 등 (2008) Unveiling a glycation hot spot in a recombinant humanized monoclonal antibody. Anal Chem. 80(7):2379-2390을 참고하라). 본 발명의 사상균은 전형적으로 산성 pH에서 배양되기 때문에, 당화의 발생이 감소된다. 선행하는 구현예들과 조합될 수 있는 구현예에서, 1.0% 미만, 0.5%, 0.1%, 0.01%, 0.001%, 또는 0%의 당단백질 조성물은 당화 구조를 포함한다. 선행하는 구현예들과 조합될 수 있는 구현예에서, 1.0% 미만, 0.5%, 0.1%, 0.01%, 0.001%, 또는 0%의 항체 조성물은 당화 구조를 포함한다.
하나의 구현예에서, 항체 같은 상기 당단백질 조성물은 Neu5Gc, 말단 Galα3Galβ4GlcNAc, 말단 Galβ4GlcNAc, 말단 Galβ3GlcNAc, 코어 결합된 푸코오스 및 당화 구조로 이루어진 군으로부터 선택된 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 구조를 가지지 않는다.
어떤 구현예들에서, 본 발명의 사상균 세포에서 생산되는 대로 포유동물-유사 N-글리칸 및 감소된 O-만노실화를 가진 그러한 당단백질은 치료용 단백질이다. 치료용 단백질은 면역글로불린, 또는 Fc 단편 또는 다른 치료용 당단백질, 예컨대 항체, 에리스로포이에틴, 인터페론, 성장 호르몬, 알부민 또는 혈청 알부민, 효소, 또는 혈액 응고 인자를 포함하는 단백질 융합을 포함할 수 있고 인간 또는 동물의 치료에 유용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 사상균 세포에 의해 생산되는 포유동물-유사 N-글리칸 및 감소된 O-만노실화를 가진 상기 당단백질은 리툭시맙 같은 치료용 당단백질일 수 있다.
사상균 세포에서 포유동물-유사 N-글리칸을 가진 당단백질을 생산하는 방법은 예를 들어 WO2012/069593에도 기재되어 있다.
하나의 양태에서, 상기 기재된 대로 본 발명에 따른 사상균 세포는 GnTI에 대한 수용체 기질로서 Man5 N-글리칸으로부터 시작한 후 GnT1, 만노시다제 II 및 GnTII 반응 단계를 연속적으로 거치는 포유동물 세포의 전통적인 경로 (이후 본 명세서에서 G0 글리코형을 생산하기 위한 "전통적인 경로(traditional pathway)"로 언급됨)를 모방하도록 유전적으로 추가적으로 변형된다. 하나의 변형예에서, GnTI 및 GnTII의 촉매 도메인을 포함하는 단일 재조합 효소가 이용된다.
택일적으로, 두 번째 양태에서, 상기 기재된 본 발명에 따른 사상균 세포는 alg3 감소된 발현을 가지도록 유전적으로 추가적으로 변형되는데, 이는 GnTI 및 GnTII 이후 반응을 위한 수용체 기질로서 코어 Man3GlcNAc2의 생산을 가능하게 하고 만노시다제 α1,2 또는 만노시다제 II 효소에 대한 필요를 우회하게 한다 (감소된 "alg3" 경로). 하나의 변형예에서, GnTI 및 GnTII의 촉매 도메인을 포함하는 단일 재조합 효소가 이용된다.
포유동물-유사 N-글리칸을 가지는 당단백질을 생산하기 위한 전통적인 경로를 모방하는 그러한 구현예들에서, T. 리세이 스트레인 같은 Man5 발현 사상균 세포는 임의적 통합을 이용하는 GnTI 또는 GnTII/GnTI 융합 효소 또는 Man5 당화에 영향을 미치지 않는 것으로 알려진 위치로 타겟팅된 통합에 의해 형질전환될 수 있다. 하이브리드 타입 글리칸(들)을 가지는 단백질의 생산을 위해 GlcNAcMan5 N-글리칸을 합성하는 스트레인이 선택된다. 상기 선택된 스트레인은 상응하는 GlcNAcMan3 글리코형 또는 이의 유도체(들)을 가지는 단백질의 생산을 위해 Man5 구조를 절단하여 GlcNAcMan3를 생산할 수 있는 만노시다제 II-타입 만노시다제의 촉매 도메인으로 추가적으로 형질전환된다. 어떤 구현예들에서, 만노시다제 II-타입 효소는 글리코시드 가수분해 효소 패밀린 38 (cazy.org/GH38_all.html)에 속한다. 규명된 효소는 cazy.org/GH38_characterized.html에 나열된 효소를 포함한다. 특히 유용한 효소는 서브패밀리 α-만노시다제 II (Man2A1;ManA2)의 효소들 같은 당단백질을 절단하는 골지-타입 효소이다. 그러한 효소의 예들은 인간 효소 AAC50302, D. 멜라노가스터 효소 (Van den Elsen J.M. 등 (2001) EMBO J. 20: 3008-3017), PDB-레퍼런스 1HTY에 따른 3D 구조를 가지는 효소, 및 PDB 내 촉매 도메인으로 참조된 효소를 포함한다. 세포질 발현을 위해, 상기 만노시다제의 촉매 도메인은 전형적으로 N-말단 타겟팅 펩타이드와 융합되거나 (예컨대 상기 섹션에 개시된 대로) 또는 동물 또는 식물 만노시다제 II 효소의 내인성 동물 또는 식물 골지 타겟팅 구조를 가지도록 발현된다. 만노시다제 II-타입 만노시다제의 촉매 도메인으로 형질전환시킨 후, (GnTI이 발현된다면) GlcNAcMan3를 생산하는 스트레인을 선택하거나 또는 (GnTI 및 GnTII의 융합체가 발현된다면) GlcNAc2Man3를 효과적으로 생산하는 스트레인을 선택한다. GlcNAcMan3를 생산하는 스트레인에 있어서, 그러한 스트레인들은 GnTII의 촉매 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드로 추가적으로 형질전환되고 GlcNAc2Man3GlcNAc2를 생산할 수 있는 형질전환 스트레인을 선택한다.
전통적인 경로를 모방하기 위한 그러한 구현예에서, 상기 사상균 세포는 이전 섹션에서 정의된 대로의 PMT-결핍 사상균 세포이며, 상기 세포는:
a) α1,2 만노시다제,
b) N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 I 촉매 도메인,
c) α 만노시다제 II,
d) N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 II 촉매 도메인,
e) β1,4 갈락토실트랜스퍼라제, 및,
f) 푸코실트랜스퍼라제
로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩타이드를 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 추가적으로 포함한다.
감소된 alg3 경로를 이용하는 구현예들에서, 트리코데르마 세포 같은 상기 사상균 세포는 부모 숙주세포에서의 활성 레벨과 비교하여 돌리킬-P-Man:Man(5)GlcNAc(2)-PP-돌리킬 만노실트랜스퍼라제의 감소된 활성 레벨을 가진다. 돌리킬-P-Man:Man(5)GlcNAc(2)-PP-돌리킬 만노실트랜스퍼라제 (EC 2.4.1.130)는 돌리킬-포스페이트 D-만나오스로부터 알파-D-만노실을 막 지질-결합된 올리고사카라이드 내로 이동시킨다. 전형적으로, 상기 돌리킬-P-Man:Man(5)GlcNAc(2)-PP-돌리킬 만노실트랜스퍼라제 효소는 alg3 유전자에 의해 인코딩된다. 어떤 구현예들에서, 포유동물-유사 N-글리칸을 가진 당단백질을 생산하기 위한 사상균 세포는 부모 스트레인에서의 발현 레벨보다 alg3 유전자의 감소된 발현 레벨을 가진다.
보다 좋게는, 상기 사상균 세포는 alg3의 돌연변이를 포함한다. 상기 ALG3 유전자는 당업계에 알려진 어떠한 방법들, 예컨대 점 돌연변이 또는 전체 alg3 유전자의 결실에 의해 돌연변이될 수 있다. 예를 들어, alg3 단백질의 기능은 alg3의 돌연변이에 의해 감소 또는 제거된다. 어떤 구현예들에서, 상기 alg3 유전자는 트리코데르마 세포 같은 사상균 세포로부터 파괴 또는 결실된다. 어떤 구현예들에서, 상기 사상균 세포는 T. 리세이 세포이다. 서열번호 36 및 37은 각각 T. 리세이 내 alg3 유전자의 핵산 및 아미노산 서열을 제공한다. 하나의 구현예에서, 상기 사상균 세포는 당단백질의 생산에 이용되고, 상기 글리칸(들)은 Manα3[Manα6]Manβ4GlcNAcβ4GlcNAc, 및/또는 이의 비-환원성 말단 연장된 변이체를 포함하거나 또는 구성된다.
어떤 구현예들에서, 상기 사상균 세포는 부모 스트레인 내의 활성 레벨과 비교하여 알파-1,6-만노실트랜스퍼라제의 감소된 활성 레벨을 가진다. 알파-1,6-만노실트랜스퍼라제 (EC 2.4.1.232)는 GDP-만노오스로부터 알파-D-만노실 잔기를 단백질-결합된 올리고사카라이드로 이동시켜, 골지체에서 연장 개시성 알파-(1->6)-D-만노실-D-만노오스 결합을 형성한다. 전형적으로, 알파-1,6-만노실트랜스퍼라제 효소는 och1 유전자에 의해 인코딩된다. 어떤 구현예들에서, 상기 사상균 세포는 부모 사상균 세포 내 발현 레벨과 비교하여 och1 유전자의 감소된 발현 레벨을 가진다. 어떤 구현예들에서, 상기 och1 유전자는 상기 사상균 세포로부터 결실된다.
포유동물-유사 N-글리칸을 가진 당단백질을 생산하는 방법에서 이용되는 사상균 세포는 말단 Manα3로 N-아세틸글루코사민의 이동을 촉매하는 N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 I 촉매 도메인 (GnTI)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 수용체 글리칸의 말단 Manα6으로 N-아세틸글루코사민을 촉매하여 복합체 N-글리칸을 생산하는 N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 II 촉매 도메인 (GnTII)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 추가적으로 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, GnTI 및 GnTII를 인코딩하는 상기 폴리뉴클레오타이드는 GnTI 및 GnTII의 촉매 도메인 모두를 포함하는 단일 단백질 융합을 생산하기 위해 결합된다.
본 명세서에 개시된 대로, N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 I (GlcNAc-TI; GnTI; EC 2.4.1.101)은 UDP-N-아세틸-D-글루코사민 + 3-(알파-D-만노실)-베타-D-만노실-R <=> UDP + 3-(2-(N-아세틸-베타-D-글루코사미닐)-알파-D-만노실)-베타-D-만노실-R 반응을 촉매하고, R은 상기 글리칸 수용체 내 N-결합된 올리고사카라이드의 나머지를 나타낸다. N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 I 촉매 도메인은 이러한 반응을 촉매할 수 있는 N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 I 효소의 어떠한 부분이다. GnTI 효소는 글리코실트랜스퍼라제 패밀리 13의 CAZy 데이터베이스 (cazy.org/GT13_all)에 나열되어 있다. 효소적으로 특징화된 종은 A. 탈리아나 AAR78757.1 (US6 653 459), C. 엘레강스 AAD03023.1 (Chen S. 등 J. Biol. Chem 1999;274(1):288-97), D. 멜라노가스터 AAF57454.1 (Sarkar & Schachter Biol Chem. 2001 Feb;382(2):209-17); C. 그리세우스 AAC52872.1 (Puthalakath H. 등 J. Biol.Chem 1996 271 (44):27818-22); H. 사피엔스 AAA52563.1 (Kumar R. 등 Proc Natl Acad Sci U S A. 1990 Dec;87(24):9948-52); M. 아우라투스 AAD04130.1 (Opat As 등 Biochem J. 1998 Dec 15;336 (Pt 3):593-8), (불활성화 돌연변이의 예를 포함함), 래빗, O. 쿠니쿨루스 AAA31493.1 (Sarkar M 등 Proc Natl Acad Sci U S A. 1991 Jan 1;88(1):234-8)을 포함한다. 다양한 생물로부터 유래된 N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 I 효소에 대한 아미노산 서열은 예를 들어 PCT/EP2011/070956에 기재되어 있다. 규명된 활성 효소의 추가적인 예들은 cazy.org/GT13_characterized에서 볼 수 있다. 래빗 GnTI의 촉매 도메인의 3D 구조는 Unligil UM 등 EMBO J. 2000 Oct 16;19(20):5269-80에서 X-선 결정학에 의해 특정되었다. GnTI에 대한 단백질 데이터 은행 (PDB) 구조는 1 F08, 1 F09, 1 FOA, 2AM3, 2AM4, 2AM5, 및 2APC이다. 어떤 구현예들에서, 상기 N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 I 촉매 도메인은 인간 N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 I 효소 (서열번호 38) 또는 이의 변이체로부터 유래된다. 어떤 구현예들에서, 상기 N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 I 촉매 도메인은 서열번호 38의 아미노산 84-445에 대해 최소 70%, 최소 75%, 최소 80%, 최소 85%, 최소 90%, 최소 95%, 최소 96%, 최소 97%, 최소 98%, 최소 99%, 또는 100% 동일성인 서열을 포함한다. 몇몇 구현예들에서, 더 짧은 서열이 촉매 도메인으로 이용될 수 있다 (예를 들어, 인간 효소의 105-445 아미노산 잔기 또는 래빗 효소의 107-447 아미노산 잔기; Sarkar 등 (1998) Glycoconjugate J 15:193-197). GnTI 촉매 도메인으로서 이용될 수 있는 추가적인 서열은 인간 효소의 약 30 내지 445 아미노산 잔기로부터 유래된 아미노산 잔기 또는 30 내지 105 사이의 아미노산 잔기로 시작하고 인간 효소의 약 아미노산 445로 이어지는 어떠한 C-말단 스템 도메인(stem domain), 또는 다른 GnTI의 상응하는 상동 서열 또는 이의 촉매 활성 있는 변이체 또는 돌연변이를 포함한다. 촉매 도메인은 스템 도메인, 트랜스막 도메인, 세포질 도메인의 전부 또는 일부 같은 효소의 N-말단성 부분을 포함할 수 있다.
본 명세서에 개시된 대로, N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 II (GlcNAc-TII; GnTII; EC 2.4.1.143)는 UDP-N-아세틸-D-글루코사민 + 6-(알파-D-만노실)-베타-D-만노실-R <=> UDP + 6-(2-(N-아세틸-베타-D-글루코사미닐)-알파-D-만노실)-베타-D-만노실-R 반응을 촉매하며, R은 상기 글리칸 수용체 내 N-결합된 올리고사카라이드의 나머지를 나타낸다. N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 II 촉매 도메인은 이러한 반응을 촉매할 수 있는 N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 II 효소의 어떠한 부분이다. N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 II 효소에 대한 아미노산 서열은 WO2012069593에 나열되어 있다.
다양한 생물로부터 유래된 N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 I 효소에 대한 아미노산 서열은 예를 들어 PCT/EP2011/070956에 기재되어 있다. 규명된 활성 효소의 추가적인 예들은 cazy.org/GT13_characterized에서 볼 수 있다. 래빗 GnTI의 촉매 도메인의 3D 구조는 Unligil UM 등 EMBO J. 2000 Oct 16;19(20):5269-80에서 X-선 결정학에 의해 특정되었다. 어떤 구현예들에서, N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 II 촉메 도메인은 인간 N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 II 촉메 도메인 (서열번호 38) 또는 이의 변이체로부터 유래된다. 추가적인 GnTII 종은 글리코실트랜스퍼라제 패밀리 16의 CAZy 데이터베이스 (cazy.org/GT16_all)에 나열되어 있다. 효소적으로 규명된 종은 C. 엘레강스, D. 멜라노가스터, 호모 사피엔스 (NP 002399.1), 라투스 노르베기쿠스(Rattus norvegicus), 수스 사크로파(Sus scrofa) (cazy.org/GT16_characterized)의 GnTII를 포함한다. 어떤 구현예들에서, N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 II 촉매 도메인은 서열번호 39의 약 30부터 약 447의 아미노산 잔기에 최소 70%, 최소 75%, 최소 80%, 최소 85%, 최소 90%, 최소 95%, 최소 96%, 최소 97%, 최소 98%, 최소 99%, 또는 100% 동일성인 서열을 포함한다. 상기 촉매 도메인은 스템 도메인, 트랜스막 도메인, 또는 세포질 도메인 모두 또는 일부 같은 상기 효소의 N-말단 부분을 포함할 수 있다.
상기 사상균 세포가 본 발명의 융합 단백질을 포함하는 구현예들에서, 상기 융합 단백질은 N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 I 촉매 도메인 및 N-아세틸글루코사밀 II 촉매 도메인 사이에 스페이서를 추가적으로 포함할 수 있다. 어떤 구현예들에서, 상기 스페이서는 EGIV 스페이서, 2xG4S 스페이서, 3xG4S 스페이서, 또는 CBHI 스페이서이다. 다른 구현예들에서, 상기 스페이서는 스템 도메인으로부터 유래된 서열을 포함한다.
ER/골지 발현을 위해 N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 I 및/또는 N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 II 촉매 도메인은 전형적으로 ER 또는 초기 골지 단백질의 타겟팅 펩타이드 또는 일부와 함께 융합되거나, 또는 동물 또는 식물 N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 효소의 내인성 ER 타겟팅 구조와 함께 발현된다. 어떤 선호되는 구현예들에서, 상기 N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 I 및/또는 N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 II 촉매 도메인은 "타겟팅 서열"로 제목된 섹션에 기재된 대로 본 발명의 타겟팅 펩타이드 중 어느 하나를 포함한다. 좋게는, 상기 타겟팅 펩타이드는 상기 촉매 도메인의 N-말단성 끝에 결합된다. 몇몇 구현예들에서, 상기 타겟팅 펩타이드는 "타겟팅 서열"로 제목된 섹션에 기재된 대로 본 발명의 스템 도메인 중 어느 하나를 포함한다. 어떤 선호되는 구현예들에서, 상기 타겟팅 펩타이드는 Kre2/Mnt1 타겟팅 펩타이드이다. 다른 구현예들에서, 상기 타겟팅 펩타이드는 상기 스템 도메인의 N-말단성 끝에 결합된 트랜스막 도메인 또는 상기 스템 도메인의 N-말단성 끝에 결합된 세포질 도메인을 추가적으로 포함한다. 상기 타겟팅 펩타이드가 트랜스막 도메인을 추가적으로 포함하는 구현예들에서, 상기 타겟팅 펩타이드는 상기 트랜스막 도메인의 N-말단성 펩타이드에 결합된 세포질 도메인을 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 사상균 세포는 또한 UDP-GlcNAc 트랜스포터를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. UDP-GlcNAc 트랜스포터를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 숙주세포에서 내인성일 (즉, 자연적으로 존재하는) 수 있거나, 또는 사상균 세포에 대해 이종일 수도 있다.
어떤 구현예들에서, 상기 사상균 세포는 α-1,2-만노시다제를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 α-1,2-만노시다제를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 숙주세포에서 내인성일 수 있거나, 또는 숙주세포에 대해 이종일 수 있다. 이종 폴리뉴클레오타이드는 효과적인 엑소-α-2-만노시다제 절단 없이 골지로부터 ER로 이동된 고-만노오스 글리칸을 발현하는 숙주세포를 위해 특히 유용하다. 상기 α-1,2-만노시다제는 글리코시드 가수분해 효소 패밀리 47에 속하는 만노시다제 I 타입 효소 (cazy.org/GH47_all.html)일 수 있다. 어떤 구현예들에서, 상기 α-1,2-만노시다제는 cazy.org/GH47_characterized.html에 나열된 효소이다. 특히, 상기 α-1,2-만노시다제는 ER α-만노시다제 I EC 3.2.1.113 효소의 서브패밀리 내 효소 같은 당단백질을 절단하는 ER-타입 효소일 수 있다. 그러한 효소의 예들은 인간 α-2-만노시다제 1B (AAC26169), 포유동물 ER 만노시다제들의 조합, 또는 α-1,2-만노시다제 (MDS1) (T. 리세이 AAF34579; Maras M 등 J Biotech. 77, 2000, 255, 또는 Trire 45717) 같은 사상균 효소를 포함한다. ER 발현을 위해, 상기 만노시다제의 촉매 도메인은 전형적으로 HDEL, KDEL, 또는 ER 또는 초기 골지 단백질의 일부 같은 타겟팅 펩타이드와 융합되거나, 또는 동물 또는 식물 만노시다제 I 효소의 내인성 ER 타겟팅 구조와 함께 발현된다.
어떤 구현예들에서, 상기 사상균 세포는 또한 갈락토실트랜스퍼라제를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 추가적으로 포함한다. 갈락토실트랜스퍼라제는 말단 N-아세틸글루코사미닐 잔기로 β-결합된 갈락토실 잔기를 이동시킨다. 어떤 구현예들에서, 상기 갈락토실트랜스퍼라제는 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제이다. 일반적으로 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제는 CAZy 글리코실트랜스퍼라제 패밀리 7 (cazy.org/GT7_all.html)에 속하고 N-아세틸락토사민 합성효소 (EC 2.4.1.90)로도 알려진 β-N-아세틸글루코사미닐-글리코펩타이드 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제 (EC 2.4.1.38)를 포함한다. 유용한 서브패밀리는 포유동물 또는 인간 β4-GalT1 또는 β4GalT-II, -III, -IV, -V, 및 -VI 또는 이의 어떠한 조합 같은 β4-GalT1, β4-GalT-II, -III, -IV, -V, 및 -VI를 포함한다. β4-GalT1, β4-GalTII, 또는 β4-GalTIII은 GlcNAcMan3, GlcNAc2Man3, 또는 GlcNAcMan5 같은 N-글리칸 상에 말단 GlcNAcβ2-구조의 갈락토실화에 특히 유용하다 (Guo S. 등 Glycobiology 2001, 11:813-20). 상기 촉매 부위의 3-차원적 구조는 알려져 있으며 (예컨대, (2006) J.Mol.Biol. 357: 1619-1633), 상기 구조는 코드 2FYD로 PDB 데이터베이스에 제시되었다. 상기 CAZy 데이터베이스는 어떤 효소의 예들을 포함한다. 규명된 효소들은 또한 cazy.org/GT7_characterized.html의 CAZy 데이터베이스에 나열되어 있다. 유용한 β4GalT 효소의 예들은 β4GalT1, 예를 들어 소 보스 타우루스(bovine Bos taurus) 효소 AAA30534.1 (Shaper N.L. 등 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83 (6), 1573-1577 (1986)), 인간 효소 (Guo S. 등 Glycobiology 2001, 11:813-20), 및 무스 무스쿨루스 효소 AAA37297 (Shaper, N.L. 등 1998 J. Biol. Chem. 263 (21), 10420-10428); 인간 β4GalTII BAA75819.1, 중국 햄스터 크리세툴루스 그리세우스(Cricetulus griseus) AAM77195, 무스 무스쿨루스 효소 BAA34385, 및 일본 메다카 어류 오리지아스 라티페스(Oryzias latipes) BAH36754 같은 β4GalTII; 및 인간 β4GalTIII BAA75820.1, 중국 햄스터 크리세툴루스 그리세우스 AAM77196 및 무스 무스쿨루스 효소 AAF22221 같은 β4GalTIII을 포함한다.
상기 갈락토실트랜스퍼라제는 숙주세포의 세포막에서 발현될 수 있다. 예컨대, Schwientek J. Biol. Chem 1996 3398 기재된 Kre2 펩타이드 같은 이종 타겟팅 펩타이드가 이용될 수 있다. 갈락토실트랜스퍼라제의 발현에 이용될 수 있는 프로모터는 gpd 같은 구조적(constitutive) 프로모터, 내인성 글리코실화 효소 및 골지 또는 ER 내 N-글리칸을 합성하는 만노실트랜스퍼라제 같은 글리코실트랜스퍼라제의 프로모터, 및 cbh1 프로모터 같은 고-생산 내인성 단백질의 유도성 프로모터를 포함한다.
사상균 세포가 갈락토실트랜스퍼라제를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 본 발명의 어떤 구현예들에서, 상기 사상균 세포는 또한 UDP-Gal4 에피머라제 및/또는 UDP-Gal 트랜스포터를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 사상균 세포가 갈락토실트랜스퍼라제를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 본 발명의 어떤 구현예들에서, 상기 숙주세포를 배양 시 락토오스가 글루코오스 대신에 탄소원으로 이용될 수 있다. 상기 배양 배지의 pH는 pH 4.5와 7.0 사이, 또는 5.0과 6.5 사이일 수 있다. 사상균 세포가 갈락토실트랜스퍼라제를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 UDP-Gal 4 에피머라제 및/또는 UDP-Gal 트랜스포터를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 본 발명의 어떤 구현예들에서, Mn2+, Ca2+ 또는 Mg2+ 같은 이가 양이온이 상기 세포 배양 배지에 첨가될 수 있다.
따라서, 어떤 구현예들에서, 본 발명의 사상균 세포, 예를 들어 뉴로스포라, 트리코데르마, 미셀리오프토라 또는 크리소스포리움 세포 중 선택되는 사상균 세포, 및 보다 좋게는 트리코데르마 리세이 세포는 다음과 같은 특징을 포함할 수 있다:
a) 생산된 이종 단백질의 생산 또는 안정성을 개선시키기 위해, 내인성 프로테아제의 활성을 감소 또는 제거시키는 최소 하나의 내인성 프로테아제에서의 돌연변이, 좋게는 2개 또는 3개 이상의 내인성 프로테아제의 프로테아제 활성, 예를 들어 pep1, tsp1, gap1 및/또는 slp1 프로테아제 활성이 감소된다,
b) PMT 유전자, 예컨대 T. 리세이 pmt1 유전자 내의 돌연변이로서, 상기 돌연변이를 포함하지 않는 부모 트리코데르마 세포와 비교하여 내인성 O-만노실트랜스퍼라제 활성을 감소 또는 제거시킨다,
c) 최소 하나의 세린 또는 트레오닌을 가지는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 좋게는 이종 당단백질, 예컨대 면역글로불린, 항체, 또는 면역글로불린의 Fc 단편을 포함하는 단백질 융합체.
d) 선택적으로, alg3 유전자의 결실 또는 파괴,
e) 선택적으로, N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 I 촉매 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 II 촉매 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드,
f) 선택적으로, β1,4 갈락토실트랜스퍼라제를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드,
g) 선택적으로, UDP-Gal 4 에피머라제 및/또는 트랜스포터를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드들.
타겟팅
서열
어떤 구현예들에서, 상기 사상균 세포 내로 도입되는 α1,2 만노시다제, GnTI, 또는 다른 글리코실트랜스퍼라제 같은 재조합 효소는 촉매 도메인에 결합된 타겟팅 펩타이드를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 대로 상기 용어 "결합된(linked)"은 폴리펩타이드의 경우에는 아미노산 잔기들의 2개의 폴리머들 또는 폴리뉴클레오타이드의 경우에는 뉴클레오타이드들의 2개의 폴리머들은 서로 근접하여 직접적으로 커플링되거나 또는 동일한 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 내에 존재하지만 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드가 개입되어 분리된다. 본 명세서에서 사용되는 대로, "타겟팅 펩타이드(targeting peptide)"는 숙주세포 내 소포체 (ER) 또는 골지체 (골지)로 재조합 단백질을 위치시킬 수 있는 재조합 단백질의 연속적인 아미노산 잔기들의 어떠한 수를 의미한다. 상기 타겟팅 펩타이드는 촉매 도메인에 대해 N-말단성 또는 C-말단성일 수 있다. 어떤 구현예들에서, 상기 타겟팅 펩타이드는 촉매 도메인에 대해 N-말단성이다. 어떤 구현예들에서, 상기 타겟팅 펩타이드는 ER 또는 골지 구성성분, 예컨대 만노시다제 II 효소와의 결합을 제공한다. 다른 구현예들에서, 상기 타겟팅 펩타이드는 ER 또는 골지 막에 직접적인 결합을 제공한다.
상기 타겟팅 펩타이드의 구성성분은 정상적으로 ER 또는 골지체에 존재하는 어떠한 효소로부터 유래할 수 있다. 그러한 효소는 만노시다제, 만노실트랜스퍼라제, 글리코실트랜스퍼라제, 타입 2 골지 단백질, 및 MNN2, MNN4, MNN6, MNN9, MNN10, MNS1, KRE2, VAN1 및 OCH1 효소를 포함한다. 그러한 효소는 아크레모니움, 아스페르길루스, 아우레오바시디움, 크립토코커스, 크리소스포리움, 크리소스포리움 루크노웬스, 필로바시디움, 푸사리움, 기베렐라, 후미콜라, 마그나포르테, 무코르, 미셀리오프토라, 미로테시움, 네오칼리마스틱스, 뉴로스포라, 파에실로미세스, 페니실리움, 피로미세스, 쉬조필룸, 탈라로미세스, 테르모아스쿠스, 티엘라비아, 톨리포클라디움, 및 트리코데르마의 종들 같은 효모 또는 곰팡이 종으로부터 유래할 수 있다. 그러한 효소의 서열들은 GenBank 서열 데이터베이스에서 확인할 수 있다.
어떤 구현예들에서 상기 타겟팅 펩타이드는 상기 재조합 단백질의 촉매 도메인 중 타겟팅 펩타이드로서 동일한 효소 및 생물로부터 유래한다. 예를 들어, 재조합 단백질이 인간 GnTII 촉매 도메인을 포함하는 경우, 상기 재조합 단백질의 타겟팅 펩타이드는 인간 GnTII 효소로부터 유래한다. 다른 구현예들에서, 상기 타겟팅 펩타이드는 상기 재조합 단백질의 촉매 도메인으로서 다른 효소 및/또는 생물로부터 유래할 수 있다.
재조합 효소를 타겟팅하는 데 이용될 수 있는 ER 또는 골지로의 단백질 타겟팅에 이용되는 다양한 타겟팅 펩타이드의 예들은:
갈락토실트랜스퍼라제와 융합된 Kre2/Mnt1 N-말단 펩타이드 (Schwientek, JBC 1996, 3398), Man5를 생산하기 위해 효모세포의 ER로 만노시다제의 위치화를 위한 HDEL (Chiba, JBC 1998, 26298-304; Callewaert, FEBS Lett 2001, 173-178), GnTI 촉매 도메인과 융합된 OCH1 타겟팅 펩타이드 (Yoshida 등, Glycobiology 1999, 53-8), α2-만노시다제와 융합된 Mns1의 효모 N-말단 펩타이드 (Martinet 등, Biotech Lett 1998, 1171), GnTI 또는 β4GalT의 촉매 도메인과 결합된 Kre2의 N-말단 부위 (Vervecken, Appl. Environ Microb 2004, 2639-46), Wildt와 Gerngross에서 검토된 다양한 접근방법들 (Nature Rev Biotech 2005, 119), 아스페르길루스 니둘란스 내 전-장 GnTI (Kalsner 등, Glycocon. J 1995, 360-370), 아스페르길루스 오리제 내 전-장 GnTI (Kasajima 등, Biosci Biotech Biochem 2006, 2662-8), 아스페르길루스에서 C. 엘레강스 GnTI과 융합된 효모 Sec12 위치화 구조의 일부 (Kainz 등 2008), 아스페르길루스에서 인간 GnTI과 융합된 효모 Mnn9의 N-말단 일부 (Kainz 등 2008), 인간 GnTI과 융합된 아스페르길루스 Mnn10의 N-말단 일부 (Kainz 등, Appl. Environ Microb 2008, 1076-86), 및 T. 리세이 내 전-장 인간 GnTI (Maras 등, FEBS Lett 1999, 365-70)을 포함한다.
어떤 구현예들에서 상기 타겟팅 펩타이드는 서열번호 40의 아미노산 서열 (예컨대 서열번호 41의 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩됨)을 가지는 Mnt1/Kre2 타겟팅 펩타이드의 N-말단 부위이다. 어떤 구현예들에서, 상기 타겟팅 펩타이드는 하기 표 1에서 볼 수 있듯이 인간 GNT2, KRE2, KRE2-유사, Och1, Anp1, Van1로부터 선택된다:
표 1.
타겟팅
펩타이드의
아미노산 서열
타겟팅 펩타이드로 이용될 수 있는 서열의 추가적인 예들은 WO2012/069593에 기재되어 있는 타겟팅 서열을 포함한다.
규명되지 않은 서열들은 효소 중 하나가 유일한 타겟팅 펩타이드로서 상기 규명되지 않은 서열을 포함하여 숙주세포 내 글리코실화 경로의 효소를 발현시키고 글리칸 생합성의 세포질 위치화의 측면에서 생산된 글리칸을 측정함으로써 타겟팅 펩타이드로서 사용을 위해 테스트되거나(예컨대, Schwientek JBC 1996 3398에서처럼), 또는 상기 타겟팅 펩타이드와 융합된 형광 리포터 단백질을 발현시키고 면역형광에 의해 골지 내 단백질의 위치화를 분석하거나 또는 상기 골지의 세포막을 분획화시켜 상기 단백질의 위치를 측정함으로써 타겟팅 펩타이드로서 사용을 위해 테스트될 수 있다.
감소된
O-
만노실화를
가지는 단백질을 생산하는 방법
상기 기재된 대로 사상균 세포는 감소된 O-만노실화를 가지는 단백질을 생산하는 방법으로 유용하다.
따라서, 다른 양태에서, 본 발명은 감소된 O-만노실화를 가지는 단백질을 생산하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은:
a) 내인성 O-만노실트랜스퍼라제 활성을 감소시키는 그러한 돌연변이를 가지지 않는 부모 스트레인과 비교하여 내인성 O-만노실트랜스퍼라제 활성을 감소시키는 PMT 유전자 내의 돌연변이를 가지고, 세린 또는 트레오닌 잔기를 가지는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 추가적으로 포함하는 PMT-결핍 사상균 세포를 제공하는 단계,
b) 상기 PMT-결핍 트리코데르마 세포를 배양하여 감소된 O-만노실화를 가지는 상기 단백질을 생산하는 단계
를 포함한다.
그러한 방법에서, 상기 생산된 단백질은 이전 섹션에서 기재된 대로 상기 PMT 유전자 내 상기 돌연변이로 인해 감소된 O-만노실화를 가진다. 상기 PMT-결핍 트리코데르마 세포는 이전 섹션에 기재된 대로 내인성 프로테아제 활성을 선택적으로 감소시킬 수 있다.
본 발명의 사상균 세포 및 방법은 O-만노실화될 수 있는 세린 또는 트레오닌을 가지는 단백질의 생산에 유용하다. 예를 들어, 부모 PMT-기능성 사상균 숙주세포, 예를 들어 서열번호 1 같은 PMT1 유전자의 야생형인 최소 하나의 트레코데르마 세포에서 생산되는 경우 O-만노실화되는 단백질의 생산에 특히 유용하다.
본 발명의 방법에서, 어떤 성장 배지는, 예를 들어 루리아-베르타니 (LB) 브로스, 사브로 덱스트로오스 (SD) 브로스 또는 효모 배지 (YM) 브로스 같은 상업적으로-제조된 일반적인 배지를 포함한다. 다른 특정된 또는 합성 성장 배지도 이용될 수 있으며 특정 숙주세포의 성장을 위한 적절한 배지는 미생물학 또는 발효 과학의 분야의 숙련자에 의해 알려져 있을 것이다. 배양 배지는 전형적으로 기본으로서 락토오스, 셀룰로오스, 스펜트 그레인(spent grain) 또는 소포로오스 같은 생산 프로모터를 유도하는 물질이 첨가된 트리코데르마 리세이 최소 배지 (Penttila 등, 1987, Gene 61, 155-164)를 가진다. 성장에 적합한 온도 범위 및 다른 조건은 당업계에 알려져 있다 (예를 들어, Bailey 및 Ollis 1986을 참고하라). 어떤 구현예들에서 세포 배양의 pH는 3.5와 7.5 사이, 4.0과 7.0 사이, 4.5와 6.5 사이, 5와 5.5 사이, 또는 5.5이다. 어떤 구현예들에서, 항체를 생산하기 위해 상기 사상균 세포 또는 트리코데르마 곰팡이 세포는 4.7부터 6.5까지; 4.8 내지 6.0; pH 4.9 내지 5.9; 및 pH 5.0 내지 5.8로부터 선택된 pH 범위에서 배양시킨다.
몇몇 구현예들에서, O-만노실화될 수 있는 단백질은 이종 단백질, 좋게는 포유동물 단백질이다. 다른 구현예들에서, 상기 이종 단백질은 비-포유동물 단백질이다.
어떤 구현예들에서, O-만노실화될 수 있는 단백질은 N-글리칸 번역후 변형을 가진 당단백질이다.
어떤 구현예들에서, O-만노실화될 수 있는 포유동물 단백질은 면역글로불린, 면역글로불린 또는 항체 중쇄 또는 경쇄, 단일클론 항체, Fab 단편, F(ab')2 항체 단편, 단일 사슬 항체, 모노머 또는 멀티머 단일 도메인 항체, 카멜리드 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편으로부터 선택된다.
본 명세서에서 사용되는 대로, 단백질의 단편은 레퍼런스 단백질의 최소 10개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개의 연속 아미노산들로 구성된다.
본 명세서에서 사용되는 대로, "면역글로불린(immunoglobulin)"은 중쇄와 경쇄가 함께 공유결합적으로 커플링되어 있고 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 멀티머 단백질을 의미한다. 면역글로불린 분자는 IgM, IgD, IgG, IgA, 및 IgE 같은 여러 가지 타입의 분자들을 포함하는 큰 패밀리의 분자들이다.
본 명세서에서 사용되는 대로 "항체"는 온전한 면역글로불린 분자 뿐 아니라 항원에 결합할 수 있는 이의 단편들을 의미한다. 이들은 하이브리드 (키메릭) 항체 분자 (예를 들어, Winter 등 Nature 349:293-99225, 1991; 및 미국 등록특허 제4,816,567 226호를 참고하라); F(ab')2 분자; 비-공유결합 헤테로다이머; 다이머 및 트리머 항체 단편 컨스트럭트; 인간화된 항체 분자 (예를 들어, Riechmann 등 Nature 332, 323-27, 1988; Verhoeyan 등 Science 239, 1534-36, 1988; 및 GB 2,276,169); 및 그러한 분자들로부터 얻어지는 어떠한 기능성 단편들 뿐 아니라, 파아지 디스플레이 또는 트랜스제닉 마우스 같은 비-통상적인 과정을 통해 얻어지는 항체들을 포함한다. 좋게는, 상기 항체는 Fc 부위를 가지는 전통적인 항체들이다. 항체를 제조하는 방법은 당업계에 알려져 있다.
추가적인 구현예들에서, 상기 포유동물 당단백질의 수율은 리터 당 최소 0.5, 최소 1, 최소 2, 최소 3, 최소 4, 또는 최소 5 그램이다.
어떤 구현예들에서, 상기 포유동물 당단백질은 항체이고, 선택적으로 lgG1, lgG2, lgG3, 또는 lgG4이다. 추가적인 구현예들에서, 상기 항체의 수율은 리터 당 최소 0.5, 최소 1, 최소 2, 최소 3, 최소 4, 또는 최소 5 그램이다. 추가적인 구현예들에서, 상기 포유동물 당단백질은 항체이며, 상기 항체는 추가적인 아미노산 잔기 없이 천연 항체 C-말단 및 N-말단의 최소 70%, 최소 80%, 최소 90%, 최소 95%, 또는 최소 98%를 포함한다. 다른 구현예들에서, 상기 포유동물 당단백질은 항체이고, 상기 항체는 어떠한 C-말단 또는 N-말단 아미노산 잔기의 결손도 없는 천연 항체 C-말단 및 N-말단의 최소 70%, 최소 80%, 최소 90%, 최소 95%, 또는 최소 98%를 포함한다.
상기 포유동물 당단백질이 세포 배양으로부터 정제되는 어떤 구현예들에서, 상기 포유동물 당단백질을 포함하는 배양은 상기 생산된 폴리펩타이드의 질량의 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 또는 10% 미만인 질량 백분율로 구성되는 폴리펩타이드 단편을 포함한다. 어떤 선호되는 구현예들에서, 상기 포유동물 당단백질은 항체이며, 상기 폴리펩타이드 단편은 중쇄 단편 및/또는 경쇄 단편이다. 다른 구현예들에서, 상기 포유동물 당단백질이 항체이고 상기 항체가 세포 배양으로부터 정제된다면, 상기 항체를 포함하는 배양은 상기 생산된 폴리펩타이드의 질량의 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 또는 10% 미만인 질량 백분율로 구성되는 자유로운 중쇄 및/또는 자유로운 경쇄를 포함한다. 폴리펩타이드 단편의 질량 백분율을 결정하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며 SDS-겔로부터 시그널 강도를 측정하는 것을 포함한다.
어떤 구현예들에서, 감소된 O-만노실화를 가지는 단백질, 예컨대 항체가 세포 배양으로부터 정제되는 경우, 상기 세포는 O-만노실화되지 않은 단백질의 최소 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100%를 포함한다 (예를 들어, MALDI TOF MS 분석에 의해 결정되는 몰%, 하기 실시예 1에 기재된 대로 피크의 면적 또는 강도를 측정하는 것).
O-만노실화될 수 있는 최소 하나의 세린 또는 트레오닌 잔기를 가지는 단백질이 세포 배양으로부터 정제되고, 상기 스트레인이 복합체 N-글리칸을 생산하도록 유전적으로 조작된 트리코데르마 세포인 어떤 구현예들에서, 상기 배양은 총 분비된 자연 N-글리칸과 비교하여 분비된 복합체 중성 N-글리칸의 최소 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30% (몰%)를 추가적으로 포함한다 (예를 들어 WO2012069593에 기재된 대로 측정됨).
다른 구현예들에서, 감소된 O-만노실화를 가진 이종 단백질, 예컨대 항체는 트리마노실 N-글리칸 구조 Manα3[Manα6]Manβ4GlcNAcβ4GlcNAc를 포함한다. 몇몇 구현예들에서, 상기 Manα3[Manα6]Manβ4GlcNAcβ4GlcNAc 구조는 감소된 O-만노실화를 가진 이종 단백질의 총 N-글리칸의 최소 20%, 30%; 40%, 50%; 60%, 70%, 80% (몰%) 또는 이상을 나타낸다. 다른 구현예들에서, 감소된 O-만노실화를 가지는 이종 단백질은 GO N-글리칸 구조 GlcNAcβ2Manα3[GlcNAcβ2Manα6]Manβ4GlcNAcβ4GlcNAc를 포함한다. 다른 구현예들에서, 비-푸코실화된 GO 글리코형 구조는 감소된 O-만노실화를 가지는 이종 단백질의 총 N-글리칸의 최소 20%, 30%; 40%, 50%; 60%, 70%, 80% (몰%) 또는 이상을 나타낸다. 다른 구현예들에서, 갈락토실화된 N-글리칸은 배양의 총 N-글리칸 및/또는 감소된 O-만노실화를 가진 이종 단백질, 예컨대 항체의 0.5% (몰%) 미만, 0.1%, 0.05%, 0.01%를 나타낸다. 어떤 구현예들에서, 상기 배양 또는 이종 단백질, 예를 들어 항체는 갈락토실화된 N-글리칸을 포함하지 않는다.
어떤 구현예에서, 상기 이종 (정제된) 단백질은 항체, 경쇄 항체, 중쇄 항체 또는 Fab로서, 주요 글리코형으로서 Man3, GlcNAcMan3, Man5, GlcNAcMan5, GO, 코어 GO, G1, 또는 G2 N-글리칸 구조 및 O-만노실화 레벨의 35% 미만, 20%, 17%, 15%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 0.5% 미만으로 포함한다 (예를 들어, MALDI TOF MS 분석에 의해 결정되는 몰%, 및 하기 실시예 1에 기재된 대로 피크의 면적 또는 강도를 측정하는 것).
특이적 구현예에서, 본 발명은 따라서 감소된 O-만노실화를 가지는 항체를 생산하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은:
a. PMT-결핍 트리코데르마 세포를 제공하는 단계로서, 상기 세포는
i. 내인성 단백질 O-만노실트랜스퍼라제 활성을 감소시키는 그러한 돌연변이를 가지지 않는 부모 스트레인과 비교하여 내인성 단백질 O-만노실트랜스퍼라제 활성을 감소시키는 돌연변이, 및,
ii. 경쇄 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 중쇄 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드
를 가지는 것인 단계,
b. 상기 세포를 배양하여 감소된 O-만노실화를 가지는 중쇄 및 경쇄로 이루어진 상기 항체를 생산하는 단계
를 포함한다.
항체의 생산과 관련된 방법의 그러한 특이적 구현예들에서, 상기 생산된 항체의 최소 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 O-만노실화되지 않는다 (예를 들어, MALDI TOF MS 분석에 의해 결정되는 몰%, 및 하기 실시예 1에 기재된 대로 피크의 면적 또는 강도를 측정하는 것).
본 발명의 개시된 방법 중 어느 하나의 어떤 구현예들에서, 상기 방법은 하나 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 또는 5개 이상의 프로테아제 억제제를 제공하는 추가적인 단계를 포함한다. 어떤 구현예들에서, 상기 프로테아제 억제제는 포유동물 폴리펩타이드와 공동-발현되는 펩타이드이다. 다른 구현예들에서, 상기 억제제는 아스파르트 프로테아제, 트립신-유사 세린 프로테아제, 서브틸리신 프로테아제, 및 글루탐산 프로테아제로부터 선택되는 프로테아제 패밀리로부터 최소 2개, 최소 3개, 또는 최소 4개의 프로테아제를 억제한다.
본 발명의 개시된 방법 중 어느 하나의 어떤 구현예들에서, 상기 사상균 세포 또는 트리코데르마 곰팡이 세포도 운반 단백질을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 대로, "운반 단백질(carrier protein)"은 사상균 세포 또는 트리코데르마 곰팡이 세포에 대해 내인적이며 이에 의해 높게 분비되는 단백질의 일부이다. 적합한 운반 단백질은 T. 리세이 만나나제 I (Man5A, 또는 MANI), T. 리세이 셀로비오히드롤라제 II (Cel6A, 또는 CBHII) (예를 들어, Paloheimo 등 Appl. Environ. Microbiol. 2003 December; 69(12): 7073-7082) 또는 T. 리세이 셀로비오히드롤라제 I (CBHI)의 운반 단백질을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 몇몇 구현예들에서, 상기 운반 단백질은 CBHI이다. 다른 구현예들에서, 상기 운반 단백질은 CBHI 코어 부위 및 CBHI 링커 부위의 일부를 포함하는 절단된 T. 리세이 CBHI 단백질이다. 몇몇 구현예들에서, 셀로비오히드롤라제 또는 이의 단편 같은 운반체는 항체 경쇄 및/또는 항체 중쇄와 융합된다. 몇몇 구현예들에서, 운반체-항체 융합 폴리펩타이드는 Kex2 절단 위치를 포함한다. 어떤 구현예들에서, Kex2, 또는 다른 운반체 절단 효소는 상기 사상균 세포에 내인적이다. 어떤 구현예들에서, 운반체 절단 프로테아제는 상기 사상균 세포에 외인적인데, 예를 들어 효모 또는 TEV 프로테아제로부터 유래된 다른 Kex2 단백질이다. 어떤 구현예들에서, 운반체 절단 효소는 과다발현된다. 어떤 구현예들에서, 상기 운반체는 T. 리세이 CBH1 단백질 GenBank 접근번호 EGR44817.1의 N-말단 부분의 약 469 내지 478 아미노산들로 구성된다.
어떤 구현예들에서, 본 발명의 사상균 세포는 KEX2 프로테아제를 과다발현한다. 일 구현예에서, 상기 이종 단백질은 내인성 곰팡이 폴리펩타이드, Kex2 절단 위치 같은 프로테아제 위치, 및 항체 중쇄 및/또는 경쇄 같은 이종 단백질을 포함하는 융합 컨스트럭트로서 발현된다. Kex2 절단 위치를 선행하는 유용한 2-7개의 아미노산 조합은, 예를 들어 Mikosch 등 (1996) J. Biotechnol. 52:97-106; Goller 등 (1998) Appl Environ Microbiol. 64:3202-3208; Spencer 등 (1998) Eur. J. Biochem. 258:107-1 12; Jalving 등 (2000) Appl. Environ. Microbiol. 66:363-368; Ward 등 (2004) Appl. Environ. Microbiol. 70:2567-2576; Ahn 등 (2004) Appl. Microbiol. Biotechnol. 64:833-839; Paloheimo 등 (2007) Appl Environ Microbiol. 73:3215-3224; Paloheimo 등 (2003) Appl Environ Microbiol. 69:7073-7082; 및 Margolles-Clark 등 (1996) Eur J Biochem. 237:553-560에 기재되었다.
본 발명은 추가적으로 단백질 조성물에 관한 것으로, 예를 들어 상기 개시된 방법에 의해 얻을 수 있거나 얻어지는 항체 조성물에 관한 것이다.
특이적 구현예에서, 본 발명의 방법에 의해 얻을 수 있거나 얻어지는 그러한 항체 조성물은 O-만노실화되지 않은 항체의 최소 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 100%를 포함한다 (예를 들어, MALDI TOF MS 분석에 의해 결정되는 몰%, 및 하기 실시예 1에 기재된 대로 피크의 면적 또는 강도를 측정하는 것). 다른 특이적 구현예들에서, 그러한 항체 조성물은 추가적으로 다음의 글리코형의 50%, 60%, 70% 또는 80% (몰% 중성 N-글리칸)로서 포함한다:
(i) Manα3[Manα6(Manα3)Manα6]Manβ4GlcNAβ4GlcNAc (Man5 글리코형);
(ii) GlcNAcβ2Manα3[Manα6(Manα3)Manα6]Manβ4GlcNAβ4GlcNAc, 또는 β4-갈락토실화된 이의 변이체;
(iii) Manα6(Manα3)Manβ4GlcNAβ4GlcNAc;
(iv) Manα6(GlcNAcβ2Manα3)Manβ4GlcNAβ4GlcNAc, 또는 β4-갈락토실화된 이의 변이체: 또는,
(v) GO, G1 또는 G2 글리코형으로부터 선택된 복합체 타입 N-글리칸.
몇몇 구현예들에서, iii-v에 따른 N-글리칸 글리코형은 15% 미만, 10%, 7%, 5%, 3%, 1% 또는 0.5%을 포함하거나 또는 상기 i)에 특정된 대로 Man5 글리칸이 없다.
본 발명은 또한 트리코데르마 세포에서 생산된 재조합 당단백질 조성물의 O-만노실화 레벨을 감소시키는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 PMT 유전자 내의 돌연변이를 가지는 트리코데르마 세포를 이용하는 단계로 이루어지고, 상기 PMT 유전자는:
a. 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 PMT1 유전자,
b. PMT1 유전자의 기능성 상동 유전자로서, 상기 유전자가 상기 PMT1 유전자에서 파괴를 가지는 T. 리세이 스트레인 내로 도입되는 경우 기능 상보성에 의해 부모 O-만노실화 레벨을 회복시킬 수 있는 것인 PMT1 유전자의 기능성 상동 유전자, 또는,
c. 서열번호 2와 최소 50%, 최소 60%, 최소 70%, 최소 90%, 또는 최소 95% 동일성을 가지는 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 폴리펩타이드는 O-만노실트랜스퍼라제 활성을 가지는 것인 폴리뉴클레오타이드
중 어느 하나이다.
그러한 방법의 하나의 특이적인 구현예에서, 상기 트리코데르마 세포는 트리코데르마 리세이이다.
그러한 방법의 다른 특이적인 구현예에서, 상기 재조합 당단백질은 최소 하나의 세린 또는 트레오닌 잔기를 포함하는 최소 하나의 경쇄 항체 또는 이의 단편 및 최소 하나의 N-글리칸을 포함한다.
도 1은 항체 MABO1을 발현하는 트리코데르마 리세이 pmt1 결실 스트레인의 서던 분석 결과를 예시한다. A) SpeI + XbaI 절단 후 pmt1 ORF 프로브를 이용하는 경우 부모 스트레인 M124 및 M304에서 5.7 kb 시그널이 예상된다. 순수한 pmt1 결실 스트레인들로부터 어떠한 시그널도 예측되지 않는다. B) SpeI + AscI 절단 후 pmt1 5'플랭크 프로브를 이용하는 경우 결실 스트레인으로부터 3.5 kb 시그널이 예측된다. C) SpeI + XbaI 절단 후 pmt1 3'플랭크 프로브를 이용하는 경우 결실 스트레인으로부터 1.7 kb 시그널이 예측된다. AscI은 근접 거리 내 온전한 pmt1 유전자 자리를 절단하지 않기 때문에, 16 kb (B) 및 10 kb (C) 이상의 시그널들이 부모 스트레인 M124 또는 M304으로부터 예측된다. 양 플랭크 프로브 (B, C)와의 혼성화에서 대조군으로서 이용된 PmeI 절단된 플라스미드 pTTv185로부터 4.1 kb 시그널이 예상된다.
도 2는 플라스크 배양된 부모 T. 리세이 스트레인 M317 (M304의 pyr4-) (A) 및 Δpmt1 파괴 클론 26-8A (B)의 경쇄의 7일째 스펙트럼을 보여준다.
도 3은 유가식 발효로부터 트리코데르마 리세이 pmt1 결실 스트레인 M403의 웨스턴 분석 결과를 보여준다. 위쪽 패널: MAB01 경쇄, 아래쪽 패널: MAB01 중쇄. 각 레인에 0.1 μl의 상층액을 로딩하였다.
도 4는 발효기 배양된 T. 리세이 스트레인 M403 (MAB01 항체 생산 스트레인의 pmt1 결실 스트레인, 클론 26-8A)의 경쇄의 7일째 스펙트럼을 보여준다.
도 5는 선택된 사상균의 PMTs의 계통발생(phylogeny)을 보여준다.
도 6은 PMT BLAST 검색 결과들의 일부 서열 정렬을 보여준다.
도 2는 플라스크 배양된 부모 T. 리세이 스트레인 M317 (M304의 pyr4-) (A) 및 Δpmt1 파괴 클론 26-8A (B)의 경쇄의 7일째 스펙트럼을 보여준다.
도 3은 유가식 발효로부터 트리코데르마 리세이 pmt1 결실 스트레인 M403의 웨스턴 분석 결과를 보여준다. 위쪽 패널: MAB01 경쇄, 아래쪽 패널: MAB01 중쇄. 각 레인에 0.1 μl의 상층액을 로딩하였다.
도 4는 발효기 배양된 T. 리세이 스트레인 M403 (MAB01 항체 생산 스트레인의 pmt1 결실 스트레인, 클론 26-8A)의 경쇄의 7일째 스펙트럼을 보여준다.
도 5는 선택된 사상균의 PMTs의 계통발생(phylogeny)을 보여준다.
도 6은 PMT BLAST 검색 결과들의 일부 서열 정렬을 보여준다.
실시예들
실시예 2에 보다 특이적으로 예시된 대로, pmt1의 결실 후 거의 95%의 정제된 mAb 및 70%의 Fab 분자는 더이상 어떠한 O-만노오스 잔기를 포함하지 않았다. 대조적으로, 실시예 3 및 4에 예시된 바와 같이, pmt2 및 pmt3 결실 스트레인에서 실시된 O-만노실화 레벨 분석은 O-만노실화에서 눈에 띄는 감소를 나타내지 않았다. 실시예 2에서 설명된 역가 및 성장 분석과 함께, 이러한 결과들은 생존율 및 생산된 당단백질의 생산에 부정적으로 영향을 미치지 않고 사상균 세포, 예컨대 트리코데르마 세포가 O-만노실화 활성을 감소 또는 억제시키도록 유전적으로 변형될 수 있다는 것을 증명한다. 그와 같이, pmt1은 분비된 단백질의 O-만노실화를 감소시키고 트리코데르마 리세이에 의해 생산된 바이오의약품의 산물 질을 개선시키기 위한 가치있는 타겟으로서 동정된다.
실시예
1: 트리코데르마
리세이
스트레인에서
pmt1
결실
본 실시예는 pmt1이 분비된 단백질의 O-만노실화를 감소시키고 트리코데르마 리세이에 의해 생산된 바이오의약품의 산물 질을 개선시키는 귀중한 타겟이라는 것을 증명한다.
pmt1
결실 플라스미드의 제조
단백질 O-만노실트랜스퍼라제 유전자 pmt1 (TrelD75421)의 결실을 위해 3개의 다른 결실 플라스미드 (pTTv36, pTTv124, pTTv185)를 구축하였다. 모든 플라스미드는 pmt1 유전자 자리로 올바른 통합을 위해 동일한 5' 및 3' 플랭킹 부위를 포함한다. 상기 3개의 플라스미드 간의 차이는 선택에서 이용되는 마커이다: pTTv36은 아스페르길루스 니둘란스의 아세트아미다제 (amdS)를 인코딩하는 유전자를 포함하고, pTTv124는 amdS 마커의 루프아웃 형태 (블라스터 카세트)를 포함하며, pTTv185는 T. 리세이의 오로티딘-5'-모노포스페이트 (OMP) 데카르복실라제 (pyr4)를 인코딩하는 유전자의 루프아웃 형태 (블라스터 카세트)를 포함한다.
단백질 O-만노실트랜스퍼라제 유전자 pmt1 (TrelD75421)에 대한 상기 세 번째 결실 컨스트럭트인 pTTv185는 성공적인 통합 후 트리코데르마 리세이 게놈으로부터 선택 마커의 제거를 가능하게 하였고 이에 의해 이후 형질전환을 위한 선택 마커의 재순환이 가능하도록 고안하였다. 이러한 접근방법에서, 상기 마커의 재순환, 즉 상기 결실 컨스트럭트로부터 pyr4 유전자의 제거는 효모에 대해 개발된 블라스터 카세트라 불리우는 것과 닮았다 (Hartl, L. 및 Seiboth, B., 2005, Curr Genet 48:204-211; 및 Alani, E. 등, 1987, Genetics 116:541-545). 유사한 블라스터 카세트가 히포크레아 제코리나(Hypocrea jecorina) (무성생식형: T. 리세이)를 포함하는 균사성 곰팡이를 위해서도 개발되었다 (Hartl, L. 및 Seiboth, B., 2005, Curr Genet 48:204-211).
상기 TrelD 번호는 관절 게놈 협회(Joint Genome Institute) 트리코데르마 리세이 v2.0 게놈 데이터베이스로부터 유래된 특정 프로테아제 유전자의 동정 번호를 의미한다. 결실 플라스미드의 구축을 위한 프라이머들은 수작업으로 또는 Primer3 소프트웨어 중 하나를 이용하여 고안하였다 (Primer3 웹사이트, Rozen 및 Skaletsky (2000) Bioinformatics Methods and Protocols : Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, NJ, pp 365-386).
마커 유전자로서 pyr4를 이용한 블라스터 카세트의 원칙은 다음과 같다: T. 리세이의 오로티딘-5'-모노포스페이트 (OMP) 데카르복실라제를 인코딩하는 pyr4 (Smith, J.L., 등, 1991, Current Genetics 19:27-33)는 우리딘 합성을 위해 필요하다. OMP 데카르복실라제 활성이 없는 스트레인은 우리딘 보충 없는 최소 배지에서 성장할 수 없다 (즉, 우리딘 영양요구체임). OMP 데카르복실라제 활성이 없는 돌연변이 스트레인 (pyr4 - 스트레인)의 제조에서 5-FOA (5-fluoroorotic acid)의 이용은 OMP 데카르복실라제에 의한 5-FOA의 독성 중간물질 5-플루오로-UMP로의 전환에 기반한다. 따라서, 돌연변이된 pyr4 유전자를 가지는 세포는 5-FOA에 내성이 있지만 우리딘에도 영양요구적이다. 상기 5-FOA 내성은 원칙적으로 다른 유전자 내 돌연변이 (pyr2, 오로테이트 포스포리보실트랜스퍼라제)로부터도 야기될 수 있어, 이러한 선택으로 얻어지는 자발적인 돌연변이느 pyr4 유전자를 이용하여 돌연변이를 보완시킴으로써 pyr4 - 유전자형을 확인할 필요가 있다. 일단 돌연변이되면, 상기 pyr4 유전자는 T. 리세이에서 영양요구성 선택 마커로서 이용할 수 있다. 본 발명자들의 블라스터 카세트에서 pyr4는 pyr4 5' 비번역된 부위 (5'UTR)의 310 bp의 직접 반복이 뒤따르고 결실될 유전자의 5' 및 3' 플랭킹 부위에 의해 둘러싸여 있다. 상기 결실 카세트의 통합은 pyr4 기능을 통해 선택된다. 이후 pyr4 마커의 제거는 5-FOA의 존재 하에서 2개의 상동 부위 (5'UTR의 직접 반복) 간의 재조합에 의해 강제되어 상기 선택 마커의 루핑 아웃을 초래하고 연속적인 라운드의 유전자 결실에서 동일한 블라스터 카세트 (pyr4 루프아웃)의 이용을 가능하게 한다. 루핑 아웃 후, 상기 유전자 자리에는 오직 5'UTR의 310 bp 서열만이 남는다.
따라서, pyr4 선택 마커 및 5' 직접 반복 (DR) 단편 (pyr4 5'UTR의 310 bp)는 T. 리세이 pyr4의 게놈 카피를 포함하는 플라스미드를 템플레이트로 이용한 PCR로 생산하였다. 양 단편들은 효모에서 상동 재조합을 이용하는 루프아웃 카세트로 플라스미드를 클로닝하는데 필요한 40 bp 중첩 서열을 포함하였다 (하기 참고). 가능한 추가적인 클로닝 단계들을 가능하게 하기 위해, AscI 절단 위치를 pyr4 마커와 5' 직접 반복 사이에 위치시키고 NotI 위치를 완전한 블라스터 카세트를 포괄하도록 위치시켰다.
pmt1 결실 플라스미드의 기본으로서 1100 bp의 5' 플랭킹 부위 및 1000 bp의 3' 플랭킹 부위를 선택하였다. 상기 플랭킹 부위 단편들은 T. 리세이 야생형 스트레인 QM6a (ATCC13631)를 템플레이트로서 이용하는 PCR로 생산하였다. 클로닝에 이용된 효모 상동 재조합 시스템을 위해 (하기 참고), 벡터 및 선택 마커를 위한 중첩 서열을 적절한 PCR-프라이머에 위치시켰다. 상기 컨스트럭트 내 마커 스위치를 가능하게 하기 위해, NotI 제한효소 위치를 플랭킹 부위와 선택 마커 사이에 도입하였다. PmeI 제한효소 위치는 T. 리세이 내로의 형질전환 전에 벡터 서열의 제거를 위해 벡터와 플랭킹 부위 사이에 위치시켰다. 벡터 백본 pRS426을 제한효소 (EcoRI 및 XhoI)로 절단하였다.
pmt1을 위한 첫 번째 결실 플라스미드 (플라스미드 pTTv36, 표 2)는 마커로서 아스페르길루스 니둘란스의 아세트아미다제를 인코딩하는 유전자인 amdS를 이용하였다. 상기 마커 카세트는 NotI으로 존재하는 플라스미드 pHHO1로부터 절단시켰다. 클로닝에 이용된 모든 단편들은 아가로오스 겔 전기영동으로 분리하였고 표준 실험실 방법을 이용한 겔 추출 키트 (Qiagen)로 상기 겔로부터 올바른 단편들을 분리하였다.
상기 첫 번째 결실 플라스미드 pTTv36을 구축하기 위해, 상기 벡터 백본 및 적절한 마커 및 플랭킹 부위 단편을 사카로미세스 세레비지에 (스트레인 H3488/FY834)에 형질전환시켰다. 효모 형질전환 프로토콜은 Colot 및 Collopy의 뉴로스포라 넉아웃 워크샵 물질 (다트머스 뉴로스포라 게놈 프로토콜 웹사이트) 및 Gietz 실험실 프로토콜 (University of Manitoba, Gietz laboratory website)에 기재된 상동 효모 재조합을 위한 방법에 기반하였다. 상기 효모 형질전환체로부터 얻어진 플라스미드 DNA는 대장균(Escherichia coli) 내로 형질전환시켜 얻었다. 적은 클론을 배양하였고, 플라스미드 DNA를 분리하고 절단하여 표준 실험실 방법을 이용하여 올바른 재조합에 대해 스크리닝하였다. 올바른 인서트(insert) 크기를 가진 약간의 클론을 시퀀싱하고 저장하였다.
두 번째 pmt1 결실 플라스미드 (플라스미드 pTTv124, 표 2)를 클로닝하기 위해, 상기 amdS 마커를 상기 결실 플라스미드 pTTv36으로부터 NotI 절단으로 제거하였고 amdS 선택 마커 유전자를 포함하는 amdS 루프아웃 카세트 후에 AscI 제한효소 위치 및 amdS 5'UTR의 300 bp 직접 반복이 뒤따르는 상기 블라스터 카세트의 다른 변이형으로 대체하였다. 상기 amdS 블라스터 카세트는 pyr4 블라스터 카세트와 유사한 방식으로 기능한다. 상기 amdS 블라스터 카세트를 포함하는 클론은 유일한 질소원인 아세트아미드 하에서 성장할 수 있다. 5-플루오로아세트아미드 (5-FAA)를 포함하는 배지 상에서, 기능성 amdS 유전자는 5-FAA를 독성 플루오로아세테이트로 전환시킬 것이고, 이에 따라, 5-FAA의 존재 하에서 amdS 유전자의 제거는 상기 곰팡이에게 유익하다. amdS 블라스터 카세트의 제거는 pyr4 블라스터 카세트에서처럼 카세트 내 300 bp DRs를 통해 증진되는데, 이는 amdS 유전자를 상기 2개의 DRs 간의 단일 크로스오버를 통한 루프 아웃시킬 수 있다. 결과적인 클론들은 5-FAA에 대해 내성이고 유일한 질소원인 아세트아미드 상에서 성장할 수 없다.
상기 amdS 블라스터 카세트를 위해 요구되는 단편들은 템플레이트로서 상기 amdS 유전자의 게놈 카피를 포함하는 플라스미드 p3SR2를 이용한 PCR로 생산하였다 (Hynes M.J. 등, 1983, Mol. Cell. Biol. 3:1430-1439). 클로닝에 이용된 효모 상동 재조합 시스템 (상기 참고)을 위해, 중첩 서열이 적절한 PCR-프라이머에 위치시켰다. 상기 컨스트럭트 내 마커 스위치를 가능하게 하기 위해, NotI 제한효소 위치를 플랭킹 부위와 블라스터 카세트 사이에 유지하였다. 추가적인 제한효소 위치 FseI 및 AsiSI 제한효소 위치를 amdS의 5' 말단에 도입하였고 AscI 위치를 amdS 및 amdS 5'DR 사이에 도입하였다. 상기 플라스미드 pTTv124는 상기 기재된 효모 재조합 시스템을 이용하여 구축하였다. 상기 효모 형질전환체로부터 얻어진 플라스미드 DNA는 대장균 내로 형질전환시켜 얻었다. 적은 클론을 배양하였고, 플라스미드 DNA를 분리하고 절단하여 표준 실험실 방법을 이용하여 올바른 재조합에 대해 스크리닝하였다. 올바른 인서트 크기를 가진 약간의 클론을 시퀀싱하고 저장하였다.
세 번째 pmt1 결실 플라스미드 (pTTv185, 표 2)를 클로닝하기 위해, 상기 amdS 마커를 상기 결실 플라스미드 pTTv36으로부터 NotI 절단으로 제거하였고 상기 기재된 pyr4 블라스터 카세트로 대체하였다. 상기 pyr4 블라스터 카세트는 NotI 절단된 다른 플라스미드로부터 얻었고, 표준 실험실 방법을 이용하여 NotI 절단된 pTTv36을 라이게이션하고 대장균에 형질전환시켰다. 표준 실험실 방법을 이용하여 적은 형질전환체를 배양하여 플라스미드 DNA를 분리하였으며 절단하여 pyr4 블라스터 카세트의 올바른 라이게이션 및 방향을 확인하였다. 올바른 인서트 크기 및 방향을 가진 하나의 클론을 시퀀싱하고 저장하였다.
pmt1에 대한 이들 결실 플라스미드 (pTTv36, pTTv124 및 pTTv185)는 pmt1 유전자 자리에 2465 bp 결실을 초래하였고 PMT1의 완전한 코딩 서열을 포괄한다.
표 2. 단백질 O-
만노실트랜스퍼라제
1 (
pmt1
,
TreID75421
)에 대한 결실 플라스미드
pTTv36
,
pTTv124
및
pTTv185
를 제조하기 위한
프라이머
pmtl
결실 스트레인
M403
,
M404
,
M406
및
M407
의 제조
플라스미드 pTTv185를 이용하여 pmt1의 결실에 적합한 pyr4 음성 타겟 스트레인을 제조하기 위해, MAB01 항체 생산 스트레인 M304를 손상된 pyr4 유전자를 포함하는 스트레인들에 대해 선택하기 위해 5-FOA (fluoro-orotic acid)의 존재 하에서의 선택에 종속시켰다. 상기 스트레인 M304의 제조는 국제특허출원번호 PCT/EP2013/05012에 기재되어 있다. T. 리세이 스트레인 M304는 NVISKR Kex2 절단 서열과 함께 T. 리세이 절단된 CBH1 운반체에 융합된 MAB01 경쇄, AXE1 [DGETVVKR] Kex2 절단 서열과 함께 T. 리세이 절단된 CBH1 운반체에 융합된 MAB01 중쇄, Δ pep1 Δ tsp1 Δ slp1을 포함하며 T. 리세이 KEX2를 과다발현한다.
M304의 포자는 20 g/l 글루코오스, 2 g/l 프로테오스 펩톤, 5 mM 우리딘 및 1.5 g/l 5-FOA, pH 4.8을 포함하는 최소 배지 플레이트에 분주하였다. 몇몇 5-FOA 내성 콜로니를 5-7일 후에 1 ml/l 트리톤 X-100 보충된 상기 기재된 플레이트 상에 스트리킹하였다. 적은 콜로니가 연속적인 정제 플레이팅을 통해 단일 세포 콜로니로 추가적으로 정제되었다: 균사체(mycelia)의 작은 양을 0.8% NaCI - 0.025% Tween 20 - 20% 글리세롤에 픽킹하고 볼텍싱으로 세세히 현탁시키고 면-충진된 파이펫 팁을 통해 여과시켰다. 정제된 콜로니를 39 g/l 감자 덱스트로오스 아가로오스를 포함하는 플레이트에서 포자 형성시켰다. 5 mM 우리딘 보충되거나 없는 최소 배지 플레이트 (20 g/l 글루코오스, 1 ml/l 트리톤 X-100, pH 4.8)에 포자를 플레이팅하여 이들 콜로니들의 우리딘 영양 요구성에 대해 테스트하였다. 우리딘이 없는 플레이트에서 어떠한 성장도 관찰되지 않았는데 이는 상기 선택된 클론이 잠재적인 pyr4-였다는 것을 의미한다. 클론을 이후 이용을 위해 저장하였고 이중 하나를 스트레인 번호 M317로 지정하였다.
상기 기재된 플라스미드 pTTv185로부터 유래된 pmt1 결실 카세트를 이용하여 pmt1을 M317 (스트레인 M304의 pyr4 - )로부터 결실시켰다. 상기 벡터 서열을 제거하기 위해, 플라스미드 pTTv185 (Δ pmt1 - pyr4)를 PmeI + XbaI로 절단하고 올바른 단편을 QIAquick 겔 추출 키트 (Qiagen)를 이용하여 아가로오스 겔로부터 정제하였다. 약 5 μg의 상기 pmt1 결실 카세트를 이용하여 스트레인 M317을 형질전환하였다. 원형질체의 제조 및 pyr4 선택을 위한 형질전환은 실질적으로 Penttila 등 (1987, Gene 61:155-164) 및 Gruber 등 (1990, Curr . Genet . 18:71-76)에 기재된 방법에 따라 실시하였다.
100개의 콜로니들을 선택적인 스트리킹으로서 픽킹하였다. 표준 실험실 방법을 이용하여 상기 결실 카세트의 올바른 통합을 위한 표 3 내 프라이머를 이용한 PCR에 의해 40개의 형질전환체들을 스크리닝하였다. 12개의 잠재적인 결실 클론들을 단일 세포 클론으로 정제하였다. 정제된 클론들을 통합 및 표 5의 프라이머를 이용한 pmt1 ORF 결실에 대해 다시 스크리닝하였다. 4개의 클론들 (이중으로)이 순수한 파괴체(disruptants) (즉, ORF 프라이머에서 어떠한 시그널도 없음)였다.
표 3.
M317
로부터 결실 카세트
pTTv185
의 통합에 대한 스크리닝 및 단백질 O-
만노실트랜스퍼라제
1 (
pmt1
,
TreID75421
)의 결실을 위한
프라이머
.
pmt1의 결실은 서던 분석으로 확인하였다. 서던 분석을 위한 DNA는 실질적으로 제조자의 설명서에 따라 게놈 DNA 분리 (Invitrogen)를 위한 Easy-DNA 키트로 추출하였다.
서던 분석은 기본적으로 방사성 표지 (32P-dCTP) 및 DecaLabel 플러스 키트 (Fermentas)를 이용하여 Sambrook 등 (1989, Molecular Cloning: A laboratory manual. 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press)에 기재된 상동 혼성화를 위한 프로토콜에 따라 실시하였다. 서던 절단 계획은 Geneious Pro 소프트웨어 (Geneious 웹사이트)를 이용하여 고안하였다. 프로브를 위한 단편들은 T. 리세이 야생형 스트레인 QM6a (ATCC13631)를 템플레이트로 이용하여 표 4에 나열된 프라이머를 이용한 PCR로 생산하였다. PCR 산물을 아가로오스 겔 전기영동으로 분리하고 올바른 단편을 표준 실험실 방법을 이용하여 상기 겔로부터 겔 추출 키트 (Qiagen)로 분리하였다.
표 4. 단백질 O-
만노실트랜스퍼라제
1 (
pmt1
,
TreID75421
) 결실 스트레인의 서던 분석에 이용된
프로브
단편의 생산용
프라이머
.
어떠한 클론들도 pmt1 ORF 프로브와 혼성화하지 않았는데 (도 1A), 이는 pmt1의 성공적인 결실을 나타낸다. 5' 및 3' 플랭크 프로브를 이용한 분석은 4개의 클론이 단일 통합체(integrants)였다는 것을 보여줬다 (도 1B 및 1C; 26-8A 및 B, 26-21A 및 B). 4개의 클론들은 추가적인 시그널을 나타냈고 이에 따라 상기 결실 카세트의 복수 통합을 나타냈다. 4개의 순수한 클론 (상기 결실 카세트의 추가적인 카피를 가지거나 없거나)은 이후 이용을 위해 저장하였다 (M403 ; 26-8A, M404 ; 26-19A, M406 ; 26-16B 및 M407 ; 26-19B).
실시예
2 Δ
pmtl
스트레인
M403
,
M404
,
M406
및
M407
의 분석
T. 리세이 M304 및 8개의 pmt1 결실 스트레인 (26-8A (M403), 26-8B, 26-16A, 26-16B (M406), 26-19A (M404), 26-19B (M407), 26-21A, 26-21B)의 쉐이크 플라스크 배양을 40 g/l 락토오스, 20 g/l 스펜트 그레인 추출물, 100 mM PIPPS, 9 g/l 카사미노산, pH 5.5를 포함하는 트리코데르마 최소 배지에서 200 rpm으로 +28℃에서 실시하였다. 시료를 진공 여과로 3일, 5일, 7일 및 10일째에 수거하였다. 상층액 시료를 -20℃에 저장하거나 (항체 및 글리칸 분석) 또는 pH 결정에 사용하였다. 세포 건조 중량 결정을 위해 균사체를 DDIW로 한번 씻은 후 20-24시간 동안 +100℃에서 건조시켰다. 게놈 DNA 추출을 위해 균사체를 DDIW로 한번 씻은 후 -20℃에서 저장하였다.
O-만노실화 상태 분석은 T. 리세이 M304 및 8개의 pmt1 파괴체 (pTTv185: 26-8A, 26-8B, 26-16A, 26-16B, 26-19A, 26-19B, 26-21A, 26-21B)의 쉐이크 플라스크 배양물로 실시하였다. 모두 TrMM - 40 g/l 락토오스 - 20 g/l SGE - 100 mM PIPPS - 9 g/l 카사미노산, pH 5.5에서 +28℃에서 실시하고 시료는 시간 점 3일, 5일, 7일 및 10일째에 취했다.
제조자의 설명서에 따라 단백질 G HP 멀티트랩 96-웰 플레이트 (GE Healthcare)를 이용하여 상층액으로부터 7일째 각 시료로부터 MAB01 항체를 정제하였다. 상기 항체를 0.1 M 시트레이트 완충액, pH 2.6으로 용출하며 2 M Tris, pH 9로 중화시켰다. 상기 농도는 MAB01 표준 곡선에 대한 분광 광도계에서 UV 흡광도에 따라 결정하였다. O-만노실화 분석을 위해, 10 μg의 단백질을 6 M 구아니디니움 HCl에서 30분 동안 +60℃에서 반응시킨 후 5 μl의 신선한 0.1 M DTT를 첨가하고 상기와 같이 다시 반응시켰다. 상기 시료를 Poros R1 96-웰 플레이트를 이용하여 정제하였으며 결과적인 경쇄를 MALDI-TOF MS로 분석하였다. 모든 시료는 이중으로(duplicates) 제조하였다.
플라스크 배양에서 pmt1 파괴체 내 O-만노실화 상태는 현저하게 변화하였다: 모든 Δ pmt1 파괴체는 동일하게 보였다 - MAB01 LC 내 O-만노실화의 거의 완전한 상실 (도 2: 플라스크 배양된 부모 T. 리세이 스트레인 M317 (M304의 pyr4- (A) 및 Δpmt1 파괴체 클론 26-8A (B)의 경쇄 스펙트럼, 7일).
Δ
pmt1
스트레인
M403
의 발효
Δ pmt1 스트레인 M403 (클론 26-8A; M317 내 pTTv185)으로 발효를 실시하였다. 발효 배양 배지는 30 g/l 글루코오스, 60 g/l 락토오스, 60 g/l 전체 스펜트 그레인, pH 5.5를 포함하였다. 락토오스 피드(feed)는 글루코오스 소진 후 시작하였다. 성장 온도는 글루코오스 소진 후 +28℃부터 +22℃로 쉬프트하였다. 시료는 진공 여과로 수득하였다. 상층액 시료를 -20℃에 저장하였다.
상층액 시료들의 웨스턴 분석이 도 3에 보여진다. MAB01 중쇄 및 경쇄가 3일 후에 상층액으로부터 검출되었다. 링커의 O-만노실화를 감소시키고 KEX2 절단에도 도움을 줄 수 있는 pmt1의 결실에도 불구하고, 상당한 양의 경쇄가 발효의 초기 날들에 운반체에 부착된 채로 남아 있다. 더 이후의 단계에서, 상기 절단이 더 완전하지만 생산량(yield)은 중쇄의 분해에 의해 영향받을 수 있다. 항체 역가에 대한 결과 (하기 표 7)는 7일 내지 10일 사이에 거의 지속적인 발현을 나타낸다. 이러한 발효에서 상기 pmt1 결실 스트레인은 부모 스트레인처럼 거의 동일한 항체 레벨을 생산하였다. 상기 동일한 스트레인이 다른 발효기를 이용하여 발효되었을 때 좀더 높은 역가를 얻었다.
M403 (클론 26-8A)를 TrMM, 30 g/l 글루코오스, 60 g/l 락토오스, 60 g/l 스펜트 그레인, pH 5.5 하에서 락토오스 피드와 함께 발효기에서 배양시켰다. 시료를 2일, 3일 및 5-11일째에 수거하였다. O-만노실화 레벨 분석은 플라스크 배양에 따라 실시하였다. 상기 O-만노실화 상태는 발효기 배양에서도 크게 감소하였다 (도 4, 표 5).
면적 및 강도의 평균값으로부터 O-만노실화 레벨을 계산하였다 (표 5). 면적 (표 6)은 강도 (표 7)보다 비-O-글리코실화된 LC의 보다 일반적인 더 높은 비율을 가지는 것처럼 보인다. 모든 시간 점에서 O-만노실화 레벨은 5% 미만이었다.
표 6. 발효기 배양으로부터 T. 리세이 스트레인 M403 (MAB01 항체 생산 스트레인의 pmt1 결실 스트레인, 클론 26-8A)의 O-만노실화 상태.
백분율은 단일 전하된 시그널의 면적 및 강도로부터 산출하였다. 시간점 9일째에 양 시료 모두 LC에 대해 100%를 제공하고 실질적으로 없는 LC+Hex1을 제공하였다.
표 6. 7일째에 발효기 배양된 M403으로부터 3개의 병행 시료의 면적 값의 백분율.
표 7. 7일째에 발효기 배양된 M403으로부터 3개의 병행 시료의 강도 값의 백분율.
스트레인 성장 특징 및 분비능의 어떠한 음적 효과도 관찰되지 않았다. 상기 스트레인 403은 잘 성장하였고 발효기 배양 내 시간에 따라 항체의 증가된 양을 생산하였다. 가장 우수한 역가는 10일째에 얻었다 (표 8). 11일째에 역가는 감소하였다.
표 8. 발효기 배양된 MAB01 생산 스트레인 M403으로부터의 역가. 단백질 G 96-웰 플레이트를 이용하여 상기 항체를 정제하였다.
pmt1의 결실은 MAB01 O-만노실화를 현저하게 감소시켰다; O-만노실화된 LC의 양은 쉐이크 플라스크 배양에서 부모 스트레인에서 약 61%였고, 가장 좋은 Δp m t1 클론에서 3%였으며, 시간 점 9일째 발효기 배양에서 실질적으로 0%였다.
Fab
발현 트리코데르마
리세이
스트레인에서
pmt1
의 결실
상기 pmt1 파괴 카세트 (pmt1 amdS)는 제한효소 절단에 의해 상기 기재된 백본 벡터 pTTv124로부터 방출되고 겔 추출을 통해 정제하였다. 원형질체 형질전환을 이용하여 상기 결실 카세트는 T. 리세이 스트레인 M304 (MAB01을 발현하는 3-배 프로테아제 결실 스트레인) 및 M307 (Fab를 발현하도록 형질전환되었던 PCT/EP2013/050126에도 기재되었던 4-배 프로테아제 결실 스트레인 Δpepl Δtspl Δslpl Δgapl)로 도입하였다. 형질전환체를 아세트아미다제 선택적 배지 (유일한 탄소원으로 아세트아미드를 포함하는 최소 배지)에 플레이팅하였다.
상기 pmt1 유전자 자리로 아세트아미다제 마커의 상동 통합에 대해 상기 컨스트럭트의 5' 플랭킹 부위 단편 외부의 정방향 프라이머 및 AmdS 선택 마커 내부의 역방향 프라이머 (5' 통합) 뿐 아니라 AmdS 선택 마커 내부의 정방향 프라이머 및 3' 플랭킹 부위 단편 외부의 역방향 프라이머 (3' 통합)을 이용하는 PCR에 의해 형질전환체를 스크리닝하였다. 상기 pmt1 유전자 자리로 상기 컨스트럭트의 올바른 통합을 보여주는 PCR 결과를 가졌던 각 형질전환 (MAB01 및 Fab 발현 스트레인)의 3개의 독립적인 형질전환체를 단일 포자 정제로 선택하여 단핵 클론을 얻었다. 상기 파괴 카세트의 적절한 통합을 상기 기재된 동일한 프라이머 조합을 이용한 PCR로 재확인하고 pmt1 개방 판독 프레임에 타겟팅된 프라이머 조합을 이용한 PCR에 의해 pmt1 유전자의 부존재를 확인하였다. 상기 파괴 카세트의 올바른 통합을 서던 혼성화를 적용시켜 모든 클론들에 대해 추가적으로 확인하였다. 상기 3개의 클론 뿐 아니라 부모 스트레인의 절단된 게놈 DNA를 상기 pmt1 유전자의 5' 및 3' 플랭크로 프로빙하여 예측된 대로 pmt1 유전자 자리의 변형을 확인하였다. 더 나아가, 상기 블랏팅된 DNA를 pmt1 개방 판독 프레임에 특이적인 프로브와 혼성화시켜 pmt1의 부존재를 입증하였다.
O-
만노실화
분석을 위한
MAB01
및
Fab
발현
mAB 및 Fab 분자의 O-만노실화 레벨 상에 pmt1 결실의 충격을 평가하기 위해, 스트레인들을 7일 동안 비연속 발효(batch fermentations)로 2% 효모 추출물, 4% 셀룰로오스, 4% 셀로비오스, 2% 소르보스, 5g/L KH2P04, 및 5g/L (NH4)2S04를 포함하는 배지에서 배양하였다. 배양 pH는 pH 5.5 (NH40H로 적정됨)에서 조절하였다. 시작 온도는 30℃였고, 48시간 후에 22℃로 쉬프트되었다. mAb 발효 (스트레인 M304, M403, M406 및 M407)는 1 L의 배양 부피를 가지는 4 패러렐 2L 글라스 반응 용기(4 parallel 2L glas reactor vessels) (DASGIP)에서 실시하였으며 Fab 발효 (TR090#5)는 6L의 배양 부피를 가지는 15L 강철 탱크 반응기 (Infors)에서 실행하였다. Fab 스트레인 (TR090#5, TR090#3, TR090#17)는 28℃에서 4일 동안 쉐이크 플라스트에서 추가적으로 배양시켰다. 주요 배지 구성성분은 1% 효모 추출물, 2% 셀로비오스, 1% 소르보스, 15g/L KH2P04 및 5g/L (NH4)2S04였고 pH는 조절되었다 (pH는 배양의 시간 경과 동안 5.5부터 <3로 떨어짐). 배양 상층액 시료를 실행 과정 동안 취했고 -20℃에 저장하였다. 시료를 이들 배양의 전체 과정으로부터 매일 수득하였으며, 생산 레벨을 친화도 액체 크로마토그래피로 분석하였다. 최대 생산 레벨을 가진 시료를 정제 및 추가적인 O-만노실화 분석에 이용하였다.
Fab
및
mAb
상의 O-
만노실화의
분석
pmt1 결실 스트레인 및 부모 스트레인 모두로부터 발현되는 mAb 및 Fab 분자 상의 O-만노실화를 분석하였다. 제조자의 프로토콜에 기재된 조건을 적용하여 각각 람다 Select Sure 및 CaptureSelect Fab 람다 (BAC) 친화도 크로마토그래프 레진을 이용하여 mAb 및 Fab를 정제하였다. 정제된 mAb 및 Fab를 포함하는 정제된 분자들 모두를 온전한 시료 및/또는 환원된/알킬화된 시료 중 어느 하나로서 RP-LC-QTOF-MS에 적용하였다.
순수 분석을 위해, 20 μg 단백질의 균등물을 컬럼에 주입하였다. mAb의 환원된/알킬화된 분석을 위해, LC-MS 분석 전에 100 μg 단백질의 균등물을 PNGase-F 효소를 이용하여 탈글리코실화시키고, DTT를 이용하여 환원시켰으며 이오도아세트아미드를 이용하여 알킬화시켰다. Fab의 환원된/알킬화된 분석을 위해, LC-MS 분석 전에 100 μg 단백질의 균등물을 DTT로 환원시키고 이오도아세트아미드를 이용하여 알킬화시켰다. 상기 환원된/알킬화된 시료 6 μg을 컬럼에 주입하였다. 5 μm 입자로 패킹된, 300 Å 동공 크기의 2.1 x 150 mm Zorbax C3 컬럼에서 역-상 크로마토그래피 분석을 실시하였고, 용출액은: 용출액 A, 물에 녹여진 0.1% TFA 및 용출액 B, 70% IPA, 20% ACN, 10% 물에 녹여진 0.1% TFA. 상기 컬럼을 75℃로 가열하고 흐름 속도(flo rate)는 200 μl/분이었다. 상기 시료 분리에 이용된 구배는 표 9에 보여진다.
표 9. 순수 시료 및 환원된/알킬화된 시료에 이용된
HPLC
구배
HPLC는 Q-TOF 울티마 질량분석기 (Waters, Manchester, UK)와 직접 커플링되었다. ESI-TOF 질량분석기는 양이온 모드에서 실행하도록 설정되었다. 순수 및 환원된/알킬화된 분석의 데이터 평가는 MassLynx 분석 소프트웨어 (Waters, Manchester, UK)를 이용하여 실시하였다. 주요 UV 시그널로부터 유래되는 평균적인 질량 스펙트럼의 디콘볼루션(deconvolution)은 MassLynx 분석 소프트웨어 (Waters, Manchester, UK)의 일부인 MaxEnt 알고리즘을 이용하여 실시하였다. 디콘볼루션 파라al터는 다음과 같았다: "반복의 최대 수(max numbers of iterations)" 는 8이다; 해상도는 0.1 Da/채널이다; 균일한 가우시안(uniform Gaussian) - 반폭치는 순수 시료에 대해 1 Da이며 감소된 사슬에 대해서는 0.5 Da이고 최소 강도 비는 좌측 30% 및 오른쪽 30%이다. O-만노실화의 평가된 레벨 (%)은 디콘볼루션 후 피크 시그널 높이를 이용하여 결정하였다. 독립적인 pmt1 결실 스트레인으로부터 유래된 mAbs 및 Fabs의 관찰된 O-만노실화 레벨 (%)은 표 10 및 표 11 내 각각의 부모 야생형 스트레인들 중 하나와 비교한다.
표 10: 다른 스트레인으로부터
Fabs
의 O-
만노실화
레벨 [%]
표 11: 다른
pmt1
결핍 스트레인
M403
,
M406
및
M407
로부터 얻어진
MAB01
의 O-만노실화 레벨 [%]. 부모 스트레인은
M304
이다
O-만노실화 레벨은 부모 스트레인으로부터 유래된 순수 Fab 상에 70%로 보여졌고 3개의 pmt1 결실 스트레인 모두에서 ~34%로 감소되었다. 만노오스의 이동은 43%부터 ~26%까지 감소되는 중쇄와 비교하여, Fab 경쇄에서 보다 효과적으로 감소하였다 (pmt1 결실 스트레인으로부터 얻어진 경쇄 상의 잔류 O-만노실화 10% 대비 부모 스트레인의 경우 59%).
O-만노실화 레벨은 부모 스트레인으로부터 유래된 mAb의 경쇄 상에 50%로 보여졌고 3개의 pmt1 결실 스트레인 모두에서 5.7-5.8%로 감소하였다. O-만노실화 레벨은 레벨은 부모 스트레인으로부터 유래된 mAb의 중쇄 상에 4.8%로 보여졌고 3개의 pmt1 결실 스트레인 모두에서 완전히 감소하였다 (LC-MS에 의한 검출 한계 미만).
결론적으로, pmt1의 결실 후 거의 95%의 정제된 mAb 및 70%의 Fab 분자는 더이상 O-만노오스 잔기를 포함하지 않았다. 따라서, pmt1은 분비된 단백질의 O-만노실화를 감소시키고 트리코데르마 리세이에 의해 생산되는 바이오의약품의 산물 특질을 개서시키는 귀중한 타겟이다.
실시예
3: 트리코데르마
리세이
스트레인 내
pmt2
결실
pmt2
결실 플라스미드의 제조
3개의 다른 결실 플라스미드 (pTTv34, pTTv122, pTTv186)는 단백질 O-만노실트랜스퍼라제 유전자 pmt2 (TrelD22005)의 결실을 위해 구축하였다. 모든 플라스미드는 pmt2 유전자 자리로의 올바른 통합을 위해 동일한 5' 및 3' 플랭킹 부위를 포함한다. 상기 3개의 플라스미드들 간의 차이는 선택에 이용되는 마커이다: pTTv34는 아스페르길루스 니둘란스의 아세트아미다제를 인코딩하는 유전자 (amdS)를 포함하고, pTTv122는 amdS 마커의 루프아웃 형태 (블라스터 카세트)를 포함하며 pTTv186은 T. 리세이의 오로티딘-5'-모노포스페이트 (OMP) 데카르복실라제를 인코딩하는 유전자 (pyr4)의 루프아웃 형태 (블라스터 카세트)를 포함한다.
두 번째 단백질 O-만노실트랜스퍼라제 유전자 pmt2 (TrelD22005) 결실 플라스미드의 기본으로서 1100 bp의 5' 플랭킹 부위 및 1000 bp의 3' 플랭킹 부위를 선택하였다. 이러한 유전자에 대한 첫 번째 플라스미드의 구축은 기본적으로 실시예 1 내 pmt1을 위해 기재된 대로 실시하였다. pmt1처럼, pmt2에 대한 상기 첫 번째 결실 플라스미드 (플라스미드 pTTv34, 표 12)는 선택 마커로서 아스페르길루스 니둘란스의 아세트아미다제를 인코딩하는 유전자인 amdS를 이용하였다.
실시예 1의 pmt1에서처럼, 두 번째 결실 플라스미드, pTTv122 (표 12)를 클로닝하기 위해, 상기 amdS 마커를 상기 결실 플라스미드 pTTv34를 NotI 절단으로 제거하였고 단편들이 PCR로 생산되는 amdS 블라스터 카세트로 대체하였다 (상세히는 상기 실시예 1을 참고하라). 상기 플라스미드 pTTv122는 실시예 1에 기재된 효모 재조합 시스템을 이용하여 구축하였다. 상기 효모 형질전환체로부터 얻어진 플라스미드 DNA는 대장균 내로 형질전환시켜 얻었다. 적은 클론을 배양하였고, 플라스미드 DNA를 분리하고 절단하여 표준 실험실 방법을 이용하여 올바른 재조합에 대해 스크리닝하였다. 올바른 인서트 크기를 가진 약간의 클론을 시퀀싱하고 저장하였다.
pmt2를 위한 세 번째 결실 플라스미드, pTTv186 (표 12)은 상기 pmt1을 위한 세 번째 결실 플라스미드처럼 클로닝하였다; 상기 amdS 블라스터 카세트를 상기 결실 플라스미드 pTTv122으로부터 NotI 절단으로 제거하였고 실시예 1에 기재된 pyr4 블라스터 카세트로 대체하였다. 상기 pyr4 블라스터 카세트는 NotI 절단된 다른 플라스미드로부터 얻었고, 표준 실험실 방법을 이용하여 NotI 절단된 pTTv122를 라이게이션하고 대장균에 형질전환시켰다. 표준 실험실 방법을 이용하여 적은 형질전환체를 배양하여 플라스미드 DNA를 분리하였으며 절단하여 pyr4 블라스터 카세트의 올바른 라이게이션 및 방향을 확인하였다. pmt2에 대한 이들 결실 플라스미드 (pTTv34, pTTv122 및 pTTv186, 표 12)는 pmt2 유전자 자리에 3186 bp 결실을 초래하고 PMT2의 완전한 코딩 서열을 포괄한다.
표 12. 단백질 O-
만노실트랜스퍼라제
2 (
pmt2
,
TreID22005
)에 대한 결실 플라스미드
pTTv34
,
pTTv122
및
pTTv186
을 제조하기 위한
프라이머
pmt2
결실 스트레인
M338
,
M339
및
M340
의 제조
벡터 서열을 제거하기 위해, 플라스미드 pTTv122 (Δ pmt2 - amdS)를 PmeI + XbaI로 절단하고 5.2 kb 단편을 QIAquick 겔 추출 키트 (Qiagen)를 이용하여 아가로오스 겔로부터 정제하였다. 약 5 μg의 상기 pmt2 결실 카세트를 이용하여 스트레인 M124를 형질전환하였다 (M124 스트레인은 WO2012/069593에 기재되어 있다). 원형질체의 제조 및 형질전환은 실질적으로 amdS 선택을 위해 Penttila 등, 1987, Gene 61:155-164 및 Gruber 등, 1990, Current Genetics 18:71-76에 따라 실시하였다.
120개의 콜로니들을 선택적인 스트리킹으로서 픽킹하였다. 표준 실험실 방법을 이용하여 상기 결실 카세트의 올바른 통합을 위한 표 13 내 프라이머를 이용한 PCR에 의해 10개의 형질전환체들을 스크리닝하였다. 5개의 잠재적인 결실 클론들을 단일 세포 클론으로 정제하였다. 정제된 클론들 (각각 2개의 병행)을 올바른 통합 및 pmt1 ORF 결실 (표 13의 프라이머)에 대해 다시 스크리닝하였다. 5개의 클론들을 서던 분석을 위해 선택하였다.
표 13.
M124
로부터 결실 카세트
pTTv122
의 통합에 대한 스크리닝 및 단백질 O-만노실트랜스퍼라제 2 (
pmt2
,
TreID22005
)의 결실을 위한
프라이머
.
pmt2의 결실은 서던 분석으로 확인하였다. 서던 분석을 위한 DNA는 실질적으로 제조자의 설명서에 따라 게놈 DNA 분리 (Invitrogen)를 위한 Easy-DNA 키트로 추출하였다.
서던 분석은 기본적으로 실시예 1에 기재된 대로 실시하였다. 프로브를 위한 단편들은 ORF 프로브를 위한 템플레이트로 T. 리세이 야생형 스트레인 M124 및 5' 및 3' 플랭크 프로브를 위한 플라스미드 pTTv122를 이용하여 표 14에 나열된 프라이머를 이용한 PCR로 생산하였다. PCR 산물을 아가로오스 겔 전기영동으로 분리하고 올바른 단편을 표준 실험실 방법을 이용하여 상기 겔로부터 겔 추출 키트 (Qiagen)로 분리하였다.
표 14. 단백질 O-
만노실트랜스퍼라제
2 (
pmt2
,
TreID22005
) 결실 스트레인의 서던 분석에 이용된
프로브
단편의 생산용
프라이머
.
3개의 클론들은 pmt2 ORF 프로브와 혼성화하지 않았는데 (데이터를 보이지 않음), 이는 pmt2의 성공적인 결실을 나타낸다. 5' 및 3' 플랭크 프로브를 이용한 분석은 동일한 3개의 클론이 단일 통합체였다는 것을 보여줬다 (데이터를 보이지 않음). 2개의 다른 클론들 (19-35A 및 19-40B)은 부모 스트레인 M124에 상응하는 시그널을 나타냈다. 3개의 순수 클론들은 이후 이용을 위해 저장하였다 (M338; 19-7B, M339; 19-22B 및 M340; 19-39B).
Δ
pmt2
스트레인
M338
,
M339
및
M340
의 분석
T. 리세이 M124 및 상기 pmt2 결실 스트레인 (19-7B/M338, 19-22B/M339 및 19-39B/M340)의 쉐이크 플라스크 배양을 삼투 안정화제로서 1 M 소르비톨을 가지거나 가지지 않는 40 g/l 락토오스, 20 g/l 스펜트 그레인 추출물, 100 mM PIPPS, pH 5.5를 포함하는 트리코데르마 최소 배지에서 200 rpm으로 +28℃에서 실시하였다. 시료를 진공 여과로 3일, 5일 및 7일째에 수거하였다. 상층액 시료를 -20℃에 저장하거나 (항체 및 글리칸 분석) 또는 pH 결정에 사용하였다. 세포 건조 중량 결정을 위해 균사체를 DDIW로 한번 씻은 후 20-24시간 동안 +100℃에서 건조시켰다. 게놈 DNA 추출을 위해 균사체를 DDIW로 한번 씻은 후 -20℃에 저장하였다.
pmt2
결실 스트레인
M452
,
M453
및
M454
의 제조
M317의 제조는 상기 실시예 1에 기재되어 있다.
상기 벡터 서열을 제거하기 위해, 플라스미드 pTTv186 (Δ pmt2 - pyr4)를 PmeI + XbaI로 절단하고 4.1 kb의 단편을 QIAquick 겔 추출 키트 (Qiagen)를 이용하여 아가로오스 겔로부터 정제하였다. 약 5 μg의 상기 pmt2 결실 카세트를 이용하여 스트레인 M317을 형질전환하였다.
원형질체의 제조 및 형질전환은 실질적으로 pyr4 선택을 위해 Penttila 등, 1987, Gene 61:155-164 및 Gruber 등, 1990, Current Genetics 18:71-76에 따라 실시하였다.
100개의 콜로니들을 선택적인 스트리킹으로서 픽킹하였다. 표준 실험실 방법을 이용하여 상기 결실 카세트의 올바른 통합을 위한 표 15 내 프라이머를 이용한 PCR에 의해 20개의 형질전환체들을 스크리닝하였다. 9개의 잠재적인 결실 클론들을 단일 세포 클론으로 정제하였다. 정제된 클론들을 5' 통합 및 pmt2 ORF 결실 (표 14의 프라이머)에 대해 다시 스크리닝하였다. 3개의 클론들이 순수 결실체(deletants) (즉, ORF 프라이머에서 어떠한 시그널도 없음)였다.
표 15.
M317
로부터 결실 카세트
pTTv186
의 통합에 대한 스크리닝 및 단백질 O-만노실트랜스퍼라제 2 (
pmt2
,
TreID22005
)의 결실을 위한
프라이머
.
pmt2의 결실은 서던 분석으로 확인하였다. 서던 분석을 위한 DNA는 실질적으로 제조자의 설명서에 따라 게놈 DNA 분리 (Invitrogen)를 위한 Easy-DNA 키트로 추출하였다.
서던 분석은 기본적으로 실시예 1에 기재된 대로 실시하였다. 프로브를 위한 단편들은 pmt2 ORF 프로브를 위한 템플레이트로 T. 리세이 야생형 스트레인 QM6a (ATCC13631) 및 5' 및 3' 플랭크 프로브를 위한 플라스미드 pTTv186을 이용하여 표 16에 나열된 프라이머를 이용한 PCR로 생산하였다. 표준 실험실 방법을 이용하여 PCR 산물을 아가로오스 겔 전기영동으로 분리하고 상기 겔로부터 겔 추출 키트 (Qiagen)로 올바른 단편을 분리하였다.
표 16. 단백질 O-
만노실트랜스퍼라제
2 (
pmt2
,
TreID22005
) 결실 클론의 서던 분석에 이용된
프로브
단편의 생산용
프라이머
.
어떠한 클론들도 pmt2 ORF 프로브와 혼성화하지 않았는데 (데이터를 보이지 않음), 이는 pmt2의 성공적인 결실을 나타낸다. 5' 및 3' 플랭크 프로브를 이용한 분석은 상기 클론들 중 2개가 단일 통합체였다는 것을 보여줬다 (데이터를 보이지 않음). 하나의 클론들은 3'플랭크 프로빙으로부터 추가적인 시그널을 나타냈고 (데이터를 보이지 않음) 이에 따라 상기 결실 카세트의 일부 또는 복수 통합을 나타냈다. 3개의 순수한 클론 (상기 결실 카세트의 추가적인 카피를 가지거나 없거나)은 이후 이용을 위해 저장하였다 (M452; 27-1OA, M453; 27-17A 및 M454: 27-18B).
Δ
pmt2
스트레인
M452
,
M453
및
M454
의 분석
T. 리세이 M304 및 3개의 pmt2 결실 스트레인 (27-10A/M452, 27-17A/M453 및 27-18B/M454)의 쉐이크 플라스크 배양을 40 g/l 락토오스, 20 g/l 스펜트 그레인 추출물, 100 mM PIPPS, 9 g/l 카사미노산, pH 5.5를 포함하는 트리코데르마 최소 배지에서 200 rpm으로 +28℃에서 실시하였다. 시료를 진공 여과로 3일, 5일, 7일 및 10일째에 수거하였다. 상층액 시료를 -20℃에 저장하거나 (항체 및 글리칸 분석) 또는 pH 결정에 사용하였다. 세포 건조 중량 결정을 위해 균사체를 DDIW로 한번 씻은 후 20-24시간 동안 +100℃에서 건조시켰다. 게놈 DNA 추출을 위해 균사체를 DDIW로 한번 씻은 후 -20℃에 저장하였다.
O-만노실화 레벨 분석을 pmt1 결실 스트레인의 플라스크 배양에서처럼pmt2 결실 스트레인에서 실시하였다. 부모 스트레인 M304와 비교하여 O-만노실화에서 어떠한 차이도 관찰되지 않았다.
실시예
4: 트리코데르마
리세이
스트레인 내
pmt3
결실
pmt3
결실 플라스미드의 제조
3개의 다른 결실 플라스미드 (pTTv35, pTTv123, pTTv187)는 단백질 O-만노실트랜스퍼라제 유전자 pmt3 (TrelD22527)의 결실을 위해 구축하였다. 모든 플라스미드는 pmt3 유전자 자리로의 올바른 통합을 위해 동일한 5' 및 3' 플랭킹 부위를 포함한다. 상기 3개의 플라스미드들 간의 차이는 선택에 이용되는 마커이다: pTTv35는 아스페르길루스 니둘란스의 아세트아미다제를 인코딩하는 유전자 (amdS)를 포함하고, pTTv123은 amdS 마커의 루프아웃 형태 (블라스터 카세트)를 포함하며 pTTv187은 T. 리세이의 오로티딘-5'-모노포스페이트 (OMP) 데카르복실라제를 인코딩하는 유전자 (pyr4)의 루프아웃 형태 (블라스터 카세트)를 포함한다.
세 번째 단백질 O-만노실트랜스퍼라제 유전자 pmt3 (TrelD22527) 결실 플라스미드의 기본으로서 1100 bp의 5' 플랭킹 부위 및 1000 bp의 3' 플랭킹 부위를 선택하였다. 이러한 유전자에 대한 첫 번째 플라스미드의 구축은 기본적으로 실시예 1 내 pmt1을 위해 기재된 대로 실시하였다. pmt1처럼, pmt3에 대한 상기 첫 번째 결실 플라스미드 (플라스미드 pTTv35, 표 17)는 선택 마커로서 아스페르길루스 니둘란스의 아세트아미다제를 인코딩하는 유전자인 amdS를 이용하였다.
실시예 1의 pmt1에서처럼, 두 번째 결실 플라스미드, pTTv123 (표 16)을 클로닝하기 위해, 상기 amdS 마커를 상기 결실 플라스미드 pTTv35를 NotI 절단하여 제거하였고 단편들이 PCR로 생산되는 amdS 블라스터 카세트로 대체하였다 (상세히는 상기 실시예 1을 참고하라). 상기 플라스미드 pTTv123은 실시예 1에 기재된 효모 재조합 시스템을 이용하여 구축하였다. 상기 효모 형질전환체로부터 얻어진 플라스미드 DNA는 대장균 내로 형질전환시켜 얻었다. 적은 클론을 배양하였고, 플라스미드 DNA를 분리하고 절단하여 표준 실험실 방법을 이용하여 올바른 재조합에 대해 스크리닝하였다. 올바른 인서트 크기를 가진 약간의 클론을 시퀀싱하고 저장하였다.
pmt3을 위한 세 번째 결실 플라스미드, pTTv187 (표 17)은 상기 pmt1을 위한 세 번째 결실 플라스미드처럼 클로닝하였다; 상기 amdS 블라스터 카세트를 상기 결실 플라스미드 pTTv123으로부터 NotI 절단으로 제거하였고 실시예 1에 기재된 pyr4 블라스터 카세트로 대체하였다. 상기 pyr4 블라스터 카세트는 NotI 절단된 다른 플라스미드로부터 얻었고, 표준 실험실 방법을 이용하여 NotI 절단된 pTTv123에 라이게이션하고 대장균에 형질전환시켰다. 표준 실험실 방법을 이용하여 적은 형질전환체를 배양하여 플라스미드 DNA를 분리하고 절단하여 pyr4 블라스터 카세트의 올바른 라이게이션 및 방향을 확인하였다. 올바른 인서트 크기를 가진 하나의 클론을 시퀀싱하고 저장하였다. pmt3에 대한 이들 결실 플라스미드 (pTTv35, pTTv123 및 pTTv187, 표 17)는 pmt3 유전자 자리에 2495 bp 결실을 초래하고 PMT3의 완전한 코딩 서열을 포괄한다.
표 17. 단백질 O-
만노실트랜스퍼라제
3 (
pmt3
,
TreID22527
)에 대한 결실 플라스미드
pTTv35
,
pTTv123
및
pTTv187
을 제조하기 위한
프라이머
pmt3
결실 스트레인
M341
및
M342
의 제조
벡터 서열을 제거하기 위해, 플라스미드 pTTv123 (Δ pmt3 - amdS)를 PmeI + XbaI로 절단하고 5.2 kb 단편을 QIAquick 겔 추출 키트 (Qiagen)를 이용하여 아가로오스 겔로부터 정제하였다. 약 5 μg의 상기 pmt3 결실 카세트를 이용하여 스트레인 M124를 형질전환하였다. 원형질체의 제조 및 형질전환은 실질적으로 amdS 선택을 위해 Penttila 등, 1987, Gene 61:155-164 및 Gruber 등, 1990, Current Genetics 18:71-76에 따라 실시하였다.
120개의 콜로니들을 선택적인 스트리킹으로서 픽킹하였다. 표준 실험실 방법을 이용하여 상기 결실 카세트의 올바른 통합을 위한 표 18 내 프라이머를 이용한 PCR에 의해 10개의 형질전환체들을 스크리닝하였다. 3개의 잠재적인 결실 클론들을 단일 세포 클론으로 정제하였다. 정제된 클론들 (각각 3개의 병행)을 올바른 통합 및 pmt3 ORF 결실 (표 18의 프라이머)에 대해 다시 스크리닝하였다. 3개의 클론들을 서던 분석을 위해 선택하였다.
표 18.
M124
로부터 결실 카세트
pTTv123
의 통합에 대한 스크리닝 및 단백질 O-만노실트랜스퍼라제 3 (
pmt3
,
TreID22527
)의 결실을 위한
프라이머
.
pmt3의 결실은 서던 분석으로 확인하였다. 서던 분석을 위한 DNA는 실질적으로 제조자의 설명서에 따라 게놈 DNA 분리 (Invitrogen)를 위한 Easy-DNA 키트로 추출하였다.
서던 분석은 기본적으로 실시예 1에 기재된 대로 실시하였다. 프로브를 위한 단편들은 ORF 프로브를 위한 템플레이트로 T. 리세이 스트레인 M124 및 5' 및 3' 플랭크 프로브를 위한 플라스미드 pTTv123를 이용하여 표 19에 나열된 프라이머를 이용한 PCR로 생산하였다. 표준 실험실 방법을 이용하여 PCR 산물을 아가로오스 겔 전기영동으로 분리하고 상기 겔로부터 겔 추출 키트 (Qiagen)로 올바른 단편을 분리하였다.
표 19. 단백질 O-
만노실트랜스퍼라제
3 (
pmt3
,
TreID22527
) 결실 스트레인의 서던 분석에 이용된
프로브
단편의 생산용
프라이머
.
상기 클론들 중 2개는 pmt3 ORF 프로브와 혼성화하지 않았는데 (데이터를 보이지 않음), 이는 pmt3의 성공적인 결실을 나타낸다. 5' 및 3' 플랭크 프로브를 이용한 분석은 동일한 2개의 클론이 단일 통합체였다는 것을 보여줬다 (데이터를 보이지 않음). 하나의 클론 (20-32C)은 부모 스트레인 M124에 상응하는 시그널을 나타냈다. 2개의 순수 클론들은 이후 이용을 위해 저장하였다 (M341; 20-34C, 및 M342; 20-35B).
Δ
pmt3
스트레인
M341
및
M342
의 분석
T. 리세이 M124 및 상기 pmt3 결실 스트레인 (20-34C/M341 및 20-35B/M342)의 쉐이크 플라스크 배양을 삼투 안정화제로서 1 M 소르비톨을 가지거나 가지지 않는 40 g/l 락토오스, 20 g/l 스펜트 그레인 추출물, 100 mM PIPPS, pH 5.5를 포함하는 트리코데르마 최소 배지에서 200 rpm으로 +28℃에서 실시하였다. 시료를 진공 여과로 3일, 5일 및 7일째에 수거하였다. 상층액 시료를 -20℃에 저장하거나 (항체 및 글리칸 분석) 또는 pH 결정에 사용하였다. 세포 건조 중량 결정을 위해 균사체를 DDIW로 한번 씻은 후 20-24시간 동안 +100℃에서 건조시켰다. 게놈 DNA 추출을 위해 균사체를 DDIW로 한번 씻은 후 -20℃에서 저장하였다.
pmt3
결실 스트레인
M522
및
M523
의 제조
M317의 제조는 상기 실시예 1에 기재되어 있다.
상기 벡터 서열을 제거하기 위해, 플라스미드 pTTv187 (Δ pmt3 - pyr4)를 PmeI + XbaI로 절단하고 4.1 kb의 단편을 QIAquick 겔 추출 키트 (Qiagen)를 이용하여 아가로오스 겔로부터 정제하였다. 약 5 μg의 상기 pmt3 결실 카세트를 이용하여 스트레인 M317을 형질전환하였다. 원형질체의 제조 및 형질전환은 실질적으로 pyr4 선택을 위해 Penttila 등, 1987, Gene 61:155-164 및 Gruber 등, 1990, Current Genetics 18:71-76에 따라 실시하였다.
200개의 콜로니들을 선택적인 스트리킹으로서 픽킹하였다. 표준 실험실 방법을 이용하여 상기 결실 카세트의 올바른 통합을 위한 표 20 내 프라이머를 이용한 PCR에 의해 59개의 형질전환체들을 스크리닝하였다. 3개의 잠재적인 결실 클론들을 단일 세포 클론으로 정제하였다. 정제된 클론들을 올바른 통합 및 pmt3 ORF 결실 (표 19의 프라이머)에 대해 다시 스크리닝하였다. 2개의 클론들 (여러 개의 병행)이 순수 결실체 (즉, ORF 프라이머에서 어떠한 시그널도 없음)였다.
표 20.
M317
로부터 결실 카세트
pTTv187
의 통합에 대한 스크리닝 및 단백질 O-만노실트랜스퍼라제 3 (
pmt3
,
TreID22527
)의 결실을 위한
프라이머
.
pmt3의 결실은 서던 분석으로 확인하였다. 서던 분석을 위한 DNA는 실질적으로 제조자의 설명서에 따라 게놈 DNA 분리 (Invitrogen)를 위한 Easy-DNA 키트로 추출하였다.
서던 분석은 기본적으로 실시예 1에 기재된 대로 실시하였다. 프로브를 위한 단편들은 ORF 프로브를 위한 템플레이트로 T. 리세이 야생형 스트레인 QM6a (ATCC13631) 및 5' 및 3' 플랭크 프로브를 위한 플라스미드 pTTv187을 이용하여 표 21에 나열된 프라이머를 이용한 PCR로 생산하였다. 표준 실험실 방법을 이용하여 PCR 산물을 아가로오스 겔 전기영동으로 분리하고 상기 겔로부터 겔 추출 키트 (Qiagen)로 올바른 단편을 분리하였다.
표 21. 단백질 O-
만노실트랜스퍼라제
3 (
pmt3
,
TreID22527
) 결실 스트레인의 서던 분석에 이용된
프로브
단편의 생산용
프라이머
.
상기 클론들 중 8개가 pmt3 ORF 프로브와 혼성화하지 않았는데 (데이터를 보이지 않음), 이는 pmt3의 성공적인 결실을 나타낸다. 비록 시그널 크기가 부모 스트레인의 사이즈에 상응하지 않을지라도 하나의 클론 (33-37K)이 pmt3 ORF 프로브와 혼성화하였는데, 이는 pmt3 유전자 자리에서의 재배열을 의미한다. 5' 및 3' 플랭크 프로브를 이용한 분석은 8개의 Δ pmt3 클론이 단일 통합체였다는 것을 보여줬다 (데이터를 보이지 않음). 하나의 클론 (33-37K)이 추가적인 시그널을 나타냈는데 이는 pmt3 유전자 자리에서의 재배열 및 상기 결실 카세트의 복수 통합을 의미한다. 2개의 순수한 클론을 이후 이용을 위해 저장하였다 (M522; 33-34A 및 M523: 33-188A-a).
Δ
pmt3
스트레인
M522
및
M523
의 분석
T. 리세이 스트레인 M304 및 8개의 pmt3 결실 스트레인 (33-34S/M522, 33-34T, 33-34U, 33-34O, 33-188A-a/M523, 33-188B-a, 33-188C-a 및 33-188D-a)의 24-웰 플레이트 배양을 40 g/l 락토오스, 20 g/l 스펜트 그레인 추출물, 100 mM PIPPS, 9 g/l 카사미노산, pH 5.5를 포함하는 트리코데르마 최소 배지에서 습도 조절 하에서 800 rpm으로 +28℃에서 실시하였다. 시료를 원심분리로 3일, 5일 및 6일째에 수거하였다. 상층액 시료를 -20℃에 저장하였다. 세포 건조 중량 결정을 위해 균사체를 DDIW로 한번 씻은 후 20-24시간 동안 +100℃에서 건조시켰다. 게놈 DNA 추출을 위해 균사체를 DDIW로 두 번 씻은 후 -20℃에 저장하였다.
O-만노실화 레벨 분석을 pmt1 결실 스트레인의 플라스크 배양에서처럼pmt3 결실 스트레인에서 실시하였다. 부모 스트레인 M304와 비교하여 O-만노실화에서 어떠한 차이도 관찰되지 않았다.
실시예
5 -
pmt
상동체
T. 리세이 pmt 상동체를 다른 생물로부터 동정하였다.
BLAST 검색은 트리코데르마 리세이 PMT 아미노산 서열을 쿼리로 이용하여 국립생물공학정보센터(NCBI) 비-중복성 아미노산 데이터베이스에서 실시하였다. 상기 BLAST 검색으로부터 얻어진 서열 히트(sequence hits)는 EBI에 의해 제공되는 ClustalW2 정렬 수단으로 정렬하였다. 계통발생학적 트리(phylogenetic trees)는 Clustal 오메가 정렬 수단에서 상기 서열들을 정렬한 후 BLOSUM62을 이용한 평균 거리를 통해 만들었다.
상기 PMT BLAST 검색의 결과들의 계통발생학적 트리 및 일부 서열 정렬은 각각 도 5 및 도 6에 예시된다.
SEQUENCE LISTING
<110> Novartis AG
<120> O-mannosyltransferase Deficient Filamentous Fungal Cells and
Methods of Use Thereof
<130> NOVA 0006 WO
<160> 197
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2322
<212> DNA
<213> Trichoderma reesei
<400> 1
atggctcgaa gtccaacgcc gcagggcagc ctgcgacagc ggaacgttgc gtccaagcag 60
gcgcctgtcg agtcggcatt cgttcccgag gtcgagctcg acaagctctc caaggccgct 120
ctgtcgtcgc gccgaaacat ccagagaggc gagctcgagc acaagcttgc cctgacgctg 180
gtgacgatcc tcggctttgt cacgcgattc tggggcatca gccaccccga cgaggtcgtc 240
tttgacgagg tgcattttgg aaagttcgcc tcctactacc tccagcgaac ctacttcttc 300
gacgtccacc cccctttcgc caagctgctc ttcgccttcg ttggctggct ggttggctac 360
gacggtcact tccacttcga caacattggc gactcctacg tggccaacaa ggtgccctat 420
gtcgccttcc gagccttgcc cgccttcctc ggcgcattga ctgtgtcggt cacatacctc 480
atcatgtggg agtctggcta tagtgtgccg gcttgccttg tcgcgaccgg cctgatcctc 540
ctggacaatg cgcacattgg ccagacccgc ctcattctgc tcgacgccac cctggtgctc 600
gccatggcct gcagtctctt gttctacatc aagttctaca agctgcggca cgagcccttt 660
agccgcaagt ggtggaagtg gctcatcctg accggctttg cgctgtcgtg cgacatctcg 720
accaagtatg tcggtctctt tgcctttgtc accattggct ccgccgtcat cattgatctg 780
tgggatcttt tggatatcaa gcgccgctat ggagccatca gcatgccaga gtttggaaag 840
cactttgcag cccgcgcctt tggcctcatc atcttgccct tcctcttcta cctcttctgg 900
ttccaggtgc acttttccgt cctgacccga tccggtcccg gcgacgactt catgactccc 960
gagttccagg agacgttgag cgacaacgtc atgctggcaa gcgccgtcga catccagtac 1020
tacgatacca tcaccatcag gcacaaggag accaaggcgt atcttcacag ccacaccgac 1080
acctaccctc tgcgatatga cgacggccgc atctccagcc aaggccaaca ggtcaccggc 1140
tacccccaca acgacaccaa caactactgg cagatcctcc ctgccgacaa tgaccagaag 1200
ctcggccgta acgttaagaa tcaagacttg gtgcgacttc gacacattgt cacggacaag 1260
atcctgctct cccatgatgt cgcctcgccc tactacccta ccaaccagga gttcacctgt 1320
gtgacccccg aggaagcatt cggcgagcgc caaaacgaca ctctgttcga gatccggatt 1380
gagggaggca agaccggcca ggacttcaag accgttgcca gccacttcaa gctcattcac 1440
ttccccagca aggtggccat gtggactcat accacgcccc ttcccgagtg ggcctacagg 1500
cagcaggaaa tcaacggcaa caagcaaatc actcccagct ccaacgtctg gattgccgaa 1560
gacattcctt cgctcccgga agacgacgct cgccgccaca aggagcagcg caaggtcaag 1620
tcgctgccgt tcctccgcaa gtggtttgag ctgcagaggt ccatgttcta ccacaacaac 1680
aagctgacca gcagccaccc ctactccagc cagccctacc actggccatt cctcctccgc 1740
ggagtgagct tctggacgca gaatgacaca cgccagcaaa tctactttgt gggcaacccc 1800
atcggctggt ggcttgccag cagtctgctg gctgtgtttg ccggcatcat tggagctgat 1860
caggtctcgc tgcgccgagg catcgatgct ctggatcacc gcacccgctc ccgactgtac 1920
aactctaccg gcttcttctt ccttgcctgg gccacccact acttcccctt tttcctcatg 1980
ggtcgtcagc tgttcttgca tcactacttg cctgcccatt tggcgtcctg cctggtcacg 2040
ggctccctcg tcgagttcat ctttaacacg gacccggcag acgaggagcc ttcgcgatcc 2100
aaaaacccca aggctactgg tcctcggaga cacatcacgg ctcgcgagcg gtttgctggc 2160
aagagcatgg ccggtgcctg gatcgcttgc tttgtgattc tcgctgccgc cgcggctagc 2220
tggtacttct tcttgccgtt gacgtatggc taccccggac tgtctgttga ggaggttctc 2280
aggagaaagt ggcttggata tgatcttcac tttgccaagt ag 2322
<210> 2
<211> 773
<212> PRT
<213> Trichoderma reesei
<400> 2
Met Ala Arg Ser Pro Thr Pro Gln Gly Ser Leu Arg Gln Arg Asn Val
1 5 10 15
Ala Ser Lys Gln Ala Pro Val Glu Ser Ala Phe Val Pro Glu Val Glu
20 25 30
Leu Asp Lys Leu Ser Lys Ala Ala Leu Ser Ser Arg Arg Asn Ile Gln
35 40 45
Arg Gly Glu Leu Glu His Lys Leu Ala Leu Thr Leu Val Thr Ile Leu
50 55 60
Gly Phe Val Thr Arg Phe Trp Gly Ile Ser His Pro Asp Glu Val Val
65 70 75 80
Phe Asp Glu Val His Phe Gly Lys Phe Ala Ser Tyr Tyr Leu Gln Arg
85 90 95
Thr Tyr Phe Phe Asp Val His Pro Pro Phe Ala Lys Leu Leu Phe Ala
100 105 110
Phe Val Gly Trp Leu Val Gly Tyr Asp Gly His Phe His Phe Asp Asn
115 120 125
Ile Gly Asp Ser Tyr Val Ala Asn Lys Val Pro Tyr Val Ala Phe Arg
130 135 140
Ala Leu Pro Ala Phe Leu Gly Ala Leu Thr Val Ser Val Thr Tyr Leu
145 150 155 160
Ile Met Trp Glu Ser Gly Tyr Ser Val Pro Ala Cys Leu Val Ala Thr
165 170 175
Gly Leu Ile Leu Leu Asp Asn Ala His Ile Gly Gln Thr Arg Leu Ile
180 185 190
Leu Leu Asp Ala Thr Leu Val Leu Ala Met Ala Cys Ser Leu Leu Phe
195 200 205
Tyr Ile Lys Phe Tyr Lys Leu Arg His Glu Pro Phe Ser Arg Lys Trp
210 215 220
Trp Lys Trp Leu Ile Leu Thr Gly Phe Ala Leu Ser Cys Asp Ile Ser
225 230 235 240
Thr Lys Tyr Val Gly Leu Phe Ala Phe Val Thr Ile Gly Ser Ala Val
245 250 255
Ile Ile Asp Leu Trp Asp Leu Leu Asp Ile Lys Arg Arg Tyr Gly Ala
260 265 270
Ile Ser Met Pro Glu Phe Gly Lys His Phe Ala Ala Arg Ala Phe Gly
275 280 285
Leu Ile Ile Leu Pro Phe Leu Phe Tyr Leu Phe Trp Phe Gln Val His
290 295 300
Phe Ser Val Leu Thr Arg Ser Gly Pro Gly Asp Asp Phe Met Thr Pro
305 310 315 320
Glu Phe Gln Glu Thr Leu Ser Asp Asn Val Met Leu Ala Ser Ala Val
325 330 335
Asp Ile Gln Tyr Tyr Asp Thr Ile Thr Ile Arg His Lys Glu Thr Lys
340 345 350
Ala Tyr Leu His Ser His Thr Asp Thr Tyr Pro Leu Arg Tyr Asp Asp
355 360 365
Gly Arg Ile Ser Ser Gln Gly Gln Gln Val Thr Gly Tyr Pro His Asn
370 375 380
Asp Thr Asn Asn Tyr Trp Gln Ile Leu Pro Ala Asp Asn Asp Gln Lys
385 390 395 400
Leu Gly Arg Asn Val Lys Asn Gln Asp Leu Val Arg Leu Arg His Ile
405 410 415
Val Thr Asp Lys Ile Leu Leu Ser His Asp Val Ala Ser Pro Tyr Tyr
420 425 430
Pro Thr Asn Gln Glu Phe Thr Cys Val Thr Pro Glu Glu Ala Phe Gly
435 440 445
Glu Arg Gln Asn Asp Thr Leu Phe Glu Ile Arg Ile Glu Gly Gly Lys
450 455 460
Thr Gly Gln Asp Phe Lys Thr Val Ala Ser His Phe Lys Leu Ile His
465 470 475 480
Phe Pro Ser Lys Val Ala Met Trp Thr His Thr Thr Pro Leu Pro Glu
485 490 495
Trp Ala Tyr Arg Gln Gln Glu Ile Asn Gly Asn Lys Gln Ile Thr Pro
500 505 510
Ser Ser Asn Val Trp Ile Ala Glu Asp Ile Pro Ser Leu Pro Glu Asp
515 520 525
Asp Ala Arg Arg His Lys Glu Gln Arg Lys Val Lys Ser Leu Pro Phe
530 535 540
Leu Arg Lys Trp Phe Glu Leu Gln Arg Ser Met Phe Tyr His Asn Asn
545 550 555 560
Lys Leu Thr Ser Ser His Pro Tyr Ser Ser Gln Pro Tyr His Trp Pro
565 570 575
Phe Leu Leu Arg Gly Val Ser Phe Trp Thr Gln Asn Asp Thr Arg Gln
580 585 590
Gln Ile Tyr Phe Val Gly Asn Pro Ile Gly Trp Trp Leu Ala Ser Ser
595 600 605
Leu Leu Ala Val Phe Ala Gly Ile Ile Gly Ala Asp Gln Val Ser Leu
610 615 620
Arg Arg Gly Ile Asp Ala Leu Asp His Arg Thr Arg Ser Arg Leu Tyr
625 630 635 640
Asn Ser Thr Gly Phe Phe Phe Leu Ala Trp Ala Thr His Tyr Phe Pro
645 650 655
Phe Phe Leu Met Gly Arg Gln Leu Phe Leu His His Tyr Leu Pro Ala
660 665 670
His Leu Ala Ser Cys Leu Val Thr Gly Ser Leu Val Glu Phe Ile Phe
675 680 685
Asn Thr Asp Pro Ala Asp Glu Glu Pro Ser Arg Ser Lys Asn Pro Lys
690 695 700
Ala Thr Gly Pro Arg Arg His Ile Thr Ala Arg Glu Arg Phe Ala Gly
705 710 715 720
Lys Ser Met Ala Gly Ala Trp Ile Ala Cys Phe Val Ile Leu Ala Ala
725 730 735
Ala Ala Ala Ser Trp Tyr Phe Phe Leu Pro Leu Thr Tyr Gly Tyr Pro
740 745 750
Gly Leu Ser Val Glu Glu Val Leu Arg Arg Lys Trp Leu Gly Tyr Asp
755 760 765
Leu His Phe Ala Lys
770
<210> 3
<211> 944
<212> PRT
<213> Trichoderma reesei
<400> 3
Met Ala Lys Ala Thr Ala Arg Gly Arg Ser Pro Gln Pro Pro Leu Val
1 5 10 15
Ala Glu Lys Met Pro Val Ala Val Thr Ala Pro Val Ala Ser Ser Lys
20 25 30
Ser Lys Ala Ala Lys Lys Asn Ser Ser Tyr Arg Ser Asp Gly Val Ala
35 40 45
Asp Asn Asp Val Phe Leu Leu Pro Gly Ala Asp Tyr Val Ala Ala Leu
50 55 60
Gly Val Thr Val Leu Ala Thr Ile Val Arg Leu Phe Lys Ile Tyr Thr
65 70 75 80
Pro Thr Ser Val Val Phe Asp Glu Val His Phe Gly Gly Phe Ala Ser
85 90 95
Lys Tyr Ile Lys Gly Arg Phe Phe Met Asp Val His Pro Pro Leu Ala
100 105 110
Lys Met Leu Ile Ala Leu Thr Gly Trp Leu Ala Gly Phe Asp Gly Asn
115 120 125
Phe Asp Phe Lys Asp Ile Gly Lys Asp Tyr Leu Glu Pro Gly Val Pro
130 135 140
Tyr Val Ala Met Arg Met Phe Pro Ala Val Cys Gly Ile Leu Leu Ala
145 150 155 160
Pro Phe Met Phe Phe Thr Leu Lys Ala Val Gly Cys Arg Thr Thr Thr
165 170 175
Ala Ile Leu Gly Ala Ser Phe Ile Ile Phe Glu Asn Gly Leu Leu Thr
180 185 190
Gln Ala Arg Leu Ile Leu Leu Asp Ser Pro Leu Val Ala Ala Thr Ala
195 200 205
Phe Thr Ala Met Ser Phe Asn Cys Phe Thr Asn Gln His Glu Gln Gly
210 215 220
Pro Asp Lys Ala Phe Ser Leu Ser Trp Trp Phe Trp Leu Ala Met Thr
225 230 235 240
Gly Leu Gly Leu Gly Ile Thr Ser Ser Ile Lys Trp Val Gly Leu Phe
245 250 255
Thr Ile Ala Trp Val Gly Ser Leu Thr Leu Val Gln Leu Trp Val Leu
260 265 270
Leu Gly Asp Ser Lys Asn Val Ser Met Arg Leu Trp Phe Lys His Phe
275 280 285
Met Ala Arg Val Phe Cys Leu Ile Ile Ile Pro Leu Thr Phe Tyr Leu
290 295 300
Ser Met Phe Ala Ile His Phe Leu Cys Leu Thr Asn Pro Gly Glu Gly
305 310 315 320
Asp Gly Phe Met Ser Ser Glu Phe Gln Ala Thr Leu Asn Ser Lys Gly
325 330 335
Met Lys Asp Val Pro Ala Asp Val Val Phe Gly Ser Arg Val Thr Ile
340 345 350
Arg His Val Asn Thr Gln Gly Gly Tyr Leu His Ser His Pro Leu Met
355 360 365
Tyr Pro Thr Gly Ser Leu Gln Gln Gln Ile Thr Leu Tyr Pro His Lys
370 375 380
Asp Glu Asn Asn Ile Trp Ile Met Glu Asn Gln Thr Gln Pro Leu Gly
385 390 395 400
Val Asp Gly Gln Pro Ile Asn Gly Thr Glu Ala Trp Asp Ala Leu Pro
405 410 415
Glu Val His His Val Val Asp Gly Ser Val Ile Arg Leu Tyr His Lys
420 425 430
Pro Thr Phe Arg Arg Leu His Ser His Asp Val Arg Pro Pro Val Thr
435 440 445
Glu Ala Glu Trp Gln Asn Glu Val Ser Ala Tyr Gly Tyr Glu Gly Phe
450 455 460
Glu Gly Asp Ala Asn Asp Leu Phe Arg Val Glu Ile Val Lys Lys Gln
465 470 475 480
Ser Lys Gly Pro Leu Ala Lys Glu Arg Leu Arg Thr Ile Glu Thr Lys
485 490 495
Phe Arg Leu Ile His Val Met Thr Gly Cys Ala Leu Phe Ser His Lys
500 505 510
Val Lys Leu Pro Glu Trp Ala Ser Glu Gln Gln Glu Val Thr Cys Ala
515 520 525
Arg Gly Gly Ser Leu Pro Asn Ser Ile Trp Tyr Ile Glu Tyr Asn Glu
530 535 540
His Pro Leu Leu Gly Asp Asp Val Glu Lys Val Asn Tyr Ala Asn Pro
545 550 555 560
Gly Phe Phe Gly Lys Phe Trp Glu Leu His Lys Val Met Trp Lys Thr
565 570 575
Asn Ala Gly Leu Thr Asp Ser His Ala Trp Asp Ser Arg Pro Pro Ser
580 585 590
Trp Pro Ile Leu Arg Arg Gly Ile Asn Phe Trp Gly Lys His His Met
595 600 605
Gln Val Tyr Leu Leu Gly Asn Pro Phe Ile Trp Trp Ser Ser Thr Ala
610 615 620
Ala Val Ala Ile Trp Val Ile Phe Lys Gly Val Ala Ile Leu Arg Trp
625 630 635 640
Gln Arg Gly Cys Asn Asp Tyr Ala Ser Ser Thr Phe Lys Arg Phe Asp
645 650 655
Tyr Glu Ile Gly Thr Ser Val Leu Gly Trp Ala Leu His Tyr Phe Pro
660 665 670
Phe Tyr Leu Met Glu Arg Gln Leu Phe Leu His His Tyr Phe Pro Ala
675 680 685
Leu Tyr Phe Ala Ile Leu Ala Leu Cys Gln Met Phe Asp Phe Ala Thr
690 695 700
Val Arg Ile Pro Ala Ala Leu Gly Tyr Arg Ser Thr Leu Ile Asn Arg
705 710 715 720
Val Gly Thr Val Ser Leu Leu Val Ile Ser Ala Ala Val Phe Thr Leu
725 730 735
Phe Ala Pro Leu Ala Tyr Gly Thr Pro Trp Thr Lys Ala Glu Cys Asn
740 745 750
Arg Val Lys Leu Phe Asp Lys Trp Asp Phe Asp Cys Asn Thr Phe Leu
755 760 765
Asp Asp Tyr Lys Ser Tyr Thr Leu Thr Ser Leu Ala Pro Ser Ser Ile
770 775 780
Ala Pro Ser Pro Pro Ala Ala Asn Val Pro Val Val Asn Gln Glu Gln
785 790 795 800
Lys Pro Leu Ala Lys Gln Pro Glu Pro Val Ile Ser Gln Ala Ala Val
805 810 815
Pro Gln Glu Pro Gln Ile Leu Ser Lys Glu Glu Lys Ile Glu Tyr Arg
820 825 830
Asp Gln Asp Gly Asn Leu Leu Asn Asp Glu Gln Val Lys Ala Leu Gln
835 840 845
Gly Lys Val Glu Phe Lys Thr Lys Tyr Glu Thr Lys Thr Arg Val Val
850 855 860
Asp Ala Gln Gly His Glu Ile Pro Val Pro Glu Gly Gly Trp Pro Asp
865 870 875 880
Asp Met Ile Ala Gly Val Ala Pro Pro His Pro Asp Val Glu Gly Val
885 890 895
Asp Lys Glu Thr Pro Lys Val Glu Ser Ala Glu Val Pro Lys Glu Ala
900 905 910
Ala Ala Ser Arg Asp Gly Glu Val Glu Ala Glu Asn Leu Lys Ala Lys
915 920 925
Pro Ala Ser Glu Gly Gln Glu Val Glu Ala Thr Val Gln Glu Glu Leu
930 935 940
<210> 4
<211> 740
<212> PRT
<213> Trichoderma reesei
<400> 4
Met Ala Ala Asp Lys Ala Ala Leu Ala Ser Gly Ala Asp Leu Gly Asp
1 5 10 15
Gly Leu Arg Lys Arg Gln Ala Ala Ser Gln Ala Val Pro Ser Phe Ile
20 25 30
Pro Ala Gln Thr Glu Asp Thr Lys Lys Leu Ala Lys Lys Asp Lys Thr
35 40 45
Phe Val Gln Val Leu Ala Asp Trp Glu Ser Val Leu Ala Pro Leu Ile
50 55 60
Phe Thr Ala Val Ala Ile Phe Thr Arg Leu Tyr Lys Ile Gly Leu Ser
65 70 75 80
Asn Ile Val Thr Trp Asp Glu Ala His Phe Gly Lys Phe Gly Ser Tyr
85 90 95
Tyr Ile Lys His Glu Tyr Tyr Phe Asp Val His Pro Pro Leu Gly Lys
100 105 110
Met Leu Val Gly Leu Ser Gly Val Leu Ala Gly Tyr Asn Gly Ser Phe
115 120 125
Glu Phe Lys Ser Gly Glu Gln Tyr Pro Glu Asp Val Asn Tyr Thr Phe
130 135 140
Met Arg Ala Phe Asn Ala Ala Phe Gly Ile Ala Cys Ile Pro Met Ala
145 150 155 160
Tyr Phe Thr Ala Lys Glu Leu Lys Leu Thr Arg Pro Ala Val Trp Phe
165 170 175
Val Thr Leu Met Val Leu Cys Glu Asn Ser Tyr Thr Thr Ile Ser Arg
180 185 190
Phe Ile Leu Leu Asp Ser Met Leu Leu Cys Gly Thr Phe Ala Thr Thr
195 200 205
Leu Cys Trp Ala Lys Phe His Asn Gln Arg His Asn Ser Phe Glu Pro
210 215 220
Glu Trp Phe Phe Trp Leu Phe Met Thr Gly Leu Ser Ile Gly Cys Val
225 230 235 240
Cys Ser Val Lys Leu Val Gly Leu Phe Val Thr Ala Leu Val Gly Leu
245 250 255
Tyr Thr Ile Glu Asp Leu Trp Arg Lys Tyr Gly Asp Arg Lys Met Pro
260 265 270
Ile Pro Val Leu Ala Ala His Phe Ser Ala Arg Val Val Gly Leu Ile
275 280 285
Ile Val Pro Phe Leu Ile Tyr Met Leu Ser Phe Ala Leu His Phe Ala
290 295 300
Ile Leu Asp His Ser Gly Pro Gly Asp Ala Gln Met Ser Ser Leu Phe
305 310 315 320
Gln Ala Asn Leu Lys Gly Thr Glu Val Gly Lys Asn Ser Pro Leu Glu
325 330 335
Ile Ala Leu Gly Ser Arg Ala Thr Ile Lys Asn Met Gly Tyr Gly Gly
340 345 350
Gly Leu Leu His Ser His Val Gln Thr Tyr Pro Glu Gly Ser Gly Gln
355 360 365
Gln Gln Val Thr Cys Tyr His His Lys Asp Ala Asn Asn Asp Trp Phe
370 375 380
Phe Tyr Pro Asn Arg His Glu Pro Asp Tyr Asp Pro Glu Gly Glu Leu
385 390 395 400
Arg Phe Ile Gly Asp Gly Ser Val Ile Arg Leu Ile His Ala Gln Thr
405 410 415
Gly Arg Asn Leu His Ser His Asp Ile Asp Ala Pro Ile Thr Lys Ser
420 425 430
His Arg Glu Val Ser Ser Tyr Gly Asn Leu Thr Val Gly Asp Glu Lys
435 440 445
Asp His Trp Lys Ile Glu Val Val Arg Asp Ala Ala Ser Arg Asp Arg
450 455 460
Ser Arg Ile Arg Thr Leu Thr Thr Ala Phe Arg Leu Lys His Thr Val
465 470 475 480
Leu Gly Cys Tyr Leu Arg Ala Gly Asn Val Asn Leu Pro Gln Trp Gly
485 490 495
Phe Lys Gln Ile Glu Val Thr Cys Asp Lys Gln Asn Asn Pro Arg Asp
500 505 510
Thr Tyr Thr His Trp Asn Val Glu Ala His Trp Asn Asp Arg Leu Pro
515 520 525
Pro Ser Asp Pro Gly Val Tyr Lys Ser Pro Phe Ile His Asp Phe Ile
530 535 540
His Leu Asn Val Ala Met Met Thr Ser Asn Asn Ala Leu Val Pro Asp
545 550 555 560
Pro Asp Lys Gln Asp Asp Leu Ala Ser Gln Trp Trp Gln Trp Pro Ile
565 570 575
Leu His Val Gly Leu Arg Met Cys Ser Trp Asp Asp Asn Ile Val Lys
580 585 590
Tyr Phe Leu Leu Gly Asn Pro Phe Val Tyr Trp Ala Ser Thr Ala Ser
595 600 605
Leu Gly Ala Val Ala Leu Val Ile Ala Trp Tyr Val Val Arg Trp Gln
610 615 620
Arg Gly Phe Lys Glu Leu Ser Asn Ser Glu Val Asp Gln Ile His Tyr
625 630 635 640
Ala Gly Ile Tyr Pro Val Ile Gly Trp Phe Leu His Tyr Leu Pro Phe
645 650 655
Val Ile Met Ala Arg Val Thr Tyr Val His His Tyr Tyr Pro Ala Leu
660 665 670
Tyr Phe Ala Ile Leu Ser Leu Gly Phe Leu Val Asp Trp Val Leu Arg
675 680 685
Asn Arg Ala Ala Val Val Gln Gly Val Ala Tyr Gly Ile Leu Tyr Thr
690 695 700
Val Val Ile Gly Leu Tyr Ile Leu Phe Met Pro Ile Cys Trp Gly Met
705 710 715 720
Thr Gly Ser Ser Lys Gln Tyr Ser Tyr Leu Lys Trp Phe Asp Asn Trp
725 730 735
Arg Ile Ser Asp
740
<210> 5
<211> 775
<212> PRT
<213> Aspergillus oryzae
<400> 5
Met Ser Gln Ser Pro Ser Pro Ser Leu Arg Lys Arg Gly Gly Lys Lys
1 5 10 15
Glu Ala Ser Pro Gly Pro Ser Glu Val Ser Ser Pro Tyr Pro Thr Asn
20 25 30
Gln Gly Ala Thr Pro Lys Pro Gln Ser Glu Trp Asp Tyr Arg Leu Ala
35 40 45
Ile Thr Val Leu Thr Val Leu Ala Phe Ile Thr Arg Phe Tyr Arg Ile
50 55 60
Ser Tyr Pro Asp Glu Val Val Phe Asp Glu Val His Phe Gly Lys Phe
65 70 75 80
Ala Ser Tyr Tyr Leu Gln Arg Thr Tyr Phe Phe Asp Val His Pro Pro
85 90 95
Phe Gly Lys Leu Leu Phe Ala Ala Val Gly Trp Leu Ile Gly Tyr Asp
100 105 110
Gly His Phe Leu Phe Glu Asn Ile Gly Asp Ser Tyr Ile Asp Asn Lys
115 120 125
Val Pro Tyr Val Ala Phe Arg Ala Leu Pro Ala Thr Leu Gly Ala Leu
130 135 140
Thr Val Pro Val Val Phe Leu Ile Met Trp Glu Ser Gly Tyr Ser Leu
145 150 155 160
Pro Ala Cys Val Leu Ala Ala Gly Leu Val Leu Phe Asp Asn Ala His
165 170 175
Ile Gly Glu Asp Arg Leu Ile Leu Leu Asp Ala Thr Leu Val Ile Thr
180 185 190
Met Ala Leu Ser Ile Leu Cys Tyr Val Arg Phe Tyr Lys Leu Arg His
195 200 205
Glu Pro Phe Gly Arg Lys Trp Trp Lys Trp Leu Leu Leu Thr Gly Val
210 215 220
Ser Leu Ser Cys Val Ile Ser Thr Lys Tyr Val Gly Val Phe Thr Phe
225 230 235 240
Val Thr Ile Gly Ala Ala Val Met Val Asp Leu Trp Asn Leu Leu Asp
245 250 255
Ile Arg Arg Pro Ala Gly Ala Leu Ser Met Met Glu Trp Thr Lys His
260 265 270
Phe Ala Ala Arg Gly Phe Ala Leu Ile Val Val Pro Phe Phe Phe Tyr
275 280 285
Leu Phe Trp Phe Gln Val His Phe Ala Ile Leu Thr Arg Ser Gly Pro
290 295 300
Gly Asp Asp Phe Met Thr Pro Glu Phe Gln Glu Thr Leu Ser Asp Asn
305 310 315 320
Ala Leu Ala Ala Glu Ser Ile Gly Ile Gln Tyr Tyr Asp Ala Ile Thr
325 330 335
Ile Arg His Lys Asp Thr Lys Val Phe Leu His Ser His Trp Glu Arg
340 345 350
Tyr Pro Leu Arg Tyr Asp Asp Gly Arg Ile Ser Ser Gln Gly Gln Gln
355 360 365
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370 375 380
Pro Thr Val Pro Leu Glu Asp Asn Glu Gly Gln Gly His Ser Val Lys
385 390 395 400
Asn Gly Asp Leu Val Gln Leu Leu His Leu Gly Thr Asp Ser Ile Leu
405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
Thr Leu Ser Ser His Phe Lys Leu Ile His Tyr Pro Thr Arg Val Ala
465 470 475 480
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485 490 495
Glu Ile Asn Gly Asn Lys Asn Val Leu Gln Thr Ser Asn Leu Trp Tyr
500 505 510
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515 520 525
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530 535 540
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545 550 555 560
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565 570 575
Ser Phe Trp Thr Lys Asn Asp Thr Arg Glu Gln Ile Tyr Phe Leu Gly
580 585 590
Asn Pro Ile Gly Trp Trp Ile Ala Ser Ser Leu Leu Ala Val Phe Ala
595 600 605
Gly Val Ile Gly Ala Asp Gln Leu Ser Leu Arg Arg Gly Val Asp Ala
610 615 620
Val Glu Glu Ile Trp Gly Pro Gly Ala Arg Ser Arg Leu Tyr Asn Ser
625 630 635 640
Thr Gly Phe Leu Phe Leu Cys Trp Gly Ala His Tyr Phe Pro Phe Trp
645 650 655
Leu Met Gly Arg Gln Arg Phe Leu His His Tyr Leu Pro Ala His Leu
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Ala Ser Cys Leu Val Thr Gly Ala Leu Ile Glu Phe Ile Phe Asn Leu
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690 695 700
Ser Lys Ser Ile Arg Pro Arg His Phe Val Thr Ala Lys Glu Arg Met
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Ser Arg Lys Ser Leu Val Ala Cys Trp Ile Ala Thr Leu Ser Ile Leu
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740 745 750
Thr Pro Gly Leu Asp Val Ala Gly Val Asn Ala Arg Arg Trp Leu Gly
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<211> 775
<212> PRT
<213> Aspergillus niger
<400> 6
Met Ser Ser Ser Pro Ser Pro Ser Leu Arg Lys Arg Gly Gly Lys Lys
1 5 10 15
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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Val Ala Leu Arg Ala Met Pro Ala Thr Leu Gly Ala Leu Thr Val Pro
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Val Val Phe Leu Ile Met Trp Glu Ser Gly Tyr Ser Leu Pro Ala Cys
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180 185 190
Ser Ile Leu Cys Tyr Ile Arg Phe Tyr Lys Leu Arg His Glu Ala Phe
195 200 205
Gly Arg Lys Trp Trp Lys Trp Leu Leu Leu Thr Gly Val Ser Leu Ser
210 215 220
Cys Val Ile Ser Thr Lys Tyr Val Gly Val Phe Thr Phe Val Thr Ile
225 230 235 240
Gly Ser Ala Val Met Val Asp Leu Trp Asn Leu Leu Asp Ile Arg Arg
245 250 255
Arg Gly Gly Ala Leu Thr Met Phe Gln Trp Gly Gln His Phe Val Ala
260 265 270
Arg Ala Phe Ala Leu Ile Ile Val Pro Phe Phe Phe Tyr Leu Phe Trp
275 280 285
Phe Gln Val His Phe Ala Ile Leu Thr Arg Ser Gly Pro Gly Asp Asp
290 295 300
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305 310 315 320
Ala Gln Ser Ile Gly Ile Glu Tyr Tyr Asp Thr Ile Thr Met Lys His
325 330 335
Lys Asp Thr Lys Val Tyr Leu His Ser His Leu Glu Arg Tyr Pro Leu
340 345 350
Arg Tyr Asp Asp Gly Arg Ile Ser Ser Gln Gly Gln Gln Val Thr Gly
355 360 365
Tyr Pro Tyr Asn Asp Thr Asn Asn Gln Trp Gln Ile Ile Pro Thr Val
370 375 380
Pro Leu Asp Val Thr Asp Thr Ser Gly His Lys Val Arg Asn Gly Asp
385 390 395 400
Val Val Gln Leu Arg His Met Gly Thr Asp Thr Ile Leu Leu Thr His
405 410 415
Asp Val Ala Ser Pro Tyr Tyr Pro Thr Asn Gln Glu Phe Thr Thr Val
420 425 430
Ser His Glu Val Ala Asn Gly Asp Arg His Asn Asp Thr Leu Phe Glu
435 440 445
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450 455 460
Ser His Phe Lys Leu Ile His Met Pro Thr Arg Val Ala Met Trp Thr
465 470 475 480
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485 490 495
Gly Asn Lys Asn Ile Leu Gln Thr Ser Asn Leu Trp Phe Val Glu Ser
500 505 510
Ile Glu Ser Leu Glu Glu Asp Ser Pro Arg Leu Val Lys Glu Glu Arg
515 520 525
Gln Val Lys His Leu Pro Phe Phe Arg Lys Tyr Leu Glu Leu Gln Arg
530 535 540
Ala Met Phe Phe His Asn Asn Ala Leu Thr Ser Ser His Pro Tyr Ala
545 550 555 560
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565 570 575
Thr Lys Asn Asp Thr Arg Glu Gln Ile Tyr Phe Leu Gly Asn Pro Val
580 585 590
Gly Trp Trp Ile Ala Ser Ser Leu Leu Ala Val Phe Ala Gly Val Ile
595 600 605
Gly Ala Asp Gln Leu Ser Leu Arg Arg Gly Val Asp Ala Val Glu Glu
610 615 620
Ile Trp Gly Gln Gly Ser Arg Ser Arg Leu Tyr Asn Ser Met Gly Phe
625 630 635 640
Leu Phe Leu Cys Trp Ala Ala His Tyr Phe Pro Phe Trp Leu Met Gly
645 650 655
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660 665 670
Leu Val Ala Gly Ala Leu Ile Glu Phe Ile Phe Asn Leu Glu Pro Leu
675 680 685
Ser Val Ile Gln Arg Val Arg Ser Glu Asp Asp Pro Ser Gly Lys Ala
690 695 700
Lys Ala Ser Ala Ser Val Gly Arg Phe Val Thr Ala Lys Glu Arg Met
705 710 715 720
Gly Thr Lys Ser Leu Leu Ala Gly Trp Ile Ala Thr Leu Val Ile Leu
725 730 735
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740 745 750
Thr Pro Gly Leu Asp Val Pro Gly Ile Leu Ala Arg Lys Trp Leu Gly
755 760 765
Tyr Asp Leu His Phe Ala Lys
770 775
<210> 7
<211> 773
<212> PRT
<213> Aspergillus nidulans
<400> 7
Met Ser Ser Ser Pro Ser Leu Arg Lys Arg Gly Gly Lys Arg Glu Asp
1 5 10 15
Thr Pro Val Pro Ser Asp Arg Ser Phe Ala Pro Ser Ala Ser Gln Leu
20 25 30
Gly Ala Ala Ser Arg Ser Ser Glu Trp Asp Tyr Arg Leu Ala Ile Thr
35 40 45
Ile Leu Thr Val Leu Ala Phe Ile Thr Arg Phe Tyr Lys Ile Ser Tyr
50 55 60
Pro Asp Gln Val Val Phe Asp Glu Val His Phe Gly Lys Phe Ala Ser
65 70 75 80
Tyr Tyr Leu Arg Arg Thr Tyr Phe Phe Asp Val His Pro Pro Phe Ala
85 90 95
Lys Leu Leu Leu Ala Phe Thr Gly Trp Leu Val Gly Tyr Asp Gly His
100 105 110
Phe Leu Phe Glu Asn Ile Gly Asp Ser Tyr Ile Asp Asn Lys Val Pro
115 120 125
Tyr Val Ala Leu Arg Ala Met Pro Ala Val Leu Gly Ala Leu Thr Ile
130 135 140
Pro Val Val Phe Leu Ile Met Trp Glu Ser Gly Tyr Ser Leu Pro Ala
145 150 155 160
Cys Val Leu Ala Ser Gly Leu Val Leu Phe Asp Asn Ala His Val Gly
165 170 175
Glu Asp Arg Leu Ile Leu Leu Asp Ser Thr Leu Val Ile Thr Met Ala
180 185 190
Leu Ser Ile Leu Cys Tyr Ile Arg Phe Tyr Lys Leu Arg His Glu Pro
195 200 205
Phe Gly Arg Lys Trp Trp Lys Trp Leu Leu Leu Thr Gly Val Ser Leu
210 215 220
Ser Cys Val Ile Ser Thr Lys Tyr Val Gly Val Phe Thr Phe Val Thr
225 230 235 240
Ile Gly Ser Ala Val Met Val Asp Leu Trp Asn Leu Leu Asp Ile Arg
245 250 255
Arg Gln Gly Gly Ala Leu Thr Met Phe Glu Trp Thr Lys His Phe Ala
260 265 270
Ala Arg Phe Phe Ser Leu Ile Val Val Pro Phe Phe Phe Tyr Leu Phe
275 280 285
Trp Phe Gln Val His Phe Ala Ile Leu Thr His Ser Gly Pro Gly Asp
290 295 300
Asp Phe Met Thr Pro Ala Phe Gln Glu Thr Leu Ser Asp Asn Ala Met
305 310 315 320
Ala Ala Gln Ser Val Ser Ile Glu Tyr Phe Asp Thr Ile Thr Met Arg
325 330 335
His Lys Asp Thr Lys Val Phe Leu His Ser His Ser Asp Thr Tyr Pro
340 345 350
Leu Arg Tyr Asp Asp Gly Arg Ile Ser Ser Gln Gly Gln Gln Val Thr
355 360 365
Gly Tyr Pro Tyr Asn Asp Thr Asn Asn His Trp Gln Ile Ile Pro Thr
370 375 380
Val Pro Leu Asp Glu Thr Asp Glu Lys Ser Arg Lys Val Arg Asn Gly
385 390 395 400
Asp Ile Val Gln Leu Arg His Val Ala Thr Asp Thr Ile Leu Leu Thr
405 410 415
His Asp Val Ala Ser Pro Tyr Tyr Pro Thr Asn Gln Glu Phe Thr Thr
420 425 430
Val Ser His Glu Leu Ala Asp Gly Lys Arg His Asn Asp Thr Leu Phe
435 440 445
Glu Ile Arg Val Glu His Gly Lys Ser Lys Gln Glu Phe Arg Thr Leu
450 455 460
Ser Ser Gln Phe Lys Leu Val His Val Pro Thr Lys Val Ala Met Trp
465 470 475 480
Thr His Thr Thr Pro Leu Pro Asp Trp Ala Tyr Lys Gln Ala Glu Ile
485 490 495
Asn Gly Asn Lys Asn Val Leu Gln Ser Ser Asn Ile Trp Tyr Val Glu
500 505 510
Ala Ile Glu Ser Leu Glu Glu Asp Ser Pro Arg Leu Lys Lys Glu Glu
515 520 525
Arg Lys Val Lys His Leu Pro Phe Trp Arg Lys Tyr Ile Glu Leu Gln
530 535 540
Arg Ala Met Phe Phe His Asn Asn Ala Leu Thr Ser Ser His Pro Tyr
545 550 555 560
Ala Ser Glu Pro Phe Gln Trp Pro Phe Leu Leu Arg Gly Val Ser Phe
565 570 575
Trp Thr Lys Ser Asp Thr Arg Glu Gln Ile Tyr Phe Leu Gly Asn Pro
580 585 590
Val Gly Trp Trp Ile Ser Ser Ser Leu Leu Ala Val Phe Ala Gly Val
595 600 605
Ile Gly Ala Asp Gln Leu Ser Leu Arg Arg Gly Val Asp Ala Val Glu
610 615 620
Glu Ile Trp Gly Pro Gly Ser Arg Ser Arg Leu Tyr Asn Ser Thr Gly
625 630 635 640
Phe Leu Phe Leu Cys Trp Ala Ala His Tyr Phe Pro Phe Trp Leu Met
645 650 655
Gly Arg Gln Arg Phe Leu His His Tyr Leu Pro Ala His Val Ala Ser
660 665 670
Ala Leu Val Thr Gly Ala Leu Ile Glu Phe Ile Phe Asn Ile Gln Pro
675 680 685
Ile Ser Val Pro Ala Thr Ile Pro Val Ala Ala Asp Asp Pro Thr Gly
690 695 700
Lys Gly Lys Thr Arg Arg Phe Val Thr Ala Arg Glu Arg Met Gly Val
705 710 715 720
Lys Ser Ile Val Ala Gly Trp Ile Ala Ser Leu Thr Ile Leu Ala Ala
725 730 735
Thr Ile Trp Gly Phe Trp Phe Phe Ala Pro Leu Thr Tyr Gly Thr Pro
740 745 750
Gly Leu Asp Val Ala Gln Val Asn Ala Arg Lys Trp Leu Gly Tyr Asp
755 760 765
Leu His Phe Ala Lys
770
<210> 8
<211> 774
<212> PRT
<213> Trichoderma virens
<400> 8
Met Ala Arg Thr Pro Thr Pro Gln Pro Pro Ser Leu Arg Gln Arg Asn
1 5 10 15
Val Ala Ser Lys Gln Pro Val Ser Glu Ala Thr Phe Ala Pro Glu Val
20 25 30
Glu Leu Asp Lys Leu Ser Lys Ala Ala Ala Ser Ser Arg Gln Asn Ile
35 40 45
Gln Arg Gly Glu Thr Glu His Arg Val Ala Leu Thr Leu Val Thr Ile
50 55 60
Leu Gly Phe Val Thr Arg Phe Trp Gly Ile Ser His Pro Asp Glu Val
65 70 75 80
Val Phe Asp Glu Val His Phe Gly Lys Phe Ala Ser Tyr Tyr Leu Gln
85 90 95
Arg Thr Tyr Phe Phe Asp Val His Pro Pro Phe Ala Lys Leu Leu Phe
100 105 110
Ala Phe Val Gly Trp Leu Val Gly Tyr Asp Gly His Phe His Phe Glu
115 120 125
Asn Ile Gly Asp Ser Tyr Ile Ala Asn Lys Val Pro Tyr Val Ala Phe
130 135 140
Arg Ala Leu Pro Ala Phe Leu Gly Ala Leu Thr Val Ser Val Thr Tyr
145 150 155 160
Leu Ile Met Trp Glu Ser Gly Tyr Ser Val Pro Ala Cys Leu Val Ala
165 170 175
Thr Gly Leu Ile Leu Leu Asp Asn Ala His Ile Gly Gln Thr Arg Leu
180 185 190
Ile Leu Leu Asp Ala Thr Leu Val Leu Ala Met Ala Cys Ser Leu Leu
195 200 205
Phe Tyr Ile Lys Phe Tyr Lys Leu Arg His Glu Pro Phe Ser Arg Lys
210 215 220
Trp Trp Lys Trp Leu Val Leu Thr Gly Phe Ala Leu Ser Cys Asp Ile
225 230 235 240
Ser Thr Lys Tyr Val Gly Leu Phe Ala Phe Val Thr Ile Gly Ser Ala
245 250 255
Val Ile Ile Asp Leu Trp Glu Leu Leu Asp Ile Arg Arg Pro Gly Gly
260 265 270
Ala Ile Ser Leu Pro Leu Phe Gly Lys His Phe Ala Ala Arg Ala Val
275 280 285
Gly Leu Ile Ile Leu Pro Phe Leu Phe Tyr Leu Phe Trp Phe Gln Val
290 295 300
His Phe Ala Val Leu Thr Arg Ser Gly Pro Gly Asp Asp Phe Met Ser
305 310 315 320
Pro Glu Phe Gln Glu Thr Leu Ser Asp Asn Val Met Leu Ala Ser Ala
325 330 335
Val Asp Ile Gln Tyr Tyr Asp Thr Ile Thr Ile Arg His Lys Glu Thr
340 345 350
Lys Ala Tyr Leu His Ser His Leu Asp Thr Tyr Pro Leu Arg Tyr Asp
355 360 365
Asp Gly Arg Ile Ser Ser Gln Gly Gln Gln Val Thr Gly Tyr Pro His
370 375 380
Asn Asp Thr Asn Asn Tyr Trp Gln Ile Ile Pro Ala Ser Asn Asp Gln
385 390 395 400
Lys Leu Gly Arg Ile Val Arg Asn Gln Glu Leu Val Arg Leu Arg His
405 410 415
Ile Val Thr Asp Lys Ile Leu Leu Ser His Asp Val Ala Ser Pro Tyr
420 425 430
Tyr Pro Thr Asn Gln Glu Phe Thr Ala Val Ser Ala Glu Glu Ala Tyr
435 440 445
Gly Asp Arg Leu Asn Asp Thr Leu Phe Glu Ile Arg Ile Glu Gly Gly
450 455 460
Lys Pro Asn Gln Asp Phe Lys Thr Ile Ala Ser His Phe Lys Leu Ile
465 470 475 480
His Phe Pro Ser Lys Val Ala Met Trp Thr His Thr Thr Pro Leu Pro
485 490 495
Glu Trp Ala Tyr Arg Gln Gln Glu Ile Asn Gly Asn Lys Gln Ile Thr
500 505 510
Pro Ser Ser Asn Val Trp Ile Ala Glu Asp Ile Pro Ser Leu Pro Glu
515 520 525
Asp His Ser Arg Arg Gln Lys Glu Glu Arg Lys Val Lys Ser Leu Pro
530 535 540
Phe Leu Arg Lys Trp Phe Glu Leu Gln Arg Ser Met Phe Tyr His Asn
545 550 555 560
Asn Lys Leu Thr Ser Ser His Pro Tyr Ser Ser Gln Pro Tyr His Trp
565 570 575
Pro Phe Leu Leu Arg Gly Val Ser Phe Trp Thr Gln Asn Asp Thr Arg
580 585 590
Gln Gln Ile Tyr Phe Val Gly Asn Pro Ile Gly Trp Trp Leu Ala Ser
595 600 605
Gly Leu Leu Ala Val Phe Ala Gly Ile Ile Gly Ala Asp Gln Val Ser
610 615 620
Leu Arg Arg Gly Ile Asp Ala Leu Asp His Arg Thr Arg Ser Arg Leu
625 630 635 640
Tyr Asn Ser Thr Gly Phe Phe Trp Leu Ala Trp Ala Thr His Tyr Phe
645 650 655
Pro Phe Phe Leu Met Gly Arg Gln Leu Phe Leu His His Tyr Leu Pro
660 665 670
Ala His Leu Ala Ser Cys Leu Val Thr Gly Ser Leu Val Glu Phe Ile
675 680 685
Phe Asn Thr Asp Pro Ala Asp Glu Glu Pro Ser Arg Ala Thr Asn Pro
690 695 700
Arg Ala Ser Gly Pro Lys Arg His Ile Thr Ala Arg Glu Arg Phe Ala
705 710 715 720
Gly Lys Ser Met Ala Gly Ala Trp Ile Ala Cys Phe Val Ile Leu Thr
725 730 735
Val Ala Ala Ala Ser Trp Tyr Phe Phe Leu Pro Leu Thr Tyr Gly Tyr
740 745 750
Pro Gly Leu Ser Val Asp Glu Val Asn Arg Arg Lys Trp Leu Gly Tyr
755 760 765
Asp Leu His Phe Ala Lys
770
<210> 9
<211> 771
<212> PRT
<213> Trichoderma atroviride
<400> 9
Met Ala Arg Ala Ser Thr Pro Gln Gly Ser Leu Arg Gln Arg Gly Val
1 5 10 15
Ala Ser Lys Gln Thr Leu Ser Glu Ser Thr Phe Ala Pro Glu Val Glu
20 25 30
Leu Asp Lys Leu Ser Lys Ala Ala Ala Ser Ser Arg Gln Asn Val Gln
35 40 45
Arg Gly Glu Ile Glu His Lys Ile Ala Leu Thr Leu Val Thr Ile Leu
50 55 60
Gly Phe Val Thr Arg Phe Trp Gly Ile Ser His Pro Asp Glu Val Val
65 70 75 80
Phe Asp Glu Val His Phe Gly Lys Phe Ala Ser Tyr Tyr Leu Gln Arg
85 90 95
Thr Tyr Phe Phe Asp Val His Pro Pro Phe Ala Lys Leu Leu Phe Ala
100 105 110
Phe Val Gly Trp Leu Val Gly Tyr Asp Gly His Phe His Phe Glu Asn
115 120 125
Ile Gly Asp Ser Tyr Val Ala Asn Lys Val Pro Tyr Val Ala Phe Arg
130 135 140
Ala Leu Pro Ala Val Leu Gly Ala Leu Thr Val Ser Val Thr Tyr Leu
145 150 155 160
Ile Met Trp Glu Ser Gly Tyr Ser Leu Pro Ala Cys Leu Val Ala Thr
165 170 175
Gly Leu Ile Leu Leu Asp Asn Ala His Ile Gly Gln Thr Arg Leu Ile
180 185 190
Leu Leu Asp Ala Thr Leu Val Leu Ala Met Ala Cys Ser Leu Leu Phe
195 200 205
Tyr Ile Lys Phe Tyr Lys Leu Arg His Glu Ala Phe Ser Arg Lys Trp
210 215 220
Trp Lys Trp Leu Ile Leu Thr Gly Phe Ala Leu Ser Cys Asp Ile Ser
225 230 235 240
Thr Lys Tyr Val Gly Leu Phe Ala Phe Val Thr Ile Gly Ser Ala Val
245 250 255
Ile Ile Asp Leu Trp Asp Leu Leu Asp Ile Lys Arg Arg Asn Gly Ala
260 265 270
Ile Ser Leu Gln Leu Phe Gly Lys His Phe Ala Ala Arg Ala Ile Gly
275 280 285
Leu Ile Val Leu Pro Phe Leu Phe Tyr Leu Phe Trp Phe Gln Val His
290 295 300
Phe Ala Val Leu Thr Arg Ser Gly Pro Gly Asp Asp Phe Met Thr Pro
305 310 315 320
Glu Phe Gln Glu Thr Leu Ser Asp Asn Val Met Leu Ala Asn Ala Val
325 330 335
Asp Ile His Tyr Tyr Asp Tyr Ile Thr Ile Arg His Lys Glu Thr Lys
340 345 350
Ala Tyr Leu His Ser His Pro Asp Thr Tyr Pro Leu Arg Tyr Asp Asp
355 360 365
Gly Arg Ile Ser Ser Gln Gly Gln Gln Ile Thr Gly Tyr Pro His Asn
370 375 380
Asp Thr Asn Asn Tyr Trp Gln Val Leu Pro Ser Asp Asn Val His Asn
385 390 395 400
Thr Glu Arg Ile Val Arg Asn Phe Asp Leu Val Arg Leu Arg His Ile
405 410 415
Val Thr Asp Lys Ile Leu Leu Ser His Asp Val Ala Ser Pro Tyr Phe
420 425 430
Pro Thr Asn Gln Glu Phe Thr Ala Val Thr Ser Glu Glu Ala Phe Gly
435 440 445
Glu Arg Gln Asn Asp Thr Leu Phe Glu Ile Arg Val Glu Thr Ala Lys
450 455 460
Val Gly Ala Glu Phe Lys Thr Val Ala Ser His Phe Lys Leu Val His
465 470 475 480
Phe Pro Ser Lys Val Ala Met Trp Thr His Thr Thr Pro Leu Pro Glu
485 490 495
Trp Gly Tyr Lys Gln Gln Glu Ile Asn Gly Asn Lys Gln Val Thr Val
500 505 510
Ser Ser Asn Met Trp Ile Ala Glu Asp Ile Pro Ser Leu Pro Gln Asp
515 520 525
Asp Ala Arg Arg Gln Lys Glu Gln Arg Gln Val Lys Ser Leu Pro Phe
530 535 540
Leu Arg Lys Trp Phe Glu Leu Gln Arg Ser Met Phe Tyr His Asn Asn
545 550 555 560
Lys Leu Thr Ser Ser His Pro Tyr Ser Ser Gln Pro Tyr His Trp Pro
565 570 575
Phe Leu Leu Arg Gly Val Ser Phe Trp Thr Gln Asn Asp Thr Arg Gln
580 585 590
Gln Ile Tyr Phe Val Gly Asn Pro Ile Gly Trp Trp Ile Thr Ser Ser
595 600 605
Leu Leu Ala Val Phe Ala Gly Ile Ile Ala Ala Asp Gln Ile Ser Leu
610 615 620
Arg Arg Asn Ile Asp Ala Leu Asp His Arg Thr Arg Ser Arg Leu Tyr
625 630 635 640
Asn Ser Thr Gly Phe Phe Trp Leu Ala Trp Ala Thr His Tyr Phe Pro
645 650 655
Phe Tyr Leu Met Gly Arg Gln Leu Phe Leu His His Tyr Leu Pro Ala
660 665 670
His Leu Ala Ser Cys Leu Val Thr Gly Ala Leu Val Glu Phe Ile Phe
675 680 685
Asn Ser Asp Ala Val Glu Glu Glu Ser Ser Lys Ser Gly Asn Arg Ser
690 695 700
Ser Pro Lys Arg His Val Thr Ala Arg Glu Arg Phe Ala Gly Lys Ser
705 710 715 720
Met Leu Gly Ala Trp Ile Ala Cys Gly Val Ile Leu Ser Ala Ala Ala
725 730 735
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740 745 750
Ser Val Glu Glu Val Val Arg Arg Lys Trp Leu Gly Tyr Asp Leu His
755 760 765
Phe Ala Lys
770
<210> 10
<211> 770
<212> PRT
<213> Fusarium oxysporum
<400> 10
Met Ala Arg Ser Ser Thr Pro Gln Gly Ser Leu Arg Gln Arg Gly Ala
1 5 10 15
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Leu Asp Lys Leu Ala Lys Ala Gly Ala Gln Arg Ala Ala Ala Gln Ser
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Glu Val His Phe Gly Lys Phe Ala Ser Tyr Tyr Leu Glu Arg Thr Tyr
85 90 95
Phe Phe Asp Val His Pro Pro Phe Gly Lys Leu Leu Phe Ala Phe Val
100 105 110
Gly Trp Leu Val Gly Tyr Asp Gly Asn Phe His Phe Glu Asn Ile Gly
115 120 125
Asp Ser Tyr Ile Ala Asn Lys Val Pro Tyr Val Ala Tyr Arg Ala Leu
130 135 140
Pro Ala Thr Leu Gly Ala Leu Thr Val Ser Val Thr Tyr Leu Ile Met
145 150 155 160
Trp Glu Ser Gly Tyr Ser Leu Pro Ala Cys Ile Leu Ala Ala Gly Leu
165 170 175
Val Leu Leu Asp Asn Ala His Ile Gly Gln Thr Arg Leu Ile Leu Leu
180 185 190
Asp Ala Thr Leu Val Leu Ala Met Ala Cys Ser Leu Leu Phe Tyr Ile
195 200 205
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210 215 220
Trp Leu Ile Leu Thr Gly Phe Ala Leu Ser Cys Asp Ile Ser Val Lys
225 230 235 240
Tyr Val Gly Val Phe Ala Phe Val Thr Ile Gly Ser Ala Val Val Ile
245 250 255
Asp Leu Trp Asp Leu Leu Asn Ile Asn Arg Pro Gly Gly Ala Ile Ser
260 265 270
Leu Gln Glu Phe Thr Lys His Phe Ala Ala Arg Ala Phe Gly Leu Ile
275 280 285
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305 310 315 320
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485 490 495
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500 505 510
Asn Val Trp Ile Ala Glu Asp Ile Pro Ser Leu Pro Ala Asp His Pro
515 520 525
Arg Arg Gln Lys Pro Glu Arg Lys Val Lys Ser Leu Pro Phe Leu Gln
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610 615 620
Gly Val Asp Ala Leu Asp Arg Arg Thr Arg Ser Arg Leu Tyr Asn Ser
625 630 635 640
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645 650 655
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Gly Trp Tyr Phe Phe Leu Pro Leu Thr Tyr Gly Tyr Pro Gly Leu Ser
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Val Asp Ala Ile Leu Arg Arg Lys Trp Leu Gly Tyr Asp Leu His Phe
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Ala Lys
770
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<212> PRT
<213> Gibberella zeae
<400> 11
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405 410 415
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485 490 495
Tyr Lys Gln Gln Glu Ile Asn Gly Asn Lys Gln Ile Ala Pro Ser Ser
500 505 510
Asn Val Trp Ile Ala Glu Asp Ile Ala Ser Leu Glu Ala Asp His Pro
515 520 525
Arg Arg Gln Lys Pro Glu Arg Lys Val Lys Ser Leu Pro Phe Leu Gln
530 535 540
Lys Trp Phe Glu Leu Gln Arg Ala Met Phe Tyr His Asn Ser Lys Leu
545 550 555 560
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Leu Arg Gly Val Ser Phe Trp Thr Gln Ser Glu Thr Arg Gln Gln Ile
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Tyr Phe Leu Gly Asn Pro Val Gly Trp Trp Leu Ala Ser Ser Leu Leu
595 600 605
Ala Val Tyr Ala Gly Ile Leu Leu Ala Asp Gln Val Ser Leu Arg Arg
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Val Ala Gly Trp Tyr Phe Phe Leu Pro Leu Thr Tyr Gly Tyr Pro Gly
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Leu Ser Val Glu Ala Ile Leu Arg Arg Lys Trp Leu Gly Tyr Asp Leu
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His Phe Ala Lys
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<211> 775
<212> PRT
<213> Myceliophthora thermophila
<400> 12
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85 90 95
Phe Phe Asp Val His Pro Pro Leu Gly Lys Leu Leu Phe Ala Phe Met
100 105 110
Gly Trp Leu Val Gly Tyr Asp Gly His Phe His Phe Glu Asn Ile Gly
115 120 125
Asp Ser Tyr Ile Val Asn Lys Val Pro Tyr Val Ala Phe Arg Ser Leu
130 135 140
Pro Ala Ile Leu Gly Ala Leu Thr Val Ser Val Thr Tyr Leu Ile Met
145 150 155 160
Trp Glu Ser Gly Tyr Ser Leu Pro Ala Cys Ile Ile Ala Ala Gly Leu
165 170 175
Ile Leu Leu Asp Asn Ala His Ile Gly Gln Thr Arg Leu Ile Leu Leu
180 185 190
Asp Ala Thr Leu Val Phe Ala Met Ala Cys Ser Leu Leu Cys Tyr Ile
195 200 205
Lys Phe Tyr Lys Leu Arg His Glu Pro Phe Ser Arg Lys Trp Trp Lys
210 215 220
Trp Leu Ile Leu Thr Gly Phe Ala Leu Ser Cys Asp Ile Ser Thr Lys
225 230 235 240
Tyr Val Gly Leu Phe Ala Phe Ile Thr Ile Gly Ser Ala Val Val Ile
245 250 255
Asp Leu Trp Asp Leu Leu Asp Ile Lys Arg Pro Gly Gly Ala Leu Thr
260 265 270
Leu Ala Glu Phe Gly Lys His Phe Ala Ala Arg Ala Phe Gly Leu Ile
275 280 285
Ile Met Pro Phe Leu Phe Tyr Leu Phe Trp Phe Gln Val His Phe Ser
290 295 300
Ile Leu Thr Arg Ser Gly Pro Gly Asp Asp Phe Met Thr Pro Glu Phe
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Gln Glu Thr Leu Ser Asp Asn Ile Met Leu Ala Asn Ala Val Thr Ile
325 330 335
Asp Tyr Tyr Asp Thr Ile Leu Ile Lys His Lys Glu Thr Lys Val Tyr
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Gly Arg His Val Arg Asn His Asp Leu Val Arg Leu Arg His Leu Gly
405 410 415
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435 440 445
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450 455 460
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485 490 495
Gly Tyr Lys Gln Gln Glu Ile Asn Gly Asn Lys Gln Ile Ala Pro Ser
500 505 510
Ser Asn Val Trp Leu Val Glu Asp Ile Val Ser Leu Pro Pro Asp His
515 520 525
Lys Arg Arg Glu Lys Pro Glu Arg Lys Val Lys Thr Leu Pro Phe Leu
530 535 540
Arg Lys Trp Phe Glu Leu Gln Arg Ser Met Phe Trp His Asn Asn Gln
545 550 555 560
Leu Thr Ala Ser His Pro Tyr Ala Ser Leu Pro Tyr Gln Trp Pro Phe
565 570 575
Leu Leu Arg Gly Val Ser Phe Trp Thr Gln Asn Glu Thr Arg Gln Gln
580 585 590
Ile Tyr Phe Leu Gly Asn Pro Val Gly Trp Trp Ile Ala Ser Ser Val
595 600 605
Leu Ala Ile Tyr Ala Gly Ile Val Leu Ala Asp Gln Phe Ser Leu Arg
610 615 620
Arg Gly Ile Asp Ala Leu Asp His Arg Ser Arg Ser Arg Leu Tyr Asn
625 630 635 640
Ser Thr Gly Phe Phe Phe Leu Ala Trp Ala Thr His Tyr Phe Pro Phe
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Tyr Val Met Gly Arg Gln Leu Phe Leu His His Tyr Leu Pro Ala His
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Leu Ala Ser Ala Leu Val Thr Gly Ala Ile Val Glu Phe Ile Phe Ala
675 680 685
Gln Asp Ser Leu Glu His Glu Val Ala Tyr Gln Ala Ala Lys Ala Gly
690 695 700
Lys Lys Thr Gly Val Gln Lys Arg His Leu Ser Ala Arg Glu Arg Phe
705 710 715 720
Ala Gly Gln Ser Met Val Ala Ser Trp Ile Ala Thr Val Val Ile Leu
725 730 735
Ile Ala Val Ala Ala Ser Trp Tyr Phe Phe Leu Pro Leu Thr Tyr Gly
740 745 750
Tyr Pro Gly Leu Ser Val Asp Gln Val Leu Arg Arg Lys Trp Leu Gly
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Tyr Asp Leu His Phe Ala Lys
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<210> 13
<211> 774
<212> PRT
<213> Neurospora crassa
<400> 13
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Gly Trp Leu Val Gly Tyr Asp Gly His Phe His Phe Glu Asn Ile Gly
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130 135 140
Pro Ala Ile Leu Gly Ala Leu Thr Val Ser Val Val Tyr Met Ile Met
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Trp Glu Ser Gly Tyr Ser Leu Pro Ala Cys Leu Ile Ala Ala Gly Leu
165 170 175
Val Leu Leu Asp Asn Ala His Ile Gly Gln Thr Arg Leu Ile Leu Leu
180 185 190
Asp Ala Thr Leu Val Phe Ala Met Ala Cys Ser Leu Leu Cys Tyr Ile
195 200 205
Lys Phe His Lys Leu Arg His Glu Pro Phe Ser Arg Lys Trp Trp Lys
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Trp Leu Ile Leu Thr Gly Phe Ala Leu Ser Cys Asp Ile Ser Thr Lys
225 230 235 240
Tyr Val Gly Leu Phe Ala Phe Ile Thr Ile Gly Ser Ala Val Cys Ile
245 250 255
Asp Leu Trp Asp Leu Leu Asp Ile Lys Arg Pro Gly Gly Ala Leu Thr
260 265 270
Leu Pro Gln Phe Gly Lys His Phe Ala Ala Arg Ala Phe Gly Leu Ile
275 280 285
Ile Met Pro Phe Ile Phe Tyr Leu Phe Trp Phe Gln Val His Phe Ser
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Ile Leu Thr Arg Ser Gly Pro Gly Asp Asp Phe Met Thr Pro Glu Phe
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325 330 335
Asp Tyr Tyr Asp Thr Ile Ser Ile Arg His Lys Glu Thr Lys Ala Tyr
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Thr Asn Gln Glu Phe Thr Thr Val Ser Ile Gly Asp Ala Tyr Gly Asp
435 440 445
Arg Ala Ala Asp Thr Leu Phe Glu Ile Arg Ile Glu His Gly Lys Ala
450 455 460
Asn Gln Glu Phe Lys Ser Ile Ser Ser His Phe Lys Leu Ile His Asn
465 470 475 480
Pro Ser Lys Val Ala Met Trp Thr His Ser Lys Pro Leu Pro Glu Trp
485 490 495
Gly His Lys Gln Gln Glu Ile Asn Gly Asn Lys Gln Leu Ala Gln Ser
500 505 510
Ser Asn Val Trp Leu Val Glu Asp Ile Val Ser Leu Pro Ala Asp His
515 520 525
Ala Arg Arg Glu Lys Pro Glu Lys Lys Val Lys Thr Leu Pro Phe Leu
530 535 540
Arg Lys Trp Phe Glu Leu Gln Arg Ser Met Phe Trp His Asn Asn Gln
545 550 555 560
Leu Thr Ser Ser His Pro Tyr Ala Ser Leu Pro Tyr Gln Trp Pro Phe
565 570 575
Leu Leu Arg Gly Val Ser Phe Trp Thr Gln Asn Asp Thr Arg Gln Gln
580 585 590
Ile Tyr Phe Leu Gly Asn Pro Ile Gly Trp Trp Leu Ala Ser Ser Val
595 600 605
Leu Ala Ile Tyr Ala Gly Ile Ile Leu Ala Asp Gln Phe Ser Leu Arg
610 615 620
Arg Gly Leu Asp Ala Met Asp Arg Arg Thr Arg Ser Arg Leu Tyr Asn
625 630 635 640
Ser Thr Gly Phe Phe Phe Leu Ala Trp Ala Thr His Tyr Phe Pro Phe
645 650 655
Phe Val Met Gly Arg Gln Leu Phe Leu His His Tyr Leu Pro Ala His
660 665 670
Leu Ala Ser Ala Leu Val Thr Gly Ser Val Val Glu Phe Leu Phe Ser
675 680 685
Thr Asp Ser Ala Glu Pro Glu Tyr Gln Pro Ser Lys Ser Gly Lys Lys
690 695 700
Val Ala Pro Thr Thr Lys Arg Arg Leu Ser Ala Arg Glu Arg Leu Ala
705 710 715 720
Gly Gln Ser Met Ala Gly Ala Trp Ile Ala Thr Ala Val Ile Met Val
725 730 735
Leu Val Ala Phe Gly Trp Tyr Phe Phe Leu Pro Leu Thr Tyr Gly Tyr
740 745 750
Pro Gly Leu Thr Ala Pro Glu Val Asn Arg Arg Lys Trp Leu Gly Tyr
755 760 765
Asp Leu His Phe Ala Lys
770
<210> 14
<211> 776
<212> PRT
<213> Penicillium chrysogenum
<400> 14
Met Ser Ser Pro Ser Pro Ser Leu Arg Lys Arg Gly Gly Lys Lys Asp
1 5 10 15
Val Tyr Thr Ala Leu Pro Ser Asp Asp Thr Ser Thr Pro Val Ser Val
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Pro Val Lys Gln Lys Ser Glu Trp Asp Tyr Trp Leu Ala Ile Val Ile
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Leu Thr Leu Leu Ala Phe Ala Thr Arg Phe Tyr Arg Leu Asp Tyr Pro
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Leu Leu Phe Ala Leu Met Gly Trp Leu Val Gly Phe Asp Gly Ser Phe
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145 150 155 160
Val Leu Ser Ala Gly Leu Met Val Phe Asp Asn Ala His Val Gly Glu
165 170 175
Asp Arg Leu Ile Leu Leu Asp Ala Thr Leu Val Leu Ser Met Ala Leu
180 185 190
Ser Ile Leu Cys Tyr Val Arg Phe Tyr Lys Leu Arg His Gln Pro Phe
195 200 205
Gly Arg Lys Trp Trp Lys Trp Leu Leu Leu Thr Gly Phe Cys Met Ser
210 215 220
Cys Val Ile Ser Thr Lys Tyr Val Gly Phe Phe Thr Phe Val Thr Ile
225 230 235 240
Gly Ala Ala Val Leu Ile Asp Leu Trp Asn Leu Leu Asp Ile Asn Arg
245 250 255
Glu Gln Gly Ala Leu Ser Met Ile Ser Trp Gly Lys His Phe Ile Ala
260 265 270
Arg Ala Val Gly Leu Val Ile Ile Pro Phe Met Phe Tyr Leu Phe Trp
275 280 285
Phe Gln Val His Phe Ala Ile Leu Asn Arg Ser Gly Pro Gly Asp Asp
290 295 300
Phe Met Thr Pro Glu Phe Gln Glu Thr Leu Ser Asp Asn Gln Met Thr
305 310 315 320
Ala Gln Ser Val Gly Ile Gln Tyr Phe Asp Thr Ile Thr Met Arg His
325 330 335
Lys Asp Thr Lys Val Phe Leu His Ser His Trp Asp Lys Tyr Pro Leu
340 345 350
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355 360 365
Tyr Pro His Asn Asp Thr Asn Asn Gln Trp Gln Ile Leu Pro Ala Glu
370 375 380
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Ile Gln Leu Arg His Ile Gly Thr Glu Ser Tyr Leu Leu Thr His Asp
405 410 415
Val Ala Ser Pro Phe Phe Pro Thr Asn Gln Glu Phe Thr Thr Val Ser
420 425 430
Gln Glu Leu Ala Asp Gly Glu Arg His Asn Asp Thr Leu Phe Glu Leu
435 440 445
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450 455 460
Leu Phe Lys Leu Val His Val Pro Thr Arg Val Ala Leu Trp Thr His
465 470 475 480
Thr Thr Pro Leu Pro Glu Trp Gly Tyr Lys Gln Ala Glu Ile Asn Gly
485 490 495
Asn Lys Asn Ile Leu Gln Ser Ser Asn Met Trp Tyr Val Glu Asn Ile
500 505 510
Glu Asn Leu Ala Glu Asp Ser Pro Arg Leu Val Lys Glu Glu Arg Lys
515 520 525
Val Lys Thr Leu Pro Phe Leu Arg Lys Tyr Phe Glu Leu Gln Gly Ala
530 535 540
Met Phe His His Asn Asn Ala Leu Thr Ser Ser His Pro Tyr Ala Thr
545 550 555 560
Glu Pro Phe Gln Trp Pro Phe Leu Leu Arg Gly Val Ser Phe Trp Thr
565 570 575
Lys Asn Asp Thr Arg Glu Gln Ile Tyr Phe Leu Gly Asn Pro Ile Gly
580 585 590
Trp Trp Ile Ala Ser Ser Ile Leu Ala Val Phe Ala Gly Val Val Gly
595 600 605
Ala Asp Gln Leu Ser Leu Arg Arg Gly Val Asp Ala Leu Glu Glu Ile
610 615 620
Trp Gly Pro Gly Thr Arg Ser Arg Leu Tyr Asn Ser Thr Gly Phe Leu
625 630 635 640
Phe Leu Cys Trp Ala Ala His Tyr Phe Pro Phe Trp Leu Met Gly Arg
645 650 655
Gln Arg Phe Leu His His Tyr Leu Pro Ser His Leu Ala Ser Thr Met
660 665 670
Val Cys Gly Ala Leu Ile Glu Phe Ile Phe Asn Leu Gln Pro Leu Asp
675 680 685
Pro Arg Thr Ala Leu Pro Pro Val Asp Asp Pro Ser Gly Lys Ser Lys
690 695 700
Ala Arg Ser Leu Ser Ser Leu Arg Arg Phe Ile Thr Ala Lys Glu Arg
705 710 715 720
Met Gly Cys Arg Ser Leu Ile Ala Gly Trp Ile Ala Thr Leu Ile Ile
725 730 735
Leu Ala Ala Thr Ile Trp Gly Phe Ile Phe Tyr Ala Pro Leu Thr Tyr
740 745 750
Gly Thr Pro Gly Leu Asp Val Ala Gly Val Asn Ala Arg Lys Trp Leu
755 760 765
Asn Tyr Asp Leu His Phe Ala Lys
770 775
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> Trichoderma reesei
<400> 15
gcacactttc aagattggc 19
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> Trichoderma reesei
<400> 16
gtacggtgtt gccaagaag 19
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<211> 448
<212> DNA
<213> Trichoderma reesei
<400> 17
gttgagtaca tcgagcgcga cagcattgtg cacaccatgc ttcccctcga gtccaaggac 60
agcatcatcg ttgaggactc gtgcaacggc gagacggaga agcaggctcc ctggggtctt 120
gcccgtatct ctcaccgaga gacgctcaac tttggctcct tcaacaagta cctctacacc 180
gctgatggtg gtgagggtgt tgatgcctat gtcattgaca ccggcaccaa catcgagcac 240
gtcgactttg agggtcgtgc caagtggggc aagaccatcc ctgccggcga tgaggacgag 300
gacggcaacg gccacggcac tcactgctct ggtaccgttg ctggtaagaa gtacggtgtt 360
gccaagaagg cccacgtcta cgccgtcaag gtgctccgat ccaacggatc cggcaccatg 420
tctgacgtcg tcaagggcgt cgagtacg 448
<210> 18
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<212> PRT
<213> Trichoderma reesei
<400> 18
Met Gln Pro Ser Phe Gly Ser Phe Leu Val Thr Val Leu Ser Ala Ser
1 5 10 15
Met Ala Ala Gly Ser Val Ile Pro Ser Thr Asn Ala Asn Pro Gly Ser
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Lys Arg Asp Ser Ala Thr Val Thr Ala Thr Pro Asp His Asp Asp Ile
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100 105 110
Leu Asp Phe Asp Thr Gly Ser Ser Asp Leu Trp Val Phe Ser Ser Asp
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Val Asp Pro Thr Ser Ser Gln Gly His Asp Ile Tyr Thr Pro Ser Lys
130 135 140
Ser Thr Ser Ser Lys Lys Leu Glu Gly Ala Ser Trp Asn Ile Thr Tyr
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Gly Asp Arg Ser Ser Ser Ser Gly Asp Val Tyr His Asp Ile Val Ser
165 170 175
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Tyr Asp Asn Ile Val Gly Ser Leu Asp Ser Pro Val Phe Val Ala Asp
225 230 235 240
Leu Arg His Asp Thr Pro Gly Ser Tyr His Phe Gly Ser Ile Pro Ser
245 250 255
Glu Ala Ser Lys Ala Phe Tyr Ala Pro Ile Asp Asn Ser Lys Gly Phe
260 265 270
Trp Gln Phe Ser Thr Ser Ser Asn Ile Ser Gly Gln Phe Asn Ala Val
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Ala Asp Thr Gly Thr Thr Leu Leu Leu Ala Ser Asp Asp Leu Val Lys
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Ala Tyr Tyr Ala Lys Val Gln Gly Ala Arg Val Asn Val Phe Leu Gly
305 310 315 320
Gly Tyr Val Phe Asn Cys Thr Thr Gln Leu Pro Asp Phe Thr Phe Thr
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Glu Ala Gly Asn Gly Gln Cys Phe Gly Gly Ile Gln Pro Ser Gly Gly
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Leu Pro Phe Ala Ile Phe Gly Asp Ile Ala Leu Lys Ala Ala Tyr Val
370 375 380
Ile Phe Asp Ser Gly Asn Lys Gln Val Gly Trp Ala Gln Lys Lys
385 390 395
<210> 19
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<212> PRT
<213> Trichoderma reesei
<400> 19
Met Glu Ala Ile Leu Gln Ala Gln Ala Lys Phe Arg Leu Asp Arg Gly
1 5 10 15
Leu Gln Lys Ile Thr Ala Val Arg Asn Lys Asn Tyr Lys Arg His Gly
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Pro Lys Ser Tyr Val Tyr Leu Leu Asn Arg Phe Gly Phe Glu Pro Thr
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Lys Pro Gly Pro Tyr Phe Gln Gln His Arg Ile His Gln Arg Gly Leu
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65 70 75 80
Lys Val Leu Ala Lys Lys Val Lys Glu Asp Gly Thr Val Asp Ala Gly
85 90 95
Gly Ser Lys Thr Gly Glu Val Asp Ala Glu Asp Gln Gln Asn Asp Ser
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Glu Tyr Leu Cys Glu Val Thr Ile Gly Thr Pro Gly Gln Lys Leu Met
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Leu Asp Phe Asp Thr Gly Ser Ser Asp Leu Trp Val Phe Ser Thr Glu
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Leu Ser Lys His Leu Gln Glu Asn His Ala Ile Phe Asp Pro Lys Lys
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275 280 285
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Phe Trp Met Phe Pro Ser Thr Lys Thr Thr Ile Asn Gly Lys Asp Ile
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Ser Gln Glu Gly Asn Thr Ala Ile Ala Asp Thr Gly Thr Thr Leu Ala
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Leu Val Ser Asp Glu Val Cys Glu Ala Leu Tyr Lys Ala Ile Pro Gly
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Asn Gln Arg Phe Gly Ala Val Pro Lys Ile Gln Ala Lys Gln Asn Leu
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Gln Pro Pro Gln
450
<210> 20
<211> 395
<212> PRT
<213> Trichoderma reesei
<400> 20
Met Lys Ser Ala Leu Leu Ala Ala Ala Ala Leu Val Gly Ser Ala Gln
1 5 10 15
Ala Gly Ile His Lys Met Lys Leu Gln Lys Val Ser Leu Glu Gln Gln
20 25 30
Leu Glu Gly Ser Ser Ile Glu Ala His Val Gln Gln Leu Gly Gln Lys
35 40 45
Tyr Met Gly Val Arg Pro Thr Ser Arg Ala Glu Val Met Phe Asn Asp
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65 70 75 80
Met Asn Ala Gln Tyr Phe Ser Glu Ile Thr Ile Gly Thr Pro Pro Gln
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Ser Ser Ser Ser Ser Thr Tyr Lys Pro Asn Gly Ser Asp Phe Glu Ile
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His Tyr Gly Ser Gly Ser Leu Thr Gly Phe Ile Ser Asn Asp Val Val
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Thr Ile Gly Asp Leu Lys Ile Lys Gly Gln Asp Phe Ala Glu Ala Thr
165 170 175
Ser Glu Pro Gly Leu Ala Phe Ala Phe Gly Arg Phe Asp Gly Ile Leu
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Gly Leu Gly Tyr Asp Thr Ile Ser Val Asn Gly Ile Val Pro Pro Phe
195 200 205
Tyr Gln Met Val Asn Gln Lys Leu Ile Asp Glu Pro Val Phe Ala Phe
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Tyr Leu Gly Ser Ser Asp Glu Gly Ser Glu Ala Val Phe Gly Gly Val
225 230 235 240
Asp Asp Ala His Tyr Glu Gly Lys Ile Glu Tyr Ile Pro Leu Arg Arg
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260 265 270
Val Ala Glu Leu Glu Asn Thr Gly Ala Ile Leu Asp Thr Gly Thr Ser
275 280 285
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Gly Ala Lys Lys Gly Phe Gly Gly Gln Tyr Thr Val Asp Cys Ser Lys
305 310 315 320
Arg Asp Ser Leu Pro Asp Ile Thr Phe Ser Leu Ala Gly Ser Lys Tyr
325 330 335
Ser Leu Pro Ala Ser Asp Tyr Ile Ile Glu Met Ser Gly Asn Cys Ile
340 345 350
Ser Ser Phe Gln Gly Met Asp Phe Pro Glu Pro Val Gly Pro Leu Val
355 360 365
Ile Leu Gly Asp Ala Phe Leu Arg Arg Tyr Tyr Ser Val Tyr Asp Leu
370 375 380
Gly Arg Asp Ala Val Gly Leu Ala Lys Ala Lys
385 390 395
<210> 21
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<212> PRT
<213> Trichoderma reesei
<400> 21
Met Lys Phe His Ala Ala Ala Leu Thr Leu Ala Cys Leu Ala Ser Ser
1 5 10 15
Ala Ser Ala Gly Val Ala Gln Pro Arg Ala Asp Glu Val Glu Ser Ala
20 25 30
Glu Gln Gly Lys Thr Phe Ser Leu Glu Gln Ile Pro Asn Glu Arg Tyr
35 40 45
Lys Gly Asn Ile Pro Ala Ala Tyr Ile Ser Ala Leu Ala Lys Tyr Ser
50 55 60
Pro Thr Ile Pro Asp Lys Ile Lys His Ala Ile Glu Ile Asn Pro Asp
65 70 75 80
Leu His Arg Lys Phe Ser Lys Leu Ile Asn Ala Gly Asn Met Thr Gly
85 90 95
Thr Ala Val Ala Ser Pro Pro Pro Gly Ala Asp Ala Glu Tyr Val Leu
100 105 110
Pro Val Lys Ile Gly Thr Pro Pro Gln Thr Leu Pro Leu Asn Leu Asp
115 120 125
Thr Gly Ser Ser Asp Leu Trp Val Ile Ser Thr Asp Thr Tyr Pro Pro
130 135 140
Gln Val Gln Gly Gln Thr Arg Tyr Asn Val Ser Ala Ser Thr Thr Ala
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Gln Arg Leu Ile Gly Glu Ser Trp Val Ile Arg Tyr Gly Asp Gly Ser
165 170 175
Ser Ala Asn Gly Ile Val Tyr Lys Asp Arg Val Gln Ile Gly Asn Thr
180 185 190
Phe Phe Asn Gln Gln Ala Val Glu Ser Ala Val Asn Ile Ser Asn Glu
195 200 205
Ile Ser Asp Asp Ser Phe Ser Ser Gly Leu Leu Gly Ala Ala Ser Ser
210 215 220
Ala Ala Asn Thr Val Arg Pro Asp Arg Gln Thr Thr Tyr Leu Glu Asn
225 230 235 240
Ile Lys Ser Gln Leu Ala Arg Pro Val Phe Thr Ala Asn Leu Lys Lys
245 250 255
Gly Lys Pro Gly Asn Tyr Asn Phe Gly Tyr Ile Asn Gly Ser Glu Tyr
260 265 270
Ile Gly Pro Ile Gln Tyr Ala Ala Ile Asn Pro Ser Ser Pro Leu Trp
275 280 285
Glu Val Ser Val Ser Gly Tyr Arg Val Gly Ser Asn Asp Thr Lys Tyr
290 295 300
Val Pro Arg Val Trp Asn Ala Ile Ala Asp Thr Gly Thr Thr Leu Leu
305 310 315 320
Leu Val Pro Asn Asp Ile Val Ser Ala Tyr Tyr Ala Gln Val Lys Gly
325 330 335
Ser Thr Phe Ser Asn Asp Val Gly Met Met Leu Val Pro Cys Ala Ala
340 345 350
Thr Leu Pro Asp Phe Ala Phe Gly Leu Gly Asn Tyr Arg Gly Val Ile
355 360 365
Pro Gly Ser Tyr Ile Asn Tyr Gly Arg Met Asn Lys Thr Tyr Cys Tyr
370 375 380
Gly Gly Ile Gln Ser Ser Glu Asp Ala Pro Phe Ala Val Leu Gly Asp
385 390 395 400
Ile Ala Leu Lys Ala Gln Phe Val Val Phe Asp Met Gly Asn Lys Val
405 410 415
Val Gly Phe Ala Asn Lys Asn Thr Asn Val
420 425
<210> 22
<211> 407
<212> PRT
<213> Trichoderma reesei
<400> 22
Met Gln Thr Phe Gly Ala Phe Leu Val Ser Phe Leu Ala Ala Ser Gly
1 5 10 15
Leu Ala Ala Ala Leu Pro Thr Glu Gly Gln Lys Thr Ala Ser Val Glu
20 25 30
Val Gln Tyr Asn Lys Asn Tyr Val Pro His Gly Pro Thr Ala Leu Phe
35 40 45
Lys Ala Lys Arg Lys Tyr Gly Ala Pro Ile Ser Asp Asn Leu Lys Ser
50 55 60
Leu Val Ala Ala Arg Gln Ala Lys Gln Ala Leu Ala Lys Arg Gln Thr
65 70 75 80
Gly Ser Ala Pro Asn His Pro Ser Asp Ser Ala Asp Ser Glu Tyr Ile
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Thr Ser Val Ser Ile Gly Thr Pro Ala Gln Val Leu Pro Leu Asp Phe
100 105 110
Asp Thr Gly Ser Ser Asp Leu Trp Val Phe Ser Ser Glu Thr Pro Lys
115 120 125
Ser Ser Ala Thr Gly His Ala Ile Tyr Thr Pro Ser Lys Ser Ser Thr
130 135 140
Ser Lys Lys Val Ser Gly Ala Ser Trp Ser Ile Ser Tyr Gly Asp Gly
145 150 155 160
Ser Ser Ser Ser Gly Asp Val Tyr Thr Asp Lys Val Thr Ile Gly Gly
165 170 175
Phe Ser Val Asn Thr Gln Gly Val Glu Ser Ala Thr Arg Val Ser Thr
180 185 190
Glu Phe Val Gln Asp Thr Val Ile Ser Gly Leu Val Gly Leu Ala Phe
195 200 205
Asp Ser Gly Asn Gln Val Arg Pro His Pro Gln Lys Thr Trp Phe Ser
210 215 220
Asn Ala Ala Ser Ser Leu Ala Glu Pro Leu Phe Thr Ala Asp Leu Arg
225 230 235 240
His Gly Gln Asn Gly Ser Tyr Asn Phe Gly Tyr Ile Asp Thr Ser Val
245 250 255
Ala Lys Gly Pro Val Ala Tyr Thr Pro Val Asp Asn Ser Gln Gly Phe
260 265 270
Trp Glu Phe Thr Ala Ser Gly Tyr Ser Val Gly Gly Gly Lys Leu Asn
275 280 285
Arg Asn Ser Ile Asp Gly Ile Ala Asp Thr Gly Thr Thr Leu Leu Leu
290 295 300
Leu Asp Asp Asn Val Val Asp Ala Tyr Tyr Ala Asn Val Gln Ser Ala
305 310 315 320
Gln Tyr Asp Asn Gln Gln Glu Gly Val Val Phe Asp Cys Asp Glu Asp
325 330 335
Leu Pro Ser Phe Ser Phe Gly Val Gly Ser Ser Thr Ile Thr Ile Pro
340 345 350
Gly Asp Leu Leu Asn Leu Thr Pro Leu Glu Glu Gly Ser Ser Thr Cys
355 360 365
Phe Gly Gly Leu Gln Ser Ser Ser Gly Ile Gly Ile Asn Ile Phe Gly
370 375 380
Asp Val Ala Leu Lys Ala Ala Leu Val Val Phe Asp Leu Gly Asn Glu
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Arg Leu Gly Trp Ala Gln Lys
405
<210> 23
<211> 446
<212> PRT
<213> Trichoderma reesei
<400> 23
Met Thr Leu Pro Val Pro Leu Arg Glu His Asp Leu Pro Phe Leu Lys
1 5 10 15
Glu Lys Arg Lys Leu Pro Ala Asp Asp Ile Pro Ser Gly Thr Tyr Thr
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Leu Pro Ile Ile His Ala Arg Arg Pro Lys Leu Ala Ser Arg Ala Ile
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Glu Val Gln Val Glu Asn Arg Ser Asp Val Ser Tyr Tyr Ala Gln Leu
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Asn Ile Gly Thr Pro Pro Gln Thr Val Tyr Ala Gln Ile Asp Thr Gly
65 70 75 80
Ser Phe Glu Leu Trp Val Asn Pro Asn Cys Ser Asn Val Gln Ser Ala
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Asp Gln Arg Phe Cys Arg Ala Ile Gly Phe Tyr Asp Pro Ser Ser Ser
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Ser Thr Ala Asp Val Thr Ser Gln Ser Ala Arg Leu Arg Tyr Gly Ile
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Gly Ser Ala Asp Val Thr Tyr Val His Asp Thr Ile Ser Leu Pro Gly
130 135 140
Ser Gly Ser Gly Ser Lys Ala Met Lys Ala Val Gln Phe Gly Val Ala
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Asp Thr Ser Val Asp Glu Phe Ser Gly Ile Leu Gly Leu Gly Ala Gly
165 170 175
Asn Gly Ile Asn Thr Glu Tyr Pro Asn Phe Val Asp Glu Leu Ala Ala
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Gln Gly Val Thr Ala Thr Lys Ala Phe Ser Leu Ala Leu Gly Ser Lys
195 200 205
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Phe His Gly Glu Leu Ala His Leu Pro Ile Val Pro Ala Asp Asp Ser
225 230 235 240
Pro Asp Gly Val Ala Arg Tyr Trp Val Lys Met Lys Ser Ile Ser Leu
245 250 255
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260 265 270
Lys Pro Val Ala Phe Pro Gln Thr Ser Met Thr Val Phe Leu Asp Ser
275 280 285
Gly Ser Thr Leu Thr Leu Leu Pro Pro Ala Leu Val Arg Gln Ile Ala
290 295 300
Ser Ala Leu Gly Ser Thr Gln Thr Asp Glu Ser Gly Phe Phe Val Val
305 310 315 320
Asp Cys Ala Leu Ala Ser Gln Asp Gly Thr Ile Asp Phe Glu Phe Asp
325 330 335
Gly Val Thr Ile Arg Val Pro Tyr Ala Glu Met Ile Arg Gln Val Ser
340 345 350
Thr Leu Pro Pro His Cys Tyr Leu Gly Met Met Gly Ser Thr Gln Phe
355 360 365
Ala Leu Leu Gly Asp Thr Phe Leu Arg Ser Ala Tyr Ala Val Phe Asp
370 375 380
Leu Thr Ser Asn Val Val His Leu Ala Pro Tyr Ala Asn Cys Gly Thr
385 390 395 400
Asn Val Lys Ser Ile Thr Ser Thr Ser Ser Leu Ser Asn Leu Val Gly
405 410 415
Thr Cys Asn Asp Pro Ser Lys Pro Ser Ser Ser Pro Ser Pro Ser Gln
420 425 430
Thr Pro Ser Ala Ser Pro Ser Ser Thr Ala Thr Gln Lys Ala
435 440 445
<210> 24
<211> 259
<212> PRT
<213> Trichoderma reesei
<400> 24
Met Ala Pro Ala Ser Gln Val Val Ser Ala Leu Met Leu Pro Ala Leu
1 5 10 15
Ala Leu Gly Ala Ala Ile Gln Pro Arg Gly Ala Asp Ile Val Gly Gly
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Asn Ser Asn Ser Ile Pro Ser Arg Leu Asn Lys Val Ser Val Pro Val
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Val Thr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly Leu Thr Gln Gly Gly Lys Asp
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Ser Cys Ser Gly Asp Ser Gly Gly Pro Ile Val Asp Ala Asn Gly Val
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Leu Gln Gly Val Val Ser Trp Gly Ile Gly Cys Ala Glu Ala Gly Phe
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Pro Gly Val Tyr Thr Arg Ile Gly Asn Phe Val Asn Tyr Ile Asn Gln
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Asn Leu Ala
<210> 25
<211> 882
<212> PRT
<213> Trichoderma reesei
<400> 25
Met Val Arg Ser Ala Leu Phe Val Ser Leu Leu Ala Thr Phe Ser Gly
1 5 10 15
Val Ile Ala Arg Val Ser Gly His Gly Ser Lys Ile Val Pro Gly Ala
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Tyr Ile Phe Glu Phe Glu Asp Ser Gln Asp Thr Ala Asp Phe Tyr Lys
35 40 45
Lys Leu Asn Gly Glu Gly Ser Thr Arg Leu Lys Phe Asp Tyr Lys Leu
50 55 60
Phe Lys Gly Val Ser Val Gln Leu Lys Asp Leu Asp Asn His Glu Ala
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Val Thr Leu Ile Asp Ala Pro Asn Pro Lys Val Glu Trp Val Ala Gly
100 105 110
Ser Thr Ala Pro Thr Leu Glu Ser Arg Ala Ile Lys Lys Pro Pro Ile
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Pro Asn Asp Ser Ser Asp Phe Pro Thr His Gln Met Thr Gln Ile Asp
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Lys Leu Arg Ala Lys Gly Tyr Thr Gly Lys Gly Val Arg Val Ala Val
145 150 155 160
Ile Asp Thr Gly Ile Asp Tyr Thr His Pro Ala Leu Gly Gly Cys Phe
165 170 175
Gly Arg Gly Cys Leu Val Ser Phe Gly Thr Asp Leu Val Gly Asp Asp
180 185 190
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195 200 205
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Pro Tyr Gly Phe Thr Gly Gly Ala Pro Asp Val Thr Leu Gly Ala Tyr
225 230 235 240
Arg Val Phe Gly Cys Asp Gly Gln Ala Gly Asn Asp Val Leu Ile Ser
245 250 255
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260 265 270
Ile Gly Gly Pro Ser Gly Trp Ala Glu Glu Pro Trp Ala Val Ala Val
275 280 285
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290 295 300
Glu Gly Asp Ser Gly Leu Phe Phe Ala Ser Thr Ala Ala Asn Gly Lys
305 310 315 320
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325 330 335
Leu Ser Val Ala Ser Tyr Lys Ile Asp Ser Gly Ala Ala Gln Asp Phe
340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
Leu Pro Asp Ser Thr Pro Asp Leu Ser Asp Tyr Ile Val Leu Val Arg
385 390 395 400
Arg Gly Thr Cys Thr Phe Val Gln Lys Ala Gln Asn Val Ala Ala Lys
405 410 415
Gly Ala Lys Tyr Leu Leu Tyr Tyr Asn Asn Ile Pro Gly Ala Leu Ala
420 425 430
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435 440 445
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Ala Leu Ile Gly Gln Ala Arg Gly Thr Phe Asp Pro Ala Leu Ile Asp
545 550 555 560
Asn Leu Leu Ala Thr Thr Ala Asn Pro Gln Leu Phe Asn Asp Gly Glu
565 570 575
Lys Phe Tyr Asp Phe Leu Ala Pro Val Pro Gln Gln Gly Gly Gly Leu
580 585 590
Ile Gln Ala Tyr Asp Ala Ala Phe Ala Thr Thr Leu Leu Ser Pro Ser
595 600 605
Ser Leu Ser Phe Asn Asp Thr Asp His Phe Ile Lys Lys Lys Gln Ile
610 615 620
Thr Leu Lys Asn Thr Ser Lys Gln Arg Val Thr Tyr Lys Leu Asn His
625 630 635 640
Val Pro Thr Asn Thr Phe Tyr Thr Leu Ala Pro Gly Asn Gly Tyr Pro
645 650 655
Ala Pro Phe Pro Asn Asp Ala Val Ala Ala His Ala Asn Leu Lys Phe
660 665 670
Asn Leu Gln Gln Val Thr Leu Pro Ala Gly Arg Ser Ile Thr Val Asp
675 680 685
Val Phe Pro Thr Pro Pro Arg Asp Val Asp Ala Lys Arg Leu Ala Leu
690 695 700
Trp Ser Gly Tyr Ile Thr Val Asn Gly Thr Asp Gly Thr Ser Leu Ser
705 710 715 720
Val Pro Tyr Gln Gly Leu Thr Gly Ser Leu His Lys Gln Lys Val Leu
725 730 735
Tyr Pro Glu Asp Ser Trp Ile Ala Asp Ser Thr Asp Glu Ser Leu Ala
740 745 750
Pro Val Glu Asn Gly Thr Val Phe Thr Ile Pro Ala Pro Gly Asn Ala
755 760 765
Gly Pro Asp Asp Lys Leu Pro Ser Leu Val Val Ser Pro Ala Leu Gly
770 775 780
Ser Arg Tyr Val Arg Val Asp Leu Val Leu Leu Ser Ala Pro Pro His
785 790 795 800
Gly Thr Lys Leu Lys Thr Val Lys Phe Leu Asp Thr Thr Ser Ile Gly
805 810 815
Gln Pro Ala Gly Ser Pro Leu Leu Trp Ile Ser Arg Gly Ala Asn Pro
820 825 830
Ile Ala Trp Thr Gly Glu Leu Ser Asp Asn Lys Phe Ala Pro Pro Gly
835 840 845
Thr Tyr Lys Ala Val Phe His Ala Leu Arg Ile Phe Gly Asn Glu Lys
850 855 860
Lys Lys Glu Asp Trp Asp Val Ser Glu Ser Pro Ala Phe Thr Ile Lys
865 870 875 880
Tyr Ala
<210> 26
<211> 541
<212> PRT
<213> Trichoderma reesei
<400> 26
Met Arg Ser Val Val Ala Leu Ser Met Ala Ala Val Ala Gln Ala Ser
1 5 10 15
Thr Phe Gln Ile Gly Thr Ile His Glu Lys Ser Ala Pro Val Leu Ser
20 25 30
Asn Val Glu Ala Asn Ala Ile Pro Asp Ala Tyr Ile Ile Lys Phe Lys
35 40 45
Asp His Val Gly Glu Asp Asp Ala Ser Lys His His Asp Trp Ile Gln
50 55 60
Ser Ile His Thr Asn Val Glu Gln Glu Arg Leu Glu Leu Arg Lys Arg
65 70 75 80
Ser Asn Val Phe Gly Ala Asp Asp Val Phe Asp Gly Leu Lys His Thr
85 90 95
Phe Lys Ile Gly Asp Gly Phe Lys Gly Tyr Ala Gly His Phe His Glu
100 105 110
Ser Val Ile Glu Gln Val Arg Asn His Pro Asp Val Glu Tyr Ile Glu
115 120 125
Arg Asp Ser Ile Val His Thr Met Leu Pro Leu Glu Ser Lys Asp Ser
130 135 140
Ile Ile Val Glu Asp Ser Cys Asn Gly Glu Thr Glu Lys Gln Ala Pro
145 150 155 160
Trp Gly Leu Ala Arg Ile Ser His Arg Glu Thr Leu Asn Phe Gly Ser
165 170 175
Phe Asn Lys Tyr Leu Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Glu Gly Val Asp Ala
180 185 190
Tyr Val Ile Asp Thr Gly Thr Asn Ile Glu His Val Asp Phe Glu Gly
195 200 205
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210 215 220
Gly Asn Gly His Gly Thr His Cys Ser Gly Thr Val Ala Gly Lys Lys
225 230 235 240
Tyr Gly Val Ala Lys Lys Ala His Val Tyr Ala Val Lys Val Leu Arg
245 250 255
Ser Asn Gly Ser Gly Thr Met Ser Asp Val Val Lys Gly Val Glu Tyr
260 265 270
Ala Ala Leu Ser His Ile Glu Gln Val Lys Lys Ala Lys Lys Gly Lys
275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
Val His Phe Ala Val Ala Ala Gly Asn Asp Asn Ala Asp Ala Cys Asn
325 330 335
Tyr Ser Pro Ala Ala Ala Thr Glu Pro Leu Thr Val Gly Ala Ser Ala
340 345 350
Leu Asp Asp Ser Arg Ala Tyr Phe Ser Asn Tyr Gly Lys Cys Thr Asp
355 360 365
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370 375 380
Tyr Ala Val Asn Thr Ile Ser Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro His Ile
385 390 395 400
Cys Gly Leu Leu Ala Tyr Tyr Leu Ser Leu Gln Pro Ala Gly Asp Ser
405 410 415
Glu Phe Ala Val Ala Pro Ile Thr Pro Lys Lys Leu Lys Glu Ser Val
420 425 430
Ile Ser Val Ala Thr Lys Asn Ala Leu Ser Asp Leu Pro Asp Ser Asp
435 440 445
Thr Pro Asn Leu Leu Ala Trp Asn Gly Gly Gly Cys Ser Asn Phe Ser
450 455 460
Gln Ile Val Glu Ala Gly Ser Tyr Thr Val Lys Pro Lys Gln Asn Lys
465 470 475 480
Gln Ala Lys Leu Pro Ser Thr Ile Glu Glu Leu Glu Glu Ala Ile Glu
485 490 495
Gly Asp Phe Glu Val Val Ser Gly Glu Ile Val Lys Gly Ala Lys Ser
500 505 510
Phe Gly Ser Lys Ala Glu Lys Phe Ala Lys Lys Ile His Asp Leu Val
515 520 525
Glu Glu Glu Ile Glu Glu Phe Ile Ser Glu Leu Ser Glu
530 535 540
<210> 27
<211> 391
<212> PRT
<213> Trichoderma reesei
<400> 27
Met Arg Leu Ser Val Leu Leu Ser Val Leu Pro Leu Val Leu Ala Ala
1 5 10 15
Pro Ala Ile Glu Lys Arg Ala Glu Pro Ala Pro Leu Leu Val Pro Thr
20 25 30
Thr Lys His Gly Leu Val Ala Asp Lys Tyr Ile Val Lys Phe Lys Asp
35 40 45
Gly Ser Ser Leu Gln Ala Val Asp Glu Ala Ile Ser Gly Leu Val Ser
50 55 60
Asn Ala Asp His Val Tyr Gln His Val Phe Arg Gly Phe Ala Ala Thr
65 70 75 80
Leu Asp Lys Glu Thr Leu Glu Ala Leu Arg Asn His Pro Glu Val Asp
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100 105 110
Thr Gly Ala Pro Trp Gly Leu Gly Arg Ile Ser His Lys Ala Arg Gly
115 120 125
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130 135 140
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165 170 175
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210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
Gly Val Asp Ala Arg Asn Thr Ser Pro Ala Ser Glu Pro Thr Val Cys
275 280 285
Thr Val Gly Ala Ser Thr Ser Ser Asp Ala Arg Ala Ser Phe Ser Asn
290 295 300
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305 310 315 320
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325 330 335
Thr Pro His Ile Val Gly Leu Gly Ala Tyr Leu Ala Gly Leu Glu Gly
340 345 350
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355 360 365
Arg Asn Leu Leu Ser Gly Ile Pro Ser Gly Thr Ile Asn Ala Ile Ala
370 375 380
Phe Asn Gly Asn Pro Ser Gly
385 390
<210> 28
<211> 387
<212> PRT
<213> Tricochoderma reesei
<400> 28
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1 5 10 15
Tyr Ile Val Val Tyr Asn Asn Ser Phe Gly Glu Glu Ala Ile Ser Ala
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Leu Ile Arg Leu Ser Asn Lys Ala Val Gly Gly Gln Asn Tyr Ile Phe
115 120 125
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130 135 140
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Leu Val Ala Val Lys Val Leu Asp Ala Asp Gly Ser Gly Ser Asn Ser
195 200 205
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Lys Arg Ser Gly Lys Ala Val Met Asn Met Ser Leu Gly Gly Ser Phe
225 230 235 240
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245 250 255
Val Pro Val Val Ala Ala Gly Asn Glu Asn Gln Asp Thr Ala Asn Thr
260 265 270
Ser Pro Gly Ser Ala Pro Gln Ala Ile Thr Val Gly Ala Ile Asp Ala
275 280 285
Thr Thr Asp Ile Arg Ala Gly Phe Ser Asn Phe Gly Thr Gly Val Asp
290 295 300
Ile Tyr Ala Pro Gly Val Asp Val Leu Ser Val Gly Ile Lys Ser Asp
305 310 315 320
Ile Asp Thr Ala Val Leu Ser Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro His Val
325 330 335
Ala Gly Leu Ala Ala Tyr Leu Met Ala Leu Glu Gly Val Ser Asn Val
340 345 350
Asp Asp Val Ser Asn Leu Ile Lys Asn Leu Ala Ala Lys Thr Gly Ala
355 360 365
Ala Val Lys Gln Asn Ile Ala Gly Thr Thr Ser Leu Ile Ala Asn Asn
370 375 380
Gly Asn Phe
385
<210> 29
<211> 409
<212> PRT
<213> Trichoderma reesei
<400> 29
Met Ala Ser Leu Arg Arg Leu Ala Leu Tyr Leu Gly Ala Leu Leu Pro
1 5 10 15
Ala Val Leu Ala Ala Pro Ala Val Asn Tyr Lys Leu Pro Glu Ala Val
20 25 30
Pro Asn Lys Phe Ile Val Thr Leu Lys Asp Gly Ala Ser Val Asp Thr
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Asn Ala Tyr Ala Gly Glu Phe Asp Glu Glu Thr Val Lys Gln Ile Lys
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100 105 110
Ser Asp Ile Val Glu Asp Lys Arg Ala Leu Thr Thr Gln Thr Gly Ala
115 120 125
Pro Trp Gly Leu Gly Thr Val Ser His Arg Thr Pro Gly Ser Thr Ser
130 135 140
Tyr Ile Tyr Asp Thr Ser Ala Gly Ser Gly Thr Phe Ala Tyr Val Val
145 150 155 160
Asp Ser Gly Ile Asn Ile Ala His Gln Gln Phe Gly Gly Arg Ala Ser
165 170 175
Leu Gly Tyr Asn Ala Ala Gly Gly Asp His Val Asp Thr Leu Gly His
180 185 190
Gly Thr His Val Ser Gly Thr Ile Gly Gly Ser Thr Tyr Gly Val Ala
195 200 205
Lys Gln Ala Ser Leu Ile Ser Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Ser Ala
210 215 220
Ser Thr Ser Val Ile Leu Asp Gly Tyr Asn Trp Ala Val Asn Asp Ile
225 230 235 240
Val Ser Arg Asn Arg Ala Ser Lys Ser Ala Ile Asn Met Ser Leu Gly
245 250 255
Gly Pro Ala Ser Ser Thr Trp Ala Thr Ala Ile Asn Ala Ala Phe Asn
260 265 270
Lys Gly Val Leu Thr Ile Val Ala Ala Gly Asn Gly Asp Ala Leu Gly
275 280 285
Asn Pro Gln Pro Val Ser Ser Thr Ser Pro Ala Asn Val Pro Asn Ala
290 295 300
Ile Thr Val Ala Ala Leu Asp Ile Asn Trp Arg Thr Ala Ser Phe Thr
305 310 315 320
Asn Tyr Gly Ala Gly Val Asp Val Phe Ala Pro Gly Val Asn Ile Leu
325 330 335
Ser Ser Trp Ile Gly Ser Asn Thr Ala Thr Asn Thr Ile Ser Gly Thr
340 345 350
Ser Met Ala Thr Pro His Val Val Gly Leu Ala Leu Tyr Leu Gln Ala
355 360 365
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370 375 380
Leu Ala Thr Thr Gly Arg Val Thr Gly Ser Leu Asn Gly Ser Pro Asn
385 390 395 400
Thr Leu Ile Phe Asn Gly Asn Ser Ala
405
<210> 30
<211> 555
<212> PRT
<213> Trichoderma reesei
<400> 30
Met Arg Ala Cys Leu Leu Phe Leu Gly Ile Thr Ala Leu Ala Thr Ala
1 5 10 15
Ile Pro Ala Leu Lys Pro Pro His Gly Ser Pro Asp Arg Ala His Thr
20 25 30
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50 55 60
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65 70 75 80
Arg Arg Glu Ala Thr Ala Ala Val Lys Arg Trp Leu Ala Arg Ala Gly
85 90 95
Val Pro Ala His Asp Val Leu Thr Asp Gly Gln Phe Ile His Val Arg
100 105 110
Thr Leu Ala Glu Lys Ala Gln Ala Leu Leu Gly Phe Glu Tyr Asn Ser
115 120 125
Thr Leu Gly Ser Gln Thr Ile Ala Ile Ser Thr Leu Pro Gly Lys Ile
130 135 140
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145 150 155 160
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Leu Tyr His Val Asp Ser Tyr Arg Ala Lys Tyr Glu Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Phe Gly Ile Val Gly Phe Ser Gly Gln Ala Ala Gln His Asp Glu Leu
195 200 205
Asp Lys Phe Leu His Asp Phe Ala Pro Tyr Ser Thr Asn Ala Asn Phe
210 215 220
Ser Ile Glu Ser Val Asn Gly Gly Gln Ser Pro Gln Gly Met Asn Glu
225 230 235 240
Pro Ala Ser Glu Ala Asn Gly Asp Val Gln Tyr Ala Val Ala Met Gly
245 250 255
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260 265 270
Ile Ile Pro Asp Leu Asp Leu Val Asp Thr Thr Glu Glu Tyr Leu Glu
275 280 285
Pro Phe Leu Glu Phe Ala Ser His Leu Leu Asp Leu Asp Asp Asp Glu
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Leu Pro Arg Val Val Ser Ile Ser Tyr Gly Ala Asn Glu Gln Leu Phe
305 310 315 320
Pro Arg Ser Tyr Ala His Gln Val Cys Asp Met Phe Gly Gln Leu Gly
325 330 335
Ala Arg Gly Val Ser Ile Val Val Ala Ala Gly Asp Leu Gly Pro Gly
340 345 350
Val Ser Cys Gln Ser Asn Asp Gly Ser Ala Arg Pro Lys Phe Ile Pro
355 360 365
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370 375 380
Gly Ile Met Pro Glu Val Ala Ala Ser Phe Ser Ser Gly Gly Phe Ser
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Asp Tyr Phe Ala Arg Pro Ala Trp Gln Asp Arg Ala Val Gly Ala Tyr
405 410 415
Leu Gly Ala His Gly Glu Glu Trp Glu Gly Phe Tyr Asn Pro Ala Gly
420 425 430
Arg Gly Phe Pro Asp Val Ala Ala Gln Gly Val Asn Phe Arg Phe Arg
435 440 445
Ala His Gly Asn Glu Ser Leu Ser Ser Gly Thr Ser Leu Ser Ser Pro
450 455 460
Val Phe Ala Ala Leu Ile Ala Leu Leu Asn Asp His Arg Ser Lys Ser
465 470 475 480
Gly Met Pro Pro Met Gly Phe Leu Asn Pro Trp Ile Tyr Thr Val Gly
485 490 495
Ser His Ala Phe Thr Asp Ile Ile Glu Ala Arg Ser Glu Gly Cys Pro
500 505 510
Gly Gln Ser Val Glu Tyr Leu Ala Ser Pro Tyr Ile Pro Asn Ala Gly
515 520 525
Trp Ser Ala Val Pro Gly Trp Asp Pro Val Thr Gly Trp Gly Thr Pro
530 535 540
Leu Phe Asp Arg Met Leu Asn Leu Ser Leu Val
545 550 555
<210> 31
<211> 388
<212> PRT
<213> Trichoderma reesei
<400> 31
Met Ala Trp Leu Lys Lys Leu Ala Leu Val Leu Leu Ala Ile Val Pro
1 5 10 15
Tyr Ala Thr Ala Ser Pro Ala Leu Ser Pro Arg Ser Arg Glu Ile Leu
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50 55 60
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65 70 75 80
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Pro Pro Trp Gly Leu Ala Thr Leu Ser Asn Lys Lys Pro His Gly Phe
115 120 125
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130 135 140
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Ala Lys Lys Thr Gln Leu Ile Gly Val Lys Val Phe Leu Asp Asp Glu
195 200 205
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210 215 220
Ile Thr Thr Lys Gly Arg Gln Gly Arg Ser Val Ile Asn Met Ser Leu
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Asp Met Gly Ile Leu Pro Val Ala Ala Ala Gly Asn Lys Gly Ile Pro
260 265 270
Ala Thr Phe Ile Ser Pro Ala Ser Ala Asp Lys Ala Met Thr Val Gly
275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
Ser Thr Asn Thr Ala Thr Arg Val Leu Ser Gly Thr Ser Met Ala Ala
325 330 335
Pro His Val Ala Gly Leu Ala Leu Tyr Leu Met Ala Leu Glu Glu Phe
340 345 350
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355 360 365
Asn Lys Val Val Asn Leu Met Thr Asp Ser Pro Asn Leu Ile Ile His
370 375 380
Asn Asn Val Lys
385
<210> 32
<211> 256
<212> PRT
<213> Trichoderma reesei
<400> 32
Met Phe Ile Ala Gly Val Ala Leu Ser Ala Leu Leu Cys Ala Asp Thr
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65 70 75 80
Ser Asn Ala Ala Gly Ser Ala Trp Val Gly Ile Asp Gly Ala Ser Cys
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Gly Ile Asp Ile Arg Gln Gly Asp Gln Ile Ala Met Ser Val Val Ala
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195 200 205
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Leu Ser Gly Ala Glu Ile Thr Glu Val Ile Val Asn Asn Gln Asp Leu
225 230 235 240
Thr Arg Cys Ser Val Ser Gly Ser Ser Thr Leu Thr Cys Ser Tyr Val
245 250 255
<210> 33
<211> 236
<212> PRT
<213> Trichoderma reesei
<400> 33
Met Asp Ala Ile Arg Ala Arg Ser Ala Ala Arg Arg Ser Asn Arg Phe
1 5 10 15
Gln Ala Gly Ser Ser Lys Asn Val Asn Gly Thr Ala Asp Val Glu Ser
20 25 30
Thr Asn Trp Ala Gly Ala Ala Ile Thr Thr Ser Gly Val Thr Glu Val
35 40 45
Ser Gly Thr Phe Thr Val Pro Arg Pro Ser Val Pro Ala Gly Gly Ser
50 55 60
Ser Arg Glu Glu Tyr Cys Gly Ala Ala Trp Val Gly Ile Asp Gly Tyr
65 70 75 80
Ser Asp Ala Asp Leu Ile Gln Thr Gly Val Leu Trp Cys Val Glu Asp
85 90 95
Gly Glu Tyr Leu Tyr Glu Ala Trp Tyr Glu Tyr Leu Pro Ala Ala Leu
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195 200 205
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225 230 235
<210> 34
<211> 612
<212> PRT
<213> Trichoderma reesei
<400> 34
Met Ala Lys Leu Ser Thr Leu Arg Leu Ala Ser Leu Leu Ser Leu Val
1 5 10 15
Ser Val Gln Val Ser Ala Ser Val His Leu Leu Glu Ser Leu Glu Lys
20 25 30
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65 70 75 80
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100 105 110
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
Phe Glu Gly Glu Thr Phe Asn Val Phe Gln Pro Asp Cys Leu Arg Thr
210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
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305 310 315 320
Phe Pro Asp Pro Val Glu Pro Ala Gly Thr Pro Asn Glu Asn Glu Pro
325 330 335
Tyr Leu Gln Tyr Tyr Glu Phe Leu Leu Ser Lys Ser Asn Ala Glu Ile
340 345 350
Pro Gln Val Ile Thr Asn Ser Tyr Gly Asp Glu Glu Gln Thr Val Pro
355 360 365
Arg Ser Tyr Ala Val Arg Val Cys Asn Leu Ile Gly Leu Leu Gly Leu
370 375 380
Arg Gly Ile Ser Val Leu His Ser Ser Gly Asp Glu Gly Val Gly Ala
385 390 395 400
Ser Cys Val Ala Thr Asn Ser Thr Thr Pro Gln Phe Asn Pro Ile Phe
405 410 415
Pro Ala Thr Cys Pro Tyr Val Thr Ser Val Gly Gly Thr Val Ser Phe
420 425 430
Asn Pro Glu Val Ala Trp Ala Gly Ser Ser Gly Gly Phe Ser Tyr Tyr
435 440 445
Phe Ser Arg Pro Trp Tyr Gln Gln Glu Ala Val Gly Thr Tyr Leu Glu
450 455 460
Lys Tyr Val Ser Ala Glu Thr Lys Lys Tyr Tyr Gly Pro Tyr Val Asp
465 470 475 480
Phe Ser Gly Arg Gly Phe Pro Asp Val Ala Ala His Ser Val Ser Pro
485 490 495
Asp Tyr Pro Val Phe Gln Gly Gly Glu Leu Thr Pro Ser Gly Gly Thr
500 505 510
Ser Ala Ala Ser Pro Val Val Ala Ala Ile Val Ala Leu Leu Asn Asp
515 520 525
Ala Arg Leu Arg Glu Gly Lys Pro Thr Leu Gly Phe Leu Asn Pro Leu
530 535 540
Ile Tyr Leu His Ala Ser Lys Gly Phe Thr Asp Ile Thr Ser Gly Gln
545 550 555 560
Ser Glu Gly Cys Asn Gly Asn Asn Thr Gln Thr Gly Ser Pro Leu Pro
565 570 575
Gly Ala Gly Phe Ile Ala Gly Ala His Trp Asn Ala Thr Lys Gly Trp
580 585 590
Asp Pro Thr Thr Gly Phe Gly Val Pro Asn Leu Lys Lys Leu Leu Ala
595 600 605
Leu Val Arg Phe
610
<210> 35
<211> 477
<212> PRT
<213> Trichoderma reesei
<400> 35
Met Arg Phe Val Gln Tyr Val Ser Leu Ala Gly Leu Phe Ala Ala Ala
1 5 10 15
Thr Val Ser Ala Gly Val Val Thr Val Pro Phe Glu Lys Arg Asn Leu
20 25 30
Asn Pro Asp Phe Ala Pro Ser Leu Leu Arg Arg Asp Gly Ser Val Ser
35 40 45
Leu Asp Ala Ile Asn Asn Leu Thr Gly Gly Gly Tyr Tyr Ala Gln Phe
50 55 60
Ser Val Gly Thr Pro Pro Gln Lys Leu Ser Phe Leu Leu Asp Thr Gly
65 70 75 80
Ser Ser Asp Thr Trp Val Asn Ser Val Thr Ala Asp Leu Cys Thr Asp
85 90 95
Glu Phe Thr Gln Gln Thr Val Gly Glu Tyr Cys Phe Arg Gln Phe Asn
100 105 110
Pro Arg Arg Ser Ser Ser Tyr Lys Ala Ser Thr Glu Val Phe Asp Ile
115 120 125
Thr Tyr Leu Asp Gly Arg Arg Ile Arg Gly Asn Tyr Phe Thr Asp Thr
130 135 140
Val Thr Ile Asn Gln Ala Asn Ile Thr Gly Gln Lys Ile Gly Leu Ala
145 150 155 160
Leu Gln Ser Val Arg Gly Thr Gly Ile Leu Gly Leu Gly Phe Arg Glu
165 170 175
Asn Glu Ala Ala Asp Thr Lys Tyr Pro Thr Val Ile Asp Asn Leu Val
180 185 190
Ser Gln Lys Val Ile Pro Val Pro Ala Phe Ser Leu Tyr Leu Asn Asp
195 200 205
Leu Gln Thr Ser Gln Gly Ile Leu Leu Phe Gly Gly Val Asp Thr Asp
210 215 220
Lys Phe His Gly Gly Leu Ala Thr Leu Pro Leu Gln Ser Leu Pro Pro
225 230 235 240
Ser Ile Ala Glu Thr Gln Asp Ile Val Met Tyr Ser Val Asn Leu Asp
245 250 255
Gly Phe Ser Ala Ser Asp Val Asp Thr Pro Asp Val Ser Ala Lys Ala
260 265 270
Val Leu Asp Ser Gly Ser Thr Ile Thr Leu Leu Pro Asp Ala Val Val
275 280 285
Gln Glu Leu Phe Asp Glu Tyr Asp Val Leu Asn Ile Gln Gly Leu Pro
290 295 300
Val Pro Phe Ile Asp Cys Ala Lys Ala Asn Ile Lys Asp Ala Thr Phe
305 310 315 320
Asn Phe Lys Phe Asp Gly Lys Thr Ile Lys Val Pro Ile Asp Glu Met
325 330 335
Val Leu Asn Asn Leu Ala Ala Ala Ser Asp Glu Ile Met Ser Asp Pro
340 345 350
Ser Leu Ser Lys Phe Phe Lys Gly Trp Ser Gly Val Cys Thr Phe Gly
355 360 365
Met Gly Ser Thr Lys Thr Phe Gly Ile Gln Ser Asp Glu Phe Val Leu
370 375 380
Leu Gly Asp Thr Phe Leu Arg Ser Ala Tyr Val Val Tyr Asp Leu Gln
385 390 395 400
Asn Lys Gln Ile Gly Ile Ala Gln Ala Thr Leu Asn Ser Thr Ser Ser
405 410 415
Thr Ile Val Glu Phe Lys Ala Gly Ser Lys Thr Ile Pro Gly Pro Ala
420 425 430
Ser Thr Gly Asp Asp Ser Asp Asp Ser Ser Asp Asp Ser Asp Glu Asp
435 440 445
Ser Ala Gly Ala Ala Leu His Pro Thr Phe Ser Ile Ala Leu Ala Gly
450 455 460
Thr Leu Phe Thr Ala Val Ser Met Met Met Ser Val Leu
465 470 475
<210> 36
<211> 1263
<212> DNA
<213> Trichoderma reesei
<400> 36
atggcgtcac tcatcaaaac tgccgtggac attgccaacg gccgccatgc gctgtccaga 60
tatgtcatct ttgggctctg gcttgcggat gcggtgctgt gcgggctgat tatctggaaa 120
gtgccttata cggaaatcga ctgggtcgcc tacatggagc aagtcaccca gttcgtccac 180
ggagagcgag actaccccaa gatggagggc ggcacagggc ccctggtgta tcccgcggcc 240
catgtgtaca tctacacagg gctctactac ctgacgaaca agggcaccga catcctgctg 300
gcgcagcagc tctttgccgt gctctacatg gctactctgg cggtcgtcat gacatgctac 360
tccaaggcca aggtcccgcc gtacatcttc ccgcttctca tcctctccaa aagacttcac 420
agcgtcttcg tcctgagatg cttcaacgac tgcttcgccg ccttcttcct ctggctctgc 480
atcttcttct tccagaggcg agagtggacc atcggagctc tcgcatacag catcggcctg 540
ggcgtcaaaa tgtcgctgct actggttctc cccgccgtgg tcatcgtcct ctacctcggc 600
cgcggcttca agggcgccct gcggctgctc tggctcatgg tgcaggtcca gctcctcctc 660
gccataccct tcatcacgac aaattggcgc ggctacctcg gccgtgcatt cgagctctcg 720
aggcagttca agtttgaatg gacagtcaat tggcgcatgc tgggcgagga tctgttcctc 780
agccggggct tctctatcac gctactggca tttcacgcca tcttcctcct cgcctttatc 840
ctcggccggt ggctgaagat tagggaacgg accgtactcg ggatgatccc ctatgtcatc 900
cgattcagat cgccctttac cgagcaggaa gagcgcgcca tctccaaccg cgtcgtcacg 960
cccggctatg tcatgtccac catcttgtcg gccaacgtgg tgggactgct gtttgcccgg 1020
tctctgcact accagttcta tgcatatctg gcgtgggcga ccccctatct cctgtggacg 1080
gcctgcccca atcttttggt ggtggccccc ctctgggcgg cgcaagaatg ggcctggaac 1140
gtcttcccca gcacgcctct tagctcgagc gtcgtggtga gcgtgctggc cgtgacggtg 1200
gccatggcgt ttgcaggttc aaatccgcag ccacgtgaaa catcgaagcc gaagcagcac 1260
taa 1263
<210> 37
<211> 420
<212> PRT
<213> Trichoderma reesei
<400> 37
Met Ala Ser Leu Ile Lys Thr Ala Val Asp Ile Ala Asn Gly Arg His
1 5 10 15
Ala Leu Ser Arg Tyr Val Ile Phe Gly Leu Trp Leu Ala Asp Ala Val
20 25 30
Leu Cys Gly Leu Ile Ile Trp Lys Val Pro Tyr Thr Glu Ile Asp Trp
35 40 45
Val Ala Tyr Met Glu Gln Val Thr Gln Phe Val His Gly Glu Arg Asp
50 55 60
Tyr Pro Lys Met Glu Gly Gly Thr Gly Pro Leu Val Tyr Pro Ala Ala
65 70 75 80
His Val Tyr Ile Tyr Thr Gly Leu Tyr Tyr Leu Thr Asn Lys Gly Thr
85 90 95
Asp Ile Leu Leu Ala Gln Gln Leu Phe Ala Val Leu Tyr Met Ala Thr
100 105 110
Leu Ala Val Val Met Thr Cys Tyr Ser Lys Ala Lys Val Pro Pro Tyr
115 120 125
Ile Phe Pro Leu Leu Ile Leu Ser Lys Arg Leu His Ser Val Phe Val
130 135 140
Leu Arg Cys Phe Asn Asp Cys Phe Ala Ala Phe Phe Leu Trp Leu Cys
145 150 155 160
Ile Phe Phe Phe Gln Arg Arg Glu Trp Thr Ile Gly Ala Leu Ala Tyr
165 170 175
Ser Ile Gly Leu Gly Val Lys Met Ser Leu Leu Leu Val Leu Pro Ala
180 185 190
Val Val Ile Val Leu Tyr Leu Gly Arg Gly Phe Lys Gly Ala Leu Arg
195 200 205
Leu Leu Trp Leu Met Val Gln Val Gln Leu Leu Leu Ala Ile Pro Phe
210 215 220
Ile Thr Thr Asn Trp Arg Gly Tyr Leu Gly Arg Ala Phe Glu Leu Ser
225 230 235 240
Arg Gln Phe Lys Phe Glu Trp Thr Val Asn Trp Arg Met Leu Gly Glu
245 250 255
Asp Leu Phe Leu Ser Arg Gly Phe Ser Ile Thr Leu Leu Ala Phe His
260 265 270
Ala Ile Phe Leu Leu Ala Phe Ile Leu Gly Arg Trp Leu Lys Ile Arg
275 280 285
Glu Arg Thr Val Leu Gly Met Ile Pro Tyr Val Ile Arg Phe Arg Ser
290 295 300
Pro Phe Thr Glu Gln Glu Glu Arg Ala Ile Ser Asn Arg Val Val Thr
305 310 315 320
Pro Gly Tyr Val Met Ser Thr Ile Leu Ser Ala Asn Val Val Gly Leu
325 330 335
Leu Phe Ala Arg Ser Leu His Tyr Gln Phe Tyr Ala Tyr Leu Ala Trp
340 345 350
Ala Thr Pro Tyr Leu Leu Trp Thr Ala Cys Pro Asn Leu Leu Val Val
355 360 365
Ala Pro Leu Trp Ala Ala Gln Glu Trp Ala Trp Asn Val Phe Pro Ser
370 375 380
Thr Pro Leu Ser Ser Ser Val Val Val Ser Val Leu Ala Val Thr Val
385 390 395 400
Ala Met Ala Phe Ala Gly Ser Asn Pro Gln Pro Arg Glu Thr Ser Lys
405 410 415
Pro Lys Gln His
420
<210> 38
<211> 445
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 38
Met Leu Lys Lys Gln Ser Ala Gly Leu Val Leu Trp Gly Ala Ile Leu
1 5 10 15
Phe Val Ala Trp Asn Ala Leu Leu Leu Leu Phe Phe Trp Thr Arg Pro
20 25 30
Ala Pro Gly Arg Pro Pro Ser Val Ser Ala Leu Asp Gly Asp Pro Ala
35 40 45
Ser Leu Thr Arg Glu Val Ile Arg Leu Ala Gln Asp Ala Glu Val Glu
50 55 60
Leu Glu Arg Gln Arg Gly Leu Leu Gln Gln Ile Gly Asp Ala Leu Ser
65 70 75 80
Ser Gln Arg Gly Arg Val Pro Thr Ala Ala Pro Pro Ala Gln Pro Arg
85 90 95
Val Pro Val Thr Pro Ala Pro Ala Val Ile Pro Ile Leu Val Ile Ala
100 105 110
Cys Asp Arg Ser Thr Val Arg Arg Cys Leu Asp Lys Leu Leu His Tyr
115 120 125
Arg Pro Ser Ala Glu Leu Phe Pro Ile Ile Val Ser Gln Asp Cys Gly
130 135 140
His Glu Glu Thr Ala Gln Ala Ile Ala Ser Tyr Gly Ser Ala Val Thr
145 150 155 160
His Ile Arg Gln Pro Asp Leu Ser Ser Ile Ala Val Pro Pro Asp His
165 170 175
Arg Lys Phe Gln Gly Tyr Tyr Lys Ile Ala Arg His Tyr Arg Trp Ala
180 185 190
Leu Gly Gln Val Phe Arg Gln Phe Arg Phe Pro Ala Ala Val Val Val
195 200 205
Glu Asp Asp Leu Glu Val Ala Pro Asp Phe Phe Glu Tyr Phe Arg Ala
210 215 220
Thr Tyr Pro Leu Leu Lys Ala Asp Pro Ser Leu Trp Cys Val Ser Ala
225 230 235 240
Trp Asn Asp Asn Gly Lys Glu Gln Met Val Asp Ala Ser Arg Pro Glu
245 250 255
Leu Leu Tyr Arg Thr Asp Phe Phe Pro Gly Leu Gly Trp Leu Leu Leu
260 265 270
Ala Glu Leu Trp Ala Glu Leu Glu Pro Lys Trp Pro Lys Ala Phe Trp
275 280 285
Asp Asp Trp Met Arg Arg Pro Glu Gln Arg Gln Gly Arg Ala Cys Ile
290 295 300
Arg Pro Glu Ile Ser Arg Thr Met Thr Phe Gly Arg Lys Gly Val Ser
305 310 315 320
His Gly Gln Phe Phe Asp Gln His Leu Lys Phe Ile Lys Leu Asn Gln
325 330 335
Gln Phe Val His Phe Thr Gln Leu Asp Leu Ser Tyr Leu Gln Arg Glu
340 345 350
Ala Tyr Asp Arg Asp Phe Leu Ala Arg Val Tyr Gly Ala Pro Gln Leu
355 360 365
Gln Val Glu Lys Val Arg Thr Asn Asp Arg Lys Glu Leu Gly Glu Val
370 375 380
Arg Val Gln Tyr Thr Gly Arg Asp Ser Phe Lys Ala Phe Ala Lys Ala
385 390 395 400
Leu Gly Val Met Asp Asp Leu Lys Ser Gly Val Pro Arg Ala Gly Tyr
405 410 415
Arg Gly Ile Val Thr Phe Gln Phe Arg Gly Arg Arg Val His Leu Ala
420 425 430
Pro Pro Leu Thr Trp Glu Gly Tyr Asp Pro Ser Trp Asn
435 440 445
<210> 39
<211> 447
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 39
Met Arg Phe Arg Ile Tyr Lys Arg Lys Val Leu Ile Leu Thr Leu Val
1 5 10 15
Val Ala Ala Cys Gly Phe Val Leu Trp Ser Ser Asn Gly Arg Gln Arg
20 25 30
Lys Asn Glu Ala Leu Ala Pro Pro Leu Leu Asp Ala Glu Pro Ala Arg
35 40 45
Gly Ala Gly Gly Arg Gly Gly Asp His Pro Ser Val Ala Val Gly Ile
50 55 60
Arg Arg Val Ser Asn Val Ser Ala Ala Ser Leu Val Pro Ala Val Pro
65 70 75 80
Gln Pro Glu Ala Asp Asn Leu Thr Leu Arg Tyr Arg Ser Leu Val Tyr
85 90 95
Gln Leu Asn Phe Asp Gln Thr Leu Arg Asn Val Asp Lys Ala Gly Thr
100 105 110
Trp Ala Pro Arg Glu Leu Val Leu Val Val Gln Val His Asn Arg Pro
115 120 125
Glu Tyr Leu Arg Leu Leu Leu Asp Ser Leu Arg Lys Ala Gln Gly Ile
130 135 140
Asp Asn Val Leu Val Ile Phe Ser His Asp Phe Trp Ser Thr Glu Ile
145 150 155 160
Asn Gln Leu Ile Ala Gly Val Asn Phe Cys Pro Val Leu Gln Val Phe
165 170 175
Phe Pro Phe Ser Ile Gln Leu Tyr Pro Asn Glu Phe Pro Gly Ser Asp
180 185 190
Pro Arg Asp Cys Pro Arg Asp Leu Pro Lys Asn Ala Ala Leu Lys Leu
195 200 205
Gly Cys Ile Asn Ala Glu Tyr Pro Asp Ser Phe Gly His Tyr Arg Glu
210 215 220
Ala Lys Phe Ser Gln Thr Lys His His Trp Trp Trp Lys Leu His Phe
225 230 235 240
Val Trp Glu Arg Val Lys Ile Leu Arg Asp Tyr Ala Gly Leu Ile Leu
245 250 255
Phe Leu Glu Glu Asp His Tyr Leu Ala Pro Asp Phe Tyr His Val Phe
260 265 270
Lys Lys Met Trp Lys Leu Lys Gln Gln Glu Cys Pro Glu Cys Asp Val
275 280 285
Leu Ser Leu Gly Thr Tyr Ser Ala Ser Arg Ser Phe Tyr Gly Met Ala
290 295 300
Asp Lys Val Asp Val Lys Thr Trp Lys Ser Thr Glu His Asn Met Gly
305 310 315 320
Leu Ala Leu Thr Arg Asn Ala Tyr Gln Lys Leu Ile Glu Cys Thr Asp
325 330 335
Thr Phe Cys Thr Tyr Asp Asp Tyr Asn Trp Asp Trp Thr Leu Gln Tyr
340 345 350
Leu Thr Val Ser Cys Leu Pro Lys Phe Trp Lys Val Leu Val Pro Gln
355 360 365
Ile Pro Arg Ile Phe His Ala Gly Asp Cys Gly Met His His Lys Lys
370 375 380
Thr Cys Arg Pro Ser Thr Gln Ser Ala Gln Ile Glu Ser Leu Leu Asn
385 390 395 400
Asn Asn Lys Gln Tyr Met Phe Pro Glu Thr Leu Thr Ile Ser Glu Lys
405 410 415
Phe Thr Val Val Ala Ile Ser Pro Pro Arg Lys Asn Gly Gly Trp Gly
420 425 430
Asp Ile Arg Asp His Glu Leu Cys Lys Ser Tyr Arg Arg Leu Gln
435 440 445
<210> 40
<211> 85
<212> PRT
<213> Trichoderma reesei
<400> 40
Met Ala Ser Thr Asn Ala Arg Tyr Val Arg Tyr Leu Leu Ile Ala Phe
1 5 10 15
Phe Thr Ile Leu Val Phe Tyr Phe Val Ser Asn Ser Lys Tyr Glu Gly
20 25 30
Val Asp Leu Asn Lys Gly Thr Phe Thr Ala Pro Asp Ser Thr Lys Thr
35 40 45
Thr Pro Lys Pro Pro Ala Thr Gly Asp Ala Lys Asp Phe Pro Leu Ala
50 55 60
Leu Thr Pro Asn Asp Pro Gly Phe Asn Asp Leu Val Gly Ile Ala Pro
65 70 75 80
Gly Pro Arg Met Asn
85
<210> 41
<211> 255
<212> DNA
<213> Trichoderma reesei
<400> 41
atggcgtcaa caaatgcgcg ctatgtgcgc tatctactaa tcgccttctt cacaatcctc 60
gtcttctact ttgtctccaa ttcaaagtat gagggcgtcg atctcaacaa gggcaccttc 120
acagctccgg attcgaccaa gacgacacca aagccgccag ccactggcga tgccaaagac 180
tttcctctgg ccctgacgcc gaacgatcca ggcttcaacg acctcgtcgg catcgctccc 240
ggccctcgaa tgaac 255
<210> 42
<211> 58
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 42
Met Arg Phe Arg Ile Tyr Lys Arg Lys Val Leu Ile Leu Thr Leu Val
1 5 10 15
Val Ala Ala Cys Gly Phe Val Leu Trp Ser Ser Asn Gly Arg Gln Arg
20 25 30
Lys Asn Glu Ala Leu Ala Pro Pro Leu Leu Asp Ala Glu Pro Ala Arg
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Gly Ala Gly Gly Arg Gly Gly Asp His Pro
50 55
<210> 43
<211> 51
<212> PRT
<213> Trichoderma reesei
<400> 43
Met Ala Ser Thr Asn Ala Arg Tyr Val Arg Tyr Leu Leu Ile Ala Phe
1 5 10 15
Phe Thr Ile Leu Val Phe Tyr Phe Val Ser Asn Ser Lys Tyr Glu Gly
20 25 30
Val Asp Leu Asn Lys Gly Thr Phe Thr Ala Pro Asp Ser Thr Lys Thr
35 40 45
Thr Pro Lys
50
<210> 44
<211> 52
<212> PRT
<213> Trichoderma reesei
<400> 44
Met Ala Ile Ala Arg Pro Val Arg Ala Leu Gly Gly Leu Ala Ala Ile
1 5 10 15
Leu Trp Cys Phe Phe Leu Tyr Gln Leu Leu Arg Pro Ser Ser Ser Tyr
20 25 30
Asn Ser Pro Gly Asp Arg Tyr Ile Asn Phe Glu Arg Asp Pro Asn Leu
35 40 45
Asp Pro Thr Gly
50
<210> 45
<211> 33
<212> PRT
<213> Trichoderma reesei
<400> 45
Met Leu Asn Pro Arg Arg Ala Leu Ile Ala Ala Ala Phe Ile Leu Thr
1 5 10 15
Val Phe Phe Leu Ile Ser Arg Ser His Asn Ser Glu Ser Ala Ser Thr
20 25 30
Ser
<210> 46
<211> 84
<212> PRT
<213> Trichoderma reesei
<400> 46
Met Met Pro Arg His His Ser Ser Gly Phe Ser Asn Gly Tyr Pro Arg
1 5 10 15
Ala Asp Thr Phe Glu Ile Ser Pro His Arg Phe Gln Pro Arg Ala Thr
20 25 30
Leu Pro Pro His Arg Lys Arg Lys Arg Thr Ala Ile Arg Val Gly Ile
35 40 45
Ala Val Val Val Ile Leu Val Leu Val Leu Trp Phe Gly Gln Pro Arg
50 55 60
Ser Val Ala Ser Leu Ile Ser Leu Gly Ile Leu Ser Gly Tyr Asp Asp
65 70 75 80
Leu Lys Leu Glu
<210> 47
<211> 55
<212> PRT
<213> Trichoderma reesei
<400> 47
Met Leu Leu Pro Lys Gly Gly Leu Asp Trp Arg Ser Ala Arg Ala Gln
1 5 10 15
Ile Pro Pro Thr Arg Ala Leu Trp Asn Ala Val Thr Arg Thr Arg Phe
20 25 30
Ile Leu Leu Val Gly Ile Thr Gly Leu Ile Leu Leu Leu Trp Arg Gly
35 40 45
Val Ser Thr Ser Ala Ser Glu
50 55
<210> 48
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 48
cgattaagtt gggtaacgcc agggttttcc cagtcacgac ggtttaaacg ctgcagggcg 60
tacagaact 69
<210> 49
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 49
atctctcaaa ggaagaatcc cttcagggtt gcgtttccag tgcggccgcg gctctaaaat 60
gcttcacag 69
<210> 50
<211> 68
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 50
cggttctcat ctgggcttgc tcggtcctgg cgtagatcta gcggccgcac gatgatgatg 60
acagccag 68
<210> 51
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 51
gtggaattgt gagcggataa caatttcaca caggaaacag cgtttaaacc gtccagctcc 60
cgcagcgcc 69
<210> 52
<211> 84
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 52
atcgctaact gctttctctt ctgtgaagca ttttagagcc gcggccgcgg ccggccgcga 60
tcgcctagat ctacgccagg accg 84
<210> 53
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 53
cggtcctggc gtagatctag ggcgcgccac tggaaacgca accctgaa 48
<210> 54
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 54
ttcagggttg cgtttccagt ggcgcgccct agatctacgc caggaccg 48
<210> 55
<211> 68
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 55
agcatcatga ccgccccctt ctggctgtca tcatcatcgt gcggccgcga ttattgcaca 60
agcagcga 68
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 56
tatggcttta gatggggaca 20
<210> 57
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 57
tgcgtcgccg tctcgctcct 20
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 58
ttaggcgacc tctttttcca 20
<210> 59
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 59
cctgtatcgt cctgttcc 18
<210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 60
gcgcctgtcg agtcggcatt 20
<210> 61
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 61
caccggccat gctcttgcca 20
<210> 62
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 62
caaggtgccc tatgtcgc 18
<210> 63
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 63
gatcgggtca ggacggaa 18
<210> 64
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 64
agcctgtctg agggacgg 18
<210> 65
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 65
caaggtcgag attcggca 18
<210> 66
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 66
cagaaggggg cggtcat 17
<210> 67
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 67
gtcccagctc ccgctct 17
<210> 68
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 68
gcgcctgtcg agtcggcatt 20
<210> 69
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 69
caccggccat gctcttgcca 20
<210> 70
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 70
cgattaagtt gggtaacgcc agggttttcc cagtcacgac ggtttaaacg tttcaggtac 60
caacacctg 69
<210> 71
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 71
atctctcaaa ggaagaatcc cttcagggtt gcgtttccag tgcggccgcg gcgaagagtc 60
tggcgggga 69
<210> 72
<211> 68
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 72
cggttctcat ctgggcttgc tcggtcctgg cgtagatcta gcggccgcaa gaggatgggg 60
gtaaagct 68
<210> 73
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 73
gtggaattgt gagcggataa caatttcaca caggaaacag cgtttaaacg aggaggactc 60
gtgagttat 69
<210> 74
<211> 84
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 74
gcgcccttcc gcctcgacaa tccccgccag actcttcgcc gcggccgcgg ccggccgcga 60
tcgcctagat ctacgccagg accg 84
<210> 75
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 75
cggtcctggc gtagatctag ggcgcgccac tggaaacgca accctgaa 48
<210> 76
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 76
ttcagggttg cgtttccagt ggcgcgccct agatctacgc caggaccg 48
<210> 77
<211> 68
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 77
gagctggcca gaaaagacca agctttaccc ccatcctctt gcggccgcga ttattgcaca 60
agcagcga 68
<210> 78
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 78
acgagttgtt tcgtgtaccg 20
<210> 79
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 79
ctttccattc atcagggatg g 21
<210> 80
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 80
ggagactcag tgaagagagg 20
<210> 81
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 81
atgttgcagt tgcgaaag 18
<210> 82
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 82
ccctcgtcgc agaaaagatg 20
<210> 83
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 83
agcctccttg ggaacctcag 20
<210> 84
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 84
cttagtgcgg ctggagggcg 20
<210> 85
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 85
ggccggttcg tgcaactgga 20
<210> 86
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 86
ggccgcaaga ggatgggggt 20
<210> 87
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 87
tcgggccagc tgaagcacaa c 21
<210> 88
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 88
ttgaggaacg gctgcctgcg 20
<210> 89
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 89
cgatggctcc gtcatccgcc 20
<210> 90
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 90
acgagttgtt tcgtgtaccg 20
<210> 91
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 91
tgcgtcgccg tctcgctcct 20
<210> 92
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 92
ttaggcgacc tctttttcca 20
<210> 93
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 93
atgttgcagt tgcgaaag 18
<210> 94
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 94
ccctcgtcgc agaaaagatg 20
<210> 95
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 95
agcctccttg ggaacctcag 20
<210> 96
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 96
cttagtgcgg ctggagggcg 20
<210> 97
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 97
ggccggttcg tgcaactgga 20
<210> 98
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 98
ggccgcaaga ggatgggggt 20
<210> 99
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 99
tcgggccagc tgaagcacaa c 21
<210> 100
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 100
ccctcgtcgc agaaaagatg 20
<210> 101
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 101
agcctccttg ggaacctcag 20
<210> 102
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 102
cgattaagtt gggtaacgcc agggttttcc cagtcacgac ggtttaaacg tgtttaaatt 60
tgatgaggc 69
<210> 103
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 103
atctctcaaa ggaagaatcc cttcagggtt gcgtttccag tgcggccgcg gtctcagaga 60
cagccttct 69
<210> 104
<211> 68
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 104
cggttctcat ctgggcttgc tcggtcctgg cgtagatcta gcggccgcac tcggcttctt 60
tgtccgag 68
<210> 105
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 105
gtggaattgt gagcggataa caatttcaca caggaaacag cgtttaaact cctcgtcggc 60
aacaaggcc 69
<210> 106
<211> 84
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 106
gcagatctgg gggaggaatc agaaggctgt ctctgagacc gcggccgcgg ccggccgcga 60
tcgcctagat ctacgccagg accg 84
<210> 107
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 107
cggtcctggc gtagatctag ggcgcgccac tggaaacgca accctgaa 48
<210> 108
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 108
ttcagggttg cgtttccagt ggcgcgccct agatctacgc caggaccg 48
<210> 109
<211> 68
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 109
aaagtgggcg agctgagata ctcggacaaa gaagccgagt gcggccgcga ttattgcaca 60
agcagcga 68
<210> 110
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 110
acgggagatc tcggaaaa 18
<210> 111
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 111
ctttccattc atcagggatg g 21
<210> 112
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 112
ggagactcag tgaagagagg 20
<210> 113
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 113
atgaagctca gcctgtgg 18
<210> 114
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 114
ggggacggct tgaggaag 18
<210> 115
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 115
ctgcttgctg cttccagtca 20
<210> 116
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 116
tggcagatgc cgaaaggcgg 20
<210> 117
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 117
tggcaaccag ctgtggctcc 20
<210> 118
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 118
cggccgcact cggcttcttt 20
<210> 119
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 119
gagtgggcta ggcgcaacgg 20
<210> 120
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 120
ggatcggcca ctgccaccac 20
<210> 121
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 121
gcccacttct ctgcgcgtgt 20
<210> 122
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 122
acgggagatc tcggaaaa 18
<210> 123
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 123
ccatgagctt gaacaggtaa 20
<210> 124
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 124
ttaggcgacc tctttttcca 20
<210> 125
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 125
atgaagctca gcctgtgg 18
<210> 126
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 126
ggatcggcca ctgccaccac 20
<210> 127
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 127
gcccacttct ctgcgcgtgt 20
<210> 128
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 128
tggcagatgc cgaaaggcgg 20
<210> 129
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 129
tggcaaccag ctgtggctcc 20
<210> 130
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 130
cggccgcact cggcttcttt 20
<210> 131
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 131
gagtgggcta ggcgcaacgg 20
<210> 132
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 132
ctctgcgcgt gttgtgg 17
<210> 133
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 133
taagggtgcg gattcgg 17
<210> 134
<211> 488
<212> PRT
<213> Trichoderma reesei
<400> 134
Met Arg Ala Ser Pro Leu Ala Val Ala Gly Val Ala Leu Ala Ser Ala
1 5 10 15
Ala Gln Ala Gln Val Val Gln Phe Asp Ile Glu Lys Arg His Ala Pro
20 25 30
Arg Leu Ser Arg Arg Asp Gly Thr Ile Asp Gly Thr Leu Ser Asn Gln
35 40 45
Arg Val Gln Gly Gly Tyr Phe Ile Asn Val Gln Val Gly Ser Pro Gly
50 55 60
Gln Asn Ile Thr Leu Gln Leu Asp Thr Gly Ser Ser Asp Val Trp Val
65 70 75 80
Pro Ser Ser Thr Ala Ala Ile Cys Thr Gln Val Ser Glu Arg Asn Pro
85 90 95
Gly Cys Gln Phe Gly Ser Phe Asn Pro Asp Asp Ser Asp Thr Phe Asp
100 105 110
Glu Val Gly Gln Gly Leu Phe Asp Ile Thr Tyr Val Asp Gly Ser Ser
115 120 125
Ser Lys Gly Asp Tyr Phe Gln Asp Asn Phe Gln Ile Asn Gly Val Thr
130 135 140
Val Lys Asn Leu Thr Met Gly Leu Gly Leu Ser Ser Ser Ile Pro Asn
145 150 155 160
Gly Leu Ile Gly Val Gly Tyr Met Asn Asp Glu Ala Ser Val Ser Thr
165 170 175
Thr Arg Ser Thr Tyr Pro Asn Leu Pro Ile Val Leu Gln Gln Gln Lys
180 185 190
Leu Ile Asn Ser Val Ala Phe Ser Leu Trp Leu Asn Asp Leu Asp Ala
195 200 205
Ser Thr Gly Ser Ile Leu Phe Gly Gly Ile Asp Thr Glu Lys Tyr His
210 215 220
Gly Asp Leu Thr Ser Ile Asp Ile Ile Ser Pro Asn Gly Gly Lys Thr
225 230 235 240
Phe Thr Glu Phe Ala Val Asn Leu Tyr Ser Val Gln Ala Thr Ser Pro
245 250 255
Ser Gly Thr Asp Thr Leu Ser Thr Ser Glu Asp Thr Leu Ile Ala Val
260 265 270
Leu Asp Ser Gly Thr Thr Leu Thr Tyr Leu Pro Gln Asp Met Ala Glu
275 280 285
Glu Ala Trp Asn Glu Val Gly Ala Glu Tyr Ser Asn Glu Leu Gly Leu
290 295 300
Ala Val Val Pro Cys Ser Val Gly Asn Thr Asn Gly Phe Phe Ser Phe
305 310 315 320
Thr Phe Ala Gly Thr Asp Gly Pro Thr Ile Asn Val Thr Leu Ser Glu
325 330 335
Leu Val Leu Asp Leu Phe Ser Gly Gly Pro Ala Pro Arg Phe Ser Ser
340 345 350
Gly Pro Asn Lys Gly Gln Ser Ile Cys Glu Phe Gly Ile Gln Asn Gly
355 360 365
Thr Gly Ser Pro Phe Leu Leu Gly Asp Thr Phe Leu Arg Ser Ala Phe
370 375 380
Val Val Tyr Asp Leu Val Asn Asn Gln Ile Ala Ile Ala Pro Thr Asn
385 390 395 400
Phe Asn Ser Thr Arg Thr Asn Val Val Ala Phe Ala Ser Ser Gly Ala
405 410 415
Pro Ile Pro Ser Ala Thr Ala Ala Pro Asn Gln Ser Arg Thr Gly His
420 425 430
Ser Ser Ser Thr His Ser Gly Leu Ser Ala Ala Ser Gly Phe His Asp
435 440 445
Gly Asp Asp Glu Asn Ala Gly Ser Leu Thr Ser Val Phe Ser Gly Pro
450 455 460
Gly Met Ala Val Val Gly Met Thr Ile Cys Tyr Thr Leu Leu Gly Ser
465 470 475 480
Ala Ile Phe Gly Ile Gly Trp Leu
485
<210> 135
<211> 761
<212> PRT
<213> Trichoderma reesei
<400> 135
Met Arg Ser Thr Leu Tyr Gly Leu Ala Ala Leu Pro Leu Ala Ala Gln
1 5 10 15
Ala Leu Glu Phe Ile Asp Asp Thr Val Ala Gln Gln Asn Gly Ile Met
20 25 30
Arg Tyr Thr Leu Thr Thr Thr Lys Gly Ala Thr Ser Lys His Leu His
35 40 45
Arg Arg Gln Asp Ser Ala Asp Leu Met Ser Gln Gln Thr Gly Tyr Phe
50 55 60
Tyr Ser Ile Gln Leu Glu Ile Gly Thr Pro Pro Gln Ala Val Ser Val
65 70 75 80
Asn Phe Asp Thr Gly Ser Ser Glu Leu Trp Val Asn Pro Val Cys Ser
85 90 95
Lys Ala Thr Asp Pro Ala Phe Cys Lys Thr Phe Gly Gln Tyr Asn His
100 105 110
Ser Thr Thr Phe Val Asp Ala Lys Ala Pro Gly Gly Ile Lys Tyr Gly
115 120 125
Thr Gly Phe Val Asp Phe Asn Tyr Gly Tyr Asp Tyr Val Gln Leu Gly
130 135 140
Ser Leu Arg Ile Asn Gln Gln Val Phe Gly Val Ala Thr Asp Ser Glu
145 150 155 160
Phe Ala Ser Val Gly Ile Leu Gly Ala Gly Pro Asp Leu Ser Gly Trp
165 170 175
Thr Ser Pro Tyr Pro Phe Val Ile Asp Asn Leu Val Lys Gln Gly Phe
180 185 190
Ile Lys Ser Arg Ala Phe Ser Leu Asp Ile Arg Gly Leu Asp Ser Asp
195 200 205
Arg Gly Ser Val Thr Tyr Gly Gly Ile Asp Ile Lys Lys Phe Ser Gly
210 215 220
Pro Leu Ala Lys Lys Pro Ile Ile Pro Ala Ala Gln Ser Pro Asp Gly
225 230 235 240
Tyr Thr Arg Tyr Trp Val His Met Asp Gly Met Ser Ile Thr Lys Glu
245 250 255
Asp Gly Ser Lys Phe Glu Ile Phe Asp Lys Pro Asn Gly Gln Pro Val
260 265 270
Leu Leu Asp Ser Gly Tyr Thr Val Ser Thr Leu Pro Gly Pro Leu Met
275 280 285
Asp Lys Ile Leu Glu Ala Phe Pro Ser Ala Arg Leu Glu Ser Thr Ser
290 295 300
Gly Asp Tyr Ile Val Asp Cys Asp Ile Ile Asp Thr Pro Gly Arg Val
305 310 315 320
Asn Phe Lys Phe Gly Asn Val Val Val Asp Val Glu Tyr Lys Asp Phe
325 330 335
Ile Trp Gln Gln Pro Asp Leu Gly Ile Cys Lys Leu Gly Val Ser Gln
340 345 350
Asp Asp Asn Phe Pro Val Leu Gly Asp Thr Phe Leu Arg Ala Ala Tyr
355 360 365
Val Val Phe Asp Trp Asp Asn Gln Glu Val His Ile Ala Ala Asn Glu
370 375 380
Asp Cys Gly Asp Glu Leu Ile Pro Ile Gly Ser Gly Pro Asp Ala Ile
385 390 395 400
Pro Ala Ser Ala Ile Gly Lys Cys Ser Pro Ser Val Lys Thr Asp Thr
405 410 415
Thr Thr Ser Val Ala Glu Thr Thr Ala Thr Ser Ala Ala Ala Ser Thr
420 425 430
Ser Glu Leu Ala Ala Thr Thr Ser Glu Ala Ala Thr Thr Ser Ser Glu
435 440 445
Ala Ala Thr Thr Ser Ala Ala Ala Glu Thr Thr Ser Val Pro Leu Asn
450 455 460
Thr Ala Pro Ala Thr Thr Gly Leu Leu Pro Thr Thr Ser His Arg Phe
465 470 475 480
Ser Asn Gly Thr Ala Pro Tyr Pro Ile Pro Ser Leu Ser Ser Val Ala
485 490 495
Ala Ala Ala Gly Ser Ser Thr Val Pro Ser Glu Ser Ser Thr Gly Ala
500 505 510
Ala Ala Ala Gly Thr Thr Ser Ala Ala Thr Gly Ser Gly Ser Gly Ser
515 520 525
Gly Ser Gly Asp Ala Thr Thr Ala Ser Ala Thr Tyr Thr Ser Thr Phe
530 535 540
Thr Thr Thr Asn Val Tyr Thr Val Thr Ser Cys Pro Pro Ser Val Thr
545 550 555 560
Asn Cys Pro Val Gly His Val Thr Thr Glu Val Val Val Ala Tyr Thr
565 570 575
Thr Trp Cys Pro Val Glu Asn Gly Pro His Pro Thr Ala Pro Pro Lys
580 585 590
Pro Ala Ala Pro Glu Ile Thr Ala Thr Phe Thr Leu Pro Asn Thr Tyr
595 600 605
Thr Cys Ser Gln Gly Lys Asn Thr Cys Ser Asn Pro Lys Thr Ala Pro
610 615 620
Asn Val Ile Val Val Thr Pro Ile Val Thr Gln Thr Ala Pro Val Val
625 630 635 640
Ile Pro Gly Ile Ala Ala Pro Thr Pro Thr Pro Ser Val Ala Ala Ser
645 650 655
Ser Pro Ala Ser Pro Ser Val Val Pro Ser Pro Thr Ala Pro Val Ala
660 665 670
Thr Ser Pro Ala Gln Ser Ala Tyr Tyr Pro Pro Pro Pro Pro Pro Glu
675 680 685
His Ala Val Ser Thr Pro Val Ala Asn Pro Pro Ala Val Thr Pro Ala
690 695 700
Pro Ala Pro Phe Pro Ser Gly Gly Leu Thr Thr Val Ile Ala Pro Gly
705 710 715 720
Ser Thr Gly Val Pro Ser Gln Pro Ala Gln Ser Gly Leu Pro Pro Val
725 730 735
Pro Ala Gly Ala Ala Gly Phe Arg Ala Pro Ala Ala Val Ala Leu Leu
740 745 750
Ala Gly Ala Val Ala Ala Ala Leu Leu
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<213> Neurospora crassa
<400> 136
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Gln Gln Lys Asn Pro Arg Phe His Lys Phe Asn Gly Ala Leu Ser Val
50 55 60
Tyr Lys Thr Tyr Leu Lys Tyr Gly Ala Pro Val Pro Asp His Leu Val
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Gln Ala Val Ala Asn His Leu Gly Ile Ser Val Glu Glu Val His Asn
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Ser Asp Leu Trp Val Phe Ser Asn Ser Leu Pro Ser Ser Gln Arg Ala
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370 375 380
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Ser
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<400> 138
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<400> 139
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<212> PRT
<213> Neurospora crassa
<400> 140
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<400> 141
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<211> 454
<212> PRT
<213> Myceliophthora thermophila
<400> 143
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450
<210> 144
<211> 489
<212> PRT
<213> Myceliophthora thermophila
<400> 144
Met Ala Ile Pro Val Leu Phe Ser Ala Leu Val Leu Leu Val Ala Leu
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Leu Trp Glu Gln Asn Val Thr Arg Val Lys Ala Tyr Thr Leu Ala Leu
195 200 205
Gly Ser Lys Asp Ser Gln Glu Gly Val Ile Val Phe Gly Gly Val Asp
210 215 220
Thr Ser Lys Phe Ala Gly Lys Leu Ala Arg Leu Pro Val Ile Pro Pro
225 230 235 240
Ala Gln Ser Pro Asp Gly Val Pro Arg Phe Trp Val Glu Met Lys Ser
245 250 255
Leu Ser Ile Thr Arg Pro Ser Gly Leu Asn Thr Val Tyr Asp Gly Gly
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Gly Ile Val Ala Ser Asp Arg Phe Thr Leu Leu Gly Asp Thr Phe Leu
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Arg Ser Ala Tyr Thr Val Phe Asp Leu Glu Thr Asp Ser Ile Trp Met
370 375 380
Ala Pro Ala Val Asn Cys Gly Ser Ser Pro Ala Ala Leu Ser Asn Val
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405 410 415
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Glu Ala Gly Ala Val Pro Thr Ser Thr Thr Thr Val Val Ser Gln Pro
435 440 445
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Gly Arg Leu Pro Ile Ile Pro Ala Glu Asp Ser Pro Asp Gly Val Pro
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<212> PRT
<213> Neurospora crassa
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435 440 445
Asn Thr Asn Thr Ile Val Glu Leu Thr Ala Asp Asn His Asp Asp Gly
450 455 460
Ala Ser Glu Arg Gly Glu Gly Ala Gly Ala Gly Ala Asp Ala Gly Thr
465 470 475 480
Arg Thr Val Ile Ala Gly Gly Leu Pro Ser Gly Leu Met Gly Val Glu
485 490 495
Ala Gln Gln Thr Thr Phe Thr Pro Thr Ala Thr Ala Asn Gly His Pro
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Gly Tyr Gly Gly Gly Pro Gly Gly Ser Thr Arg Pro Gly Ser Glu Arg
515 520 525
Asn Ala Ala Ala Gly Gly Phe Thr Ala Val Arg Thr Gly Leu Leu Gly
530 535 540
Glu Leu Val Gly Val Ala Ala Val Thr Ala Leu Phe Ile Leu Leu Gly
545 550 555 560
Gly Ala Leu Ile Ala Val
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<213> Myceliophthora thermophila
<400> 152
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20 25 30
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Gly Trp Ser Glu Asp Pro Trp Ala Ala Val Val Thr Arg Ile Val Glu
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Asn Gly Val Pro Cys Val Val Ser Ala Gly Asn Asp Gly Asp Ala Gly
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435 440 445
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515 520 525
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530 535 540
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Gly Lys Val Val Lys Gly Val Ser Ser Phe Ala Asp Lys Ala Glu Lys
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Leu
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<400> 158
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195 200 205
Val Ala Gly Thr Ile Gly Gly Lys Thr Phe Gly Val Ala Lys Lys Val
210 215 220
Asn Leu Val Ala Val Lys Val Leu Gly Ala Asp Gly Ser Gly Ser Asn
225 230 235 240
Ser Gly Val Ile Ala Gly Met Gln Phe Val Ala Ser Asn Ala Thr Ala
245 250 255
Met Gly Leu Lys Gly Arg Ala Val Met Asn Met Ser Leu Gly Gly Pro
260 265 270
Ala Ser Arg Ala Val Asn Ser Ala Ile Asn Gln Val Glu Ala Ala Gly
275 280 285
Val Val Pro Val Val Ala Ala Gly Asn Glu Ser Gln Asp Thr Ala Asn
290 295 300
Thr Ser Pro Gly Ser Ala Glu Ala Ala Ile Thr Val Gly Ala Ile Asp
305 310 315 320
Gln Thr Asn Asp Arg Met Ala Ser Phe Ser Asn Phe Gly Glu Leu Val
325 330 335
Asp Ile Phe Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Val Gly Ile Arg Ser
340 345 350
Asp Thr Ser Thr Asn Thr Leu Ser Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro His
355 360 365
Val Ala Gly Leu Ala Ala Tyr Ile Met Ser Leu Glu Asn Ile Thr Gly
370 375 380
Val Gln Ala Val Ser Asp Arg Leu Lys Glu Leu Ala Gln Ala Thr Gly
385 390 395 400
Ala Arg Ala Arg Gly Val Pro Arg Gly Thr Thr Thr Leu Ile Ala Asn
405 410 415
Asn Gly Phe Ala
420
<210> 159
<211> 421
<212> PRT
<213> Neurospora crassa
<400> 159
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1 5 10 15
Pro Ala Ser Ile Thr Trp Ala Ala Pro Ile Ile Glu Val Glu Thr Lys
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Pro Ile Pro Glu Lys Tyr Ile Val Leu Leu Lys Pro His Ala Asp Leu
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50 55 60
Arg Arg Asp Thr Ala Gly Val His Lys Ala Trp Ser Val Gly Ser Lys
65 70 75 80
Phe Lys Ala Tyr Ala Gly Glu Phe Asp Glu Glu Thr Leu Lys Ile Ile
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Gln Arg Asp Glu Arg Asn Val His Ser Ile Glu Pro Asp Lys Ser Trp
100 105 110
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130 135 140
Leu Ser His Lys Gly Lys Thr Ser Ser Asp Tyr Val Tyr Asn Ser Thr
145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
Pro Asp Ser Pro Phe Ile Asp Met Asp Gly His Gly Thr His Val Thr
195 200 205
Gly Thr Leu Ile Ser Lys Thr Tyr Gly Val Ala Lys Asn Ala Thr Val
210 215 220
Ile Cys Val Lys Val Phe His Gly Gly Gly Ser Ala Asn Thr Ile Val
225 230 235 240
Met Asp Gly Phe Glu Trp Ala Val Lys Asp Ile Ile Ala Lys Lys Arg
245 250 255
Gln Arg Asn Ser Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Cys Asp Arg Ser Glu
260 265 270
Ala Phe Asn Ala Ile Val Asp Ala Ala Tyr Asp Gln Gly Ile Leu Thr
275 280 285
Val Val Ala Ala Gly Asn Glu Asn Gln Pro Ala Ala Leu Val Ser Pro
290 295 300
Ala Ser Ser Ala Arg Ala Phe Ser Val Gly Ala Ile Asp Asn Lys Asn
305 310 315 320
Thr Arg Ala Tyr Phe Ser Asn Tyr Gly Ala Ile Val Asp Ile Phe Ala
325 330 335
Pro Gly Val Asn Ile Val Ser Thr Tyr Ile Gly Lys Lys Asp Gly Asp
340 345 350
Asn Asn Arg Thr Met Thr Met Ser Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro His
355 360 365
Val Ala Gly Leu Ala Leu Tyr Leu Lys Ser Leu Asp Pro Glu Lys Tyr
370 375 380
Gly Asn Ser Ser Asp Ala His Ser Gly Leu Arg Ala Leu Gly Val Pro
385 390 395 400
Asp Lys Val Trp Asp Ala Gly Glu Met Ser Pro Asn Leu Val Ala Tyr
405 410 415
Asn Gly Val Gln Gly
420
<210> 160
<211> 243
<212> PRT
<213> Myceliophthora thermophila
<400> 160
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1 5 10 15
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Tyr Thr Gly
<210> 161
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<212> PRT
<213> Neurospora crassa
<400> 161
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<212> PRT
<213> Myceliophthora thermophila
<400> 162
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210 215 220
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Pro Tyr Asp Asn Ser Asn Phe Val Val Val Ser Lys Pro
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<212> PRT
<213> Myceliophthora thermophila
<400> 163
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195 200 205
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225 230 235 240
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260 265 270
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Gly Asp Asn
305
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<212> PRT
<213> Myceliophthora thermophila
<400> 164
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20 25 30
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35 40 45
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115 120 125
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130 135 140
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<212> PRT
<213> Myceliophthora thermophila
<400> 165
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1 5 10 15
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100 105 110
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130 135 140
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His Ile Arg Met Val Ala Pro Val Val Arg Phe Gly Gln Ile Arg Pro
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Glu Arg Ser Gln Val Phe Glu Val Val Glu Thr Ala Pro Ser Gln Val
180 185 190
Lys Val Ala Ala Ala Ile Pro Pro Gln Asp Leu Asp Val Lys Ala Cys
195 200 205
Asn Thr Ser Ile Thr Pro Glu Cys Leu Arg Ala Leu Tyr Lys Val Gly
210 215 220
Ser Tyr Gln Ala Glu Pro Ser Lys Lys Ser Leu Phe Gly Val Ala Gly
225 230 235 240
Tyr Leu Glu Gln Trp Ala Lys Tyr Asp Gln Leu Glu Leu Phe Ala Ser
245 250 255
Thr Tyr Ala Pro Tyr Ala Ala Asp Ala Asn Phe Thr Ser Val Gly Val
260 265 270
Asn Gly Gly Glu Asn Asn Gln Gly Pro Ser Asp Gln Gly Asp Ile Glu
275 280 285
Ala Asn Leu Asp Ile Gln Tyr Ala Val Ala Leu Ser Tyr Lys Thr Pro
290 295 300
Ile Thr Tyr Tyr Ile Thr Gly Gly Arg Gly Pro Leu Val Pro Asp Leu
305 310 315 320
Asp Gln Pro Asp Pro Asn Asp Val Ser Asn Glu Pro Tyr Leu Glu Phe
325 330 335
Phe Ser Tyr Leu Leu Lys Leu Pro Asp Ser Glu Leu Pro Gln Thr Leu
340 345 350
Thr Thr Ser Tyr Gly Glu Asp Glu Gln Ser Val Pro Arg Pro Tyr Ala
355 360 365
Glu Lys Val Cys Gln Met Ile Gly Gln Leu Gly Ala Arg Gly Val Ser
370 375 380
Val Ile Phe Ser Ser Gly Asp Thr Gly Val Gly Ser Ala Cys Gln Thr
385 390 395 400
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405 410 415
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Gln Ala Ala Ala Phe Ser Ser Gly Gly Phe Ser Asp Ile Phe Lys Arg
435 440 445
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450 455 460
Gly Ser Arg Trp Lys Gly Leu Tyr Asn Pro Gln Gly Arg Gly Phe Pro
465 470 475 480
Asp Val Ser Ala Gln Gly Val Ala Tyr His Val Phe Ser Gln Asp Lys
485 490 495
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Leu Val Ser Leu Leu Asn Asn Ala Arg Leu Ala Gln Gly Arg Pro Pro
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Gly Ala Leu Thr Asp Ile Val His Gly Gly Ser Ser Gly Cys Thr Gly
545 550 555 560
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<212> PRT
<213> Neurospora crassa
<400> 166
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Tyr Ser Val Pro Asp Glu Leu Asp Ala His Val Asp Met Ile Gln Pro
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180 185 190
Gly Asp His Pro Thr Cys Thr Gly Cys Ile Tyr Pro Asp Glu Ile Arg
195 200 205
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Ile Ala Phe Ala Ser Tyr Leu Glu Gln Tyr Ser Asn Tyr Asp Asp Phe
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Thr Ser Phe Ala Lys Ala Phe Ile Pro Asp Ala Ala Asp Arg Asn Tyr
245 250 255
Thr Val Lys Leu Val Lys Gly Gly Leu His Asp Gln Ser Pro Asp Lys
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Ile Gly Val Glu Ala Asn Leu Asp Leu Gln Tyr Ile Leu Ala Ile Ser
275 280 285
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Leu Asp Phe Phe Gln Tyr Leu Leu Ser Leu Lys Asn Ser Glu Leu Pro
325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
Gly Val Ser Val Ile Phe Ser Ser Gly Asp Ser Gly Pro Gly Asp Ala
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Gly Arg Leu Val Gly Val Ser Gly Thr Ser Ala Ser Ala Pro Met Phe
485 490 495
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<212> PRT
<213> Myceliophthora thermophila
<400> 167
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245 250 255
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420 425 430
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435 440 445
Ser Trp Pro Ala Ser Tyr Met Arg Arg Gln Cys Leu Glu Val Leu Lys
450 455 460
Leu Ala Leu Gln Gly Val Thr Val Val Glu Ser Ser Gly Asp Phe Gly
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545 550 555 560
Gly Arg Pro Lys Trp Gln Asp Arg His Val Arg Glu Tyr Leu Arg Lys
565 570 575
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580 585 590
Asp Ser Leu Arg Pro Pro Pro Ala Gly Gly Lys Leu Phe Asn Arg Leu
595 600 605
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625 630 635 640
Pro Val Trp Ala Ser Ile Leu Thr Leu Ile Asn Glu Glu Arg Arg Ala
645 650 655
Val Gly Lys Gly Pro Val Gly Phe Val His Gln Val Leu Tyr Gln His
660 665 670
Pro Glu Val Phe Thr Asp Ile Thr Val Gly Ser Asn Pro Gly Cys Gly
675 680 685
Thr Asp Gly Phe Pro Val Glu Glu Gly Trp Asp Pro Val Thr Gly Leu
690 695 700
Gly Ser Pro Ile Tyr Pro Lys Leu Leu Lys Leu Phe Met Ser Leu Pro
705 710 715 720
<210> 168
<211> 719
<212> PRT
<213> Neurospora crassa
<400> 168
Met Phe Arg Phe His Leu Trp Thr Leu Leu Arg Leu Phe Ala Leu Leu
1 5 10 15
Ser Ser Leu Val Thr Ala Ser Arg Ile Val Leu Glu Glu Ala Gly His
20 25 30
Leu Pro Ala Gly Trp Lys Val Glu Arg His Ala Thr Ala Ser Asp Arg
35 40 45
Ile Gln Leu Ser Ile Ala Leu Lys Glu Pro Gly Ile Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Arg Arg Leu Leu Gln Gln Ser Thr Ser Asp Asp His Pro Asn Ser Arg
65 70 75 80
Gln Phe Thr Lys Glu Glu Val Glu Lys His Arg Gln Pro Asp Gln Arg
85 90 95
Ser Val Thr Ala Val Gly Arg Trp Leu Gln Ser His Gly Ile Lys Ser
100 105 110
Tyr Asn Ala Asp Asn Ser Trp Ile Thr Phe Lys Ala Thr Ala Ala Thr
115 120 125
Val Gln Met Leu Phe Glu Ala Asp Leu Ala Tyr Tyr Ser Tyr Asn Gly
130 135 140
Asp Pro Ser Thr Gln Ile Leu Arg Ser Arg Ser Tyr Thr Ile Pro Arg
145 150 155 160
Trp Leu Ser Asp Asp Ile Asp Phe Val His Pro Leu Thr Asn Phe Met
165 170 175
Pro Pro Arg Asn Arg Asn Asp Gly Thr Leu Gly Ile Gly Arg Arg Gln
180 185 190
Pro Ile Gln Pro Lys Leu Ser Ala Arg Glu Asp Phe Phe Ala Pro Pro
195 200 205
Cys Trp Thr Gly Thr Phe Pro Gly Cys Ile Arg Lys Leu Tyr Asn Leu
210 215 220
Thr Tyr Thr Pro Ser Pro Asp Phe Arg Ser Pro Ser Pro Val Arg Phe
225 230 235 240
Gly Ile Ala Ser Phe Leu Glu Gln Tyr Ile Thr His Arg Asp Val Thr
245 250 255
Ser Phe Leu Ala Thr Tyr Ala Arg Glu Leu Leu Pro Leu Arg Pro Thr
260 265 270
Pro Ser Arg Gly Gly Ser Gly Gly Ser Leu Thr Leu Pro Pro Val Thr
275 280 285
Asn Thr Thr Ser Glu Pro Pro Tyr Asn Ile Thr Ile Thr Leu Leu Asn
290 295 300
Asn Ala Thr Arg Trp Asp Pro His Ser Thr Asp Pro Ala Leu Ser Gly
305 310 315 320
Leu Glu Ala Asn Leu Asp Val Gln Tyr Ala Leu Ser Leu Gly His Pro
325 330 335
Thr Arg Val Ile Tyr Tyr Ala Thr Gly Gly Arg Gly Thr Lys Leu Asp
340 345 350
Ser Ser Gly Arg Pro Leu Pro Thr Asn Asp Pro Arg Ala Asn Asn Glu
355 360 365
Pro Phe Leu Glu Phe Leu Gln Ala Leu Leu Ala Leu Pro Asp Asn Gln
370 375 380
Ile Pro His Val Leu Ser Ile Ser Tyr Ala Asp Asp Glu Gln Ser Val
385 390 395 400
Pro Arg Lys Tyr Ala His Arg Val Cys Asp Leu Phe Ala Ala Val Ala
405 410 415
Ala Arg Gly Thr Ser Val Leu Val Ala Thr Gly Asp Gly Gly Ala Ala
420 425 430
Gly Ile Gly Phe Ser Ala Gly Gly Gly Asp Thr Cys Ile Lys Asn Asp
435 440 445
Gly Ser Gly Arg Arg Ala Phe Val Pro Thr Phe Pro Ala Ser Cys Pro
450 455 460
Trp Val Thr Ser Val Gly Ala Thr Asp Asn Thr Ala Leu Asn Leu Thr
465 470 475 480
Gly Ala Ala Phe Ser Ser Gly Gly Phe Ser Glu Tyr Phe Asp Arg Pro
485 490 495
Leu Trp Gln Arg Ala Ala Val Asp Pro Tyr Val Ser Ser Leu Leu Arg
500 505 510
Ser Arg Ser Ser Lys Pro Gly Gln Pro Ser Gln Pro Arg Asp Leu Lys
515 520 525
Gly Val Tyr Phe Ser His Asn Gly Arg Gly Met Pro Asp Met Ala Ala
530 535 540
Ile Gly Ser Gly Phe Gln Ile Ile His Arg Gly Glu Met Val Glu Val
545 550 555 560
Arg Gly Thr Ser Ala Ser Thr Pro Val Val Ala Ala Met Val Ala Leu
565 570 575
Val Asn Asp Gln Arg Leu Arg Gln Gly Lys Arg Ser Leu Gly Trp Leu
580 585 590
Asn Gly His Leu Tyr Leu Asp Pro Arg Val Arg Arg Val Leu Thr Asp
595 600 605
Val Lys Trp Gly Arg Ser Glu Gly Cys Val Phe Pro Gly Glu Ala Leu
610 615 620
Glu Glu Gly Arg Gly Lys Gly Lys Glu Lys Tyr Trp Arg His Ser Val
625 630 635 640
Val Glu Lys Arg Gln Gly Asn Ser Glu Glu Asp Gly Gly Thr His Gly
645 650 655
Gly Asp Gly Glu Gly Lys Ala Asp Glu Glu Asp Trp Gly Gly Glu Gly
660 665 670
Glu Val Gly Glu Gly Glu Gly Asp Gln Ser Glu Asn Val Ile Leu Gly
675 680 685
Gly Trp Asp Ala Arg Lys Gly Trp Asp Pro Val Thr Gly Leu Gly Val
690 695 700
Pro Gly Asp Phe Gln Glu Met Leu Lys Val Leu Gly Ser Val Trp
705 710 715
<210> 169
<211> 454
<212> PRT
<213> Neurospora crassa
<400> 169
Met Arg Ala Thr Leu Val Val Val Leu Cys His Leu Ser Leu Ala Phe
1 5 10 15
Ala Leu Ala Ile Ser Pro Ala Ala Ser His Trp Lys Arg Ser Ala Arg
20 25 30
Leu Ala Ser Asp Gln Thr Ala Ser Glu Arg Tyr Ser Leu Pro Ser Arg
35 40 45
Val Ala Arg Tyr Ile Asp Tyr Val Leu Pro Ala Pro Asp Pro Asp Pro
50 55 60
Val Ser Ser Ala Pro Lys Ser Val Ala Val Gln Asp Pro Pro Thr Leu
65 70 75 80
Lys Gly Val Ile Gly Ala Arg Gln Thr Arg Asp Val Asp Cys Leu Gln
85 90 95
Tyr Ile Ala Pro Gln Cys Leu Arg Gln Leu Ala Trp Leu Ala Glu Asp
100 105 110
Leu Asp Met Phe Phe Gly Asp Phe Ala Pro Asp Leu Leu Thr Asn Phe
115 120 125
Asn Leu Glu Pro Asn Leu Asp Tyr Lys Tyr Thr Met Ala Met Ala Lys
130 135 140
Pro Ile Pro Val Thr Asn Ile Gln Val Gly Asp Phe Val Val Gln Gly
145 150 155 160
Asn Met Asn Ile Met Leu Ala Ala Phe Asn Ala His Tyr Cys Arg Thr
165 170 175
Gly Leu Asp Pro Gln Phe Asp Pro Val Tyr Pro Asn Pro Ala Pro Gly
180 185 190
Gly Tyr Asn Ala Ser Asp Cys Gly Thr His Val Pro Pro Arg Val Ile
195 200 205
Ala Ile Met Tyr Ala Trp Asn Lys Ala Trp Tyr Ser Asp Ala Asp Phe
210 215 220
Ala Ser Ile Phe Pro Ala Ser Asp Pro Trp Val Thr Ser Val Gly Gly
225 230 235 240
Thr Gln Phe Leu Pro Val Val Ser Asn Gly Ser Ser Ser Thr Thr Ala
245 250 255
Ser Ser Gly Met Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser
260 265 270
Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Leu Phe Pro Gly Glu Thr Ala
275 280 285
Leu Asp Asp Asn Asn Thr Gly Ser Ser Gly Gly Ser Phe Ser Arg Leu
290 295 300
Phe Pro Gly Pro Trp Tyr Gln Gly Asn Leu Thr Arg Glu Tyr Leu Ala
305 310 315 320
Ser Ala Pro Gly Ala Ala Glu Leu Ala Arg Gln Gly Tyr Phe Asn Gly
325 330 335
Ser Gly Arg Gly Tyr Pro Asp Ile Ser Ala Met Ala Arg Ser Phe Leu
340 345 350
Val Ala Leu His Gly Gly Tyr His Ala Val Ser Gly Thr Ser Ala Ser
355 360 365
Thr Pro Val Val Ala Ala Met Val Ala Lys Ile Asn Asp Ala Arg Leu
370 375 380
His Ala Gly Lys Ser Thr Val Gly Phe Leu Asn Pro Val Leu Tyr Ser
385 390 395 400
Ala Ala Ala Gly Lys Ala Gly Val Leu Arg Asp Val Pro Leu Gly Lys
405 410 415
Asn His Asp Cys Gly Val Gly Glu Ala Phe Pro Ala Arg Arg Ala Trp
420 425 430
Asp Ala Val Thr Gly Leu Gly Thr Pro Asp Phe Glu Lys Leu Lys Glu
435 440 445
Leu Tyr Leu Gly Leu Pro
450
<210> 170
<211> 50
<212> PRT
<213> Aspergillus niger
<400> 170
Ile Val Thr Trp Asp Glu Ala His Phe Gly Lys Phe Gly Ser His Tyr
1 5 10 15
Leu Lys Arg Glu Phe Tyr Phe Asp Val His Pro Pro Leu Gly Lys Met
20 25 30
Leu Val Gly Leu Ser Gly Phe Leu Ala Gly Tyr Asn Gly Ser Phe Glu
35 40 45
Phe Lys
50
<210> 171
<211> 50
<212> PRT
<213> Aspergillus oryzae
<400> 171
Ile Val Thr Trp Asp Glu Ala His Phe Gly Lys Phe Gly Ser His Tyr
1 5 10 15
Leu Lys Arg Glu Phe Tyr Phe Asp Val His Pro Pro Leu Gly Lys Met
20 25 30
Leu Val Gly Leu Ser Gly Tyr Leu Ala Gly Tyr Asn Gly Ser Phe Glu
35 40 45
Phe Lys
50
<210> 172
<211> 50
<212> PRT
<213> Aspergillus nidulans
<400> 172
Ile Val Thr Trp Asp Glu Ala His Phe Gly Lys Phe Gly Ser His Tyr
1 5 10 15
Leu Lys Arg Glu Phe Tyr Phe Asp Val His Pro Pro Leu Gly Lys Met
20 25 30
Leu Val Gly Leu Ser Gly Leu Leu Ala Gly Tyr Asn Gly Ser Phe Glu
35 40 45
Phe Lys
50
<210> 173
<211> 50
<212> PRT
<213> Myceliophthora thermophila
<400> 173
Ile Val Thr Trp Asp Glu Ala His Phe Gly Lys Phe Gly Ser His Tyr
1 5 10 15
Leu Lys Arg Glu Phe Tyr Phe Asp Val His Pro Pro Ala Gly Lys Leu
20 25 30
Leu Val Gly Leu Ser Gly Tyr Leu Ala Gly Tyr Asn Gly Ser Phe Glu
35 40 45
Phe Lys
50
<210> 174
<211> 50
<212> PRT
<213> Neurospora crassa
<400> 174
Ile Val Thr Trp Asp Glu Ala His Phe Gly Lys Phe Gly Ser His Tyr
1 5 10 15
Leu Lys Arg Glu Phe Tyr Phe Asp Val His Pro Pro Ala Gly Lys Leu
20 25 30
Leu Val Gly Leu Ser Gly Leu Leu Ala Gly Tyr Asn Gly Ser Phe Glu
35 40 45
Phe Lys
50
<210> 175
<211> 50
<212> PRT
<213> Trichoderma virens
<400> 175
Ile Val Thr Trp Asp Glu Ala His Phe Gly Lys Phe Gly Ser Tyr Tyr
1 5 10 15
Ile Lys His Glu Tyr Tyr Phe Asp Val His Pro Pro Leu Gly Lys Met
20 25 30
Leu Val Gly Leu Ser Gly Val Leu Ala Gly Tyr Asn Gly Ser Phe Glu
35 40 45
Phe Lys
50
<210> 176
<211> 50
<212> PRT
<213> Trichoderma reesei
<400> 176
Ile Val Thr Trp Asp Glu Ala His Phe Gly Lys Phe Gly Ser Tyr Tyr
1 5 10 15
Ile Lys His Glu Tyr Tyr Phe Asp Val His Pro Pro Leu Gly Lys Met
20 25 30
Leu Val Gly Leu Ser Gly Val Leu Ala Gly Tyr Asn Gly Ser Phe Glu
35 40 45
Phe Lys
50
<210> 177
<211> 50
<212> PRT
<213> Fusarium oxysporum
<400> 177
Ile Val Thr Trp Asp Glu Ala His Phe Gly Lys Phe Gly Ser Tyr Tyr
1 5 10 15
Ile Lys His Glu Tyr Tyr Phe Asp Val His Pro Pro Leu Gly Lys Met
20 25 30
Leu Val Gly Leu Ser Gly Val Leu Ala Gly Tyr Asn Gly Thr Phe Glu
35 40 45
Phe Lys
50
<210> 178
<211> 50
<212> PRT
<213> Neurospora crassa
<400> 178
Ser Val Val Phe Asp Glu Val His Phe Gly Gly Phe Ala Ser Lys Tyr
1 5 10 15
Ile Lys Gly Lys Phe Phe Met Asp Val His Pro Pro Leu Ala Lys Leu
20 25 30
Met Ile Thr Leu Phe Gly Trp Leu Ala Gly Phe Asp Gly Ser Phe Asp
35 40 45
Phe Lys
50
<210> 179
<211> 50
<212> PRT
<213> Myceliophthora thermophila
<400> 179
Ser Val Val Phe Asp Glu Val His Phe Gly Gly Phe Ala Thr Lys Tyr
1 5 10 15
Ile Lys Gly Lys Phe Phe Met Asp Val His Pro Pro Leu Ala Lys Leu
20 25 30
Met Ile Thr Leu Phe Gly Trp Leu Ala Gly Phe Lys Gly Asn Phe Asp
35 40 45
Phe Lys
50
<210> 180
<211> 50
<212> PRT
<213> Trichoderma virens
<400> 180
Ser Val Val Phe Asp Glu Val His Phe Gly Gly Phe Ala Ser Lys Tyr
1 5 10 15
Ile Lys Gly Lys Phe Phe Met Asp Val His Pro Pro Leu Ala Lys Met
20 25 30
Leu Ile Ala Leu Thr Gly Trp Leu Ala Gly Phe Asp Gly Asn Phe Asp
35 40 45
Phe Lys
50
<210> 181
<211> 50
<212> PRT
<213> Trichoderma atroviride
<400> 181
Ser Val Val Phe Asp Glu Val His Phe Gly Gly Phe Ala Ser Lys Tyr
1 5 10 15
Ile Lys Gly Arg Phe Phe Met Asp Val His Pro Pro Leu Ala Lys Met
20 25 30
Leu Ile Ala Leu Thr Gly Trp Leu Ala Gly Phe Asp Gly Asp Phe Asp
35 40 45
Phe Lys
50
<210> 182
<211> 50
<212> PRT
<213> Trichoderma reesei
<400> 182
Ser Val Val Phe Asp Glu Val His Phe Gly Gly Phe Ala Ser Lys Tyr
1 5 10 15
Ile Lys Gly Arg Phe Phe Met Asp Val His Pro Pro Leu Ala Lys Met
20 25 30
Leu Ile Ala Leu Thr Gly Trp Leu Ala Gly Phe Asp Gly Asn Phe Asp
35 40 45
Phe Lys
50
<210> 183
<211> 50
<212> PRT
<213> Fusarium oxysporum
<400> 183
Ser Val Val Phe Asp Glu Val His Phe Gly Gly Phe Ala Thr Lys Tyr
1 5 10 15
Ile Lys Gly Lys Phe Phe Met Asp Val His Pro Pro Leu Ala Lys Met
20 25 30
Leu Ile Ala Leu Thr Gly Trp Leu Ala Gly Phe Asp Gly Ser Phe Asp
35 40 45
Phe Lys
50
<210> 184
<211> 50
<212> PRT
<213> Aspergillus nidulans
<400> 184
Ser Val Val Phe Asp Glu Val His Phe Gly Gly Phe Ala Thr Lys Tyr
1 5 10 15
Ile Lys Gly Arg Phe Phe Met Asp Val His Pro Pro Leu Ala Lys Leu
20 25 30
Leu Ile Thr Leu Ala Gly Trp Leu Ala Gly Phe Lys Gly Asp Phe Asp
35 40 45
Phe Lys
50
<210> 185
<211> 50
<212> PRT
<213> Aspergillus oryzae
<400> 185
Ser Val Val Phe Asp Glu Val His Phe Gly Gly Phe Ala Ser Lys Tyr
1 5 10 15
Ile Lys Gly Arg Phe Phe Met Asp Val His Pro Pro Leu Ala Lys Leu
20 25 30
Leu Ile Thr Leu Ala Gly Trp Leu Ala Gly Phe Asn Gly Asp Phe Asp
35 40 45
Phe Lys
50
<210> 186
<211> 50
<212> PRT
<213> Aspergillus niger
<400> 186
Ser Val Val Phe Asp Glu Val His Phe Gly Gly Phe Ala Thr Lys Tyr
1 5 10 15
Ile Lys Gly Arg Phe Phe Met Asp Val His Pro Pro Leu Ala Lys Leu
20 25 30
Leu Ile Thr Leu Ala Gly Trp Leu Ala Gly Phe Asp Gly Glu Phe Asp
35 40 45
Phe Lys
50
<210> 187
<211> 50
<212> PRT
<213> Penicillium chrysogenum
<400> 187
Ser Val Val Phe Asp Glu Val His Phe Gly Gly Phe Ala Ser Lys Tyr
1 5 10 15
Ile Lys Gly Lys Phe Phe Met Asp Val His Pro Pro Leu Ala Lys Leu
20 25 30
Leu Leu Thr Leu Ala Gly Trp Leu Ala Gly Phe Asp Gly Asn Phe Asp
35 40 45
Phe Lys
50
<210> 188
<211> 50
<212> PRT
<213> Trichoderma reesei
<400> 188
Glu Val Val Phe Asp Glu Val His Phe Gly Lys Phe Ala Ser Tyr Tyr
1 5 10 15
Leu Gln Arg Thr Tyr Phe Phe Asp Val His Pro Pro Phe Ala Lys Leu
20 25 30
Leu Phe Ala Phe Val Gly Trp Leu Val Gly Tyr Asp Gly His Phe His
35 40 45
Phe Asp
50
<210> 189
<211> 50
<212> PRT
<213> Trichoderma virens
<400> 189
Glu Val Val Phe Asp Glu Val His Phe Gly Lys Phe Ala Ser Tyr Tyr
1 5 10 15
Leu Gln Arg Thr Tyr Phe Phe Asp Val His Pro Pro Phe Ala Lys Leu
20 25 30
Leu Phe Ala Phe Val Gly Trp Leu Val Gly Tyr Asp Gly His Phe His
35 40 45
Phe Glu
50
<210> 190
<211> 50
<212> PRT
<213> Fusarium oxysporum
<400> 190
Glu Val Val Phe Asp Glu Val His Phe Gly Lys Phe Ala Ser Tyr Tyr
1 5 10 15
Leu Glu Arg Thr Tyr Phe Phe Asp Val His Pro Pro Phe Gly Lys Leu
20 25 30
Leu Phe Ala Phe Val Gly Trp Leu Val Gly Tyr Asp Gly Asn Phe His
35 40 45
Phe Glu
50
<210> 191
<211> 50
<212> PRT
<213> Gibberella zeae
<400> 191
Glu Val Val Phe Asp Glu Val His Phe Gly Lys Phe Ala Ser Tyr Tyr
1 5 10 15
Leu Glu Arg Thr Tyr Phe Phe Asp Val His Pro Pro Phe Gly Lys Leu
20 25 30
Leu Phe Ala Phe Val Gly Trp Leu Val Gly Tyr Asp Gly His Phe His
35 40 45
Phe Asp
50
<210> 192
<211> 50
<212> PRT
<213> Myceliophthora thermophila
<400> 192
Glu Val Val Phe Asp Glu Val His Phe Gly Lys Phe Ala Ser Tyr Tyr
1 5 10 15
Leu Glu Arg Thr Tyr Phe Phe Asp Val His Pro Pro Leu Gly Lys Leu
20 25 30
Leu Phe Ala Phe Met Gly Trp Leu Val Gly Tyr Asp Gly His Phe His
35 40 45
Phe Glu
50
<210> 193
<211> 50
<212> PRT
<213> Neurospora crassa
<400> 193
Glu Val Val Phe Asp Glu Val His Phe Gly Lys Phe Ala Ser Tyr Tyr
1 5 10 15
Leu Glu Arg Thr Tyr Phe Phe Asp Val His Pro Pro Phe Gly Lys Leu
20 25 30
Leu Phe Ala Phe Met Gly Trp Leu Val Gly Tyr Asp Gly His Phe His
35 40 45
Phe Glu
50
<210> 194
<211> 50
<212> PRT
<213> Aspergillus nidulans
<400> 194
Gln Val Val Phe Asp Glu Val His Phe Gly Lys Phe Ala Ser Tyr Tyr
1 5 10 15
Leu Arg Arg Thr Tyr Phe Phe Asp Val His Pro Pro Phe Ala Lys Leu
20 25 30
Leu Leu Ala Phe Thr Gly Trp Leu Val Gly Tyr Asp Gly His Phe Leu
35 40 45
Phe Glu
50
<210> 195
<211> 50
<212> PRT
<213> Aspergillus niger
<400> 195
Glu Val Val Phe Asp Glu Val His Phe Gly Lys Phe Ala Ser Tyr Tyr
1 5 10 15
Leu Gln Arg Thr Tyr Phe Phe Asp Val His Pro Pro Phe Gly Lys Leu
20 25 30
Leu Phe Ala Phe Met Gly Trp Leu Val Gly Tyr Asp Gly His Phe Leu
35 40 45
Phe Asp
50
<210> 196
<211> 50
<212> PRT
<213> Aspergillus oryzae
<400> 196
Glu Val Val Phe Asp Glu Val His Phe Gly Lys Phe Ala Ser Tyr Tyr
1 5 10 15
Leu Gln Arg Thr Tyr Phe Phe Asp Val His Pro Pro Phe Gly Lys Leu
20 25 30
Leu Phe Ala Ala Val Gly Trp Leu Ile Gly Tyr Asp Gly His Phe Leu
35 40 45
Phe Glu
50
<210> 197
<211> 50
<212> PRT
<213> Penicillium chrysogenum
<400> 197
Glu Val Val Phe Asp Glu Val His Phe Gly Lys Phe Ala Ser Tyr Tyr
1 5 10 15
Leu Gln Arg Thr Tyr Phe Phe Asp Val His Pro Pro Phe Gly Lys Leu
20 25 30
Leu Phe Ala Leu Met Gly Trp Leu Val Gly Phe Asp Gly Ser Phe Leu
35 40 45
Phe Glu
50
Claims (16)
- a) 첫 번째 돌연변이를 가지지 않는 부모 사상균 세포와 비교하여 내인성 프로테아제 활성을 감소 또는 제거시키는 첫 번째 돌연변이, 및
b) 두 번째 돌연변이를 가지지 않는 부모 사상균 세포와 비교하여 내인성 O-만노실트랜스퍼라제 활성을 감소시키는 PMT 유전자 내의 두 번째 돌연변이
를 포함하는 PMT-결핍 사상균 세포로서,
상기 사상균 세포는 트리코데르마, 뉴로스포라, 미셀리오프토라 및 크리소스포리움 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 PMT-결핍 사상균 세포. - 제1항에 있어서, 내인성 O-만노실트랜스퍼라제 활성을 감소시키는 상기 두 번째 돌연변이는 내인성 단백질 O-만노실트랜스퍼라제 활성을 인코딩하는 PMT 유전자의 결실 또는 파괴인 것인 PMT-결핍 사상균 세포.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 PMT 유전자 내의 두 번째 돌연변이는:
a) 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 PMT1 유전자,
b) PMT1 유전자의 기능성 상동 유전자로서, 상기 기능성 상동 유전자가 상기 PMT1 유전자 내 파괴를 가지는 T. 리세이 스트레인 내로 도입되는 경우 기능 상보성(functional complementation)에 의해 부모 O-만노실화 레벨을 회복시킬 수 있는 것인 PMT1 유전자의 기능성 상동 유전자, 또는;
c) 서열번호 2와 최소 50% 동일성을 가지는 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 폴리펩타이드는 O-만노실트랜스퍼라제 활성을 가지는 것인 폴리뉴클레오타이드
중 어느 하나에 존재하는 돌연변이인 것인 PMT-결핍 사상균 세포. - 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 세포는 세 번째 돌연변이를 가지지 않는 부모 사상균 세포 내 발현 레벨과 비교하여 ALG3 유전자의 발현 레벨을 감소 또는 제거시키는 세 번째 돌연변이를 가지는 것인 PMT-결핍 사상균 세포.
- 제4항에 있어서, 상기 세포는 N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 I 촉매 도메인을 인코딩하는 첫 번째 폴리뉴클레오타이드 및 N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 II 촉매 도메인을 인코딩하는 두 번째 폴리뉴클레오타이드를 추가적으로 포함하는 것인 PMT-결핍 사상균 세포.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 세포는:
a) α1,2 만노시다제;
b) N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 I 촉매 도메인;
c) α 만노시다제 II;
d) N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 II 촉매 도메인;
e) β1,4 갈락토실트랜스퍼라제; 및,
f) 푸코실트랜스퍼라제
로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩타이드를 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 추가적으로 포함하는 것인 PMT-결핍 사상균 세포. - 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 세포는 트리코데르마 pmt1의 단백질 O-만노실트랜스퍼라제 활성을 감소 또는 제거시키는 돌연변이를 포함하는 트리코데르마 세포인 것인 PMT-결핍 사상균 세포.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 세포는 트리코데르마 세포, 예를 들어 트리코데르마 리세이이며, 상기 세포는
a) 3개의 내인성 프로테아제 pepl, tspl 및 slpl;
b) 3개의 내인성 프로테아제 gapl, slpl 및 pepl;
c) pepl, pep2, pep3, pep4, pep5, pep8, pep11, pep12, tspl, slpl, slp2, slp3, slp7, gapl 및 gap2로 이루어진 군으로부터 선택된 3개의 내인성 프로테아제;
d) pepl, pep2, pep3, pep4, pep5, tspl, slpl, slp2, slp3, gapl 및 gap2로 이루어진 군으로부터 선택된 3개 내지 6개의 프로테아제; 또는
e) pepl, pep2, pep3, pep4, pep5, pep7, pep8, tspl, slpl, slp2, slp3, slp5, slp6, slp7, slp8, tppl, gapl 및 gap2로 이루어진 군으로부터 선택된 7개 내지 10개의 프로테아제
의 활성을 감소 또는 제거시키는 돌연변이를 포함하는 것인 PMT-결핍 사상균 세포. - 감소된 O-만노실화를 가지는 단백질을 생산하는 방법으로서, 상기 방법은:
a) 내인성 O-만노실트랜스퍼라제 활성을 감소시키는 그러한 돌연변이를 가지지 않는 부모 스트레인과 비교하여 내인성 O-만노실트랜스퍼라제 활성을 감소시키는 PMT 유전자 내의 돌연변이를 가지고, 추가적으로 세린 또는 트레오닌 잔기를 가지는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 PMT-결핍 사상균 세포를 제공하는 단계,
b) 상기 PMT-결핍 사상균 세포를 배양하여 감소된 O-만노실화를 가지는 상기 단백질을 생산하는 단계
를 포함하며,
상기 사상균 세포는 트리코데르마, 뉴로스포라, 미셀리오프토라 또는 크리소스포리움 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법. - 제9항에 있어서, 상기 PMT 유전자 내의 돌연변이는:
a) 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 PMT1 유전자,
b) PMT1 유전자의 기능성 상동 유전자로서, 상기 유전자가 상기 PMT 유전자에서 파괴를 가지는 T. 리세이 스트레인 내로 도입되는 경우 기능 상보성에 의해 부모 O-만노실화 레벨을 회복시킬 수 있는 것인 PMT1 유전자의 기능성 상동 유전자, 또는
c) 서열번호 2와 최소 50% 동일성을 가지는 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 폴리펩타이드는 O-만노실트랜스퍼라제 활성을 가지는 것인 폴리뉴클레오타이드
중 어느 하나에 존재하는 돌연변이인 것인 방법. - 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 사상균 세포는 기능성 내인성 샤페론 단백질, 예컨대 단백질 디술피드 이소머라제 (PDI)를 발현하는 것인 방법.
- 제9항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 PMT-결핍 사상균 세포는 제1항 내지 제8항 중 어느 하나에 정의된 대로의 세포로부터 선택되는 것인 방법.
- 제9항 내지 제12항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 생산된 단백질은
a) IgG 같은 면역글로불린,
b) 면역글로불린의 경쇄 또는 중쇄,
c) 항체의 중쇄 또는 경쇄,
d) 단일 사슬 항체,
e) 카멜리드 항체,
f) 모노머 또는 멀티머 단일 도메인 항체,
g) FAb-단편, FAb2-단편, 및,
h) 이들의 항체-결합 단편들
로 이루어진 군으로부터 선택되는 이종 포유동물 단백질인 것인 방법. - 감소된 O-만노실화를 가지는 항체를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은:
a) PMT-결핍 사상균 세포를 제공하는 단계로서, 상기 세포는
i. 내인성 단백질 O-만노실트랜스퍼라제 활성을 감소시키는 그러한 돌연변이를 가지지 않는 부모 스트레인과 비교하여 내인성 단백질 O-만노실트랜스퍼라제 활성을 감소시키는 돌연변이, 및,
ii. 경쇄 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 중쇄 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드
를 가지는 것인 단계,
b) 상기 세포를 배양하여 감소된 O-만노실화를 가지는 중쇄 및 경쇄로 이루어진 상기 항체를 생산하는 단계
를 포함하며,
상기 사상균 세포는 트리코데르마, 뉴로스포라, 미셀리오프토라 및 크리소스포리움 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법. - 제9항 내지 제14항 중 어느 하나의 항의 방법에 의해 얻어질 수 있는 단백질 또는 항체 조성물.
- 제15항에 있어서, 상기 단백질 또는 항체는, 주요 글리코형으로서:
a) Manα3[Manα6(Manα3)Manα6]Manβ4GlcNAβ4GlcNAc (Man5 글리코형);
b) Manα6(Manα3)Manβ4GlcNAβ4GlcNAc (Man3 글리코형);
c) 하이브리드 또는 복합체 타입 N-글리칸, 예컨대 GlcNAcMan3, GO, 하이브리드 글리칸 GlcNAcMan5, 그리고 GalGlcNAcMan3, G1, G2; 및 GalGlcNAcMan5 글리코형 같은 갈락토실화된 유도체들로 이루어진 서브군으로부터 선택된 글리코형
중 어느 하나를 포함하는 것인 단백질 또는 항체 조성물.
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